DE1695329C - Verfahren zur Herstellung von 5-Purinnucleotiden durch Fermentation von Mikroorganismen in Gegenwart von Antibiotica oder oberflächenaktiven Substanzen. Ausscheidung aas: 1570022 - Google Patents

Description

^{1 2}

Verfahren zurv Herstellung von 5'-Purinnucleotiden Im Rahmen der Erfindung werden Antibiotics, wie

aus Purinbasen ;durch Fermentierung von Mikro- Penicillin, Mitomycin, Streptomycin, Cycloserin, Ba-

organismen sind aus den französischen Patentschriften citracin, Tetracyclin, Hydroxytetracyclin, Chlortetra-

849 519 und I 301 052 bekannt. Jedoch ergeben die cyclin, Carzinophilin (Antibioticum aus Strep. Saha-

bekannten Verfahren nur geringe Ausbeuten an dem 5 chiroi-KuIturen), Kanamycin oder Neomycin benutzt,

gewünschten 5'-Purinnucleotid. Besonders wirksam sind Mitomycin, Penicillin,Strepto-

Demgegenüber befaßt sich die Erfindung mit einem mycin und Cycloserin.

Fermentationsverfahren zur Herstellung von 5'-Purin- Im allgemeinen wird das Antibioticum bei Beginn nucleotiden, wie 5'-lnosinsäure, 5'-Xanthylsäure, der logarithmischen Wachstumspenode der Mikro-5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure in wirtschaftlich io Organismen, wenn deren Zunahme üblicherweise ausgünstiger Weise im Industriemaßstab aus Purinbasen. nehmend stark ist, zugefügt. Jedoch wird eine weitere

Geeignete Basen sind z. B. Hypoxanthien, Guanin Zunahme an gewünschtem Produkt dann erzielt, und Adenin. Die Basen können als solche oder als wenn das Antibioticum kurz nach der obengenannten Nucleoside oder in Naturprodukten, die Basen bzw. Periode bei normalem Wachstum der Bakterien zuge-Nucleoside enthalten, vorliegen. Die erfindungsgemäß 15 fügt wird, und es erfolgt dann eine ausgezeichnete Anverwendeten Mikroorganismen sind Brevibacterium reicherung.

ammoniagenes ATCC 6871 und 6872 und Micro- Gemäß der Erfindung können die vorstehenden mit

coccus sodonensis ATCC 15 932. Antibiotica erzielbaren Ergebnisse, d.h. die Unter-

Die Erfindung befaßt sich mit einer Verbesserung drückung des übermäßigen Bakterienwachstums zu-

der bei der fermentativen Herstellung von 5'-Purin- 20 gunsten der Bildung von 5'-Purinnucleotid, statt durch

nucleotiden mit Brevibacterium ammoniagenes oder Zugabe von Antibiotica auch durch die Verwendung

Micrococcus sodonensis auftretenden Verminderung von oberflächenaktiven Substanzen im Fermentations-

dcr Ausbeute des angestrebten Produktes infolge über- medium erreicht werden.

mäßiger Zunahme von Mikroorganismen wegen der Die Bildung der gewünschten Produkte wird ferner

Anwesenheit zu großer Mengen wachstumsfördernder »5 dadurch erhöht, daß oberflächenaktive Mittel nicht

Substanzen. Diese Erscheinung ist um so leichter zu nur im Falle übermäßigen Bakterienwachstums zuge-

beobachten, wenn Nährstoffe mit großem Gehalt an fügt werden, sondern auch, ähnlich wie bei der Be-

wachstumsfördernder Substanz, z. B. einige Arten handlung mit Antibiotica, wenn 5'-Purinnucleotid

Maisquellwasser, Reiskleie oder Fischextrakte ver- ausgezeichnet entwickelt wird,

wendet werden. 30 Als oberflächenaktive Mittel können solche mit

Ebenso wie die übermäßige Zugabe von Amino- kationischen, anionischen, amphoteren oder nicht säurequellen verursacht die Zufügung kleiner Mengen ionischen Eigenschaften verwendet werden. Kationenvon Substanzen, wie Mangansalz oder Eisensalz, in aktive Substanzen sind am wirkungsvollsten, dann einer über einem bestimmten Wert liegenden Konzen- folgen nichtionische Substanzen, und etwas weniger tration zum Kulturmedium, welches Pantothensäure 35 wirkungsvoll sind anionenaktive Stoffe. Beispiele für und Thiamin enthält, ungewöhnliches Bakterienwachs- kationenaktive Stoffe sind Polyoxyäthylenalkylamin, turn und damit geringe Bildung von 5'-Purinnucleotid. Cetylpyridinchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid Aus wirtschaftlichen Gründen werden als Quelle für und Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid. Beispiele AminosäurenzweckmäßigerweisebilligeNaturprodukte für nichtionische oberflächenaktive Stoffe sind Gebenutzt. Einige dieser Naturprodukte enthalten jedoch 40 mische aus 40% Polyoxyäthylen und 60% PoIyauch erhebliche Mengen Eisen- oder Mangansalz. propylen oder aus 10% Polyoxyäthylen und 90%

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung Polypropylen.

von 5'-Purinnucleotiden durch Fermentation von Im allgemeinen empfiehlt es sich, die oberflächen-

Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium, aktiven Mittel relativ spät in der Periode des logärith-

das neben üblichen Mengen an Kohlenstofflieferanten, 45 mischen Wachstums der Mikroorganismen — im

Stickstoffquellen, anorganischen Salzen und Vitamin H Falle übermäßig starker Zunahme — zuzufügen,

auch größere Mengen wachstumsfördernder Substan- Wenn z. B. das maximale Wachstum 30 mg/ml,

zen sowie Eisen- und Mangansalze enthalten kann, bezogen auf getrocknete Bakterienzellen, ausmacht,

in Gegenwart einer dem 5'-PurinnucIeotid entsprechen- so ist es zweckmäßig, die Substanz bei zwei Drittel

den Purinbase als Vorläufer ist dadurch gekennzeich- 50 dieser Größe, d. h. bei etwa 20 mg/ml, zuzugeben,

net, daß man als Mikroorganismen Brevibacterium Die Zunahme des zu gewinnenden Produkts wird

ammoniagenes ATCC 6871 und 6872 oder Micro- weiter erhöht, wenn man die oberflächenaktiven

coccus sodonensis ATCC 15 932 verwendet und dem Substanzen zu einem späteren als dem obengenannten

Fermentationsmedium ein Antibioticum oder eine Zeitpunkt zufügt, also kurz danach,

oberflächenaktive Substanz in der Periode des loga- 55 Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung an

rithmischen Wachstums oder Mikroorganismen oder Hand bevorzugter Ausführungsformen. Falls nichl

kurz danach zugibt. anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben

Erfindungsgemäß wird somit die unerwünschte Ent- in den folgenden Beispielen auf das Gewicht prc

wicklung von Mikroorganismen ohne ausreichende Volumen Fermentationsmedium.

Erzeugung der 5'-Purinnucleotide verhindert, indem 60

die Fermentation in einem Fermentationsmedium mit Beispiel 1

zugefügten Antibiotica oder oberflächenaktiven Mit- Als Impfbaktcrium wird Brevibacterium ammonia-

teln ausgeführt wird, wodurch die Erzeugung von genes (ATCC 6872) 24 Stunden in einem Kultur-

5'-Purinnucleotid erhöht wird. Die Anwesenheit von medium aus 2% Glucose, 1,5% Pepton, 0,2% Harn

Antibiotica ist für eine Maximalerzeugung von 5'-Pu- 6₅ stoff, 0,Γ'/₀ K₂HPO₄, 0,03% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,3"/,

rinnucleotid auch dann zweckmäßig, selbst wenn keine NaCl, 0,01% FeSO₁ · 7 H₂O und 30 y/l Vitamin H

Bedingungen vorliegen, die ein übermäßiges Wachs- (Restprozente — Wasser), pH = 7,3, kultiviert. Dam

turn von Mikroorganismen begünstigen. werden 10 Volumprozent dieser Impfkultur auf eir

Fermentationsmedium übertragen. Beide Medien sind zuvor sterilisiert worden. Die Kultivierung wird bei 30⁰C unter Schütteln in einem Fermentationsmedium durchgeführt, das die folgende Zusammensetzung aufweißt: 10 "/„ Glucose, 1% K₈HPO₄, 1,3% KH₂PO₄, 1,1 % MgSO₄ · 7 H₂O, 0,01 °/₀ CaCl₂ · 2 H₈O, 30 y/1 Vitamin H, 5 y/ml Calciumpantothenat, 3 y/ml Thiaminhydrochlorid, 0,5% .Maisquellwasser, 3 mg/ml Hypoxanthin (Restprozente = Wasser). Der pH-Wert wird vor der Sterilisierung mit 5 n-NaOH auf 8,0 eingestellt. Nach der Sterilisierung wird zuvor sterilisierter Harnstoff in das Kulturmedium bis zu einem Gehalt von 0,6% gegeben. Die nachstehend angeführten Mengen Mitomycin C wurden in einzelnen Dosen nach einer bestimmten Kulturdauer zugegeben. Tabelle I gibt die nach 96stündiger Kultivierung in der Fermentationsflüssigkeit angesammelten Mengen 5'-Natriuininosinat an.

Tabelle 1	Mitom Zugabe zeit (Std.)	ycin C Zugabe mengen (V/ml)	Entstandene Mengen an 5'-Natriuminosinat*) (mg/ml)	Mengen getrockneter Bakterienzellen (mg/ml)
8	15 30	1,3 2,5	12,9 11,0
12	20 40	8,82 11,03	15,1 14,8
16	20 40	3,92 4,03	18,0 17,6
20	30 40	1,22 1,11	21,3 20,7
Keine Zugabe	Spuren	32,8

Penicillin G-Natrium	Zugabe
Zugabe	inenge
zeit	(r/ml)
(Std.)	5
8	10
	5
12	10
	50
	10
18	50
	Keine Zugabe

Entstandene

Mengen an

5'-Natriuminosinat*)

(mg/ml)

2,3
4,1

4,0
6,3

10,2

9,0
7,9

Spuren

Mengen

getrockneter

Bakterienzellen

(mg/ml)

13,3
13,0

15,9
15,9

14,2

19,1
18,3

38,2 tation und in verschiedenen Konzentrationen Cycloserin zugefügt. Die übrigen Kulturbedingungen bleiben dieselben wie im Beispiel 1. Nach 96 ständiger Kultur hat sich 5'-Natriuminosinat gebildet wie in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

*) Bestimmt als S'-Inosinsäuredinatriumsalz · 7¹/» H_aO.
Beispiel 2

Der Vorgang entspricht dem im Beispiel 1 angegebenen, außer, daß an Stelle von Mitomycin C hier zu verschiedenen Zeiten Penicillin G-Natrium zugefügt wurde. Die entstandenen Mengen an 5'-Natriuminosinat nach 120stündiger Kultivierung sind in Tabelle Il angegeben.

Tabelle Il

*) Bestimmt als 5'-Inosinsauredinatriumsalz · 7¹/» H_aO.
Beispiel 3

Es wird das gleiche Impfbakterium sowie das gleiche Fermentationsmedium wie im Beispiel 1 verwendet, jedoch statt Maisquellwasser 0,0005% MnSO₄ ■ 4 H₁₁O zugegeben. Ferner wird an Stelle von Mitomycin (Beispiel 1) zu verschiedenen Zeiten während der Fermen

Cycloserin	Zugabe
Zugabe	menge
zeit	(y/ml)
(Std.)	400
7	800
	1600
	800
10	1600
	2000
	800
13	1600
	2000
	Keine Zugabe

Entstandene

Mengen an'

5'-Natriuminosinat*)

(mg/ml)

5,3

•7,2

9,0

3,1

10,2

9,9

6,4 9,2 6,8

Spuren

Mengen

getrockneter

Bakterienzellen

(mg/ml)

13,8 12,0 12,2

•14,2 14,0 13,6

18,2 17,3 17,5

39,1

*) Bestimmt als S'-Inosinsäuredinatriumsalz - 7¹/* H₁O.

Beispiel 4

Es werden das gleiche Impfbakterium wie im Beispiel 1 und das Fermentationsmedium wie im Beispiel 3, jedoch ohne Hypoxanthin verwendet. Nach 48stündiger Kultivierung wird Guanin mit 3,0 mg/ml zugefügt. Dihydrostreptomycinsulfat wird als Antibioticum in unterschiedlichen Konzentrationen und zu verschiedenen Zeiten zugegeben. Die übrigen Kulturbedingungen entsprechen denen des Beispiels 1.

Tabelle IV zeigt die Bildung von 5'-Natriumguanylat nach 96stündiger Kultur.

Tabelle IV .

Dihydrostrepto-	sulfat Zugabe menge	Entstandene	Menffcn
mycin Zugabe zeit	(WmI)	Mengen an 5'-Natrium- guanylat*)	getrockneter Bakterienzellen
(Std.)	5	(mg/ml)	(mg/ml)
8	10	1,3	15,2
	50	2,6	14,9
	5	2,7	14,1
14	10	2,3	19,2
	50	4,4	18,1
	5	5,1	18,8
20	10	1,2	22,5
	50	1,2	23,0
	Keine Zugabe	2,0	21,6
Spuren	38,9

·) Bestimmt als S'-Guanylsäuredinatriumsalz.

Beispiel 5

Das gleiche Impfbakterium wie im Beispiel I und das Fermentationsmedium wie im Beispiel 4 werden verwendet. Nach 48stündiger Kultivierung werden 2,5 mg/ml Adenin zugegeben. Tetracyclin wird als Antibioticum in unterschiedlichen Konzentrationen zu verschiedenen Zeiten zugefügt. Die übrigen Kulturbedingungen entsprechen denen des Beispiels 1. Nach 96 Stunden sind die in Tabelle V aufgeführten Mengen 5'-Adenylsäure nachzuweisen.

Tabelle V

Tetracylin-Zusatz Zugabe- Zugabezeit menge (Std.) I (WmI)

1
2

1
2
5

1
2
5

Keine Zugabe

Entstandene

Mengen an

5'-Adenylsäure

(mg/ml)

1,1 2,3

2,1 4,1 1.9

.0,8 3,8 2,7

Spuren

Mengen

getrockneter

Bakterienzellen

(mg/ml)

17,1 16,8

18,1 15,3 14,2

13,1 12,9 13,0

40,2 Bei spi el 6

Es werden das gleiche Impfbakterium und das gleiche Fermentationsmedium wie im Beispiel 1 verwendet, jedoch Maisquellwasser durch 0,3% eines enzymatischen Gaseinhydrolysats ersetzt und die Hypoxanthinzugabe auf 4 mg/ml erhöht. Während der Kulturdauer werden bestimmte Konzentrationen von

ίο Penicillin G-Kalium, Mitomycin C und Dihydrostreptoiriycinsulfat zu bestimmten Zeiten zugegeben. Im übrigen sind die Kulturbedingungen wie im Beispieil. TabelleVI gibt die nach 120stündiger Kultivierung im Fermentationsmedium gefundenen Mengen 5'-Natriuminosinat wieder.

Tabelle VI

Antibioticum Art

Zugabe	Zugabe
zeit	menge
(Std.)	(WmI)
24	10
28	20
30	50
Keine	Zugabe

Entstandene	Mengen
Mengen an	getrockneter
5'-Natriuminosinat*)	Bakterienzellen
(mg/ml)	(mg/ml)
15,1	15,7
16,0	16,3
13,8	17,0
9,9	19,8

Penicillin-G-Kalium

Mitomycin C ...χ . ί Dihydrostreptomycihsulfat

*) Bestimmt als S'-lnosinsäuredinacriumsalz ■ 7 Vt H₁O.

Beispiel 7

Kanamycin

Zugabezeit (Std.)

Zugabemenge
WI

10
20
50

10 20 50

Mengen

getrockneter'

Bakterienzellen

(mg/ml)

12,0 11,5 10,1

14,5 13,1 13,3

Entstandene Mengen

an 5'-Natrium-

guanylat*)

(mg/ml)

0,9 2,9 1,3

2,0 3,9

5,2

Keine Zugabe 28,3 Spuren

*) Bestimmt als S'-Guanylsäuredinatriumsalz.

Beispiel 8

Impfbakterium: Micrococcus sodonensis (ATCC 15932); Kulturmedium: 2% Glucose, 0,5%> Hefeextrakt, 1,5% Pepton und 0,25% NaCl (Restprozente = Wasser), pH = 7,3; Fermentationsmedium: 10% Glucose, 0,6% K₂HPO₄, 0,6% MgSO₄ · 7H₂O,

65 0,01»/,

Impfbakterium: Brevibacterium ammoniagenes (ATCC 6871), Fermentationsmedium nach Beispiel Nach 50stündiger Kulturdauer werden 3,0 mg/ml Guanin zugegeben. Kanamycinsulfat wird in unterschiedlicher Konzentration nach 10 bzw. 15 Stunden zugesetzt. Die übrigen Kulturbedinguugen entsprechen denen des Beispiels 1. Tabelle VII gibt die nach 96 Stunden gewonnenen Mengen an 5'-Natriumguanylat wieder.

Tabelle VII

ο CaCl₂ · 2 H₂O, 5 y/ml Calciumpantothenat, 1 y/mlThiamin, 30 y/Vitamin H, 0,1% FeSO₄ · 7 H₂O, 1% Caseinaminosäuren, 0,6% Harnstoff und 2,5 mg/ ml Hypoxanthin (Restprozente = Wasser); pH-Wert = 8,0 vor der Sterilisation. Die übrigen Kulturbedingungen entsprechen denen des Beispiels 1. Nach lOstündiger Kultivierung wird Penicillin G-Kalium in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Die nach 96stündiger Kultur gefundenen Mengen an 5'-Natriuminosinat sind in Tabelle V3II wiedergegeben.

Tabelle VIIJ

Penicillin G-Kalium Zugabemenge (WmI)	Mengen getrockneter Bakterienzellen (mg/ml)	Entstandene Mengen an 5'-Natriuminosinat*] (mg/ml)
5 10 20 50 Keine Zugabe	19,3 18,2 14,3 14,1 30,8	4,1 5,8 7,2 7,0 Spuren

*) Bestimmt als S'-Inosinsäuredinatriumsalz · 7Vi H₂O.

Beispiel 9

Impfbakterium: Brevibacterium
(ATCC 6872); Kulturmedium: 2%

ammoniagenes Glucose, 2%

Pepton, 0,1% Harnstoff, 0,1% K₂HPO₄, 0,03% MgSO₄-7 H₂O, 0,3% NaCl, 0,01% FeSO-7 H₂O und 30y/ml Vitamin H (Restprozente = Wasser); Kulturdauer 24 Stunden; pH-Wert = 7,3. 10 Volumprozent dieses Impfmediums werden in ein Fermenta-

tionsmedium gegeben. Beide Kulturmedien sind zuvor sterilisiert. Das Fermentationsmedium besitzt die unten angegebene Zusammensetzung. Die aerobe Kultivierung wird bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt.

Zusammensetzung des Fermentationsmediums: 10% Glucose, 1% K₂HPO₄, l°/₀ KH₂PO₁, 1% MgSO₄-7 H₂O, 0,1 % CaCl₂ · 2 H₂O, 30 y/ml Vitamin H, 5 y/ml Calciumpantothenat, 3 y/ml Thiaminhydrochlorid, 4 mg/ml Hypoxanthin (Restprorente = Wasser). Der pH-Wert wird vor der Sterilisation mit 5 n-NaOH auf 8,0 eingestellt. Nach'der Sterilisation werden zu dem Fermentationsmedium 0,6% sterilisierter Harnstoff gegeben.

Nach 20, 24 und 48 Stunden Kulturdauer wird Polyoxyäthylenalkylamin in unterschiedlichen Kon zentrationen zugegeben. Die nach 120stündiger Kultivierung gewonnenen Mengen 5'-Natriuminosinat sind in Tabelle IX wiedergegeben.

Tabelle IX Beispiel 11

Es werden das gleiche Impfbakterium wie im Beispiel 1 und das Fermentationsmedium nach Beispiel 1 verwendet, das jedoch an Stelle von Maisquellwasser 0,0005 °/o MnSO₄-4 H₂O enthielt. Cctyl- trimethylammoniumbromid wird als oberflächenaktives Mittel verwendet. Die übrigen Kulturbedingungen stimmen mit denen im Beispiel 1 überein.. Nach 96stündiger Kultivierung waren die in Tabelle Xl angegebenen Mengen 5'-Natriuminosinat entstanden.

Polyoxy alkyl Zugabe zeit (StQ.)	ithylen- imin Zugabe mengen (y/tnl)	Mengen getrockneter Bakterienzellen (mg/ml)	Entstandene Mengen an 5'-Natriuminosinat *) (mg/ml)
20	500 750 1000	24,3 21,2 19,9	7,6 9,0 6,3
24	750 1000 1300	22,0 20,1 21,0	10,1 15,9 13,6
28	750 1000 1300	23,2 22,0 21,7	9,8 12,2 12,0
Keine Zugabe	30,8	Spuren

	Cetyl-trir ammoniu Zugabe zeit (Std.)	tiethyl- mbromid Zugabe menge O/ml)	Tabelle XI	Entstandene Mengen an S'-Natriuminosinat*] (mg/ml).
15	20	500 750 1000	Mengen getrockneter Bakterienzellen (mg/ml)	3,6 5,2 6,5
20	24	750 1000 1250	24,0 20,2 16,5	10,6 14,9 15,1
«5	28	750 1000 1250	21,3 21,8 , 19,2	8,2 9,1 8,7
		Keine Zugabe	22,3 22,5 21,5	Spuren
30	34,8

35

·) Bestimmt als S'-Inosinsäuredinatriumsalz · I¹I, H,O.

Beispiel 10

Es werden die gleichen Maßnahmen wie im Beispiel 1 angewendet; an Stelle von Polyoxyäthylenaikylamin wird zu verschiedenen Zeiten in unter-i schiedlichen Konzentrationen Cetylpyridinchlorid zugefügt, Mengen an 5'-Natriuminosinat, die nach 120-stündiger Kultivierung nachzuweisen sind, sind in Tabelle X wiedergegeben.

Tabelle X

*) Bestimmt als S'-Inosinsäurcdinatriumsalz · 7¹/« H₁O.

Beispiel 12

Es werden, das gleiche Impfbakterium und Fermentationsmedium wie im Beispiel 1, jedoch ohne Hypoxanthin verwendet. Nach 50stündiger Kultivierung werden 2,5 mg/ml Guanin zugegeben. Als oberflächenaktives Mittel wird Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid verwendet. Die übrigen Kulturbedingungen entsprechen denen des Beispiels 1. Nach 96stündiger 'Kultur finden sich die in Tabelle XII angegebenen Mengen an 5'-NatriumguanyIat.

Tabelle XlI

AlkyldimethylbenzylaramoniumcMorid

Zugabezeit (SId.)

Cetylpyridinchlorid

Zugabezeit (Std.)

250 500 750

500 750

Keine Zugabe

Zugabemengen (y/ml)

250 500 750

Mengen

getrockneter

Bakterienzellen

(mg/ml)

25,0 22,3 19,1

25,9 23,2 20,4

24,8 23,2

32,9

Entstandene Mengen an 5'-Natriuminosinat*) (mg/ml) 22

3,5 4,9 4,1

8,1 12,9 10,2

6,3 7,1

Spuren 26

30

6o Zugabemengen (V/ml)

500
1000

500
1000
1250

500
1000
1250

Keine Zugabe

Mengen

getrockneter

Bakterienzellen

(mg/ml)

19,5 17,1

20,3 19,3 20,1

21,5 21,3 22,7

36,8

Entstandene Mengen an

5'-Natrium-

guanylat*)

(mg/ml)

1,1 2,0

1,9 5,9 4,7

2,3 4,0 3,1

Spuren

*) Bestimmt als S'-Inosinsäurcdinatriumsalz · 7'/t H,O.

·> Bestimmt als S'-Guanylsäuredinatriamsalz.

Beispiel 13

Es werden das gleiche Impfbakterium und Fcrnicntationsmedium wie im Beispiel 1 verwendet, jedoch

209632/285

an Stelle von Maisquellwasser 0,4% Pepton eingesetzt. In bestimmten Konzentrationen werden zu bestimmten Zeiten Polyoxyäthylenalkylamin, Cetylpyridinchlorid lind Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid

zugegeben. Die übrigen Kulturbedingungen stimmen mit denen aus Beispiel 11 überein. Nach l20stündiger Kultivierung sind die in Tabelle XIII angegebenen Mengen 5'-Natriuminosinat nachzuweisen.

Tabelle XIII

Oberflächenaktive Substanz Art

Mengen

getrockneter

Bakterienzellen

(mg/ml)

Entstandene

Mengen an

5'-Natriuminosinat*)

(mg/ml)

Polyoxyäthylenalkylamin Cetylpyridinchlorid Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid

*) Bestimmt als 5'-lnosinsäuredinatriumsalz · 7'/i H₈O.

38 36 38

400
200
400

Keine Zugabe

18,6 18,9 19.0 22,9

15,8

15,0

14,7

8,9

Beispiel 14

Impfbakterium: Brevibacterium ammoniagenes (ATCC 6871), Fermentationsmedium nach Beispiel 11, jedoch mit nur 2 mg/ml Hypoxanthin. Im übrigen gleiche Kulturbedingungen wie im Beispiel 11. Als oberflächenaktive Substanz wird ein Gemisch aus 40% Polyoxyäthylen und 60% Polypropylen verwendet. Nach 120 Stunden sind die in Tabelle XIV angegebenen Mengen 5'-Natriuminosinat entstanden.

Tabelle XIV Tabelle XV

Ein Gemisch aus	Zugabe	Mengen	Entstandene
40% Polyoxyäthvlen	mengen (ylrnW	getrockneter Bakterienzellen	Mengen an 5'-Natriüminosinat·'»
und 60% Polypropylen	500
Zugabe	1000	(mg/ml)	(mg/ml)
zeit (StcU	1000	25,4	1,3
16	1500	23,2	' 2,2
	1000	23,9	7,5
20	1500	21,0	6,1
	Keine Zugabe	24,3	4,0
24		22,0	2,6
	37,2	Spuren

33

Polyoxyäthylen	Mengen	Entstandene Mengen
alkylamin	getrockneter	an 5'-Natrium-
Zugabemengen	Bakterienzellen	adenylat·)
(WmI)	(mg/ml)	(mg/ml)
500	24,9	1,08
750	22,1	3,93
1000	20,4	4,08
1250	18,2	2,99
Keine Zugabe	29,3	Spuren

*) Bestimmt als S'-Adenylsäuredinatriumsalz.

*) Bestimmt als S'-Inosinsäuredinatriumsalz ■ 7'/i H₁O.

Beispiel 15

Impfbakterium: Micrococcus sodonensis (ATCC 15932); Kulturmedium: 2% Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 1,5% Pepton und 0,25% NaCl (Restprozente = Wasser); pH = 7,3. Das Fermentationsmedium: 10% Glucose, 0,6% K₂HPO₄, 0,6% KHgPO₄, 0,6% MgSO₄ · 7H₈O, 0,01% CaCl · 2 H₂O, 5 y/mi Calciumpantothenat, 1 y/ml Thiamin, 30 y/ml Vitamin H, 0,1 % FeSO₄ · 7 H₂O, 1 % Casein-Aminosäuren und 0,6% Harnstoff (Restprozente = Wasser); pH-Wert = 8,0 vor der Sterilisation. Nach 48stündiger Kultivierung werden 20 mg/ml Adenin und nach 30 stündiger Kultivierung noch Polyoxyäthylenalkylamin in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die übrigen Kulturbedingungen entsprechen denen von Beispiel 11. Nach 96stündiger Kultivierung konnten die ra Tabelle XV angegebenen Mengen 5'-Netriumadenylat gewonnen werden.

Beispiel 16

Es wurden das gleiche Impfbakterium und Kulturmedium wie im Beispiel 15 verwendet; an Stelle von Adenin werden in das Medium nach 48 Stunden jedoch 2,0 mg/ml Guanin gegeben. Ferner wird Cetylpyridinchlorid nach 30stündiger Kultivierung in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt. Die sonstigen Kulturbedingungen entsprechen denen des Beispiels 11. Die nach 96stündiger Kultivierung gewonnenen Men gen an 5'-Natriumguanylat ergeben sich aus Ta belle XVI.

Tabelle XVI

Cetylpyridinchlorid Zugabemengen

(y/ml)

55

250

500

750

1000

Keine Zugabe

Mengen

getrockneter

Bakterienzellen

(mg/ml)

22,8 22,0 20,1 19,6 28,7

Entstandene Mengen

. an 5'-Natrium-

guanylat*)

(mg/ml)

2,1 4,3 4,7 1,8 Spuren

*) Bestimmt als 5'-Guanylsäun:dinatriumsalz.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 5'-Purianucleotiden durch Fermentation von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium, das heben üblichen Mengen an Kohlenstofflieferaiiien, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen und Vitamin H auch

   größere Mengen wachstumsfördernder Substanzen sowie Eisen- und Mangansalze enthalten kann, in Gegenwart einer dem 5'-Purinnucleotid entsprechenden Purinbase als Vorläufer, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 und 6872 oder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 verwendet und dem Fermentationsmediuir ein Antibioticum oder eine oberflächenaktive Sub· stanz in der Periode des logarithmischen Wachstums der Mikroorganismen oder kurz danacr zugibt.