DE1642716B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure - Google Patents

Description

3 4

Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Ka- Die nach Beendigung der Züchtung in der Kultur-

liummonohydrogenphosphat, Natriumchlorid, Eisen- flüssigkeit angereicherte Citronensäuremenge beträgt

sulfat sowie auch andere üblicherweise verwendete 10 mg/ml.

Salze von Magnesium, Eisen, Mangan, Zink, Calcium Beispiel 2
u. dgl. Gemische derartiger anorganischer Verbin- 5

düngen können ebenfalls verwendet werden. Die Züchtung wird in demselben Züchtungsmedium, Bei der Herstellung der erfindungsgemäß zu ver- wie es im Beispiel 1 beschrieben worden ist, durchwendenden Fermentationsflüssigkeiten kann entspre- geführt, mit der Abwandlung, daß 0,05% Tween40 chend der französischen Patentschrift 1 451 390 auch (Polyoxyäthylensorbitanmonopalmitat) zu dem Menoch Calciumcarbonat eingesetzt werden. Hierbei io dium hinzugefügt werden. Die Züchtung wird unter empfiehlt sich entsprechend den bekannten Fermen- denselben Bedingungen, wie sie im Beispiel 1 antationsverfahren mit Kohlenwasserstoffen als Haupt- gegeben worden sind, 96 Stunden lang durchgeführt, kohlenstoff quelle außerdem auch noch Salze oder Die in der Kulturflüssigkeit angereicherte Citronen-Ester höherer Fettsäuren, verschiedener Arten von säuremenge beträgt 15 mg/ml,
oberflächenaktiven Mitteln oder Methanol zuzusetzen. 15 .

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Fermen- Beispiel-J

tationsflüssigkeiten werden unter aeroben Bedin- 3 Liter eines Kulturmediums der folgenden Zu-

gungen, wie z. B. aerobem Schütteln der Kultur oder sammensetzung werden in einem 5-Liter-Jar-Fermen-

durch Rühren einer Submerskultur, und bei einer ter eingebracht und sterilisiert:

Temperatur von etwa 20 bis 40° C sowie einem pH- 20 0 2°/ KH PO

Wert von etwa 4 bis 9 erhalten. Nach etwa 3 bis q'·, ₀;° M₂Io *7 H O

7Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen π'λγκο/ f/insn . /ΐπ'η

werden bemerkenswert große Mengen an Citronen- nmo/ p„«n τ ti η

saure in dem Zuchtungsmedium angereichert. 10°/ NH NO

Nach Beendigung der Fermentation kann die 25 q^ _o ," jj_arnst_og

Citronensäure mit den üblichen Mitteln, wie z.B. 3'θ^ο/° CaCO '

Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz Chro- 0^01"% Maisquellflüssigkeit,

matographie, Ausfallung, Extraktion od dgl., von 0,05 % Polyoxyäthylenglycolmonostearat.
der Fermentationsnussigkeit abgetrennt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfin- 30 Der pH-Wert des Mediums ist etwa neutral. Eine

dung erläutern. Falls nicht anders angegeben, beziehen Kulturnüssigkeit von Arthrobacter paraf fineus ATCC

sich die Prozentangaben in der gesamten Beschreibung 15 591, die durch Züchtung unter aerobem Schütteln

auf das Gewicht. in einem Züchtungsmedium, bestehend aus 1,0%

Fleischextrakt, 1,0% Pepton, 0,5% Natriumchlorid

Beispiell 35 und 1,0 % Sorbit, bei einem pH-Wert von 7,2 erhalten

worden ist, wird in das Fermentationsmedium in einer

20 ml eines Züchtungsmediums mit der folgenden Menge von 5 % eingeimpft. Die Züchtung wird so-

Zusammensetzung (pro Liter Wasser) werden in dann bei 28° C und bei einer Rührbewegung von

einem 500-ml-Sakaguchikolben hergestellt: 600 UpM sowie unter Belüftung mit einer Durchsatz-

5 0°/ n-Dodecan ⁴° g^esCßwm^igkeit von 1 Liter steriler Luft pro Minute

o'?°/°KHPO ' 72 Stunden lang durchgeführt. Zu Beginn der Züch-

01°/° MgSO -7HO tung werden 200 ml n-Paraffine mit 12 bis 14 Kohlen-

o'oO5°°/ MnSO · 4²H Ό stoff atomen zu dem Züchtungsmedium hinzugefügt.

o'o2°/ FeSO ·*7 H O² ' Die nach Beendigung der Züchtung in der Kultur-

o'5°/ NHNO ^a ' 45 flüssigkeit angereicherte Citronensäuremenge beträgt

o'l °/° Harnstoff ^ mg/ml. Nach Behandlung der Lösung mit den üb-

lo'mg°Thiamin pro Liter liehen Isoliermethoden werden aus ihr 60 g Citronen-

3,0% CaCO₃. ' säure gewonnen.

Sodann wird ImI einer Einsaat-Kulturflüssigkeit 50 Beispiel4
von Arthrobacter paraffineus ATCC 15 591, die mit Arthrobacter paraffineus ATCC 15 590 wird verHilfe einer 24 Stunden lang dauernden Schüttelkultur wendet; die übrigen Züchtungsbedingungen sind ähnin einem flüssigen Bouillon-Medium bei 30⁰C erhalten lieh wie die in Beispiel 1 verwendeten. Nach 96 Stunworden war, in das Fermentationsmedium eingeimpft. den dauernder Züchtung haben sich 9,5 mg Citronen-Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln der 55 säure in einem Milülieter der Kulturflüssigkeit anKultur bei 28° C 96 Stunden lang durchgeführt, gereichert.

Claims (1)

1 2

Ausgehend von diesem Stand der Technik wurde

Patentanspruch: nun gefunden, daß aus den durch aerobes Züchten

von Arthrobacter paraffineus in mindestens ein n-Pa-

Verwendung von durch aerobes Züchten von raffln mit 9 bis 30 Kohlenstoffatomen als Haupt-Arthrobacter paraffineus in mindestens ein n-Pa- 5 kohlenstoffquelle enthaltenden wäßrigen Nährmedien raffln mit 9 bis 30 Kohlenstoffatomen als Haupt- bei pH-Werten von etwa 4 bis 9 und Temperaturen kohlenstoffquelle enthaltenden wäßrigen Nähr- von etwa 20 bis 40⁰C erhaltenen Fermentationsmedien bei pH-Werten von etwa 4 bis 9 und Tem- flüssigkeiten Citronensäure gewonnen werden kann, peraturen von etwa 20 bis 40° C erhaltenen Fer- Dementsprechend besteht die Erfindung in der Vermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Ci- io wendung von durch aerobes Züchten von Arthrotronensäure. bacter paraffineus in mindestens ein η-Paraffin mit \ 9 bis 30 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden wäßrigen Nährmedien bei pH-Werten von etwa 4 bis 9 und Temperaturen von etwa 15 20 bis 40⁰C erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten zur

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der biotech- Gewinnung von Citronensäure.

nischen Herstellung von Citronensäure. Nachdem die Gewinnung von Citronensäure aus

Citronensäure ist eine chemische Substanz, die zahl- unter Einsatz von Kohlenhydratmaterialien als Hauptreiche Anwendungsmöglichkeiten besitzt. Citronen- kohlenstoff quelle erhaltenen Fermentationsflüssigkeisäure wird Getränken, pharmazeutischen Siruparten, 20 ten bereits durchgeführt wird, eröffnet die vorliegende Elexierzubereitungen, Brausepulvern und -tabletten Erfindung dem Fachmann die Möglichkeit, bei veru. dgl. zugesetzt. Sie wird verwendet, um den pH-Wert schiedenen sachlichen und örtlichen Gegebenheiten von Nahrungsmitteln einzustellen, sowie als syner- und Bedürfnissen zwischen mehreren Möglichkeiten gistisches Antioxydationsmittel bei der Käseherstel- zur biotechnischen Herstellung von Citronensäure lung. Weitere Anwendungsmöglichkeiten bestehen 25 nach Zweckmäßigkeitsgründen zu wählen, z. B. in ihrer Verwendung als Chelatisierungsmittel Entweder ein synthetisches oder ein natürliches

zur Entfernung von Spurenmetallen, als Beize zur Nährmedium ist für die Herstellung der erfindungs-Aufhellung von Farben, als Reagenz für Albumin, gemäß zu verwendenden Fermentationsflüssigkeiten Mucin, Glucose und Gallenfarbstoffe usw. Citronen- geeignet, solange es die für das Wachstum des versäure ist außerdem in der Medizin verwendet worden, 30 wendeten Arthrobacter paraffmeus-Stammes erforderz. B. als mildes Adstringens. liehen Nährstoffe und wenigstens ein η-Paraffin mit

Die bei dem üblichen Verfahren zur biotechnischen 9 bis 30 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoff-Herstellung von Citronensäure als Ausgangsmateri- quelle enthält. Derartige Nährstoffe sind in der Techalien verwendeten Kohlenhydrate sind verhältnis- nik bekannt; zu ihnen gehören Stoffe, wie eine Kohlenmäßig teuer, und bei der Verwendung von End- 35 stoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Vermelassen als Ausgangsmaterial ist es nachteilig, daß bindungen u. dgl., welche durch den verwendeten das Produkt anorganische Bestandteile aus dem Aus- Mikroorganismus in geeigneten Mengen ausgenutzt gangsmaterial enthält. werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Ver- Die anzuwendende Kohlenstoffquelle umfaßt n-Pa-

fahren zur mikrobiologischen Umwandlung von 40 raffine mit 9 bis 30 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt η-Paraffinen aus Erdöl in Citronensäure zur Verfügung werden auf Grund einer hohen Produktionsausbeute zu stellen. an Citronensäure η-Paraffine mit 10 bis 18 Kohlen-

Ais Ergebnis von Untersuchungen über die aus Stoffatomen. Beispiele dafür sind geradkettige Pan-Paraffinen durch aus der Natur isolierte Kohlen- raffine (Alkane), wie z. B. n-Decan, n-Undecan, Wasserstoffe assimilierende Mikroorganismen haupt- 45 n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, sächlich gebildeten Fermentationsprodukte, die mit n-Eicosan, n-Docosan, n-Tricosan, n-Triacontan usw. dem Ziel durchgeführt wurden, die bei den Fermen- Rohmaterialien, die n-Paraffine enthalten, können tationsverfahren bisher als Ausgangsmaterialien ver- ebenfalls wirksam verwendet werden. Mischungen wendeten Kohlenhydrate durch Kohlenwasserstoffe zweier oder mehrerer η-Paraffine können als Kohlenzu ersetzten, wurden bereits Verfahren zur Her- 50 stoffquelle verwendet werden.

stellung von «-Ketoglutarsäure und L-Glutaminsäure Kleine Mengen anderer Kohlenstoffquellen, wie

entwickelt. In der französischen Patentschrift 1451390 z.B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Rohrist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von zucker, Stärkehydrolysate, Abfallmelassen usw. köna-Ketoglutarsäure beschrieben, bei dem unter an- nen ebenfalls in dem Fermentationsmedium zusammen deremeinzur Art Arthrobacter paraffineus; gehörender 55 mit der Kohlenwasserstoffverbindung oder den Koh-Mikroorganismus (Arthrobacter paraffineus ATCC lenwasserstoffverbindungen verwendet werden. 15 591) unter Einsatz von η-Paraffinen mit 10 bis Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von

25 Kohlenstoffatomen als Kohlenstoffquelle bei hier- anorganischen oder organischen Salzen oder Verbinfür üblichen Temperaturen und pH-Werten gezüchtet düngen verwendet werden, wie z. B. Harnstoff oder und aus der Fermentationsflüssigkeit a-Ketoglutar- 60 Ammoniak oder Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumsäure gewonnen wird. Ferner ist in der französischen sulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat usw., Patentschrift 1 412 706 ein Verfahren zur Gewinnung oder natürliche, stickstoffhaltige Substanzen, z. B. von Glutaminsäure bzw. Calciumglutamat beschrie- Maisquellflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, Hefeben, bei dem aus einer durch Züchten von Arthro- extrakt, Caseinhydrolysate, Fischmehl usw. Gemische bacter paraffineus unter Einsatz von η-Paraffinen als 65 zweier oder mehrerer dieser Stickstoffquellen können einziger Kohlenstoffquelle erhaltenen Fermentations- verwendet werden.

flüssigkeit Glutaminsäure als Calciumglutamat iso- Anorganische Verbindungen, die zu dem Züch-

liert wird. tungsmedium hinzugesetzt werden können, sind z. B.