DE1617549C - Process for the manufacture of a vaccine against rabies - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen die Tollwut, der einen erhöhten Titer an Lebendviren oder an Antigen aufweist, ohne Gefahr verwendet werden kann und einen stark erhöhten Impfschutz sichert.The invention relates to a method for producing a vaccine against rabies which has an increased Has titer of live viruses or of antigen, can be used without danger and a ensures greatly increased vaccination protection.
Es ist bekannt, einen Impfstoff gegen die Tollwut durch Kultivieren eines Stammes von Tollwutviren auf einer Zellkultur einer Zellinie aus einem Organ eines Tieres der Familie der Nagetiere oder Hühnervögel herzustellen. Hierbei wird ein serumhaltiges Substrat verwendet, entsprechend der allgemeinen Meinung, daß sich das Tollwutvirus vorteilhaft in einem albuminhaltigen Milieu entwickelt und das Serum die einzig wirtschaftlich verwendbare Albuminquelle darstellt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich ein Impfstoff gegen die Tollwut auf den genannten und noch anderen Zellkulturen herstellen läßt, die nur im ersten Teil der Kultur Serum enthalten, nicht aber im letzten Teil der Kultur. Hierdurch wird nicht nur eine höhere Virusausbeute erreicht, sondern es wird ein Impfstoff erhalten, der keinSerumalbumin mehr enthält, das als Ursache für zahlreiche Schwierigkeiten und Unfälle bei der Impfung gegen die Tollwut angesehen werden muß.It is known to produce a vaccine against rabies by cultivating a strain of rabies virus on a cell culture of a cell line from an organ of an animal of the rodent or fowl family to manufacture. A serum-containing substrate is used here, according to the general one Opinion that the rabies virus develops favorably in an albumin-containing environment, and so does the serum is the only commercially viable source of albumin. Surprisingly, it was found that a vaccine against rabies can be produced on these and other cell cultures which contain serum only in the first part of the culture, but not in the last part of the culture. Through this Not only does a higher virus yield result, but a vaccine that does not contain serum albumin is obtained contains more that as the cause of numerous difficulties and accidents in vaccination must be viewed against rabies.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen die Tollwut durch Kultivieren eines Stammes von Tollwutviren auf einer Zellkultur einer Zellinie aus einem Organ eines Tieres der Familie der Nagetiere oder Hühnervögel ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur auf diesen Zellen oder außerdem auf Zellen eines Tieres der Familie der Mardertiere (Mustelideae) oder auf einem Zellenstamm oder einer Primärzellenkultur eines Primaten zunächst in einem serumhaltigen Milieu und den letz- !en Teil der Kultur in einem entsprechenden, kein Selum enthaltenden Milieu durchführt. Nach dem Zerkleinern des Zellengewebes wird die überstehende Flüssigkeit zur Verwendung als lebender Impfstoff abgetrennt oder gegebenenfalls mittels eines Inaktivierungsmittels wie //-Propiolacton, Glycidaldehyd oder Formol inaktiviert. Gegebenenfalls wird der Impfstoff vorzugsweise durch Gefriertrocknung konserviert, um seine Haltbarkeit zu verbessern.The method of the present invention for producing a vaccine against rabies by culturing of a strain of rabies virus on a cell culture of a cell line from an organ of a family animal of rodents or chickens is characterized by the fact that one has the culture on these cells or also on cells of an animal of the marten family (Mustelideae) or on a cell strain or a primary cell culture of a primate first in a serum-containing environment and the last ! en part of the culture in a corresponding, no selum Carries out containing milieu. After shredding the cell tissue, the protruding Liquid separated for use as a live vaccine or optionally by means of an inactivating agent like // - propiolactone, glycidaldehyde or formol inactivated. If necessary, the vaccine is used preferably preserved by freeze drying to improve its shelf life.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Impfstoff mit inaktivierten Viren vom Virusstamm Pasteur hergestellt, der an die für die Kultur verwendeten Zellen adaptiert worden ist.According to a preferred embodiment of the invention, an inactivated virus vaccine is provided produced by the Pasteur virus strain, which has been adapted to the cells used for the culture.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird ein Impfstoff mit Lebendviren ausgehend von einem modifizierten Virusstamm, der unter der Bezeichnung Flury H.E.P. bekannt ist, hergestellt (H. K op ro w ski, J.Black, D. J. N e 1 s e η , Studies on chick embryo adapted rabies virus VI — Further changes in pathogenic properties following prolonged cultivation in the developping chick embryo. J. Immunol., Bd. 72, [ 1954], S. 94).In a further embodiment of the method according to the invention, a live virus vaccine is used starting from a modified virus strain known as Flury H.E.P. known is, made (H. K op ro w ski, J.Black, D. J. N e 1 s e η, Studies on chick embryo adapted rabies virus VI - Further changes in pathogenic properties following prolonged cultivation in the developping chick embryo. J. Immunol., Vol. 72, [1954], p. 94).
Die als Viruskultur dienende ZellenkuHur wird vorzugsweise unter den Zellinien von Organen der Mardertiere (Mustelideae) und besonders denen der Nagetiere wie Maus, Ratte und Hamster, z. B. der Haut, der Lunge oder den Nieren dieser Tiere, ausgewählt.The cell culture serving as virus culture is preferred among the cell lines of organs of the marten animals (Mustelideae) and especially those of the rodents like mouse, rat and hamster, e.g. B. the skin, the lungs or the kidneys of these animals.
Man kann z. B. gemäß der Erfindung Zellinien verwenden, die unter der Bezeichnung BHK (M. Stoker, I. MacPherson, Syrian Hamster fibroblast cell line BHK 21 an its derivatives. Nature, 1964, Bd. 203, Nr. 4952, S. 1355 bis 1357) oder unter der BezeichnungNIL (L. Diamond, Two spontaneously transformed cell lines derived from the same hamster embryo culture-Internation. J. of Cancer, Bd. 2, 1967, S. 143 bis 152) bekannt sind oder eine andere Zelllinie, die von Nierenzellen vom Hamster und besonders vom jungen Hamster abstammt.You can z. B. use cell lines according to the invention, which under the name BHK (M. Stoker, I. MacPherson, Syrian Hamster fibroblast cell line BHK 21 an its derivatives. Nature, 1964, Vol. 203, No. 4952, pp. 1355 to 1357) or under the name NIL (L. Diamond, Two spontaneously transformed cell lines derived from the same hamster embryo culture internation. J. of Cancer, Vol. 2, 1967; S. 143 to 152) are known or another cell line, that of kidney cells from hamsters and especially descends from the young hamster.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens muß zunächst auf bekannte Weise der Virusstamm an die zur Kultur dienenden Zellen adaptiert werden.When carrying out the method according to the invention, the virus strain must first be identified in a known manner adapted to the cells used for culture.
Der in erster Stufe verwendete Nährboden kann z. B. eine isotonische Salzlösung, die Aminosäuren, Vitamine, Zucker und ein Serum enthält, beispielsweise ein Nährboden nach Stock er, McPherson, sein.The nutrient medium used in the first stage can, for. B. an isotonic salt solution, the amino acids, Contains vitamins, sugar and a serum, for example a nutrient medium according to Stocker, McPherson, being.
Die Viruskultur kann auf einer Zellensuspension in einem Nährboden, aber auch auf einer Glaswand, im
stehenden oder vorzugsweise im sich drehenden Kolben, durchgeführt werden.
Zu Beginn wird die Kultur in einem serumhaltigen Medium z. B. etwa 48 Stunden lang bei einer Temperatur
von 34 bis 38° C durchgeführt. Das in dem Kulturnährboden enthaltene Serum muß den Zellen angepaßt
sein. Hier wird die Kultur in einem zweiten serumfreien Medium fortgesetzt, dessen Volumen bedeutend
kleiner, z. B. zehnmal kleiner als das Volumen des ersten Mediums ist.The virus culture can be carried out on a cell suspension in a nutrient medium, but also on a glass wall, in a stationary or preferably in a rotating flask.
At the beginning, the culture is in a serum-containing medium z. B. carried out for about 48 hours at a temperature of 34 to 38 ° C. The serum contained in the culture medium must be adapted to the cells. Here the culture is continued in a second serum-free medium, the volume of which is significantly smaller, e.g. B. is ten times smaller than the volume of the first medium.
In diesem zweiten Nährboden ohne Serum kann die Kultur z. B. 24 bis 48 Stunden fortgesetzt werden. Die Gesamtkulturdauer entspricht dann etwa 72 bis 96 Stunden.In this second medium without serum, the culture can e.g. B. continued for 24 to 48 hours. the The total culture time then corresponds to about 72 to 96 hours.
Gemäß einer-bevorzugten Verfahrensweise ändert man zu Beginn der Kultur den pH-Wert durch Einleitung einer ausreichenden Menge von Kohlendioxyd in das Nährmedium, um dessen pH-Wert auf einen optimalen Wert nahe 7 zu bringen.According to a preferred procedure changes one at the beginning of the culture the pH by introducing a sufficient amount of carbon dioxide in the nutrient medium to bring its pH to an optimal value close to 7.
Wenn die Kultur beendet ist, werden die Zellen in üblicher Weise gefroren und wieder aufgetaut und danach in einer Flüssigkeit, die vorteilhaft durch die überstehende Flüssigkeit des Kulturmediums gebildet sein kann, zerkleinert. Die Zellenreste werden durch Abzentrifugieren abgetrennt.When the culture is complete, the cells are frozen and thawed in the usual manner and thereafter in a liquid that is advantageously formed by the supernatant liquid of the culture medium can be crushed. The cell remains are separated off by centrifugation.
Die Inaktivierung der Viren erfolgt gegebenenfallsThe viruses are deactivated if necessary
. vorzugsweise durch Zusatz von /J-Propiolacton bis zu einer Verdünnung zwischen 1 : 1000 und 1 : 6000 Volumteilcn. Sie kann bei Temperaturen zwischen beispielsweise 0 und 37° C innerhalb einiger Stunden bis zu mehr als 24 Stunden durchgeführt werden. Bei 0° C erhält man in 24 Stunden eine ausreichende In-. preferably by adding / I-propiolactone up to a dilution between 1: 1000 and 1: 6000 parts by volume. You can at temperatures between, for example 0 and 37 ° C can be carried out within a few hours to more than 24 hours. at 0 ° C you get a sufficient indoor temperature in 24 hours
aktivierung mit /J-Propiolacton in einer Verdünnung von 1 : 5000 Volumteilen. In 16 Stunden bei 18° C wird bei gleicher Verdünnung das gleiche Ergebnis erzielt. activation with / J-propiolactone in a dilution of 1: 5000 parts by volume. The same result is achieved in 16 hours at 18 ° C with the same dilution.
Mit einer Verdünnung von 1 :2000 kann man mit ß-Propiolacton das Virus in 3 Stunden bei 25° C inaktivieren, wogegen die gleiche Inaktivierung bei einer Temperatur von 37° C mit einer Verdünnung von 1 : 4000 nach 2 Stunden erhalten wird.With a dilution of 1: 2000 you can inactivate the virus with ß-propiolactone in 3 hours at 25 ° C, whereas the same inactivation at a temperature of 37 ° C with a dilution of 1: 4000 is obtained after 2 hours.
Die Verwendung von /3-Propiolacton für die Inaktivierung des Virus ist mit Rücksicht auf die gute Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse bevorzugt.The use of / 3-propiolactone for inactivation of the virus is with regard to the good reproducibility and reliability of the results preferred.
Der hergestellte Impfstoff wird in üblicher Weise gefriergetrocknet. Vor der Gefriertrocknung oder bei der Anwendung wird vorzugsweise dem Impfstoff eine Flüssigkeit hinzugefügt, die eines der üblichen Potenzierungshilfsmittel enthält, z. B. ein Mineralöl oder ein mit Dianhydromannitmonooleat emulgiertes öl oder ein Produkt auf der Basis von Erdnußöl und Aluminiumstearat.The vaccine produced is freeze-dried in the usual way. Before freeze drying or at the application is preferably added a liquid to the vaccine, one of the usual Contains potentiating agents, e.g. B. a mineral oil or one emulsified with dianhydromannite monooleate oil or a product based on peanut oil and aluminum stearate.
Man kann auch als Zusatz eine Aluminiumhydroxydlösung verwenden, die etwa 2 °/o reines A1.,O3 oder außerdem Aluminiumphosphat AlPO4 in einer Konzentration von 1 % enthält. Diese beiden Zusatzmittel werden z. B. in Mengen von 1 mg pro Milliliter Impfstoff verwendet.An aluminum hydroxide solution can also be used as an additive, which contains about 2 % pure A1, O 3 or, in addition, aluminum phosphate AlPO 4 in a concentration of 1%. These two additives are z. B. used in amounts of 1 mg per milliliter of vaccine.
Zur Erläuterung der Erfindung werden im folgenden mehrere Ausführungsformen beschrieben.In order to explain the invention, several embodiments are described below.
30 Beispiel 1 30 Example 1
Man stellt eine Suspension einer Zellenkultur der Zellinie NIL mittels Trypsin her. Diese Suspension wird durch Zugabe von fixierten Tollwuterregerviren infiziert. Sie wird dann auf Kulturkolben verteilt, die einen Nährboden von McPherson-Stoker enthalten und in den Brutschrank bei einer Temperatur von 37° C gelegt.A suspension of a cell culture of the NIL cell line is prepared using trypsin. This suspension is infected by the addition of fixed rabies viruses. It is then distributed to the culture flasks contain a nutrient medium from McPherson-Stoker and place in the incubator at a temperature of 37 ° C.
Sobald das Zellenbett fließt, werden die infizierten Zellen mittels Trypsin aus dem Glas entfernt und mit einer nicht infizierten Zellensuspension im Verhältnis von 1 Volumen infizierte Zellensuspension zu 3 bis 4 Volumen nicht infizierter Zellensuspension gemischt.As soon as the cell bed flows, the infected cells are removed from the glass by means of trypsin and taken with it an uninfected cell suspension in a ratio of 1 volume of infected cell suspension to 3 to 4 Volume of uninfected cell suspension mixed.
Diese Mischung wird darauf in feststehende oder drehende Kulturkolben unter Zusatz eines frischen Nährbodens wie oben verteilt. Die Kolben werden im Brutschrank auf einer Temperatur von 37° C gehalten. This mixture is poured into stationary or rotating culture flasks with the addition of a fresh one Spread the nutrient medium as above. The flasks are kept at a temperature of 37 ° C. in the incubator.
Ein aliquoter Teil der Suspension der so erhaltenen Zellen wird entnommen und auf Objektträgern in Petrischalen kultiviert, um die Virusinfektion zu kontrollieren. An aliquot of the suspension of the cells thus obtained is removed and placed on microscope slides in Petri dishes cultivated to control viral infection.
Nach einer Zeit von allgemein zwischen 48 und 60 Stunden stellt man das Vorhandensein von spezifisehen intracytoplasmischen Einschlüssen bei verschiedenen Schnitten fest.After a period of generally between 48 and 60 hours, the presence of specifics is established intracytoplasmic inclusions at different sections.
Der Ausgangskulturnährboden wird dann durch einen neuen, von Serum befreiten Nährboden im Verhältnis von 1 Volumen neuen Nährbodens zu 10 Volumen des eliminierten Nährbodens ersetzt. Der pH-Wert des Nährbodens wird durch Einleiten von Kohlendioxyd auf einen Wert von 7 gebracht.The starting culture medium is then proportionally replaced by a new, serum-free culture medium replaced by 1 volume of new agar to 10 volumes of the eliminated agar. the The pH of the nutrient medium is brought to a value of 7 by introducing carbon dioxide.
Die Kolben werden während nochmals 20 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 37° C aufbewahrt und dann bei — 30° C gefroren.The flasks are kept at a temperature of 37 ° C. for a further 20 to 24 hours and then frozen at - 30 ° C.
Die virulente Flüssigkeit wird nach dem Auftauen und heftigem Schleudern der Kolben aufgefangen, um eine gute Trennung von der Zellenschicht zu erreichen. The virulent liquid is collected after the flasks have thawed and thrown vigorously to achieve a good separation from the cell layer.
Die virulente Flüssigkeit wird darauf zur Entfernung von Zellenresten zentrifugiert und dann über keimfreie Filter gefiltert. Die Überprüfung der Sterilität wird an verschiedenen Stadien vorgenommen. Darüber hinaus macht man eine Entnahme, die zur Bestimmung des Infektionsgehalts, durch intracerebrale Einimpfung an einer Maus und für die Reaktion auf die Fixierung des Komplementärstoffs verwendet wird.The virulent liquid is then centrifuged to remove cell debris and then poured over filtered germ-free filter. The sterility check is carried out at different stages. In addition, one makes a collection, which is used to determine the infection content, through intracerebral Inoculation on a mouse and used for the response to fixation of the complementary substance will.
Die Inaktivierung wird darauf durch im Verhältnis 1 : 4000 verdünntes ß-Propiolacton, das man während 24 Stunden bei einer Temperatur von 0° C und anschließend 2 Stunden bei 37° C einwirken läßt, vorgenommen. The inactivation is thereupon by ß-propiolactone diluted in a ratio of 1: 4000, which one during 24 hours at a temperature of 0 ° C and then allowed to act for 2 hours at 37 ° C, made.
Darauf wird der Impfstoff auf Ampullen abgefüllt und in Gegenwart von als Stabilisator wirkender Lactose gefriergetrocknet.The vaccine is then filled into ampoules and in the presence of lactose, which acts as a stabilizer freeze dried.
Die Überprüfung der bakteriologischen Sterilität und der absoluten Unschädlichkeit wird dann durch bekannte Versuche vorgenommen, um eine gute Inaktivierung und Wirksamkeit des Impfstoffs sicherzustellen. The check of the bacteriological sterility and the absolute harmlessness is then carried out Known attempts have been made to ensure good inactivation and effectiveness of the vaccine.
Beisp iel 2Example 2
Ein Kolben, der eine Suspension diploider menschlicher Zellen (WI 38) enthält, wird durch Zugabe des Tollwuterregervirus HEP infiziert. Diese Suspension wird in zwei Kolben mit gleichem Fassungsvermögen, die mit Kulturnährboden von Eagle aufgefüllt werden, verteilt.A flask containing a suspension of diploid human cells (WI 38) is prepared by adding the HEP infected rabies virus. This suspension is poured into two flasks of the same capacity, which are replenished with culture medium from Eagle, distributed.
Am 3. oder 4. Tag vergewissert man sich von der Gegenwart der spezifischen Tollwuterregereinschlüsse in allen Zellen.On the 3rd or 4th day, make sure that the specific rabies inclusions are present in all cells.
Die so infizierten diploiden Zellen werden nach der Trypsinbehandlung in eine Suspension gelegt und mit einer neuen diploiden nicht infizierten Zellensuspension vermischt. Diese Mischung wird z.B. im Verhältnis von einem Volumen infizierte Zellensuspension zu 10 Volumen nicht infizierter Zellensuspension vorgenommen; das ganze auf 20 Kulturkolben verteilt.The diploid cells infected in this way are placed in a suspension after the trypsin treatment and with a new diploid uninfected cell suspension mixed. This mixture is e.g. in the ratio made from one volume of infected cell suspension to 10 volumes of uninfected cell suspension; the whole distributed over 20 culture flasks.
Die überstehende Flüssigkeit des anfänglich infizierten Kolbens wird gleichmäßig auf die 20 Kolben, von denen jeder mit neuem Eagle-Nährboden aufgefüllt wird, verteilt.The supernatant liquid from the initially infected flask is evenly distributed over the 20 flasks, each of which is replenished with new Eagle medium.
Ein aliquoter Teil der Mischung aus infizierten Zellen und nicht infizierten Zellen und überstehender infizierter Flüssigkeit wird entnommen und auf Objektträgern in Petrischalen kultiviert.An aliquot of the mixture of infected cells and uninfected cells and excess infected cells Liquid is removed and cultured on microscope slides in Petri dishes.
Am 2. oder 3. Tag der Kultur wird der Kulturnährboden durch einen neuen, das Serum nicht enthaltenden Nährboden ausgetauscht, wobei das Volumen des neuen serumfreien Nährbodens beispielsweise zehnmal kleiner als das Volumen des Ausgangsnährbodens ist.On the 2nd or 3rd day of culture, the culture medium is replaced with a new one that does not contain the serum The nutrient medium exchanged, the volume of the new serum-free nutrient medium, for example, ten times is smaller than the volume of the starting medium.
Am 4. oder 5. Tag wird durch Immunfluoreszenz die Gegenwart von Einschlüssen von Tollwuterregern in allen Zellen sichergestellt.On the 4th or 5th day, the presence of inclusions of rabies pathogens is determined by immunofluorescence ensured in all cells.
Die Kulturkolben werden bei einer Temperatur von — 30° C gefrieren gelassen.The culture flasks are allowed to freeze at a temperature of -30 ° C.
Das virulente Produkt wird aufgefangen und eine Entnahme gemacht, um die bakteriologische Sterilität und die Infektionskraft durch intracerebrale Einimpfung bei einer neugeborenen Maus zu prüfen.The virulent product is collected and a sample is taken to ensure bacteriological sterility and to test the infectious potency by intracerebral inoculation in a newborn mouse.
Darauf wird das Virus zentrifugiert, auf sterilisierten Filtern filtriert und nach der KonditionierungThe virus is then centrifuged, filtered on sterilized filters and after conditioning
durch Gefriertrocknung in Gegenwart eines durch Lactose gebildeten Stabilisators in Ampullen gefüllt. Einige Kolben werden für eine neue bakteriologische Überprüfung und für die üblichen Versuche auf die Wirksamkeit des lebenden nicht inaktivierten Impfstoffs verwendet.filled into ampoules by freeze-drying in the presence of a stabilizer formed by lactose. Some flasks will be used for a new bacteriological examination and for the usual experiments the effectiveness of the live non-inactivated vaccine used.
VergleichsversucheComparative experiments
Es wurden Versuche an Mäusen nach dem klassisehen NIH-Test (»Die Tollwut«, Laboratoriumstechnik, OMS Monographiereihe Nr. 23,1967, S. 151) mit bekannten Vaccinen und einer erfindungsgemäß hergestellten Vaccine, die auf einer Kultur der Zellen der Linie NIL erhalten wurden (als NIL bezeichnet), durchgeführt. Die Ergebnisse, ausgedrückt durch die 5O°/oige Schutzdosis DP 50, sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.Experiments were carried out on mice according to the classic NIH test (»Die Tollwut«, laboratory technology, OMS Monograph Series No. 23, 1967, p. 151) with known vaccines and a vaccine produced according to the invention, which is based on a culture of the cells of the Line NIL (referred to as NIL) were performed. The results, expressed by the 50% protective dose DP 50 are listed in Table I below.
Weiterhin wurde gemäß dem klassischen Serumneutralisationstest (»Die Tollwut«, Laboratoriumstechnik, OMS Monographiereihe Nr. 23, 1967, S. 173) eine Versuchsreihe bei Hunden durchgeführt, die mit erfindungsgemäß hergestellten und bekannten Vaccinen geimpft worden waren. Der Antikörpertiter wurde 28 bzw. 14 Tage nach.einer Einzelinjektion bestimmt. Es wurden folgende in Tabelle II aufgeführte Ergebnisse erhalten. ■ ·'Furthermore, according to the classic serum neutralization test ("Die rabies", laboratory technology, OMS Monographiereihe No. 23, 1967, p. 173) carried out a series of experiments in dogs that had been vaccinated with vaccines produced according to the invention and known. The antibody titer was determined 28 and 14 days after a single injection. The following were listed in Table II Get results. ■ · '
Es ergibt sich aus Tabelle I, daß die 5O°/oige Schutzdosis bei einer erfindungsgemäß hergestellten Vaccine wesentlich schwächer als bei bekannten Vaccinen ist.It can be seen from Table I that the 50% protective dose is significantly weaker in a vaccine produced according to the invention than in known vaccines.
Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß der Antikörpertiter bei einer erfindungsgemäß hergestellten Vaccine sehr viel höher als bei bekannten Vaccinen liegt, selbst wenn sie um das Hundertfache verdünnt ist.From Table II it can be seen that the antibody titer in a vaccine prepared according to the invention is much higher than in known vaccines, even if it is diluted a hundred times.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR111547 | 1967-06-22 | ||
| FR111547 | 1967-06-22 | ||
| DEJ0035056 | 1967-11-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1617549A1 DE1617549A1 (en) | 1972-03-16 |
| DE1617549C true DE1617549C (en) | 1973-04-19 |
Family
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