DE1642663B2

DE1642663B2 - Verfahren zur herstellung von uricase

Info

Publication number: DE1642663B2
Application number: DE19671642663
Authority: DE
Inventors: Juichiro Takarazuka; Yamamoto Takehiko Amagasaki; Fukumoto (Japan)
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1966-02-02
Filing date: 1967-01-31
Publication date: 1973-08-02
Also published as: GB1135354A; US3431176A; DE1642663C3; FR1508800A; CH489537A; DE1642663A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Uricase aus diese enthaltenden Hefezellen. Das Verfahren liefert Uricase in hoher Ausbeute und Reinheit, ohne daß eine Ruptur der Hefezellen erforderlich ist.

Uricase ist ein Enzym, das Harnsäure katalytisch zu Allantoin oxydiert Es findet sich nicht in den Geweben höherer Säugetiere, insbesondere nicht in menschlichem Gewebe, ist aber außerordentlich verbreitet in den Geweben, besonders den inneren Organen, von niederen Säugetieren sowie in verschiedenen Mikroorganismen.

Uricase wird bei der klinischen Analyse des Harnsäuregehalts im Blut als Enzym verwendet und wird manchmal bei der Behandlung von Gicht, Arthritis und anderen Entzündungskrankheiten, die durch übermäßige Anhäufung von Harnsäure verursacht werden, als Arzneimittel benutzt.

Uricase wurde bisher meistens aus Tierleber, z. B. von Hornvieh, oder Schweinenieren durch Extraktion dieser Gewebe hergestellt Die Reinigung des Extraktes ist aber so kompliziert, daß Uricase in hoher Ausbeute und Reinheit nur schwierig zu gewinnen ist. Außerdem sind die Rohmaterialien, die inneren Organe von Tieren, teuer und beschwerlich zu verarbeiten. Das herkömmliche Verfahren der Herstellung von Uricase aus inneren Organen von Tieren ist aus diesen Gründen recht kostspielig.

Es ist leicht einzusehen, daß bei der Verwendung von Mikroorganismen als Ausgangsmaterialien Tür die Uricasegewinnung die Uricase weniger teuer ist als die aus tierischen Organen gewonnene, das Mikroorganismen in großer Menge kultiviert werden können und leicht zu verarbeiten sind. Mikroorganismen wurden aber bisher industriell nicht als Ausgangsmaterial für die Uricasegewinnung benutzt. Der Grund liegt darin, daß nicht nur für die Extraktion der Uricase, sondern auch für die Bestimmung dei Uricaseaktivität kein anderes brauchbares Verfahren entwickelt wurde, als das der vollständigen Zerstörung der Zellen der Mikroorganismen. Die Zerstörung der Zellen kann aber nur mittels umständlicher und kostspieliger Verfahren, wie z. B. durch Ultrabeschallung oder Gefrieren und Wiederauftauen, erfolgen. Aber

ίο auch bei Zerstörung der Zellen enthält die gewonnene Uricaselösung so viel Verunreinigungen, daß umständliche Verfahren zur Reinigung der L'ricase erforderlich sind. So ist aus Science, Bd. 124, 1Q 56, S. 125, ein Verfahren zur Gewinnung von Uricase mittels einer bei Trockeneistemperatur arbeitenden Hughespresse bekannt, also ein Verfahren, daß technisch sehr aufwendig ist und sich nicht Für die industrielle Anwendung eignet und ein proteinhaltiges Produkt liefert.

zo Ertindungsgemäß erfolgt die Herstellung von Uricase aus diese enthaltenden Hefezellen dadurch, daß die Hefezellen in eine wäßrige Lösung eines der anorganischen Salze Ammoniumsulfat, Diammoniumhydrogenphosphat, Ammoniumdihydrogenphosphat, Ammoniumchlorid, Natriumchlorid, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Natriumsulfat, Kaliumchlorid, Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid mit einer Ionenstärke von mehr als 2,0 und einem pH-Wert von 3 bis 8 bei einer Temperatur unter 15° C eingetaucht werden und daß die so behandelten Zellen anschließend der Extraktion mit einer wäßrigen Lösung eines der genannten anorganischen Salze mit einer Ionenstärke von weniger als 1,0 und einem pH-Wert von 7 bis 11 bei einer Temperatur zwischen 15 und 0° C unterworfen werden.

Es kann jede beliebige Hefe verwendet werden, die

adaptiv oder induziert Uricase erzeugt Bevorzugt wird aber eine zur Art Candida utilis gehörende Hefe.

Im allgemeinen produzieren verschiedene Mikro-Organismen adaptiv oder induziert Uricase. Diese Uricase wird aber als intrazellulares Enzym gebildet und nicht aus den Zellen ausgeschieden. Wenn aber Mikroorganismen als Uricasequelle verwendet werden, werden vorzugsweise solche ausgewählt, die nicht nur eine hohe adaptive Uricaseproduktivität besitzen, sondern auch leicht zi: kultivieren sind und eine hohe Ausbeute an Zellen liefern.

Es wurde nun gefunden, daß Uricase aus diese enthaltenden Hefezellen unter ganz bestimmten Bedingungen in hoher Ausbeute und Reinheit extrahiert werden kann, ohne daß eine Zerstörung der Zellen erforderlich ist.

Die Hefe kann in der üblichen Weise kultiviert werden. Beispielsweise wird ein Stamm von Candida utilis bei etwa 28° C nach dem Verfahren der Submerskultur in einem Nährmedium kultiviert, das Maisquellflüssigkeit, Glukose usw. enthält. Die üricasebildung kann nun in bekannter Weise induziert werden (z. B. A. H. R ο u s h und A. J. D a m η a s, Science 124, 125/126 [1956]; M. F. Quetsch und W. F. Dan forth, J. Cell, and Comp. Physiol. 64, 115—122, 123—130 [1964]). So werden danach z. B. Glukose und Harnsäure in einem Stadium vor der stationären Wachstumsphase zu der Kultur zugesetzt, um die Adaption oder Induktion zur Uricasebildung einzuleiten. Diese Kultivierung von Hefe und Adaption oder Induktion der Uricasebildung sind dem Fachmann per se bekannt und bilden kein neues Merkmal

der Erfindung; es ist daher unnötig, das Verfahren näher zu erläutern.

Nach der Kultivierung werden die Zellen nach einem geeigneten Verfahren, wie z. B. durch Filtration oder Zentrifugierung, abgetrennt.

Es ist wesentlich, daß die Hefezellen vor der Extraktion in eine wäßrige Lösung eines der obengenannten anorganischen Salze unter den dort angegebenen Bedingungen eingetaucht werden. Hierbei kann die Ionenstärke bis in die Nähe der Sättigung gehen und liegt vorzugsweise höher als die Halbsättigung. Diese Vorbehandlung ermöglicht eine wirksame und selektive Extraktion der Uricase aus den Hefezellen. Bei zu geringer Ionenstärke kann nämlich die gewünschte Modifizierung der Zellen nicht bewirkt werden. Der bevorzugte pH-Wert bei dieser Vorbehandlung ist 4,5 bis 7,5, am besten etwa 7. Bei zu hohem pH-Wert würde eine unerwünschte Zerstörung der Hefezellen stattfinden, was zu Enzymverlust in diesem Stadium führt, während bei zu niedrigem pH-Wert eine Inaktivierung der Uricase eintritt.

Die Vorbehandlung sollte bei möglichst niedriger Temperatur durchgeführt werden, möglichst bei einer Temperatur unter 10⁰C. Das Eintauchen der Hefezellen erfolgt in die wäßrige Lösung, welche z. B. das etwa 5- bis lOfache Volumen der Zellen besitzt. Die Eintauchzeit schwankt innerhalb eines weiten Bereiches und hängt im einzelnen von dem benutzten Salz und seiner Ionenstärke ab. Im allgemeinen wird aber ein befriedigendes Ergebnis bei einer Eintauchze't von 8 bis ?A Stunden erzielt. Durch diese Vorbehandlung werden die H&jzellen der Plasmolyse und einer weiteren Modifikation der Zellstruktur unterworfen, wodurch die wirksame und selektive Extraktion der Uricase im anschließenden Stadium erleichtert werden.

Die dann folgende Extraktion kann durch Suspendieren der Hefezellen in der wäßrigen Lösung eines der genannten anorganischen Salze unter den angegebenen Bedingungen oder durch Dialysieren gegen diese wäßrige Lösung unter den angegebenen Bedingungen erfolgen. Bei Q'.r Extraktion kann das gleiche Salz wie bei der Vorbehandlung oder auch ein anderes der dort einzusetzenden Salze verwendet werden. Zweckmäßig werden die gleichen Lösungen wie bei der Vorbehandlung benutzt.

Das wesentliche Merkmal der Extraktion liegt darin, daß die [onenstärke des Extraktionsmediums sehr gering ist, während der pH-Wert verhältnismäßig hoch liegt. Die Ionenstärke der Lösung mit den genannten Salzen muß bei der Extraktion geringer als 1,0 und vorzugsweise 0,02 bis 0,04 sein, wobei der pH-Wert 7 bis 11 und vorzugsweise etwa 8, beträgt. Diese besonderen Bedingungen sind wichtig, um die Uricase in einer Form zu extrahieren, die anschließend mittels per se bekannter Verfahren leicht weitergereinigt werden kann. Bei Bedingungen außerhalb dieser Werte, z. B. bei einer Ionenstärke von mehr als 1,0, läßt sich die Uricase ebenfalls extrahieren, es entstehen aber gewisse intrazellulare Bruchstücke (aus den Zelle«), die von der Uricase durch Aussalzen, Filtration über Molekularsiebe, Behandlung mit Ionenaustauschern usw. nur außerordentlich schwer abzutrennen sind, so daß die gewonnene Uricase eine erhebliche Menge dieser Substanzen als Verunreinigungen enthält und auch nach maximaler Reinigung nur eine spezifische Aktivität von etwa 8.0 besitzt. Wenn dagegen die Extraktion unter den besonderen obigen Bedingungen durchgeführt wird und die oben beschriebene Vorbehandlung der Extraktion vorausgegangen ist. kann die Uricase in freier und vollständig löslicher Form extrahiert werden, so daß sie nach der Reinigung eine hohe spezifische Aktivität von z. B. 12,3 aufweist. Bei diesem Reinheitsgrad liegt eine homogene Uricase vor. wie sich durch Ultrazentrifugierung nachweisen läßt.

Bei der Durchführung der Extraktion werden die vorbehandelten Zellen von der verwendeten Lösung. z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und nach Belieben mit Wasser gewaschen. Sie werden dann in Wasser suspendiert, wobei die Wassermenge etwa das 3- bis 5fache des Gewichts der nassen Zellen beträgt. Wenn erforderlich, werden eine bestimmie Salzmenge und eine alkalische Substanz zugesetzt, um Ionenstärke und pH-Wert innerhalb des oben angegebenen Bereichs für die Extraktion einzustellen.

Die bei der Vorbehandlung benutzte Lösung, in der sich die Hefezellen noch befinden, kann aber auch mit Wasser verdünnt werden, bis die erforderliche Ionenstärke für die erfindungsgemäße Extraktion erreicht ist. Auf jeden Fall muß das Medium in und mit dem die Extraktion der Uricase aus den Hefezellen durchgeführt wird, so eingestellt werden, daß es den obigen Anforderungen hinsichtlich Ionenstärke und pH-Wert entspricht.
Zur Einstellung des pH-Wertes wird vorzugsweise eine alkalische Substanz, wie Borax, Borax-Borsäure-Puffer, Trihydroxyaminomethan, Veronal - natrium, Natriumcarbonat, Natriumhydroxyd usw. oder wäßriges Ammoniak, verwendet.

Die Extraktion soll ebenfalls bei niedgger Temperatur, und zwar unter 15" C und möglichst unter 10⁰C durchgeführt werden. Die zur Extraktion erforderliche Zeit beträgt ei va !0 bis 48 Stunden, es können aber auch 48 bis 72 Stunden notwendig sein. Wie bereits oben erwähnt, kann die Extraktion auch durch Dialyse erfolgen. Die vorbehandelten Zellen werden dazu von der benutzten Lösung abgetrennt und in einer wäßrigen Lösung suspendiert, die sich in einem Dialysierbeutel befindet (z. B. einem Zellophanbeutel) und die gleiche Ionenstärke und den gleichen pH-Wert besitzt wie das oben beschriebene Extraktionsmedium. Der Beutel wird dann in eine geeignete Flüssigkeit gehängt, die die Aufrechterhaltung von Ionenstärke und pH-Wert der Lösung in dem Beutel gewährleistet.

Bei beiden Extraktionsformen (Suspensionsverfahren oder Dialyse) wird die Uricase fast vollständig aus den Zellen eluiert, wobei eine geringe Menge anderer Proteine mitgeht. Bei der Dialyse wandert die eluierte Uricase nicht durch den Beutel, so daß sie sich in dem Beutel in einer Konzentration und Reinheit ansammelt, die viel höher liegen als bei dem Suspensionsverfahren.

Nach dieser Extraktion werden die Zellen von dem

die Uricase enthaltenden Extraktionsmedium nach einer geeigneten Methode wie etwa durch Zenirifugieren abgetrennt. Die noch in der Lösung enthaltene Uricase kann auf eine beliebige per se bekannte.Weise weitergereinigt werden. Es soll aber darauf hingewiesen werden, daß die Uricase erfindungsgemäß in einer leicht zu reinigenden Form extrahiert wird, so daß die Reinigung keine Schwierigketten bereitet.

Die Uricase enthaltende, von der Hefe abgetrennte

Lösung wird z. B. mit Ammoniumsulfat versetzt, bis eine Sättigung von 0,2 erreicht ist, so daß die meisten

Proteine ausgefallt werden, während die Urica.se in der übersiehenden Flüssigkeit bleibt. Die Ausfällung wird durch Filtration oder Zentrifugierung abgetrennt. Ein weiterer Zusatz von Ammoniumsulfat zu der Lösung bis zu einer Sättigung von 0,5 bewirkt die praktisch vollständige Ausfallung der Uricase. Durch zweimalige Wiederholung dieses Verfahrens wira eine 10- bis 20fache Erhöhung der spezifischen Aktivität des Enzyms erreicht. Mit dem Präzipitat können weitere Reinigungsoperationen wie Gelfiltration, Ionenaustauscher - Chromatographie usw. durchgeführt werden. Die gewonnene Uricase kann nach der Dialyse bei niedriger Temperatur luftgetrocknet oder gefriergetrocknet werden. Diese Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt und bilden kein besonderes Merkmal der Erfindung, so daß ihre Ausführung nicht näher erläutert zu werden braucht.

Die Erfindung soll an Hand der folgenden Beispiele eingehender beschrieben werder.. Wenn nicht anders vermerkt, sind alle Prozentzah'en gewichtsmäßig angegeben. Die Aktivität der Uricase wird stets an Hand der Verminderung des Absorptionsvermögen? von Harnsäure bei 290 ηΐμ bestimmt, wenn eine vorher festgesetzte Menge Harnsäure durch die Uricase bei 25° C und pH 8,5 zersetzt oder oxydiert worden ist. Eine Uricaseaktivitätseinheit entspricht somit einer Enzymmenge, die 1 Mikromol Harnsäure in einer Minute bei 25 ⁰C und pH 8,5 zersetzt.

Das Prinzip der Bestimmung beruht auf dem Verschwinden von Harnsäure, gemessen durch Spektralfotometrie. Uricase katalysiert die folgende Gesamtreaktion :

Harnsäure + O₂ + 2H₂O
-♦Allantoin + H₂O₂ + CO₂

Die intensive UV-Absorption von Harnsäure bei 290 Γημ wird gemessen. Allantoin zeigt keine Absorption bei dieser Wellenlänge.

Es werden folgende Reagenzien verwendet:

1. m/5 Borsäurelösung (es werden 12,37 g Borsäure, H₃BO₃ in destilliertem Wasser gelöst, und dann wird auf 1000 ml aufgefüllt).

2. m/20 Natriumboratlösung (es werden 19,07 g Natriumborat, Na₂B₄O₇ · 10H₂O, in destilliertem Walser gelöst, und es wird auf 1000 ml aufgefüllt).

3. m/100 Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure (ÄDTA) - Lösung (3,72 g ÄDTA · Na₂ · 2H₂O werden in destilliertem Wasser gelöst, und es wird auf 100 ml aufgefüllt).

4. 1 %ige Lösung eines Detergenzes (nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, das hauptsächlich aus Isooctylphenylpolyäthylenoxyd besteht).

5. m/20 Boratpuffer (Lösung) pH 8,5, enthaltend m/1000 ÄDTA und 10 ppm des obigen Detergenzes.

Es werden folgende Reagenzien gemischt:

a) 250 ml von Reagenz 1,

b) 250 ml von Reagenz 2,

c) 200 ml von Reagenz 3,

d) 2 mi von Reagenz 4.

Mit destilliertem Wasser wird auf 2000 ml aufgefüllt. Dieser Puffer hat einen pH von 8,5 ±0,1. In diesem Fehlerbereich ist die Differenz der Enzymaktivität vernachlässigbar.

6. 20%ige Kaliumhydroxid-Lösung (es werden 20 g Kaliumhydroxid, KOH, in destilliertem Wasser gelöst -ind es wird auf 100 ml aufgefüllt).

7. Harnsäuresubstrat (jeden Tag frisch hergestellt) 10 mg Harnsäure (p. A.) werden in 1000 m!

m/20 Boratpuffer (Reagenz 5) gelöst.
Die OD der Lösung gegen destilliertes Wasser bei 290 πΐμ muß 0,800 ± 0,02 sein, da die Enzymaktivität von der Konzentration der Harnsäure abhängt.

Arbeitsweise

1. Die Enzymlösung wird mit m/20 Boratpuffer (Reagenz 5) hergestellt. Die Menge an verwende-

tem Enzym sollte von solcher Konzentration sein, daß 1 ml der endständigen Verdünnung ein J OD von 0,2 bis 0,3 (etwa 0,02 bis 0,03 E/ml) ergibt.

2. Aliquote Anteile dts Harnsäuresubstrats von 4 ml (Reagenz 7) und 1 ml destilliertes Wasser werden jeweils in Reagenzgläser pipettiert. Diese und die Enzymlösung werden in ein Wasserbad von 25° C gegeben und 10 Minuten für die Einstellung der Temperatur darin belassen.

3. In geeigneten Intervallen werden 1 ml der Enzymlösungen in die jeweiligen Reagenzgläser gegeben. 4. Nach genau 5minutiger Inkubation werden 0,4 ml 20%iger K OH-Lösung (Reagenz 6) in jedes Reagenzglas gegeben, um die Reaktion zu beenden.

5. Im Blind versuch wird die Substratlösung (Stufe 2) mit 20%iger KOH-Lösung (Reagenz 6) gemischt, bevor die Enzymlösung zugegeben wird.
6. Die OD der Blindprobe und jeder Probe wird gegen destilliertes Wasser bei 290 ηΐμ gemessen. Das AOD (Kontrolle minu.; Testprobe) sollte 0,2—0,3 sein. Wenn das ,1OD zu hoch oder niedrig ist, wird der Versuch mit einer verdünnteren oder weniger verdünnten Enzymlösung wiederholt.

Berechnung

Eine Einheit der Uricaseaktivität wird definiert als Enzymaktivität, welche ein μ-Mol Harnsäure pro Minute unter den obigen Bedingungen oxydiert. Der molare Ab^orptionskoeffizient von Harnsäure beträgt 1,22· 10⁴Cm"¹. Das AOD entspricht der OD der Blindprobe minus der OD der Testprobe.

Einheiten/mg

AOD- 1000

6,4 (ml) x Verdünnungsfaktor
iTmin · 1,22 ~~\W- 1 (ml)

-AOD- 0,105 x Verdünnungsfaktor

Verdünnungsfaktor

Volumen der Enzymverdünnung in Millimeter
Gewicht des Enzyms in Milligramm

Die f pezifische Aktivität ist hier stets definiert als die Uricaseaklivität pro Absorptionseinheit der Enzymlösung bei 280 ηΐμ pro Zentimeter Lichtweg.

Beispiel 1

Ein Stamm von Candida utilis wurde der Submerskultur in einem Medium (pH 6,2) unterworfen, das 5% Glukose, 4% Maisquellflüssigkeit und etwas

anorganische Salze enthielt. Die Dauer betrug 36 Stunden, die Temperatur war 28°C. Die gewachsenen Hefezellen wurden gesammelt und bei 4° C in eine 0,5%ige Glukoselösung gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht wurden die Zellen abgetrennt und in einer Lösung (pH 7,4) suspendiert, die 3% Glukose, 0,03% Harnsäure, 0,3% Na₂HPO₄ und eine sehr geringe Menge anderer Mineralsalze enthielt. Die Suspension wurde aerob 4 Stunden geschüttelt, um die Bildung von Uricase in den Zellen zu induzieren.

Dann wurden die Hefezellen durch Zentrifugieren abgetrennt und in nassem Zustand (Wassergehalt 75%) in dem lOfachen Volumen einer 25%igen wäßrigen Natriumchloridlösung (pH 6,0, tonenstärke 4,3) bei 6⁰C 18 Stunden suspendiert.

Die so vorbehandelten Zellen wurden abgetrennt und in dem gleichen Volumen einer 1/50-molaren Boraxlösung (pH 9,2) suspendiert. Die Suspension wurde in einen Cellophanbeutel gegeben und dann gegen die Austauschboraxlösung mit der gleichen Konzentration 56 Stunden bei 6⁰C dialysiert.

Die Suspension in dem Beutel wurde zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert, wobei etwa 78 Gewichtsprozent der ursprünglichen Zellen erhalten wurden. Zu der so gewonnenen Lösung wurde Ammoriumsulfat bis zum Sättigungsgrad 0,2 zugesetzt und das erhaltene Präzipitat verworfen. Zu der Lösung wurde weiteres Ammoniumsulfat bis zum Sättigungsgrad 0,5 zugesetzt, wobei die Uricase ausgefällt wird. Die Ausfällung wurde mehrere Tage gegen eine Boratpufferlösung mit einem pH 8,4 diaiysieri. uie Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle I

Zusammenfassung der Extraktion und partiellen

Reinigung von Hefeuricase (1 kg Naßgewicht an

Hefezellen)

Extrakt

Nach Reinigung
durch Aussalzen
mit Ammonsulfat und Dialyse

pH	Aktivität pro ml	Gesamt aktivität
9.2	3,6	3820
8,2	21,0	3410

spezifische Aktivität

0,08

1.59

45

Beispiel 2

Präzipitat wurde in dem halben Volumen der ursprünglichen Extraktlösung' gelöst und wieder wie oben mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Die Gesamturicaseaktivität betrug 3670 und die spezifische Aktivität 1,02.

Beispiel 3

5 g ähnlich wie im Beispiel 1 erhaltene Candida utilis-Hefezellen wurden der Submerskultur in 25 ml einer wäßrigen Lösung (verschiedener Salze in verschiedenen Konzentrationen, wie in der folgenden Tabelle gezeigt) eines anorganischen Salzes unterworfen, und die Suspension wurde bei 10°C 16 Sti den stehengelassen. Dann wurde die Suspension zur Entfernung des größten Teils der Flüssigkeit zentrifugiert und der Rückstand in Wasser gebracht, dem das gleiche Salz zugesetzt war, wie es bei der anfänglichen Submerskultur verwendet wurde, sowie Kaustischsoda, um den pH auf 9 und die Ionenstärke auf 0,9 zur Extraktion der Uricase einzustellen. Die Extraktion wurde bei 5° C 36 Stunden lang durchgeführt. Dann wurde die Uricaseaktivität bezüglich des Extrakts gemessen. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.

Verwendetes Salz

(NH₄J₂SO₄ ..
(NH₄J₂HPO₄

(NH₄)H₂PO₄

NH₄CI

NaCI

Na₂HPO₄...

NaH₂PO₄ ...

Na₂SO₄

KCl

CaCl₂

MgCI₂

Eintauchprozeß PH

4,5
7,0
5.0
5,0
4,5
7,0
5.5
5.0
4.5
5.0
5.0

lonenstärke

6
6

8
3
5
9

7
3

4
5
5

Enzym Aktivität

E'g

Feuchter Zellen

Spezifische Aküvi'ä!

5,2 5,0

4,3 2.6 4.5 3.8 4.5 0.7 3.0 3.3 3,5

0,09 0.08 0,07 0,04 0,09 0,05 0.07 0.04 0.08 0.05 0,05

5°

Beispiel 4

1 kg der Uricase-induzierten Hefezeilen, erbalten nach Beispiel 1, wurden in die fünffache Menge einer AinmonmmsulfatJösung vom Sättigungsgrad 0,5 (pH 5,6, Ionenstärke 7,77, 6⁰C) gegeben und 24 Stunden stehengelassen. Die Zellen worden dann abgetrennt, durch Waschen mit Wasser mit Hilfe der Zentrifugienmg so weit wie möglich von Ammonium- sulfat befreit and dann in dem lOfachen Volumen einer 1/50 molaren Na₂CO_rLösung suspendiert (An- fangs-pH-Wert 10,4, Ioneostärke etwa OjOft Nach 48stündiger Behandlung bei 10⁰C wurde die Suspension zentrifugiert und die Uricase in der Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigung zwischen 0,2 und O^S fraktioniert ausgefallt Das so erhaltene Jeder der drei in der nachfolgenden Tabelle an' gegebenen Candida-Stämme, welche beim Fennen tation Resarch Institute, Agency of Industrial Science and Technoloy, Japan, hinterlegt sind, werde in dei gleichen Weise wie im Beispiel 1 der Submerskultui unterworfer. Die gewachsenen Hefezellen (feucht wurden im fünffachen Volumen einer 0,45gesättigtet Ammoniumsulfatlösung (pH 7,0) eingetaucht, und di< Suspension wurde bei 4° C 20 Stunden stehengelassen Dann wurde sie zentrifugiert, und der Rückstam wurde in einer gleichen Menge l/100-molarer Borax lösung (pH 9,2) suspendiert, in einen Cellophanbeute gebracht und dann gegen die mehrfach gewechselt Boraxlösung der gleichen Konzentration bei 4°( 3 Tage lang dialysiert Nach der Dialyse wurde da Produkt in der gleichen Weise wie im Beispiel gereinigt. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt

309531/38

	pH	Aktivität pro ml	Gesamt aktivität	Spezifische Aktivität
C. tropicalis Nr. 1496 *	9,2 . 8,4 9,1 8,3 9,2 8,3	2,5 19,0 3,4 20,2 3,! 20,8	2700 2400 3500 3150 3040 2800	0,05 1,09 0,07 1,41 0,06 1,28
** C. mycoderma Nr. 1495
** C. lipolytica Nr. 1497 *

IO

B. Zellenaufbruch durch Gefrieren-Auftauen

Die in der gleichen Weise wie oben unter A erhaltenen gewachsenen Hefezellen wurden mit Trockeneis eingefroren, dann wurde die gefrorene Zellenmasse in einem Mörser zerkleinert und bei 30° C aufgetaut. Dieses Gefrieren und Auftauen wurde dreimal wiederholt. Dann wurde die Masse in 1/10-molarem Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und die Suspension bei 4° C 20 Minuten (20 00OUpM) zentrifugiert. Im Zentrifugat wurde die Uricaseaktivität gemessen; die Ergebnisse waren wie folgt:

20

*) Extrakt.
*·) Nach der Dialyse.

Vergleichsversuche A. Zellenaufbruch durch Ultrabeschallung ^2S

1 g der gewachsenen Hefezellen (naß), die ähnlich dem Beispiel 1 erhalten worden waren, wurde in 9 irl eines 1/10-molaren Phosphatpuffers (pH 7,0) suspensiert und der Ultrabeschallung 45 Minuten bei !0 KHz unterworfen. Dann wurde die Suspension 20 Minuten bei 40° C und einer Geschwindigkeit von 20 000 UpM zentrifugiert. Bei diesem Zentrifugat wurden Uricaseaktivität und optische Dichte (OD, 280 ηΐμ) gemessen. Die Ergebnisse waren wie folgt:

40 pH des
Zentrifugales

5,0

fJD/g nusser
/eilen. 280 mn

Enzymaktiviläl E/g nasser Zellen

77,7

0,036

Spezifische
Aktivität

0,00047

C. Erfindungsgemäß

Die nach der gleichen Weise wie oben unter A erhaltenen gewachsenen Hefezellen wurden in zehnfachem Volumen einer wäßrigen Lösung von (NH₄J₂HPO₄ (pH 8,2, lonenstärke 11,0) eingetaucht. Unmittelbar nach Zugabe der Hefezellen sank der pH-Wert der Suspension auf unter 8 ab. Die Suspension wurde über Nacht bei 4° C stehengelassen. Dann wurde die Suspension in einen Cellophanbeutel gebracht und gegen eine miTifach gewechselte 1/50-molare Borat-Na₂CO₃-Pufferlösung (pH 9,0) bei 4° C 3 Tage lang dialysiert. Die Uricaseaktivität der dialysierten überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen. Die Ergebnisse sind wie folgt:

pH des Zentri- fugates	OD/g nasser Zellen, 280 πΐμ	Enzymaktivität E/g nasser Zellen	Spezifische Aktivität
5,0	93,7	0,358	0,00169

pH des
Zentrifugales

8,0

Oß/g nasser
Zellen. 280 ΓΠμ

69,6

Enzymaktivität
y% nasser Zellen

4,8

Spezifische
Aktivität

0,069

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Uricase aus diese enthaltenden Hefezellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefezellen in eine wäßrige Lösung eines der anorganischen Salze Ammoniumsulfat, Diammoniumhydrogenphosphat, Ammoniumdihydrogenphosphat, Ammoniumchlorid, Natriumchlorid, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Natriumsulfat, Kaliumchlorid, Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid mit einher Ionenstärke von mehr als 2,0 und einem pH-Wert von 3 bis 8 bei einer Temperatur unter 15° C eingetaucht werden und daß die so behandelten Zellen anschließend der Extraktion mit einer wäßrigen Lösung eines der genannten anorganischen Salze mit einer Ionenstärke von weniger als 1,0 und einem pH-Wert von 7 bis 11 bei einer Temperatur zwischen 15 und 0^cC unterworfen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, &J.Ü das Eintauchen der Hefezellen während mehr als 8 Stunden erfolgt

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Extraktionslösung eine Ionenstärke von 0,02 bis 0,04 und einen pH-Wert von etwa 8 besitzt.