DE1617288B - Verfahren zur Herstellung eines Gnppe Virusimpfstoffs - Google Patents

Description

Tabelle I

	Behandlung	Anti-HA-Titer (log10-Einheiten/ml)	300	Primär	30 000	'ür verschiedene	Impfstoffdosen*	')	30 000
Virus			HA-Einheiten	3000	HA-Einheiten		Sekundär		HA-Einheiten
		3,21	HA-Einheiten	n. U.	300	3000	n. u.
	Intakt	3,00	3,54	3,63	HA-Einheiten	HA-Einheiten	4,29
SW	Sub-Einheit	3,06	3,30	3,63	4,47	4,47	3,99
	Intakt	1,89	3,30	3,27	4,20	4,38	3,78
BEL	Sub-Einheit	3,00	3,21	4,02	4,02	4,11 ·	4,59
	Intakt	2,10	3,48	3,42	2,79	3,84	3,96
AS	Sub-Einheit	3,24	4,41	4,53
		3,27	4,11

*) Die Zahlen sind die geometrischen Mittelwerte für Gruppen von sechs Kaninchen am 21. 25., 36 (primäre Reaktion) und 42. und 49. (sekundäre Reaktion) Tag.
n. u. = Nicht untersucht.

Diese Ergebnisse zeigen, daß der nach der Vorschrift dieses Beispiels hergestellte Impfstoff antigen ist.

Die Antisera, die durch Immunisierung von Kaninchen mit Grippevirussubeinheitsimpfstoffen, die wie oben angefertigt wurden, hergestellt worden waren, unterschieden sich in der Aktivität und der Neutralisierungspotenz nicht von Antisera, die durch Immunisierung von Kaninchen mit intakten Grippeviren hergestellt worden waren. In ähnlicher Weise zeigten die Antikörper, die in den Kaninchen durch jede der Impfstofftypen induziert worden waren, die gleichen Kreuzreaktionen.

Beispiel 2

Herstellung von zweiwertigen Grippevirussubeinheitsimpfstoffen durch Desoxycholatbehandlung und Demonstration ihrer Immunogenität bei Mäusen.

Die unten beschriebenen Verfahren wurden getrennt auf die folgenden Stämme von Grippeviren angewendet: A²/S A/64 (A2/64), ein typischer A²-Stamm, der 1964 in Australien isoliert wurde; B/Vic/65 (B/65), ein Stamm der Type B, der in Australien 1965 isoliert wurde. Beide Stämme sind bei der Herstellung von handelsüblichen Grippevirusimpfstoffen in Gebrauch.

Die Viren wurden in der Allantoishohle von 10 Tage alten embryonalen Einer gezüchtet. Der Virus wurde von der abgekühlten Allantoisflüssigkeit durch Hindurchleiten durch Sharples-Superzentrifugen abgetrennt, in einem Phosphatpuffer wieder suspendiert und mit Formaldehyd inaktiviert. Die Viruskonzentrate enthielten 4 470 Kückenzellenagglutinationseinheiten (C. C. A.-Einheiten) bzw. 12 100 C. C. A.-Einheiten (ΙΟ⁴·⁷⁰ bzw. 10⁵'²⁶HA-Einheiten).

Zu jedem wurde ein Volumen einer 5°l^gen Natriumdesoxycholatlösung gegeben, die einem Viertel des Volumens des Viruskonzentrats entsprach. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 37° C stehengelassen und dann bei einem pH von 8,2 gegen einen Kaliumdihydrogenphosphat-Puffer dialysiert, der Formaldehyd enthielt, bis die Natriumdesoxycholatkonzentration der Impfstoffe einen unfeststellbaren Wert erreichte. Geeignete Volumina.eines jeden Subeinheitsimpfstoffs wurden dann gemischt und verdünnt mit Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung, so daß jeder ml des endgültigen Gemischs das Äquivalent von 300 C. C. A.-Einheiten des ursprünglichen Impfstoffs mit intaktem Virus einer jeden Type enthielt.

Ein ähnliches Gemisch von Präparationen mit intaktem Virus wurde hergestellt, wobei es auch in diesem Fall 300 C. C. A.-Einheiten einer jeden Type je ml enthielt.

Tabelle II

Virus-	Zweiwertige	Anti-HA-Titer (log10 <	Sub-Einheit	Intakt	des Reziprokwerts)*)	Sub-Einheit	Intakt
staxnm	Impfstoff	Primär	2,13	2,52	Sekundär	3,41	3,16
	verdünnung	1,84	2,27	3,15	3,11
Α2/64	Unverdünnt	1,86	2,04	2,82	2,91
	1:2	1,59	1,85	2,72	2,85
	1:4	(5/9)0**)	1,73	2,50	2,70
	1:8	(6/10)**)	1,44 (9/10)	2,32	2,46
	1:16	2,29	2,35	3,38	3,02
	1:32	2,04	2,15	3,19	2,91
Β/65	Unverdünnt	2,13	2,03	3,10	2,76
	1:2	1,89 (9/10)	1,84	2,97	2,61
	1:4	1,42 (7/10)	1,67	2,54	2,37
	1:8	1,57 (8/10)	1,60 (7/10)	2,64	2,33
	1:16
	1:32

*) Die Zahlen sind die geometrischen Mittelwerte für Gruppen von 10 Mäusen von Blutentnahmen, die am 20. Tag (Primärreaktion) und am 32. Tag (Sekundärreaktion) entnommen worden waren.

0 Wo nicht alle Mäuse in einer Gruppe einen entdeckbaren Antikörper bei einer 1: 20-Verdünnung der Sera hatten, ist die Anzahl der reagierenden Tiere als Zähler angegeben.

**) Unzureichende Tierreaktion, um einen gültigen geometrischen Mittelwerttiter zu bestimmen.

Zweifach-Verdünnungen eines jeden dieser endgültigen Impfstoffe über einen Bereich Vöii Unverdünnt bis l,32fach wurden für die Einimpfung in Mäuse hergestellt. Gruppen von 10 Mäusen wurden mit 0,25 ml einer jeden Verdünnung eines jeden Impfstoffs injiziert, worauf 20 Tage später eine Blutentnahme vorgenommen wurde. Jede Maus erhielt eine zweite Dosis am 21. Tag, und am 32. Tag wurde abermals eine Blutentnahme vorgenommen.

Die Antihämagglutintiter der Sera einer jeden Maus wären wie in Tabelle ΙΓ angegeben:

Die Ergebnisse zeigen, daß der nach der Vorschrift in diesem Beispiel hergestellte Impfstoff antigen ist.

Aus dem Obigen geht hervor, daß die vorliegende Erfindung ein-V-erfaMen^'-schäfftj-das-die beim älteren Verfahren, auf tretenden gefahren, nicht besitzt, wobei es gleichzeitig -^!die ftersteilungieines Grippevirusimpfstoffs erlaubt, der immunögeri und gleichzeitig in minimalern Ausmaß reäktogeh ist.

Claims (1)

1 2

Tier antigen ist und seine spezifische Toxizität verloren

Patentanspruch: hat. Jedoch bringt die Verwendung von Äther in

großtechnischen Verfahren Gefahren mit sich, und es

Verfahren zur Herstellung eines antigenen, nur besteht deshalb ein Bedarf für ein weiteres Verfahren, noch wenig reaktogenen Grippevirussubeinheiten- 5 bei welchem die unerwünschten, mit der Verwendung impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, von Äther verknüpften Gefahren vermieden werden daß man eine Suspension von Grippeviren bei können.

einem pH von 7,5 bis 8,2 und einer Temperatur von Der vorliegenden Erfindung lag demgemäß die Auf-

20 bis 37° C mit einem löslichen Salz der Desoxy- gäbe zugrunde, ein solches verbessertes Verfahren zur cholsäure versetzt, bis die Virussuspension eine io Herstellung eines Grippevirussubeinheitsimpfstoffs, Konzentration von 0,5 bis 2% Desoxycholat ent- der antigen, jedoch nicht toxisch ist, zur Verfügung zu hält, 1 bis 60 Minuten stehenläßt und anschließend stellen.

durch Dialyse die Konzentration des Desoxychol- So wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Ver-

säuresalzes auf weniger als 0,01 % senkt. fahren zur Herstellung eines antigenen, nur noch wenig

15 reaktogenen GrippevirussubeinheitenirnpfStoffs vorgeschlagen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

eine Suspension von Grippeviren bei einem pH von

7,5 bis 8,2 und einer Temperatur von 20 bis 37°C mit einem löslichen Salz der Desoxycholsäure versetzt, bis

Damit ein Impfstoff auf dem Gebiet der vorbeugen- 20 die Virussuspension eine Konzentration von 0,5 bis den Medizin von maximalem Wert ist, ist es nötig, daß 2 % Desoxycholat enthält, 1 bis 60 Minuten stehenläßt er in hohem Maße immunogen und nur in einem ge- und anschließend durch Dialyse die Konzentration ringen Maße reaktogen ist. des Desoxycholsäuresalzes auf weniger als 0,01 %

Bei einem inaktivierten Virusimpfstoff ist die Immu- senkt.

nogenität selbstverständlich die wichtigste Eigenschaft; 25 Vorzugsweise wird als Salz der Desoxycholsäure beim sie ist eine Funktion der antigenen Masse, die in einer erfindungsgemäßen Verfahren Natriumdesoxycholat Dosis des Impfstoffs vorhanden ist. verwendet.

Bei parenteralen ■ Verabreichungen können beim Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele

Menschen durch eine Anzahl von Faktoren in einem näher erläutert
Impfstoff Reaktionen hervorgerufen werden. Einige 30

derselben sind: (a) das Zellensystem, das für die Kulti- Beispiell

vierung des Virus verwendet worden ist; beispielsweise

können allergene Reaktionen bei Menschen, die gegen- Herstellung von Grippevirussubeinheitsimpf stoff en

über Eiern empfindlich sind, durch Impfstoffe hervor- durch Desoxycholatbehandlung und Demonstration gerufen werden, die aus in embryonalen Eiern gezüch- 35 ihrer Immunogenität bei Kaninchen,
teten Viren hergestellt worden sind; (b) pyrogene Sub- Die unten beschriebenen Verfahren wurden ge-

stanzen im Impfstoff; beispielsweise rufen lebensfähige trennt auf die folgenden Stämme von Grippeviren an-Grippeviren pyrogene Reaktionen hervor; (c) toxische gewendet: Swine (SW), Stamm 15 von Shope; BEL ein Substanzen, die mit den Mikroorganismen verbunden schnellwachsender Stamm der Type A; und Asian AS sind, von denen der Impf stoff hergestellt wird, wie z. B. 40 (A²/AA/23/57), ein typischer A²-Stamm vom Strain die spezifische toxische Substanz, die mit intakten Study Centre, Commission on Influenza, School of Grippeviruspartikelchen verbunden ist. Public Health, Ann Arbor, USA.

Die Reaktogenität eines Impfstoffs kann modifiziert Die Viren wurden in der Allantoishohle von 11 Tage

oder beseitigt werden, indem man beispielsweise den ... alten embryonalen Eiern gezüchtet und teilweise durch Impfstoff zur Entfernung nicht spezifischen Proteins 45 Adsorptions-Elution an Kückenerythrocyten gereinigt reinigt oder indem man pyrogenfreie Verdünnungs- und nachfolgend differenziert zentrifugiert. Die fertigen flüssigkeiten verwendet oder indem man die Dosis Viruspräparationen (welche in keiner Weise rein waren) durch Kontrolle der verabreichten antigenen Masse wurden in 0,15 Natriumchlorid mit einem Gehalt von beschränkt. 0,01 m Trispuffer und einen pH-Wert von 7,5 in einer

Bei Grippevirusimpfstoffen kann der Eiproteingehalt 50 Konzentration von annähernd ΙΟ⁵·⁶⁰ Hämagglutineindurch Zentrifugierung auf einen annehmbaren Wert heiten (HA) je ml suspendiert.

verringert werden, und die mit den lebensfähigen Viren Jede Suspension der Viruspartikelchen (2,0 ml)

verbundene Pyrogenität kann durch Inaktivierung mit wurde mit einer 5°/oigen Lösung von Natriumdesoxyeinem Mittel, wie z. B. Formaldehyd, beseitigt werden. cholat (0,5 ml) gemischt, worauf das Gemisch 5 Minu-Es verbleibt jedoch, noch die spezifische Toxizität, die 55 ten bei 35° C stehengelassen wurde. Das Gemisch mit den intakten, obwohl inaktivierten Virusteilchen wurde dann gegen Wasser dialysiert, um die Konzenverbunden ist, welche die Wirksamkeit des Impsftoffs tration des Natriumdesoxycholats auf weniger als bei Erwachsenen beschränkt und seine Verwendung bei 0,01 % zu reduzieren.

Kindern kontraindiziert. Diese unerwünschten Be- Die Impfstoffe wurden dann für die Injektion in

schränkungen haben ihren Grund in der Tatsache, daß 60 Kaninchen entsprechend verdünnt,
ein Grippevirusimpfstoff, dessen Antigengehalt auf Gruppen von sechs Kaninchen wurden mit 300,

einen Wert herabgesetzt ist, der in den meisten Fällen 3 000 oder 30 000 HA-Einheiten eines intakten SW-, von annehmbarer Reaktogenität ist, keine brauchbare BEL- oder AS-Virus und entsprechenden Verdünnun-Immunogenität zeigt. gen der behandelten Impfstoffe geimpft. Jedes Kanin-

Es ist bekannt, daß die Behandlung von Myxoviren, 65 chen wurde 35 Tage nach Verabreichung der ersten einschließlich der Influenzaviren, mit Äther die Dosis mit einer zweiten Dosis geimpft.
Viruspartikelchen in Subeinheiten spaltet. Es wurde Die Antihämagglutinintiter der Sera von den

gezeigt, daß das erhaltene Material bei Mensch und Kaninchen waren wie in Tabelle I angegeben.