DE1617549C

DE1617549C - Verfahren zur Herstellung eines Impf Stoffs gegen Tollwut

Info

Publication number: DE1617549C
Application number: DE19671617549
Authority: DE
Inventors: Robert Caluire Petermann Horst Georg Dr med vet Branche Robert Dr Lyon Soulebot Jean Paul Dr med Caluire Mackowiak Czeslaw Dr Lyon Lang, (Frankreich)
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1967-06-22
Filing date: 1967-11-17
Publication date: 1973-04-19

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen die Tollwut, der einen erhöhten Titer an Lebendviren oder an Antigen aufweist, ohne Gefahr verwendet werden kann und einen stark erhöhten Impfschutz sichert.

Es ist bekannt, einen Impfstoff gegen die Tollwut durch Kultivieren eines Stammes von Tollwutviren auf einer Zellkultur einer Zellinie aus einem Organ eines Tieres der Familie der Nagetiere oder Hühnervögel herzustellen. Hierbei wird ein serumhaltiges Substrat verwendet, entsprechend der allgemeinen Meinung, daß sich das Tollwutvirus vorteilhaft in einem albuminhaltigen Milieu entwickelt und das Serum die einzig wirtschaftlich verwendbare Albuminquelle darstellt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich ein Impfstoff gegen die Tollwut auf den genannten und noch anderen Zellkulturen herstellen läßt, die nur im ersten Teil der Kultur Serum enthalten, nicht aber im letzten Teil der Kultur. Hierdurch wird nicht nur eine höhere Virusausbeute erreicht, sondern es wird ein Impfstoff erhalten, der keinSerumalbumin mehr enthält, das als Ursache für zahlreiche Schwierigkeiten und Unfälle bei der Impfung gegen die Tollwut angesehen werden muß.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen die Tollwut durch Kultivieren eines Stammes von Tollwutviren auf einer Zellkultur einer Zellinie aus einem Organ eines Tieres der Familie der Nagetiere oder Hühnervögel ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur auf diesen Zellen oder außerdem auf Zellen eines Tieres der Familie der Mardertiere (Mustelideae) oder auf einem Zellenstamm oder einer Primärzellenkultur eines Primaten zunächst in einem serumhaltigen Milieu und den letz- !en Teil der Kultur in einem entsprechenden, kein Selum enthaltenden Milieu durchführt. Nach dem Zerkleinern des Zellengewebes wird die überstehende Flüssigkeit zur Verwendung als lebender Impfstoff abgetrennt oder gegebenenfalls mittels eines Inaktivierungsmittels wie //-Propiolacton, Glycidaldehyd oder Formol inaktiviert. Gegebenenfalls wird der Impfstoff vorzugsweise durch Gefriertrocknung konserviert, um seine Haltbarkeit zu verbessern.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Impfstoff mit inaktivierten Viren vom Virusstamm Pasteur hergestellt, der an die für die Kultur verwendeten Zellen adaptiert worden ist.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird ein Impfstoff mit Lebendviren ausgehend von einem modifizierten Virusstamm, der unter der Bezeichnung Flury H.E.P. bekannt ist, hergestellt (H. K op ro w ski, J.Black, D. J. N e 1 s e η , Studies on chick embryo adapted rabies virus VI — Further changes in pathogenic properties following prolonged cultivation in the developping chick embryo. J. Immunol., Bd. 72, [ 1954], S. 94).

Die als Viruskultur dienende ZellenkuHur wird vorzugsweise unter den Zellinien von Organen der Mardertiere (Mustelideae) und besonders denen der Nagetiere wie Maus, Ratte und Hamster, z. B. der Haut, der Lunge oder den Nieren dieser Tiere, ausgewählt.

Man kann z. B. gemäß der Erfindung Zellinien verwenden, die unter der Bezeichnung BHK (M. Stoker, I. MacPherson, Syrian Hamster fibroblast cell line BHK 21 an its derivatives. Nature, 1964, Bd. 203, Nr. 4952, S. 1355 bis 1357) oder unter der BezeichnungNIL (L. Diamond, Two spontaneously transformed cell lines derived from the same hamster embryo culture-Internation. J. of Cancer, Bd. 2, 1967, S. 143 bis 152) bekannt sind oder eine andere Zelllinie, die von Nierenzellen vom Hamster und besonders vom jungen Hamster abstammt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens muß zunächst auf bekannte Weise der Virusstamm an die zur Kultur dienenden Zellen adaptiert werden.

Der in erster Stufe verwendete Nährboden kann z. B. eine isotonische Salzlösung, die Aminosäuren, Vitamine, Zucker und ein Serum enthält, beispielsweise ein Nährboden nach Stock er, McPherson, sein.

Die Viruskultur kann auf einer Zellensuspension in einem Nährboden, aber auch auf einer Glaswand, im stehenden oder vorzugsweise im sich drehenden Kolben, durchgeführt werden.
Zu Beginn wird die Kultur in einem serumhaltigen Medium z. B. etwa 48 Stunden lang bei einer Temperatur von 34 bis 38° C durchgeführt. Das in dem Kulturnährboden enthaltene Serum muß den Zellen angepaßt sein. Hier wird die Kultur in einem zweiten serumfreien Medium fortgesetzt, dessen Volumen bedeutend kleiner, z. B. zehnmal kleiner als das Volumen des ersten Mediums ist.

In diesem zweiten Nährboden ohne Serum kann die Kultur z. B. 24 bis 48 Stunden fortgesetzt werden. Die Gesamtkulturdauer entspricht dann etwa 72 bis 96 Stunden.

Gemäß einer-bevorzugten Verfahrensweise ändert man zu Beginn der Kultur den pH-Wert durch Einleitung einer ausreichenden Menge von Kohlendioxyd in das Nährmedium, um dessen pH-Wert auf einen optimalen Wert nahe 7 zu bringen.

Wenn die Kultur beendet ist, werden die Zellen in üblicher Weise gefroren und wieder aufgetaut und danach in einer Flüssigkeit, die vorteilhaft durch die überstehende Flüssigkeit des Kulturmediums gebildet sein kann, zerkleinert. Die Zellenreste werden durch Abzentrifugieren abgetrennt.

Die Inaktivierung der Viren erfolgt gegebenenfalls

. vorzugsweise durch Zusatz von /J-Propiolacton bis zu einer Verdünnung zwischen 1 : 1000 und 1 : 6000 Volumteilcn. Sie kann bei Temperaturen zwischen beispielsweise 0 und 37° C innerhalb einiger Stunden bis zu mehr als 24 Stunden durchgeführt werden. Bei 0° C erhält man in 24 Stunden eine ausreichende In-

aktivierung mit /J-Propiolacton in einer Verdünnung von 1 : 5000 Volumteilen. In 16 Stunden bei 18° C wird bei gleicher Verdünnung das gleiche Ergebnis erzielt.

Mit einer Verdünnung von 1 :2000 kann man mit ß-Propiolacton das Virus in 3 Stunden bei 25° C inaktivieren, wogegen die gleiche Inaktivierung bei einer Temperatur von 37° C mit einer Verdünnung von 1 : 4000 nach 2 Stunden erhalten wird.

Die Verwendung von /3-Propiolacton für die Inaktivierung des Virus ist mit Rücksicht auf die gute Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse bevorzugt.

Der hergestellte Impfstoff wird in üblicher Weise gefriergetrocknet. Vor der Gefriertrocknung oder bei der Anwendung wird vorzugsweise dem Impfstoff eine Flüssigkeit hinzugefügt, die eines der üblichen Potenzierungshilfsmittel enthält, z. B. ein Mineralöl oder ein mit Dianhydromannitmonooleat emulgiertes öl oder ein Produkt auf der Basis von Erdnußöl und Aluminiumstearat.

Man kann auch als Zusatz eine Aluminiumhydroxydlösung verwenden, die etwa 2 °/o reines A1.,O₃ oder außerdem Aluminiumphosphat AlPO₄ in einer Konzentration von 1 % enthält. Diese beiden Zusatzmittel werden z. B. in Mengen von 1 mg pro Milliliter Impfstoff verwendet.

Zur Erläuterung der Erfindung werden im folgenden mehrere Ausführungsformen beschrieben.

30 Beispiel 1

Man stellt eine Suspension einer Zellenkultur der Zellinie NIL mittels Trypsin her. Diese Suspension wird durch Zugabe von fixierten Tollwuterregerviren infiziert. Sie wird dann auf Kulturkolben verteilt, die einen Nährboden von McPherson-Stoker enthalten und in den Brutschrank bei einer Temperatur von 37° C gelegt.

Sobald das Zellenbett fließt, werden die infizierten Zellen mittels Trypsin aus dem Glas entfernt und mit einer nicht infizierten Zellensuspension im Verhältnis von 1 Volumen infizierte Zellensuspension zu 3 bis 4 Volumen nicht infizierter Zellensuspension gemischt.

Diese Mischung wird darauf in feststehende oder drehende Kulturkolben unter Zusatz eines frischen Nährbodens wie oben verteilt. Die Kolben werden im Brutschrank auf einer Temperatur von 37° C gehalten.

Ein aliquoter Teil der Suspension der so erhaltenen Zellen wird entnommen und auf Objektträgern in Petrischalen kultiviert, um die Virusinfektion zu kontrollieren.

Nach einer Zeit von allgemein zwischen 48 und 60 Stunden stellt man das Vorhandensein von spezifisehen intracytoplasmischen Einschlüssen bei verschiedenen Schnitten fest.

Der Ausgangskulturnährboden wird dann durch einen neuen, von Serum befreiten Nährboden im Verhältnis von 1 Volumen neuen Nährbodens zu 10 Volumen des eliminierten Nährbodens ersetzt. Der pH-Wert des Nährbodens wird durch Einleiten von Kohlendioxyd auf einen Wert von 7 gebracht.

Die Kolben werden während nochmals 20 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 37° C aufbewahrt und dann bei — 30° C gefroren.

Die virulente Flüssigkeit wird nach dem Auftauen und heftigem Schleudern der Kolben aufgefangen, um eine gute Trennung von der Zellenschicht zu erreichen.

Die virulente Flüssigkeit wird darauf zur Entfernung von Zellenresten zentrifugiert und dann über keimfreie Filter gefiltert. Die Überprüfung der Sterilität wird an verschiedenen Stadien vorgenommen. Darüber hinaus macht man eine Entnahme, die zur Bestimmung des Infektionsgehalts, durch intracerebrale Einimpfung an einer Maus und für die Reaktion auf die Fixierung des Komplementärstoffs verwendet wird.

Die Inaktivierung wird darauf durch im Verhältnis 1 : 4000 verdünntes ß-Propiolacton, das man während 24 Stunden bei einer Temperatur von 0° C und anschließend 2 Stunden bei 37° C einwirken läßt, vorgenommen.

Darauf wird der Impfstoff auf Ampullen abgefüllt und in Gegenwart von als Stabilisator wirkender Lactose gefriergetrocknet.

Die Überprüfung der bakteriologischen Sterilität und der absoluten Unschädlichkeit wird dann durch bekannte Versuche vorgenommen, um eine gute Inaktivierung und Wirksamkeit des Impfstoffs sicherzustellen.

Beisp iel 2

Ein Kolben, der eine Suspension diploider menschlicher Zellen (WI 38) enthält, wird durch Zugabe des Tollwuterregervirus HEP infiziert. Diese Suspension wird in zwei Kolben mit gleichem Fassungsvermögen, die mit Kulturnährboden von Eagle aufgefüllt werden, verteilt.

Am 3. oder 4. Tag vergewissert man sich von der Gegenwart der spezifischen Tollwuterregereinschlüsse in allen Zellen.

Die so infizierten diploiden Zellen werden nach der Trypsinbehandlung in eine Suspension gelegt und mit einer neuen diploiden nicht infizierten Zellensuspension vermischt. Diese Mischung wird z.B. im Verhältnis von einem Volumen infizierte Zellensuspension zu 10 Volumen nicht infizierter Zellensuspension vorgenommen; das ganze auf 20 Kulturkolben verteilt.

Die überstehende Flüssigkeit des anfänglich infizierten Kolbens wird gleichmäßig auf die 20 Kolben, von denen jeder mit neuem Eagle-Nährboden aufgefüllt wird, verteilt.

Ein aliquoter Teil der Mischung aus infizierten Zellen und nicht infizierten Zellen und überstehender infizierter Flüssigkeit wird entnommen und auf Objektträgern in Petrischalen kultiviert.

Am 2. oder 3. Tag der Kultur wird der Kulturnährboden durch einen neuen, das Serum nicht enthaltenden Nährboden ausgetauscht, wobei das Volumen des neuen serumfreien Nährbodens beispielsweise zehnmal kleiner als das Volumen des Ausgangsnährbodens ist.

Am 4. oder 5. Tag wird durch Immunfluoreszenz die Gegenwart von Einschlüssen von Tollwuterregern in allen Zellen sichergestellt.

Die Kulturkolben werden bei einer Temperatur von — 30° C gefrieren gelassen.

Das virulente Produkt wird aufgefangen und eine Entnahme gemacht, um die bakteriologische Sterilität und die Infektionskraft durch intracerebrale Einimpfung bei einer neugeborenen Maus zu prüfen.

Darauf wird das Virus zentrifugiert, auf sterilisierten Filtern filtriert und nach der Konditionierung

durch Gefriertrocknung in Gegenwart eines durch Lactose gebildeten Stabilisators in Ampullen gefüllt. Einige Kolben werden für eine neue bakteriologische Überprüfung und für die üblichen Versuche auf die Wirksamkeit des lebenden nicht inaktivierten Impfstoffs verwendet.

Vergleichsversuche

Es wurden Versuche an Mäusen nach dem klassisehen NIH-Test (»Die Tollwut«, Laboratoriumstechnik, OMS Monographiereihe Nr. 23,1967, S. 151) mit bekannten Vaccinen und einer erfindungsgemäß hergestellten Vaccine, die auf einer Kultur der Zellen der Linie NIL erhalten wurden (als NIL bezeichnet), durchgeführt. Die Ergebnisse, ausgedrückt durch die 5O°/oige Schutzdosis DP 50, sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I	Vaccine	Dosis	DP 50
Patas	2 ml	1/43
HDCS	2 ml	1/20 bis 1/100
FERMI	20 ml	1/2
HEMPT	10 ml	1/3
NIL	2 ml	1/500

Weiterhin wurde gemäß dem klassischen Serumneutralisationstest (»Die Tollwut«, Laboratoriumstechnik, OMS Monographiereihe Nr. 23, 1967, S. 173) eine Versuchsreihe bei Hunden durchgeführt, die mit erfindungsgemäß hergestellten und bekannten Vaccinen geimpft worden waren. Der Antikörpertiter wurde 28 bzw. 14 Tage nach.einer Einzelinjektion bestimmt. Es wurden folgende in Tabelle II aufgeführte Ergebnisse erhalten. ■ ·'

Tabelle II

	Ver	Dosis	Antikörperetiter	14 Tage nach
Vaccine	dünnung		28 Tage nach	einsr Einzel
			einer Einzel	injektion
	rein	2ml	injektion	3,20
Erfin- f	1/10	2 ml	2,08	2,90
dungs- I	1/100	2 ml	1,64	1,80
gemäß [	rein	10 ml	0,61	—
²⁰ HEMPT	rein	20 ml	0,10	0,45
FERMI		0

Es ergibt sich aus Tabelle I, daß die 5O°/oige Schutzdosis bei einer erfindungsgemäß hergestellten Vaccine wesentlich schwächer als bei bekannten Vaccinen ist.

Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß der Antikörpertiter bei einer erfindungsgemäß hergestellten Vaccine sehr viel höher als bei bekannten Vaccinen liegt, selbst wenn sie um das Hundertfache verdünnt ist.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen die Tollwut durch Kultivieren eines Stammes von Tollwutviren auf einer Zellkultur einer Zellinie aus einem Organ eines Tieres der Familie der Nagetiere oder Hühnervögel, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur auf diesen Zellen oder außerdem auf Zellen eines Tieres der Familie der Mardertiere (Mustelideae) oder auf einem Zellenstamm oder einer Primürzellenkultur eines Primaten zunächst in einem serumhaltigen Milieu und den letzten Teil der Kultur in einem entsprechenden, kein Serum enthaltenden Milieu durchführt.