DE1642663A1

DE1642663A1 - Verfahren zur Herstellung von Uricase

Info

Publication number: DE1642663A1
Application number: DE19671642663
Authority: DE
Inventors: Juichiro Fukumoto; Takehiko Yamamoto
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1966-02-02
Filing date: 1967-01-31
Publication date: 1972-03-30
Also published as: GB1135354A; US3431176A; DE1642663C3; FR1508800A; CH489537A; DE1642663B2

Description

DR. MÜLLER-BORS DIPL.-ING. GRALFS DR. MANITZ

PATENTANWÄLTE

Braunschwelg, 27. Jan. 1967 Unser Zeichen: Bff/GÖ — T 4-63

TOYO BOSEKI KABUSHIKI KAISHA 8, Dojima-Hamadori 2-chome, Kita-ku Osaka/ Japan

Verfahren zur Herstellung von Uricase

Priorität: Japan vom 2. Februar 1966 Nr. 6346/66

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Uricase aus Hefe in hoher Ausbeute und Reinheit ohne Zerstörung der Hefezellen.

Uricase ist ein Enzym, das Harnsäure katalytisch zu Allantoin oxydiert. Es findet sich nicht in den Geweben höherer Säugetiere, insbesondere nicht in menschlichem Gewebe, ist aber außerordentlich verbreitet in den Geweben, besonders den inneren Organen, von niederen Säugetieren sowie in verschiedenen Mikroorganismen·

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Uricase wird bei der klinischen Analyse des Harnsäuregehalts im Blut als Enzym verwendet und manchmal bei der Behandlung von Gicht, Arthritis und anderen Entzündungskrankheiten, die durch übermäßige Anhäufung von Harnsäure verursacht werden, als Arzneimittel benutzt.

Uricase wurde bisher meistens aus Tierleber, z. B. von Hornvieh, oder Schweinenieren durch Extraktion dieser Gewebe hergestellt. Die Reinigung des Extraktes ist aber so kompliziert, daß Uricase in hoher Ausbeute und Heinheit nur schwierig zu gewinnen ist. Außerdem sind die Rohmaterialien, die inneren Organe von Tieren, teuer und beschwerlich zu verarbeiten. Das herkömmliche Verfahren der Herstellung von Uricase aus inneren Organen von Tieren ist aus diesen Gründen recht kostspielig.

Es ist leicht einzusehen, daß bei der Verwendung von Mikroorganismen als Ausgangsmaterialien für die Uricasegewinnung die Uricase weniger teuer ist als die aus tierischen Organen gewonnene, da Mikroorganismen in großer Menge kultiviert werden können und leicht zu handhaben sind. Mikroorganismen wurden aber bisher industriell nicht als Ausgangsmaterial für die Uricasegewinnung benjtfutzt. Der Grund liegt darin, daß nicht nur für die Extraktion der Uricase, sondern auch für die Bestimmung der Uricaseaktivität kein anderes brauchbares Verfahren entwickelt wurde, als das der vollständigen Zerstörung der Zellen

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der Mikroorganismen. Me Zerstörung der Zellen kann aber nur mittels eines umständlichen und kostspieligen Verfahrens, wie z. B. durch TJl trabe schallung oder Gefrieren und Wiederauftauen erfolgen. Aber auch bei Zerstörung der Zellen enthält die gewonnene Uricaselösung so viel Verunreinigungen, daß umständliche Verfahren zur Reinigung der Uricase erforderlich sind.

Im allgemeinen produzieren verschiedene Mikroorganismen adaptiv oder induziert Uricase. Diese Uricase wird aber als intrazellulares Enzym gebildet und nicht von den Zellen ausgeschieden. Wenn daher Mikroorgansimen als Uricasequelle verwendet werden, werden vorzugsweise solche ausgewählt, die nicht nur eine hohe adaptive Uricaseproduktivität besitzen, sondern auch leicht zu kultivieren sind und eine hohe Anbeute an Zellen liefern.

Auf Grund der obigen Gesichtspunkte seigte es sich, daß Hefe eine ausgezeichnete Uricasequelle ist und Uricase unter ganz bestimmten Bedingungen aus Hefezellen in hoher Ausbeute und Reinheit extrahiert werden kann, ohne daß eine Zerstörung der Zellen erforderlich ist.

Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Herstellung von Uricase durch Kultivierung von Hefe zwecks adaptiver Erzeugung von Uricase in den Hefezellen und Extraktion der Uricase aus den Hefezellen, das dadurch gekennzeichnet 2098U/1168

ist, daß die Zellen mit einer wässrigen Lösung anorganischer Salze mit einer Ionenstärke von mehr als 2,0 und einem pH-Wert von 3 bis 8 in Berührung gebracht und die behandelten Zellen dann in einer wässrigen Lösung eines anorganischen oder organischen Salzes mit einer Ionenstärke von weniger als 1,0 und einem pH-Wert von 7»0 bis 11,0 suspendiert oder gegen eine solche Lösung dialysiert werden, um die Extraktion der Uricase durchzuführen. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jede beliebige Hefe verwendet werden, die adaptiv oder induziert Uricase erzeugt. Bevorzugt wird aber eine zum Stamm Candida utilis gehörende Hefe.

Die Hefe kann in der üblichen Weise kultiviert werden. Beispielsweise wird ein Stamm von Candida utilis bei etwa 28⁰C nach dem Verfahren der Submerskultur in einem Nährmedium kultiviert, das Getreideeinweichflüssigkeit, Glukose usw. enthält. Die Uricasebildung kann in bekannter Weise induziert werden (z. B. A.H. Roush und A.J. Damnas, Science 124, 125 - 126 (1956); M.F. Quetsch und W.F. Danforth, J. Cell, and Comp. Physiol. 64, 115 - 122, 123.-130 (1964). So werden z. B. Glukose und Harnsäure in einem Stadium vor der stationären Wachstumsphase zu der Kultur zugesetzt, um die Adaption oder Induktion zur Uricasebildung einzuleiten. Diese Kultivierung von Hefe und Adaption oder Induktion der Uricasebildung sind dem Fachmann per se bekannt und bilden kein neueas Merkmal der Erfindung; es

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ist daher unnötig, das Verfahren näher zu erläutern.

Nach der Kultivierung werden die Zellen nach einem geeigneten Verfahren, wie z. B. durch Filtration oder Zentrifugierung,abgetrennt.

Die Hefezellen werden anschließend der Extraktion mit einer wässrigen Lösung anorganischer oder organischer Salze un- * terworfen. Um eine wirksame und selektive Extraktion der Uricase aus den HefezeDLen durchführen zu können, erwies es sich aber als notwendig, die Zellen mit einer wässrigen Lösung eines Salzes bei einem "bestimmten pH-Wert und einer bestimmten Ionenstärke vorzubehandeln. Diese Vorbehandlung ist ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens und wird in der Weise ausgeführt, daß die Hefezellen mit einer wässrigen Lösung an-organischer Salze mit einer Ionenstärke von mehr als 2,0 und bis in die Nähe der Sätti- i gung (vorzugsweise höher als Halbsättigung) und einem pH-Wert von 3 bis 8, vorzugsweise 4,5 bis 7»5 in Berührung gebracht werden.

Als anorganische Salze werden neutrale Salze bevorzugt, aber es können auch schwach saure oder schwach basische Salze verwendet werden, vorausgesetzt, daß der pH-Wert so eingestellt werden kann, daß er innerhalb des angegebenen Bereichs liegt. Bei den Salzen sollte es sich aber um Salze des Ammonium, der Alkalimetalle und wasserlöslichen

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— Ό —

Erdalkalimetalle !landein, da Schwermetalle leicht eine Inaktivierung des Enzyms bewirken. Bevorzugte anorganische Salze sind "beispielsweise Ammoniumsulfat, Diammoniumhydrogenphosphat, Ammoniumdihydrogenphosphat, Ammoniumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Natriumsulfat usw.

der
Die Ionenstärke "bei der Vorbehandlung anzuwendenden Lösung sollte höher als 2,0 sein. Wenn die Ionenstärke zu gering ist, kann die gewünschte Modifikation der Zellen nicht bewirkt werden. Wenn auch die Salzkonzentration bis zur Sättigung gehen kann, wird vorzugsweise doch bei Halbsättigung oder darüber gearbeitet.

Der pH-Wert der bei der Vorbehandlung anzuwendenden wässrigen Salzlösung sollte 3 bis 8, vorzugsweise 4,5 bis 7 »5 und am besten etwa 7 betragen. Bei zu hohem pH-Wert würde eine unerwünschte Zerstörung der Hefezellen stattfinden, was zu einem Enzymverlust in diesem Stadium führen würde, während bei zu niedrigem pH-Wert eine Inaktivierung der Uricase eintreten würde.

Die Vorbehandlung wird bei möglichst niedriger Temperatur durchgeführt. Sie sollte unter 15°C und möglichst unter 10°C liegen.

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Am besten erfolgt die Vorbehandlung durch. Eintauchen der Hefezellen in die wässrige Lösung (z. B. etwa 5 t>is 10-faches "Volumen der Zellen). Die Eintauchzeit ist innerhalb eines weiten Bereichs variabel und hängt im einzelnen von dem benutzten Salz und seiner Ionenstärke ab» Im allgemeinen wird aber ein befriedigendes Ergebnis bei einer Eintauchzeit von 8 bis 24 Stunden erzielt.

Durch diese Vorbehandlung werden die Hefezellen der Plasmo-

weiteren
lyse und einer Modifikation der Zellstruktur unterworfen, wodurch die effektive und selektive Extraktion der Uricase im anschließenden Stadium erleichtert werden.

Zur Extraktion werden die vorbehandelten Zellen dann in einer wässrigen Lösung eines anorganischen - organischen Salzes mit einer Ionenstärke von weniger als 1,0 und einem pH-Wert von 7*0 bis 11,0 suspendiert oder gegen diese

wässrige Lösung dialysiert. Bei der Extraktion werden die " gleichen Lösungen wie bei der Vorbehandlung benutzt. Es kann das gleiche Salz oder auch ein anderes wie bei der Vorbehandlung verwendet werden.

Das wesentliche Merkmal der Extraktion liegt darin, daß die Ionenstärke des Extraktionsmediums sehr gering ist, während der pH-Wert verhältnismäßig hoch liegt. Die Ionenstärke muß bei der Extraktion geringer als 1,0 und vorzugsweise 0,02 bis 0,04 sein. Der pH-Wert soll 7 bis 11 und

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vorzugsweise etwa 8 betragen. Diese besonderen Bedingungen sind wichtig, um die itricase in einer Form zu extrahieren, die anschließend mittels per se bekannter Verfahren leicht gereinigwerden kann. Bei Bedingungen außerhalb dieser Werte, z. B. bei einer Ionenstärke von mehr als 1,0, läßt sich die Uricase ebenfalls extrahieren, es entstehen aber gewisse intrazellulare Bruchstücke (aus den Zellen), die von der Uricase durch Aussalzen, Filtration über Molekularsiebe, Behandlung mit Ionenaustauschern ubw. nur außerordentlich schwer abzutrennen sind, so daß die gewonnene Uricase eine erhebliche Menge dieser Substanzen als Verunreinigungen enthält und auch nach maximaler Reinigung nur eine spezifische Aktivität von etwa 8,0 besitzt. Wenn dagegen die Extraktion unter den besonderen obigen Bedingungen durchgeführt wird und die oben beschriebene Vorbehandlung der Extraktion vorausgegangen ist, kann die Uricase in freier und vollständig löslicher Form extrahiert werden, so daß sie nach der Reinigung eine hohe spezifische Aktivität von 12,3 aufweist. Bei diesem Reinheitsgrad liegt eine hmogene Uricase vor, wie sich durch Ultrazentrifugierung nachweisen läßt.

Bei der Durchführung der Extraktion werden die vorbehandelten Zellen von der verwendeten Lösung, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und nach Belieben mit Wasser gewaschen. Sie werden dann in Wasser suspendiert, wobei die Wassermenge etwa das 3- bis 5-f^acb-e d.es Gewichts der nassen Zellen

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beträgt. Wenn erforderlich., werden eine bestimmte Salzmenge und eine alkalische Substanz zugesetzt, um Ionenstärke und pH-Wert innerhalb des oben angegebenen Bereichs einzustellen. Die bei der Vorbehandlung benutzte Lösung, in der sich die Hefezellen noch befinden, kann aber auch mit Wasser verdünnt werden, bis die gewünschte Ionenstärke erreicht ist. Auf jeden Fall muß das Medium in und mit dem die Extraktion der Uricase aus den Hefezellen durch- f geführt wird, so eingestellt werden, daß es den obigen Anforderungen hinsichtlich Ionenstärke und pH-Wert entspricht.

Zur Einstellung des pH-Wertes wird vorzugswieise eine alkalische Substanz, wie Borax, Borax-Borsäure-Puffer, Trihydroxyaminomethan, Veronal-natrium, Natriumcarbonat, Natriumhydroxyd usw.oder wässriges Ammoniak, verwendet.

Die Extraktion soll ebenfalls bei niedriger Temperatur,

und zwar unter 15° C und. möglichst unter 10⁰C durchgeführt werden. Die zur Extraktion erforderliche Zeit beträgt etwa 10 bis 48 Stunden, es können aber auch 48 bis 72 Stunden notwendig sein.

Wie bereits oben erwähnt, kann die Extraktion auch durch Dialyse erfolgen. Die vorbehandelten Zellen werden dazu von der benutzten Lösung abgetrennt und in einer wässrigen Lösung suspendiert, die sich in einem Dialysierbeutel be-

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- ίο -

findet (ζ. B. einem Zellophanbeutel) und die gleiche Ionenstärke und den gleichen pH-Wert "besitzt wie das oben beschriebene Extraktionsmedium. Der Beutel wird dann in eine geeignete Flüssigkeit gehängt, die die Aufrechterhaltung von Ionenstärke und pH-Wert der Lösung in dem Beutel gewährleistet.

In beiden Fällen (Suspensionsverfahren oder Dialyse) wird die Uricase fast vollständig aus den Zellen eluiert, wobei eine geringe Menge anderer Proteine mitgeht. Bei der Dialyse wandert die eluierte Uricase nicht durch den Beutel, so daß sie sich in dem Beutel in einer Konzentration und Reinheit ansammelt, die viel höher liegen als bei dem Suspensionsverfahren.

Nach dieser Extraktion werden die Zellen von dem die Uricase enthaltenden Extraktionsmedium nach einer geeigneten Methode wie etwa durch Zentrifugieren abgetrennt. Die noch in der Lösung enthaltene Uricase kann auf eine beliebige per se feEXXKtaigK bekannte Weise gereinigt werden. Es soll aber darauf hingewiesen werden, daß die Uricase erfindungsgemäß in einer leicht zu reinigenden Form extrahiert wird, so daß die Reinigung keine Schwierigkeiten bereitet»

Die Uricase enthaltende, von der Hefe abgetrennte Lösung wird z. B. mit Ammoniumsulfat vasrsetzt, bis eine Sättigung von 0,2 erreicht ist, so daß die meisten Proteine ausge-

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fällt werden, während die Uricase in der überstehenden Flüssigkeit bleibt. Die Ausfällung wird durch Filtration oder Zentrifugierung abgetrennt. Ein weiterer Zusatz von Ammoniumsulfat zu der Lösung bis zu einer Sättigung von Q£> bewirkt die praktisch vollständige Ausfällung der Uricase. Durch zweimalige Wiederholung dieses Verfahrens wird eine 10-bis 20-fache Erhöhung der spezifischen Aktivität des Enzyms erreicht. Mit dem Präzipitat können weitere f

Reinigungsoperationen wie Gelfiltration, Ionenaustauscher-Chromatographie usw. durchgeführt werden. Die gewonnene Uricase kann nach der Dialyse bej/iiedriger Temperatur luftgetrocknet oder gefriergetrocknet werden. Diese Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt und bilden kein besonderes Merkmal der Erfindung, so daß ihre Ausführung nicht näher erläutert zu werden braucht.

Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele eingehender beschreiben werden. Wenn nicht anders vermerkt, sind alle Prozentzahlen gewichtsmäßig angegeben. Die Aktivität der Uricase wird anhand der Verminderung des Absorptionsvermögens von Harnsäure bei 290mu bestimmt, wenn eine vorher festgesetzte Menge Harnsäure durch die Uricase bei 25°C und pH 8,5 zersetzt oder oxydiert worden ist. Eine Uricaseaktivitätseinheit entspricht somit einer Enzymmenge, die 1 Millimol Harnsäure in einer Minute bei 25°C und pH 8,5 zersetzt.

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Die spezifische Aktivität ist hier definiert als die Uricaseaktivität pro Absorptionseinheit der Enzymlösung bei 280 mu pro cm Lichtweg.

Beispiel 1

Ein Stamm von Candida utilis wurde der Submerskultur in einem Medium (pH 6,2) unterworfen, das 5 °/° Glukose, 4 % Getreideeinweichflüssigkeit und etwas anorganische Salze enthielt. Die Dauer betrug 36 Stunden, die Temperatur war 28⁰O. Die gewachsenen Hefezellen wurden gesammelt und bei 4-⁰C in eine 0,5%ige Glukoselösung gegeben. Nach Stehenlassen über Nacht wurden die Zellen abgetrennt und in einer Lösung (pH 7^) suspendiert, die 3 % Glukose, 0,03 % Harnsäure, 0,3 % NapHPO^ und eine sehr geringe Menge anderer Mineralsalze enthielt. Die Suspension wurde aerob 4- Stunden geschüttelt, um die Bildung von Uricase in den Zellen zu induzieren.

Dann wurden die Hefezellen durch Zentrifugieren abgetrennt und in nassem Zustand (Vassergehalt 75 %) in dem 10-fachen Volumen einer 2%igen wässrigen Natriumchloridlösung (pH 6,0, Ionenstärke 4,3) bei 6°C 18 Stunden suspendiert.

Die vorbehandelten Zellen wurden abgetrennt und in dem gleichen Volumen einer 1/50 molaren Boraxlösung (pH 9,2) suspendiert. Die Suspension wurde in einen Zellophanbeutel

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gegeben und dann gegen die Austauschboraxlösung mit der gleichen Konzentration 56 Stunden bei 6°C dialysiert.

Die Suspension in dem Beutel wurde zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert, wobei etwa 78 Gewichtsprozent der ursprünglichen Zellen erhalten wurden. Zu der so gewonnenen Lösung wurde Ammoniumsulfat bis zur 0,2-Sättigung zugesetzt und das erhaltene Präzipitat VBrwafen. Zu der Lösung wurde f weiteres Ammoniumsulfat bis zur 0,5-Sättigung zugesetzt, wobei die Uricase ausgefällt wurde. Die Ausfällung wurde mehrere Tage gegen eine Boratpufferlösung mit einem pH 8,4 dialysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Zusammenfassung der Extraktion und

partiellen Reinigung von Hefeuricase >

(1 kg Naßgewicht an Hefezellen) '

pH Aktivität Gesamt- spezifische pro ml aktivität Aktivität

Extrakt 9,2 3,6 3820 0,08 Nach Reinigung

durch Aussalzen

mit Ammonsulfat

und Dialyse 8,2 21,0 3410 1,59

Beispiel 2

1 kg der Uricase-induzierten Hefezellen, erhalten nach 2098U/1168

Beispiel 1, wurden in die 5-f^ache Menge einer Ammoniumsulfatlösung mit 0,45-Sättigung (pH 5 »6, Ionenstärke 7»77» 6 C) gegeben und 24 Stunden stehengelassen. Die Zellen wurden dann abgetrennt, durch Waschen mit Wasser mit Hilfe der Zentrifugierung so weit wie möglich von Ammoniumsulfat befreit und dann in dem 10-fachen Volumen einer 1/50 molaren NapCO^-Lösung suspendiert (Anfangs-pH-Wert 10,4, Ionenstärke ca. 0,06). Nach 48-stündiger Behandlung bei 10°G wurde die Suspension zentrifugiert und die Uricase in der Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigung zwischen 0,2 und 0,55 fraktioniert ausgefällt. Das so erhaltene Präzipitat wurde in dem halben Volumen des ursprünglichen Extraktes gelöst und wieder wie oben mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Die Gesamturicaseaktivität betrug 3670 und die spezifische Aktivität 1,02.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Uricase, dadurch gekennzeichnet, daß Uricase enthaltende Hefezellen in eine wässrige Lösung eines anorganischen Salzes mit einer Ionenstärke von mehr als 2,0 und einem pH-Wert von 3 *>is 8 bei einer Temperatur unter 15°G eingetaucht werden und die so behandelten Zellen anschließend der Extraktion mit einer wäss- ä rigen Lösung eines anorganischen oder organischen Salzes mit einer Ionenstärke von weniger als 1,0 und einem pH-Wert von 7 bis 11 bei einer Temperatur zwischen 15°C und O⁰C unterworfen werden, wodurch die Uricase aus den Zellen in die Extraktionslösung eluiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als anorganisches Salz bei der Vorbehandlung und der anschließenden Extraktion Ammoniumsulfat, Diammoniumhydrogenphosphat, Ammoniumdihydrogenphosphat, Ammoniumchlorid, Natriumchlorid, Dinatriumhydrοgenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Natriumsulfat, Kaliumchlorid, Calciumchlorid oder Ma^e^nsiumchlorid verwendet wird.

3- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Eintauchen der Hefezellen während mehr als 8 Stunden erfolgt·

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4. Verfahren, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Extraktionslo sung eine lonenstärke von 0,02 bis 0,04 und eineit, pH-Wert von etwa 8 besitzt.

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