DE1642653A1

DE1642653A1 - Fermentationvsverfahren und -vorrichtung

Info

Publication number: DE1642653A1
Application number: DE19671642653
Authority: DE
Inventors: Atsuo Kitai; Asaichiro Ozaki; Hiroshi Fujusawa Tone
Original assignee: Sanraku Ocean Co Ltd
Current assignee: Sanraku Ocean Co Ltd
Priority date: 1966-10-06
Filing date: 1967-10-06
Publication date: 1972-01-05
Also published as: DE2037903A1; DE2037903B2; DE1642653C3; DE1642653B2; DE2037903C3

Description

Ferment ation svorfahren und -vorrichtung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahren unter Verwendung einer mehi»3tufigen Forraentetionsvorrichtung, welches die Stufe der aeroben oder anaeroben Züchtung von Mikroorganismen umfasst« wobei die Vorrichtung einen Satz von senkrecht Übereinander angeordneten Kammern aufweist, die durch horizontal angeordnete« mit einen oder mehreren Löchern versehene Platten getrennt sind. Die Erfindung betrifft auch die Perraentationsvorrichtung.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahreh unter Verwendung einer mehr3tufigen Fermentationsvorrichtung und insbesondere ein Fermentationsverfahren/ gemäss welchem Mikroorganismen aerob oder anaerob in einer Perraentationsvorrichtung gezüchtet werden» die mit einer oder mehreren Platten

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(Art. 711 Atai 2 Nr. 1

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ausgestattet ist, die oich horizontal durch dleae hinduroh erstrecken, wobei jede dieser Platten eine oder mehrere öffnungen aufweist.

Industriell wird die mikrobiologische Fermentation gewöhnlich nach einem diskontinuierlichen Verfahren durchgeführt. Kontinuierliche Verfahrenstechniken wurden angestrebt, wobei entweder ein einziger Fermenter verwendet wurde oder mehrere in Serie angeordnete solche Fermenter verwendet wurden» doch wurde keine Technik so vollständig entwickele, dass sie für technische Zwecke geeignet wäre. Allgemein wird ein kontinuierliches Verfahren mit einem einzigen Fermenter im Falle der mit Wachstum verbundenen Fermentation durchgeführt, in der die Bildung eines gewünschten Produkts zusammen mit dem Wachstum des Mikroorganismus in dem Kulturmedium stattfindet. Es wird auch mit mehr als zwei Fermentern im Falle nicht mit Wachstum verbundener Fermentation durchgeführt, bei der die Bildung eines gewünschten Produkts nicht bei dem Wachstum des Mikroorganismus erfolgt,sondern nach Beendigung des mikrobiellen Wachstums ψ stattfindet. Zn diesem letzteren Falle muss die kontinuierliche Pigmentation, mit mehr als zwei Fermentern durchgeführt werden, wobei in jedem von diesen eine besondere Züchtungsphase, die von den anderen verschieden ist, vorgenommen wird« so dass das mikrobielle Wachstum und die Produktbildung getrennt während des Verfahrens stattfinden. Dies erfordert jedoch zusätzliche Einrichtungen , wie beispielsweise ein Belüftungssystem, eine Vorrichtung zum Bewegen, eine Dosierpumpe usw. mit einer Ka pa-

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zit&t» die der Anzahl der verwendeten Permenter proportional 1st. Bei« Einsatz im technischen Maeestabe let die zur Durchführung des Verfahrens auf der Basis eines stationären Zuetands erforderliche Anlage sehr kostspielig.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahren« bei welche« ein Permenter verwendet wird, der mehrere Kammern aufweist und neuartige Betriebscharakteristiken hat. Durch diese Charakteristiken können bessere und wirksamere Ergebnisse erzielt werden. Mit dieser Vorrichtung können nicht nur diskontinuierliche und kontinuierliche Verfahren mit Erfolg durchgeführt werden« sondern es können auch synchrone Züchtung und Gewinnung der Zellen sehr wirksam vorgenommen werden. Ausserdem können durch diese Vorrichtung die oben genannten Nachteile der bekannten kontinuierlichen Verfahren sowohl in wirtschaftlicher als auch in funktloneller Hinsicht aufgrund der folgenden vorteilhaften Merkmale vollständig ausgeschaltet werden: (1) Die Vorrichtung weist eine einfache Konstruktion auf j (2) sie erfordert nicht notwendigerweise eine Vorrichtung zum Bewegen, da die Flüssigkeit durch Belüftung gut gerührt wirdι (2) sie erfordert keine Pumpe zur Überführung der Brühe von einem Gefäss in ein anderesι (4) es iet leicht* den stationären Zustand aufrechtzuerhalten; (5) der Betrieb ist einfach und leicht zu automatisieren; (6) das Kühlen und Erhitzen erfolgt mit hohem Wirkungsgrad aufgrund der grossen wärmeübergangs fläche Je EIn-

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he it Innenvolumenj (7) wird ein festes Substratmaterial bei der Fermentation verwendet (im folgenden als "Feststoff-Fermentation" bezeichnet), bo werden die dispergieren Feststoffteilchen in der Säule durch den Betrieb der WährStufenvorrichtung gehalten, wodurch gewöhnlich eine gute Ausbeute im Verhältnis zu den eingesetzten Rohmaterial erzielt wird« da wenig Materialverlust durch den überlauf der Flüssigkeit auitrittj (8) bei der Feststoff-Fermentation ist es weder erforderlich, das Material zu pulverisi3ren noch ein Lösungsmittel, das für den Mikroorganismus schädlich sein kann, zu verwenden. Ein anderes bedeutendes Merkmal bei einem kontinuierlichen Betrieb ist, dass bei dem erfindungsgemässen Verfahren das Zellenalter in der abgezc nen fermentierten Brühe enger in Beziehung zu der durchschnittlichen Verweilzeit gehalten wird als bei einem einzigen Rührbehälter, bei welchem das Zellenalter in der fermentierten Brühe zwischen N.ull und unendlich liegt.

Die für das erfindungsgemässe Verfahren verwendete mehrstufige Fermentationsvorrichtung be3teht im wesentlichen aus einer das Gehäuse des Fermenters bildenden Säule und einer oder mehreren Platten, von denen jede mit einem oder mehreren Löchern versehen ist, wobei die Platte oder Platten horizontal quer zu dem Fermenter angeordnet ist bzw. sind, so dass dieser in Abschnitte unterteilt iefc. Baulich gesehen wex«den die Oehäuseabsohnitte des Fermenters, von denen jeder an beiden Enden offen und ge-

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flanscht ist« aufeinander gesetzt* wobei eine mit einem Looh oder Löchern versehene Platte jeweils zwischen zwei Abschnitte eingesetzt wird/ so dass eine Reihe von Kammern gebildet wird» die durch Abdecken des oben und unteren Endes verschlossen werden. (Wenn im folgenden von der ersten Kammer» zweiten Kammer usw. die Rede ist« so ist Jede Kammer vom Boden aus nach aufwärts numeriert.) Die Vorrichtung weist Einlass- und Auslassöffnungen an beiden Enden für sowohl Luft als auch Medium auf, sowie Heiz- und KUhleinrlchtungen (z.B. einen Mantel), ein Thermometer* Rohre (oder Hähne) zur Probeentnahme und andere Hilfseinrichtungen, die nützlich sein können.

Der Fermenter wird nun unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher beschrieben. Es zeigen:

Flg.1 einen Axiall&ngsschnitt durch den für das erflndungsgemässe Verfahren verwendeten Fermenter;

Fig.2 eine Draufsicht auf eine mit Löchern versehene Platte;

Fig. 3 einen Axlallängaechnitfc durch eine andere AusfUhrungsfown des für das erfindungsgeiaäSiae Verfahren verwandeten Fermenters i

. 4 eine graphiäsoft« Baimt^ltimg dar Hesishung zwischen der ation ιηχά der äureh^ohtilttilJksii Vsfweil&äifc In Km-tm? Im Verglaiuh zu einer WaeiHöt'*£äii&vi2»tfe bsi d:la»ko»^ llQhu&s, gmuäss Versuch h-, al® aaigt, uA&n die

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Zellenkonzentration bei einem kontinuierlichen Verfahren unter Verwendung des Mehretufenferraenters gernäss der vorliegenden Erfindung einen stationären Zustand erreichtj

Fig. 5 den Betriebszustand innerhalb jeder Kaniner des Permentere« das Kulturmedium sioh in der Fermentation befindet;

Fig. 6 die Gesamtströmungscharakteristiken des Ferment or s in Eezug auf verschiedene Kombinationen von Lochdurchraeseer einer Platte mit dem Verhältnis des öffnungsquersohnltts Jeder Platte zu dem Oesamtquersohhitt dieser Platte unter Verwendung von gewöhnlichem Wasser gemäss Versuch tj und

Fig. 7 ebenfalls die Geaaifltströmungacharakteristiken eines Fermenters in Bezug auf verschiedene Kombinationen des Lochdurchmeesers einer Platte mit dein Verhältnis des öffnungsquerschnitts ,jeder Platte zu dem Gesamt querschnitt der Platte unter Verwendung einer tatsächlichen fermentierten Brtlhe gemäss Versuch 2.

Bs sei nun auf Fig. 1 Bezug genommen» die im Vertikaischnitt einen zylindrischen mehrstufigen Fermenter zeigt _s der aus vier Kammern (1) besteht» die Übereinander mit den Platten (2) als Trennviandungen angeordnet sind. (Fig. 2 zeigt die Oberfläche ölner Platte.) Jede Kammer kann mit ainer Temperaturreguliereinrichtung, wie beispielsweise ©ineia Mantel (5) und einer elektrischen Heizung, ausgestattet sein und das KopfetUck (5) sowie der Boden (6) sind mit einem Paar von Rohren (

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verbunden, die das Einströmen lind AbfHessen von Luft bzw. Medium ermöglichen. Diese Rohre können direkt an die Kammern angeschlossen sein* und in diesem Falle sind Abschlussteile (5) und (6) nicht erforderlich.

Der Fermenter weist gewöhnlich eine Anzahl von Kammern von einheitlicher Form und Grosse auf, die übereinander angeordnet sind, doch kann er auch Kammern, die in Form und Grosse verschieden sind, aufweisen. Die Hauptsache ist, dass der Fermenter durch eine Platte oder Platten unterteilt ist, von denen jede zumindest eine Öffnung aufweist. Die Grosse, Höhe und Breite des Fermenters kennen daher frei gewählt werden, und die Form der Kammer kann teilkugelig, wie in Flg. 3 gezeigt, oder oval oder kubisch sein. Es ist besser, dass der Gesamtaufbau eines solchen Fennentere, wenn alle Kammern verbunden sind, ein langgestrecktter ist. Bei einer speziellen AusfUhrungsform des Fermenters, wie er in den in einigen der folgenden Beispiele beschriebenen Versuchen verwendet wurde, weist Jede Kammer eine Höhe von 12 cm und einen Durchmesser von 7 om aufj jede Platte hat 100 Löcher von 2 mm Durchmesser, und" die Gesamtquerschnittsflache> die von den Löchern eingenommen wird, beträgt etwa 8 - 10 # der Gesamtquerschnittsfläche der Platte. Die hier angegebenen Werte sind lediglich ein Beispiel für die Beziehung des Lochdurchmessers mit dem Öffnungsverhältnis einer Platte zur Gesemtplattenquerschnittsflache. Die Kombination dieser Grossen variiert, wie im folgenden noch erörtert wird, in einem weiten Bereich.

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Die Gehäuse teile können aus Metall,Glas oder Kunststoff gefertigt sein. Bin transparentes Material ist jedoch zweckmässig, da das Innere des Fermenters während des Betriebs dann sichtbar 1st. Das Material, aus dem die Platten gefertigt sind, 1st ebenfalls frei wählbar, doch sollten die Bestandteile des Mediums und das infolge· der Fermentation erzeugte Produkt, die auf das Plattenmaterial wirken und dieses korrodieren können» in Betracht gezogen werden. Manchmal werden Drahtgewebeplatten oder poröse oder perforierte Platten verwendet. Die Gröeae von jedem Loch und die Anzahl der Löcher (Öffnungsquerschnittsfläche) werden durch solche Faktoren, wie Oröese des Fermenters und Art der gewünschten mikrobiellen Reaktion, bestimmt. Die Anzahl der Kammern wird durch die besten Bedingungen vom Standpunkt solcher Faktoren, wie gewünschter Fermentationatyp, Höhe und Volumen des Fermenters, Belüftungssystem, Druckabfall und dgl., bestimmt. Jede eingesetzte Platte kann mit den Flanschen der Gehäuseteile mit Dichtungen dazwischen verschraubt sein. Probeentnahme-, Besohickungs- und/oder Abzugsleitungen (oder Hähne) (7), die an einzelnen Kammern montiert sind, sind ebenfalle zur Kontrolle und Steuerung der Fermentation nützlich, da sie den Austritt oder Eintritt von flüssigem Inhalt ermöglichen. Ein Luftfilter ist wie bei den üblichen Fermentern vorgesehen. Schllesslich kann dieser mehrstufige Ferraenter entweder allein oder in einer Gruppe verwendet werden.

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Spezielle Merkmale dieser Ferraentationevorrichtung, wie sie oben beschrieben wurde, sind aus den folgenden Versuchen ersiohtlich:

Versuoh 1

Die wirkung der Plattenbeschaffenheit, d.h. des Durchmessers der Löcher und des Verhältnisses der perforierten Querschnittsfläche jeder Platte zur Gesatntquerschnittsfla'che dieser Platte* auf die Strömungscharakteristiken der für das erfindungsgensässe Verfahren verwendeten Fermentationsvarriehtung viurde untersucht. Die Vorrichtung war, wie in Fig. 1 gezeigt, mit perforierten Platten in vier Kammern unterteilt» von denen jede einen Dui*©haesser von 7 cm und eine Höhe von 12 cm aufwies. Wasser wurde mit einer Bate von 6 1 je Stunde in diese Vorrichtung vo» Boden aus eingepumpt und floss von der obersten Kammer ab. Andererseits wurde luft vom Boden durch die an diese» angebracht® Düse aiit einer Rate von 10 1 je Minute augeftihrt.

Wenn die Luft und die Flüssigkeit in stationärem Zustand strömten, wurde eine Tracer-Lösung von dem Waesereinlass aus durch £-funktionelles Einspritzen eingeführt. Die Änderung der Tracer-Konzentration wurde in bestimmten Zeitabständen am Auslass dieser Vorrichtung bestimmt, und es wurde so eine Empfindliohkeltskurve, d.h. Empfindlichkeit gegen Störung, erhalten. Die Gesamtströmungsaharakteristiken wurden durch die entsprechenden Zahlen der in.Reihe angeordneten Behälter ausgedrückt, wie es in Fig. 6 gezeigt 1st. Wenn jede Kammer der Vorrichtung sich unab-

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hängig von den. anderen In dem stationären Zustand mit Belüftung befindet» so wäre die entsprechende Anzahl von in Reihe angeordneten Behältern vier. Wenn jedoch irgendein RUckoisehen unter den Kammern stattfindet, so wäre die Anzahl weniger als vier. Dies bedeutet, dass sich ein mehrstufiger Fermenter gemäss der vorliegenden Erfindung in der gleichen Weise verhält wie die entsprechende Anzahl von in Serie angeordneten Behältern P mit gleichem Volumen.

Unter Verwendung der Platten mit Löchern mit 2 mm Durchmesser und einem Verhältnis von Gesamtlochquerschnittsflache in jeder Platte zur Gesaratplattenquerschnittsflache im Bereich von 1 bis 30 % wurde das Verhalten des Fersaenters nicht beeinflusst. Bei einem Lochdurchmesser von mehr als 3 am sollte Jedoch das Öffnungsverhältnis kleiner sein, um die Heterogenität in den Fermenter aufrechtzuerhalten. Aus diesen Versuch 1st zu schlieseen, dass sehr komplizierte Beziehungen zwischen dem Lochdurchnesser und dem Verhältnis der perforierten Querschnittsfläche einer Platte zu der Oesaratquerschnittsflache dieser Platte existieren« um einen optimalen Zustand fUr die Kombination von beiden zu erzielen. Der obige Versuch beruhte auf dem reinen Wasser-Luft-System, und die Situation wird daher durch das verwendete System weitgehend beeinflusst.

Versuch 2

Die Wirkung der Plattenbeschaffenheit, wie sie in Versuch 1 beschrieben ist, auf d.1e Strömungscharakteristiken eines erfin-

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dungsgemässen Fermenters wurde untersucht, wobei dieses Mal eine tatsächliche Fermentationsbrühe verwendet wurde*

Xanthomonas eampestoris E-J24 wurde bei JK)⁰C zwei Tage lang in einem Medium gezüchtet, das 3 £» u2.ur.ose> Ö»2 & Pe pt on, 0,2 % Fumarsäure* 0,2 % KH₂PO₂^ 0*2 # Ns₃CO₃ und 0*05 % MgSO^ . 7HgO enthielt und mit ITaOH auf pH 6,0 eingestellt war. Die oben erhaltene viskose Kulturbrühe wurde zur Bestimmung der StrÖmungs-Charakteristiken dieses Fermentes in der gleichen Weise wie in Versuch 1 beschrieben verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt.

Unter Verwendung der Platten mit Löchern mit 5 mm Durchmesser und einem öffnungsverhältnis in Jeder Platte im Bereich von 1 bis 40 % wurde die Hete^ogenität in dem Fermenter völlig aufrechterhalten. Bei einem Lochdurchmesser von mehr als 8 mm sollte dagegen das Öffnungsverhältnis kleiner sein, um die Heterogen! tat aufrechtzuerhalten.

Aue den obigen Versuchen 1 und 2 ist ersichtlich» dass eine solche Beziehung eine komplizierte Funktion der Flüssigkeitseigenschaften» wie Dichte, Viskosität und Oberflächenspannung» der Belüftungsrate» der Flüssigkeitsströmungsrate* des Abstands von einer Platte zu einer anderen,deε Durchmessers einer Platte (der Grosse des Fermenters) usw. ist. Die Wahl der Platte bezüglich der obigen Korabination von Lochdurchmesser und Off-

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nungsVerhältnis hängt auch von dem Fermentationsobjekt ab. Unter Berücksichtigung der oben beschriebenen Faktoren sollte die optimale Beschaffenheit einer Platte individuell bei jedem Versuch vor dem tatsächlichen Einsatz des Percenters bestimmt werden. Es 1st zwar sehr schwierig solche Plattenbeschaffenheiten zu verallgemeinern, doch liegt die am häufigsten angewendete Kombination im Bereich zwischen 1 und 20 mm bezüglich des Durchmessers der Löcher und 1 und 40 % bezüglich dee öffnungsVerhältnisses.

Versuch 3

Ein ZUohtungsmedium (pH 7*0), das je 1 1 g Oluooee, 0,5 g Hefeextrakt, 5*0 g m^Cl, 1,0 g NH₄NO,, 2,0 g Na₃SO₄, 0,1 g MgSC₄. 7H₂O, 3*0 g K₃HPO₄ und 1,0 g KH₂PO₄ enthielt» wurde In einen zylind erf örmigen Fermenter mit einer Höhe von 130 cm und einem Durchmesser von 7 cm eingebracht, der durch fünf quer angeordnete Platten gleichmäaslg in sechs Kammern unterteilt war.

Die Beimpfung wurde mit 5 VoI-£ einer Impfkultur von E. coil B-548* die 18 Stunden gezüchtet worden war, vorgenommen. Die zugefUhrte Luft strömte mit einer linearen Geschwindigkeit von 7 cm/Sekunde durch den Fermenter. Nach dem Beginn des mikrobiellen Wachstums füllte die Luft in jeder Kammer einen leeren Rsum im oberen Teil dieser Kammer gegen die unmittelbar darüber bs-

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findliche Platte aus. Eine bestimmte Menge Flüssigkeit, die in jeder einzelnen Kairoer gehalten wurde» wurde in Abhängigkeit von der Menge an zugeführter Luft» dem Durchmesser der Löcher* dem Öffnungsverhältnis in jeder Platte, den physifalisehen Eigenschaften der Flüssigkeit und dgl. bestimmt. Ss wurde diese bestimmte Menge Flüssigkeit in jeder Kammer gehalten, wobei selten Mischen mit der Flüssigkeit in der benachbarten Kammer auftrat. Auf diese Weise arbeitete jede Kammer getrennt und einzeln als einzelne Fermentationsvorriehtung.

Die Phasen von bakteriellem Wachstum in der Kultur in den jeweiligen Kammern wurden beobachtet und aufgezeichnet (nachfolgende Tabelle I). Zusammenfassend gesagt unterscheiden sich die Wachstumsphasen von einer Kammer zu einer anderen, und die Unterschiede zwischen den erhaltenen Werten liegen »usserhalb des Bereiche statistischer Fehler. Die Werte in Tabelle I geben die optische Dichteeinheit an (in nachfolgenden bezeichnet als U.O.D.: optische Dichte bei 610 πΐμ χ Anzahl von Verdünnungen)*

Tabelle I

Kammer

(vom Boden aus) U.O.P. zu verschiedenen Züchtungastunden

0 1 2 3 4

Nr. 1 0,10 0,220 0,421 0,756 1,02

Nr. 2 0,10 0,210 0,412 0,74} 0,98

Nr. 3· 0,11 0,207 0,410 0,735 0,95

Nr. 4 0,11 0,205 0,405 O_:731 0,95

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Versuch 4

Nach den obigen Arbeitsweisen wurde eine Fermentation in einem anderen ^ermenter durchgeführt, der dieses Mal in 10 Kammern mit in gleiohem Abstand angeordneten Platten unterteilt war, wobei jade Platte Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm und ein Öffnungsverhältnis von 11 % aufwies.

fe Nach 3-stündiger Kulturinitiierung wurde ein Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie in Versuch 3 mit einer konstanten Rate vom Boden des Permenters aus zugeführt. Die Verdünnungsrate, bezogen auf das Gesamtvolumen des? Mediums» betrug 1/5 je Stunde. Insbesondere wurde die Menge an zugefUhrtem Medium mo eingestellt, dass die Verdünnungerate in der Bödenkammer die maximale spezifische Wachstumsrate des Mikroorganismus nicht überstieg, überschüssige Flüssigkeit, die durch den Fermenter nach oben geführt wurde» floss voa oberen Ende über.

ψ Die Unterschiede in der Zellenkonzentration von einer Kammer zu der nächsten wurden mit fortschreitender Zeit ersichtlicher, und nach 17 bis 20 Stunden kam der Gradient in der Zellenkonzentration in einen stationären Zustand. Die Zellenkonzentration (U.Q.D.) bei diesem Zustand und der Nucleinsäuregehalt je U.O.D. in den einzelnen Kammern sind in Tabelle II angegeben. In Fig. 4 sind ebenfalls die Zellenkonzentrationen in einigen Kammern in Abhängigkeit von der durchschnittlichen Verweilzeit, zu Yergieichszwecken zusammen mit der Wach3tumskurve bei dis -kontinuierlicher Kultur, gezeigt.

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•Tabelle II

Kammer Zellenkonzentraticn Nueieinsäure (vom Boden aus) (U.0.D.) r-HNS/U.O.D.

Nr. 3 0,310 15*0

Hr. 5 0,492 10,0

Hr. 7 0,698 8*3

Hr. 9 0,792 8,0

Nr. 10 0,810 7*9

Die obigen beiden Versuche J und k zeigen* dass die raehr~ atufige Fermentatio&svorrichtung die folgenden Merkmale aufweist: Wenn Mikroorganismen in einem solchen Fermenter wie in Versuch > gezüchtet werden» wirkt jede Kammer als einzelner Fermenter* in welchem die Luft den oberen Teil des Raums angrenzend an die darüber befindliche Platte ausfüllt und hier als Kissen wirkt. Mit anderen Vierten« das Medium innerhalb einer Kammer wird durch Belüftung gründlich gemischt, doch mischt es sich kaum mit dem Medium in den benachbarten Kammern. Die Gehalte an Seilen variieren daher zwischen den einzelnen Kammern.

Wird andererseits das Kulturmedium mit einer bestimmten Rate vom Boden des Percenters aus eingeführt,, d.h. die Fermentation kontinuierlich durchgeführt* so ist die Verteilung der Zellen etwas anders. Während das Medium in jeder Kammer gut gerührt und gemischt wird, bewegt sich eine gewisse Menge des Mediums, die der vom Boden aus einströmemnden Menge entspricht, aufwärts von einer Kammer zu der nächsten durch die Locher in der oberen PlafcVe. Hiei^ei hindern Foktoran_r ι*ίη tfie Eei.tnang an der PlaV.to :V.£ 109882/0298

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der Flüssigkeitsgehaita die Belüftung und dgl.* das Medium am Äufströmen und bewirken So₅ dass die Luft den oberen Teil einer Kammer unter der oberen Platte ausfüllt ₉ wie wenn alle Kammern gesondert wie oben beschrieben betrieben werden. Diese Bedingungen sind in Fig. 5 gezeigt. Die AufwSrtsströraung und Zufuhr des Mediums werden jedoch quantitativ durchgeführt. Wenn das Medium in jeder Kammer gründlich gemischt ist_s nimmt die Strömung des Mediums als Ganzes die deutliche Form einer Kolbenströmung . Das Medium wird so nach oben gedrückt und am oberen Ende des Fermenters quantitativ abgezogen. Das gleiche Prinzio kann auf den Betrieb mit einer Batterie von Fennentern * die in Reihe angeordnet sind« angewendet werden.

Der Versuch 4 zeigt, dass* wenn das Wachstum den stationären Zustand erreicht, jede Kammer Zellen bei der durchschnittlichen Verweilzeit hält. Die Zellenkonaentration variiert daher mit den Kammern. Spezieller ausgedrückt erfolgt die Züchtung kontinuierlich unter solchen Bedingungen* dass die gellen sich am Boden stets am Beginn ihrer logarithmischen Wachstumsphase befinden, diejenigen in der Mitte in der Zwischenphase und diejenigen am oberen Ende in der Endphase» und zwar durch eine geeignete Korabination der Strömungsrate des Mediums mit der Zellenwachstumsrate. Wird ein gewünschtes Produkt bei dem Zellenwachstum oder bei einer gewissem Periode der Wachstumsphase gebildet« so tritt die unterschiedliche Verteilung der Produktkonzentration in der gleichen Weise auf.

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Die Tatsachea dass der Unterschied in der Zellenkonzentration in den jeweiligen Kammern nicht nur auf physikalischen Faktoren beruht, wurde mittels der biologischen Aktivitäten von Zellen nachgewiesen., die aus den Jeweiligen Kammern entnommen wurden„ beispielsweise durch den Nucleinsäuregehalt der gellen. Es 1st wesentlich* dass beim Betrieb jeder Kammer als einzelne Fermentlervorriehtung in einem kontinuierlichen Verfahren das Verhältnis des Volumens der Kammer zu der Strömungsrate des Mediums* d.h. die Verdünnungsrate* die maximale spezifische Wachstumsrate des Mikroorganismus nicht übersteigt. Die aus dem Oberlauf erhaltenen Zellen haben daher unter stationären Züchtungsbedingungen eine gewisse durchschnittliche Verweilzeit oder ein gewisses Zellenalter. Je mehr der Fermenter unterteilt ist, um so mehr arbeitet das Gesamtverfahren nach einem perfekten Kolbenströmungsmuster und umso deutlicher wird das Muster des Zellenkonzentrationsgradienten. Dies kann sowohl theoretisch als auch experimentell nachgewiesen werden.

Es wurde ein kontinuierliches Verfahren beschrieben* bei weichem das Medium vom Boden des Fermenters aus eingeführt wird/ doch kann das gleiche Grundverfahren stattdessen auch umgekehrt unter Einführung des Mediums vom oberen Ende her ohne Sinbusse der vorteilhaften Charakteristiken des bereits beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden. In diesem zweiten Falle tritt die Verteilung der Zellen natürlich vom oberen Ende nach dem Boden zu auf. Bei anaerober Fermentation wird durch Inert-

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gass> wie beispielsweise Stickstoff oder Kohlendioxyd und/oder im Verlaufe der Fermentation entwickelte Gasblasen der gleiche Effekt wie mit Luft oder Belüftung bei aerofcer Fermentation erzielt.

Die Schaffung der oben beschriebenen neuen Fermentationsvorrichtung ermöglicht ein neues Fermentaticnsverfahren unter Anwendung der oben beschriebenen Charakteristiken auf dein Gebiet der mikrobiologischen Reaktionen, die sich von rein chemisches Reaktionen unterscheiden. Einige Beispiele filr Fermentationsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemässen Vorichtung und verschiedener Arten von Materialien werden im folgenden angegeben ί

(1) Übliche Fermentation

Viele Untersuchungen und Studien der üblichen Fermentation wurden bereits durchgeführt.» doch wurde bei keiner ein Verfahren* wie das erfindungsgemSsse, angewendet. Dieses wird in besonders wirksamer Weise auf ein kontinuierliches Fermentationsverfahren angewendet. Zu Beginn wird das Medium wie bei einem diskontinuierlichen Verfahren in einen Fermenter eingeführt ₃ mit dem gewünschten Stamm von Mikroorganismen geimpft und unter Belüftung bei einer geeigneten Temperatur gezüchtet. Es ist kein Bewegen erforderlich» da die Platten mit den Löchern diese Arbeit erledigen. Nach einer gewissen Zeitspanne wird zusätzliches Medium in einer Volumenmenge, die von der Kapazität des Fermenters und der speziellen Wachstumsrate des Stamms ab»

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hängt, eingeführt? um die gewünschte Endbrühe am Auslass des Fermenters zu erhalten» Wie in Versuch ¹I gezeigt.-» variiert das Sellenalter von Kammer zu Kammer, und die £ellenalterverteilung im überlauf hat grosse Ähnlichkeit mit einer Kolbengangscharakteristik . Es ist leicht ersichtlich,, dass ein kontinuierliches Verfahren sich im Vergleich zu einem diskontinuierlichen Verfahren durch seine hohe Produktivität auszeichnet.

(2) Feststoff-Fermentation

Es existieren einige Berichte über Fermentationen* bei welchen feste Materialien verwendet werden* doch wurden sie kaum für den industriellen Gebrauch entwickelt mit Ausnahme der Steroidfermentation. Die Fermentation von aromatischen Substanzen, wie beispielsweise Naphthalin und Anfchracan* die Verwendung von festem Paraffin bei der Fermentation und die Oxydation von Steroiden sind einige Beispiele für Feststoff-Fermentationen« die in gewissem Ausmass erfolgreich im Labormassstab durchgeführt wurden. Bei Durchführung in technischem Massstab treten jedoch verschiedene Probleme auf,und es werden nicht immer adäquate Ausbeuten erzielt. Ein wesentliches Problem bezieht sich auf die Behandlung von festen Materialien. Die genannten festen Materialien sind solches die in Wasser unlöslich oder wenig löslich sind. Bin Mikroorganismus würde nur den sehr kleinen Anteil der schlecht löslichen Materialien der sich im Wasser löst» assimilieren und daraus ein gewünschtes Produkt produzieren. Es ist daher sowohl theoretisch als auch experi-

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raentell nachweisbar* dass die Auflösungsrate des Materials in Wasser der begrenzende Faktor für die Waehstumsrate der Mikroorganismen und die Produktionsrate eines geviUnschten Produkts wird und dass die Produktivität je Zeiteinheit im Langzeitbetrieb niedrig ist. Zur Erhöhung der Auflösungsrate des festen Materials wird das Material verflüssigt* indem es erst pulverisiert wird, um eine grosse Oberfläche zu sohaffen^ und dann eine grosse Menge in V/asser gegeben wird oder indem es in einem Lösungsmittel vor dem Einbringen in Wasser gelöst wird und sohliesslich durch kräftiges Bewegen.

Dieses Verfahren erfordert nicht nur einen ausserordentlichen Zeitaufwand und Auftaand an Arbeit und Ausrüstung,, sondern führt auch zu einem beträchtlichen Materialverlust. Das Lösungsmittel beeinträchtigt häufig das Wachstum der Mikroorganismen _s ferner treten Probleme bei der Wahl der Materialien bezüglich der Quantität und Qualität auf-, und schliesslich sind die Kosten sicher nicht zu vernachlässigen. Zusätzlich zu den obigen Problemen neigen die in Wasser gegebenen pulverisierten Materialien manchmal dazu« in den kolloidalen Zustand überzugehen. Bsi Anwendung in grosser Menge gehen auch nicht verwertete feste Materialien in der abgezogenen KulturbrUhe verloren. Dieses Problem tritt sowohl bei diskontinuierlichen als auch bei kontinuierlichen Verfahren auf, doch inabesondere bei letzteren, da eine gewisse Menge an Medium aus der Fermentationsvorrichtung abfliesst.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Überwindung aller oben genannten Probleme. Bei dem diskontinuierlichen Verfahren

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braucht der Fermenfcer keine spezielle Einrichtung zur Fulverisierung Gder Emulgierung des festen Materials aufzuweisen, und es wird eine grössere Menge an festem Material als gewannlieh verwendet. Dies erhöht im Verhältnis den Oberflächenberelch des festen Materials je Einheit an Menge Medium und beschränkt die Wachsturasrate des Mikroorganismus nicht, wodurch die Beschränkungen überwunden werden* die bei dem gewöhnlichen Feststoff-Perraentationsverfahren leicht auftreten. Dann wird ein Medium in den Permenter eingeführt ₉ das gewisse für das Wachstum des Mikroorganismus wesentliche Bestandteile enthält, und die Temperatur wird,, wenn die Fermentation erfolgt ₃ eingestellt und Luft eingesprüht. Bei des diskontinuierlichen Verfahren ist es nicht erforderlich, dass jede Kammer als solche wirkt* und es besteht eine freie Wahl bezüglich der Grosse und des perforierten Bereichs einer Platte. Die Löcher können gross sein. Es kann sogar ein grobes Drahtnetzt verwendet werden. Die Wahl erfolgt je nach den Mikroorganismen und dem verwendeten Material. Die Platten erfüllen hier mehrere Aufgaben, na*m~ lieh, das Material in dem Medium zu halten« die vom Boden her eingeführte, aufwärts strömende Luft zu zerteilen, so dass sich die Luft in dem Medium in allen Richtungen ausbreitet * und so das Medium und die Luft in engem Kontakt zu halten, was zu einer hohen Sauerstoffübeffülirungsrate führt.

Nach der Fermentation wird die fermentierte Brühe abgezogen und dem Isolierungsverfahren des Produkts unterworfen. Nach Abziehen der flüssigen Phase bleibt festes Material in dem Fer-

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menter, das nicht mit dem Mikroorganismus reagiert hat, und eine weitere Fermentation kann durch einfache Zufuhr des Mediums durchgeführt werden. Dies kann viele Male wiederholt werden, bis das verbleibende feste Material vollständig verbraucht ist. So wird das Verfahren in diesem Fermenter frei von den Nachteilen durchgeführt,, die stets gewöhnliche Fermentationsverfahren unter Verwendung fester Materialien beeinträchtigt haben.

Das kontinuierliche Verfahren wird in der gleichen Weise wie das diskontinuierliche Verfahren begonnen. Hier ist es jedoch wesentlich _s dass jede Kammer gesondert und einzeln arbeitete und es kann erforderlich sein/. Platten mit kleineren Löchern zu verwenden, jedoch ohne sie so klein zu machen? dass ein Verlust an Luftdruck bewirkt wird oder Fremdelemente die Löcher verstopfen und eine glatte Strömung der Flüssigkeit verhindern können und dgl.. Die Grosse der Löcher und des perforierten Bereichs einer Platte sollten durch solche Faktoren bestimmt werden» wie die Höhe der verwendeten Säule, ihren Querschnitt, das Verhältnis von Säulenhöhe zu Querschnitt„ den Abstand von einer Platte zu einer anderen (Höhe einer Kammer)/ die physikalischen Eigenschaften des zu verwendenden Mediums, die zugeführte Luftmenge» die Art der Fermentation und dgl.. Diese werden vor Beginn des Verfahrens bestimmt.

Eine gewisse Zeit nach Inoculation des Mikroorganismus und nach Beginn der Fermentation wird zusätzliches Medium vom Boden aus quantitativ unter Belüftung bei einer gesteuerten Temperatur

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zugeführt* und die Fermentation wird so kontinuierlich so lange als gewünscht durchgeführt. Die Belüftung bewirkt ein gründliches Bewegen des Mediums in jeder Kammer, überschüssiges, durch die Zufuhr vom Boden her nach oben gepresstes Medium fliesst am oberen Ende über₃ wobei dessen Menge der zugeftihrten Menge entspricht. Sehlieslsieh wird ein Zellenkonzentrationsgradient von der Bodenkammer zu der Kammer am oberen Ende in Richtung der Mediumströmung erzeugt.

Wird ein festes Material als einzige Kohlenstoffquelle für den zu züchtenden Mikroorganismus verwendet, so sollte dieses in die einzelnen Kammern vor Beginn des Verfahrens eingebracht werden. In diesem Falle wird die Menge, die in jede Kammer einzubringen ist;, durch die Beziehung von Zellenalter zu dem zu verbrauchenden festen Material bestimmt. Wenn das Material keine direkte Fermentationsquelle sondern Substrat ist, auf welches ein durch den Mikroorganismus während der Fermentation erzeugtes Enayni wirkt {bei der Steroidoxydation), und die Produktion von Enzym eine gewisse Beziehung zu dem Zellenalter hat, verläuft die kontinuierliche Fermentation mit einem mehrstufigen Fermenter noch vollständiger. Mit anderen Worten, die Wirkung eines durch einen Mikroorganismus erzeugten Enzyms kann in wirksamer Weise dadurch Induziert werden, dass das Material nur in die Kammern eingebracht wird, die Zellen eines gewissen Alters, die dieses Enzym erzeugen» enthalten, da das Zellenalter in den jeweiligen Kammern variiert. Da3 kontinuierliche Verfahren kann fortgeführt werden, bis das Material vollständig verbreuoht ist.

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p) Fermentation bei Erdölpz'odukten

Aufgrund der UnlSslichkeit von einigen Materialien treten bei der Verwendung von Erdölprodukten zur Fermentation in technischem Massstab Probleme auf. Mikroorganismen werden zur Entschwefelung oder Entparaffinierung von öl vsrwenclet sowie in Erdölprodukten gezüchtet _s und der erfiridungsgemMsse irehrstufige Fermenter kaiin mit Vorteil bei solchen ^erfahren verwendet werden,

Bei dei· kontinuierlichen Fermentation in Üblichen Fermentern erfolgt keine vollständige Assimiiiorung von Erdölprodukten₂ und es ist schwierig* ölrÜGkstMnde von den Bekterienzellen in der tiberfliessenden KulturbrUhe abautrennen, Ein Verfahren unter Verwendung eines Fermenters gemäss der vorliegenden Erfindung ermöglichte dass der obere Teil des Fermenters als vollständiger Assimilator fUr ölrückstände «irkti so dass die Seilen darin vollständig ausgewachsen sind \xnä die abgezogene Kulturbrühe hauptsächlich aus Wasser besteht.

Zur Entschwefelung oder Entparaffinierung, int ein kontinuierliches Verfahren unter Verwendung sines mehrstufigen Fermenters vorteilhafte um eine Endbrühe mit dem erwarteten Ausmass an Reaktion zu erhalten. Mit zumindest einem Erdölprodukt, das in dem Medium leicht emulgiert und kontinuierlich vom Boden des Fermenters aus eingebracht wurde,- kann die Fermentation unter Belüftung und Einstellung der Menge an zugeführtera Medium so durchgeführt warden, dans ein« Bi'tthe erhalten wird« die ein

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einheitliches Reaktionsausraass aufweist. In diesem Fall wird ebenfalls die Verteilung des Alters der fellen festgestellt, und die erhaltenen Zellen habsn eine gewisse ermittelte Qualität . "

synchrone Fermentation

Wie bereits wiederholt erwähnt wurde,* weist bei Durchführung eines kontinuierlichen Verfahrens in einer mehrstufigen Fermentationsvorrichtung geraäse der Erfindung das Medium in jeder Kammex* eine Kulturphase, die von denjenigen in anderen Kammern verschieden ist_s auf. In manchen Fällen erfordert die Fermentation die Anwendung einer synchronen Methode _s um die optimale gellenvertellung zu erzielen. Es wurde beispielsvieise festgestellte dass eine Extraktion von Ribonukleinsäure aus Hefesellen wirksamer am Ende der logarithmischen Wachstumsphase des Stamirs durchgeführt werden kann, lfm dies zu erreichen* wurden einige Vorrichtungen und Verfahren ausgestaltet _g um Zellen des optimalen Alters bei kontinuierlicher Fermentation zu erhalten» Die erfindungsgemässe Methode und Vorrichtung sind jedoch neu. Die Arbeitsweise ist die gleiche wie bei der sonstigen Fermentation, und die Zufuhrmenge und -rate* die Kapazität der jeweiligen Kammern und Anzahl der Platten werden demzufolge so bemessen und bestimmt_!? dass die fermentierte Endbrühe auf den Endzustand der logarithmischen Wachstumsphase gebracht wird.

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Vile bereits dargelegt wurde _s kann die erfindungsgeniSssa Fermentationsvorrichtimg aufgrund iiirsr besonderen Qualität sehr wirksam bei verschiedenen kontinuierlichen Fermentationsverfahren angewendet werden. Neben der hohen Wirksamkeit sind die Kosten de.r erforderlichen Anlage gering* und es wird ©ine hohe Ausbeute je Einheit in allen Fällen erzielt.

Es ist ferner ein wesentliches Merkmal des in der Fermentationsfe teehnlk verwendeten Grund ve rf ahrens,, dass die rnikrobiellen Zellen in einem Medium oder einer Suspension nach Beendigung der Fermentation von dem Medium oder der Suspension abgetrennt werden müssen. Dies erfolgt gewöhnlich durch Zentrifugieren und Filtrieren. Weder das Zentrifugieren noch das S'iltrieren kann jedoch zur Isolierung von reinen Bakterienssellen führen·, da auch andere feste Substanzen als die Zellen in dem Medium gesammelt werden^ und es ist schwierig solche Substanzen von den Zellen durch Waschen abzutrennen. Wenn eine spezielle Form von Zellen gewünscht wird oder beispielsweise für einen technischen Zweck nur eine Sporensuspfnsion vervjendet werden soll, ermöglicht es weder das Zentrifugieren noch das Filtrieren, Sporen von vegetativen Zellen abzutrennen. Wenn die Zellen als industrielle Materialien für die Produktion von Enzymen verwendet werden sollen* ist es erforderlich, nur die gezüchteten Zellen, die eine spezielle Eigenschaft haben, zu sammeln, beispielsweise diejenigen mit einem hohen Nucleinsäuregehalt oder nach Entfernung von autolysierten Zellmaterialien hochgradig aktivierte

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l'ic-j · le«. übliche l5o3ie:inmjjsra©thodQn können diese Erfordernisse nicht öi'i'iiilen. Aussserdem ist es vom fachlichen Staiidkpunkt aus, ■beispielsweise vom physiologischen* immunologischen? cytolo-Cisohen und mikrobiologischen Standpunkt aus, häufig erforderlich, i'Girie Bakterienseilen an gewinnen. Eisher wurde keine perfekte Methode sur Abtrennung solcher Zellen bekannt.

'&qX imUörsuohungen= die auf die Konzentrierung, ilev/innung und/ oder Isolierung von Bakterienseiliin mit spezifischen JBigensohaf-

i;oj». gerichtet waren? wurde gefunden» dass diese Zwecke und Erfordernisse durch Verwendung eines mehrstufigen Fermenters erroiohv werden können_: in welchen eine Eakteriensellensuispension uder eine Suspension von Sellfraktionen eingeführt wird. Diese Rüspenqion wird vom Boden her belüftet, um einen Schaum zu bilden. Zellen oder Proteinteilchen werden an der Oberfläche des Schauras geraäss ihrer Ladung adsorbiert. Diese Bakterienzellen werden in dem Fermenter aufwärts fraktioniert, konzentiert und/oder verteilt.

Ira einzelneren wird die Eaktex-ienaellen suspension oder die Suspension von Zellfraktionen in einen mehrstufigen Fermenfcer eingeführt, in den erforderlichenfalls ein Schäumungsraittel eingeführt wird und der vom Boden her belüftet wird. Diese BaIcteriensiellen oder Zellen Traktionen werden* wenn die Suspension schäumt, an der Oberfläche des Schaums in einer gewissen Rate Je

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nach der Zusammensetzung der Suspension, der Anordnung des Schaums, der Art des Sehäumungsmittels und dergl. verteilt, wobei die Konzentrationsrate von der jenigen in einem flüssigen Medium verschieden ißt* und der Schaum geht durch die Löcher in joder Trennplatte nach oben in die unmittelbar darüber befindliche Kammer _t in der er in Kontakt mit dem Medium kommt* und weiter nach oben durch das Medium in dieser und durch eine weitere Platte und so weiter, bis er das obere Ende des Fermenfe ters erreicht.

Im stationären Zustand findet keine Änderung in der in jeder Kammer enthaltenen PlUssigkeitsmenge statt, und das Kedium aus der oberen Kammer strömt* wenn der Schaum sich von einer Kammer in die nächste nach oben bewegt, in einer Menge herab, die derjenigen des FlUssigkeitsgehalts des Schaums entspricht. D.h., der Schaum steigt auf, während das Medium sich abwärts bewegt, und es findet an jeder Teilerplatte zwischen den beteiligten Kammern eine Wechselwirkung der Mediumlö'sung statt. ψ An dieser Verbindungsstelle werden die Bellen, wenn die Zellenkonzentration an dem Schaum höher als diejenige in dem Me-■ dium ist, nach oben gedrückt. Wenn die Zellenkonzentration in dem Medium höher als diejenige an dem Schaum ist, tritt ein entgegengesetzter Effekt auf. Die Konzentration von Zellen an dem Schaum differiert im Grad nach solchen Faktoren, wie Typ des Mediums, verwendeten Bakterienzellen oder Zellfraktionen und Art des Sehäumungsmittels und pH-Wert. Diese Bedingungen

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sollten durch Vorversuch© vorher eingestellt werden. Es können so Zellen mit einer spezifischen Eigenschaft konzentriert und/ oder fraktioniert «erden. Dieses Verfahren kann noch wirksamer durch wiederholte Zyklen des oben beschriebenen Verfahrens durchgeführt «erden. Wenn dagegen das Medium oder die flüssige Phase gebraucht vjlrd₃ kann sie aus den Kammern, in denen der Zellengehalt gering 1st, entnommen werden.

Die erfindungsgemässe Fermentationsvorrichtung kann so zum Sammeln und Abtrennen gewünschter Zellkörper verwendet werden« wobei im allgemeinen ' mehr als 90 # der uesamtzellen abgetrennt und/oder fraktioniert werden* ohne dass eine nachteilige physikalische und chemische Beeinflussung durch Erhitzen, durch grössere Änderungen des pH-Werts und dgl. auftritt. Ausserdem können die Zellen erforderlichenfalls anschliessend mit höherem Wirkungsgrad als bei den Üblichen Methoden filtriert oder zentrifugiert werden. Einfache Betriebsweisen bei der Durchführung eines kontinuierlichen Verfahrens sind ein weiterer /orteil der vorliegenden Erfindung. Im Gegensatz zu dem erfindungsgemässen Verfahren werden die Zellen in einem üblichen Fermenter gleichförmig verteilt und können daher nicht konzentriert und/ oder abgetrennt werden.

Die Art und Konsistenz der Versohäumungsmittel« die in dem Verfahren verwendet werden können, hängt von dem Zustand und der Art der zu verwendenden Zollen ab. Verschiedene Arten von oberflächenaktiven Substanzen, Fettsäureaminen > anorganischen SaI-

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zen und dgl., können einzeln oder in Korabination verwendet werden. Die Konsistenz kann durch einfache Prüfungen bestimmt werden.

Durch das obige Verfahren können Sporen.» Froteingranulae, ZeIlfragmente und dgl., sowie vegetative Zellen und Mikroorganismen getrennt, konzentriert und/oder fraktioniert werden. Andererseits wird ein Medium oder eine Kulturbrühe erhalten, die frei von Bakterienzellen oder anderen Fremdelementen ist.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren, bei welchem die speziellen Charakteristiken der mehrstufigen Fermentationsvorriehtung angewendet werden« können Bakterienzellen aus einem Kulturmedium abgetrennt, konzentriert und/oder fraktioniert werden. Eine solche Methode ist bisher nicht bekannt geworden, und sie ist für industrielle Anwendungen ausserordentlich wertvoll.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung« ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Ein zylindrischer Fermenter mit einem Innendurchmesser von 6 cm und einer Höhe von 120 cm war durch vier quer angeordnete Platten in gleiche Tolle unterteilt* wobei Jede Platte mehrere Löoher mit einem Durchmesser von 2 mm aufwies und das Offungsverhältnis 20 % ausmachte (vgl. Fig. *;)·

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Rohes technisches Naphthalin wurde in einer Menge von 10 Gew.-^ der GesamtfltissigVeit in die zweite Kammer von unten einge führt, und ein von Bakterien freies Züchtungsmediurrip das 0*25 Ammoniumchlorid* 2 % Hanganchlorid« 0,005 % Ferrosulfat und Of05 % Calciumchlorid enthielt., wurde eingegossen» wonach die Kammer mit Pseudomonas aeruginosa Mr. B-3^ beimpft wurde.

Bei der Durchführung der Fermentation bei 50°C unter Belüftung mit einer lineraren Geschwindigkeit von 3 cm/Sekunde gelangte eine gewisse Menge des in dieser Kammer vorhandenen festen Naphthalins durch die Löcher in den Platten in die benachbarten Kammern. Nach 36-stUndiger Fermentation waren 10,6 g Salicylsäure «Je 1 erzeugt. Diese Salicylsäure wird durch weitere Fermentation nicht vermindert oder zersetzt.

Nach beendeter Fermentation wurde die fermentierte Brühe vom Boden des Fermenters abgezogen» und 85 $ des anfänglichen festen Naphthalins wurde in dem Fermenter gesammelt. Unter Verwendung dieses wiedergewonnenen Naphthalins und der Zellen* die in dem Fermenter geblieben waren» wurde ein weiterer Fermentationszyklus durch einfaches Einbringen der oben beschriebenen Minerallösung durchgeführt. Dieser Arbeitsgang wurde sechsmal wiederholt.

Beispiel 2

Ein ZUchtungsmedlura mit einem Gehalt von 10 56 Glucose« 1 % Harnstoff, 0,1 $ KH₂PO₁^ OpO^ % MgSO₄ . 7HgO, 0,6 # Maisquell-

trakt* 2 Teile j

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wasser, 0,1 % Kefeextrakt* 2 Teile je Million. Fe*"⁸", 2 ¹EeIIe je

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Million Mn⁺* und 2 ing/i Biotin wurde in den gleichen Fermenter wie in Beispiel 1 in der gleichen Weise eingebracht. Mach der Sterilisation wurde das Medium auf 30⁰C abgekühlt «ad mit der Impfkultur in einer Menge, die 2 \^rol.-# des Mediums entsprach beimpft _f wobei die Impfkultur durch Züchtung von Corynebacterium gelatinosum Nr. 718jJ in einem Medium erhalten war, das die gleiche Zusammensetzung wie oben beschrieben mit der einzigen Ausnahme hattej, dass der Gluoosogehalt" 8 % betrug. Εε wurde dann bei 30^eC unter einer Belüftung von 200 - 400 ecm je Minute gezüchtet. Nach 58 Stunden erreichte dor DL-Alanin-Gehalt in dem Medium 40 g/l. Die Anzahl der verwendeten Platten kann frei gewählt werden und beeinflusst selbst das Ergebnis des Arbeitsgangs im Falle dieses diskontinuierlichen Verfahrens nicht.

Ein kontinuierliches Verfahren unter Verwendung der gleichen Bestandteile und von fünf in gleichem Abstand quer in dem Fermenter angeordneten Platten wurde dann durchgeführt. 1/12 des Gesamtvolumens des Mediums wurde je Stunde vom Boden des Fermenters aus einegebracht. In etwa 24 Stunden war der stationäre Zustand erreicht. Der Gehalt an Zellen und Alanin in dem Medium war in den jeweiligen Kanunern verschieden. Beide Gehalte waren* wie festgestellt wurde, in der obersten Kammer am höchsten, nämlich 34 g/l Alanin und 9,2 U.O.D. Bakterienzellen. So betrug beispielsweise der Alaningehalt in den jeweiligen Kammern von unten nach oben* (1) 0,5 g/l_f (2) 5 g/l, (3) 17 g/l, (4) 29 g/l, (5) 34 g/l.

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Beispiel 3

Nach den in Beispiel 1 beschriebenen Arbeltsweisen wurde das Medium hergestellt und mit dem gleichen Bakterieninooulum beimpft. Naphthalin wurde wie in Beispiel 1 verwendet.

Nach 24-stündiger Fermentation erreichte der Salicylsäuregehalt in dem Medium 6,2 g/l· Von diesem Zeitpunkt ab wurde eine sterilisierte anorganische Salzlösung vom Boden aus mittels einer Dosierpumpe eingeführt. Der Mengenanteil dieser Lösung zu der Gesamtflüssigkeit in dem Fermenter oder die VferdUnnungsrate betrug 1/15 je Stunde · Wach 40 Stunden vom Beginn ties Verfahrens ab enthielt jede Kammer Bakterienzellen und Salicylsäure« und der stationäre Zustand war erreicht. Die Menge an gebildeter Salicylsäure betrug von der Bodenkammer aus nach oben: (1) 0,8 g/l, (2) 0,8 g/l, O) 6,} g/l und (4) 7,5 g/L Der Gehalt in der vierten Kammer war mit dem Gehalt in der abgezogenen fermentierten Brühe identisch. Die Fermentation wurde kontinuierlich etwa 10 Tage durchgeführt, bis das feste Naphthalin in dem Fermenter vollständig verbraucht war.

Beispiel 4

Ein säulenförmiger 5 1-Fermenter war in 6 Kammern unterteilt, wobei bei jeder Platte die Löcher 20 & ihrer Gesamtfläche ausmachten und die Löcher jeweils einen Durchmesser von 2 mm aufwiesen. Die Einteilung war so, dass die erste Kammer (Bodenkammer) ein Volumen von 1,5 1 aufwies und die restlichen Kammern jeweils ein Volumen von 0*7 1 hatten. Unter Verwendung von

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Leichtöl wurde die Fermentation von Hefe (Candida 1-ypolitica) und die Entparaffinierung druohgeführt.

100 Teile Medium (pH 4,5),daö 3,0 g Ammoniumsulfate 1,0 g Kalium phosphat« 0,5 g Magnesiumsulfat, 0,1 g Hefeextrakt und eine kleine Menge an Spurenelementen je 1 enthielt, wurden mit 13 Teilen Leichtöl und 0,02 Teilen eines oberflächenaktiven Mittels (Tween 40) so gemischt, dass eine stabile Emulsion gebildet wurde.

Vor dieser Stufe wurde Candida lypolitica 35 Stunden in einem Medium der gleichen Zusammensetzung wie oben gezüchtet. 5 Vol.-# dieser Vorkultur von Candida lypolitica wurde zu dem obigen emulgierten Medium zugegeben, und die Züchtung bei 28*C unter Belüftung mit einer Rate von 15 1/ Minute durchgeführt.

Nach 24-atttndiger Fermentation wurde ein enulgiertes Medium, das mit 15 Teilen Leichtöl je 100 Teile Wasser gemischt war, vom Boden her mit einer Rate von 200 ml/Stunde eingeführt und so eine kontinuierliche Fermentation vorgenommen. Die fermentierte Brühe, die aus Hefezellen, nichtverwertetem Leichtöl und Wasser bestand und eine gewisse Verweilzeit hatte« wurde fortschreitend am oberen Ende des Fermenters abgezogen.

Nach Erreichen des stationären Zustande wurde aus jeder Kammer eine Probe der Brühe entnommen . Der Gehalt an Kefezelien und Leichtöl-war der folgendes 1,6 g/l (Trockengewicht) Zellmasse und 14,0 Teile (Volumenteile) ölschicht (Je 100 Teile anfänglichem Wasser) in der ersten Kammer, 2,5 g/l und 12,8 Teile in

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der dritten und 2_?1 g/l und 11,5 Teile in der fünften. Die überflieasende Brühe wurde nach bekannten Methoden in Zellkörper, entparaffiniertes Leichtöl und Wasser getrennt.

Beispiel 5

In einem Fermenter mit einem Innendurchmesser von 6_B5 cm, der in 10 Kammern unterteilt war, wobei jede der Platten 100 Löcher mit 2 mm Durchmesser aufwies, wurde die Produktion von Bakteriensporen in einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt. (

Als Xmpfkultur wurde auf einem Bouillonschrägagar gelagerter Bazillus stearothermophilus ATCC 8005 in das Glucose-Bouillionmedium eingeimpft und unter aeroben Bedingungen bei 55⁹C gezüchtet. Die Hauptεporenproduktlon wurde mit 5 Vol.-# dieser Kultur initiiert. Das Gesamtvolumen betrug 4,0 1.

Das Medium enthielt 6 g Glucose* 12 g Hefeextrakt, 1 g KHgPO^, 0,1 g MnSO₁^.H₂Q* 0,01 g PeSO^.7H₂O, 0,1 g CaCl₂ und 1 1 destilliertes Wasser. Nach 4 bis 5 Stunden wurde zusätzliches Medium kontinuierlich am Boden des Fermenters in einer Menge von j$60 ml/Stunde zugeführt. Die fermentierte Brühe, die Sporen enthielt, floss am oberen Ende Über. Der Dlpioollnsäuregehalt und die U.O.D. der Zellen in den jetteiligen Kammern erreichten den stationären Zustand. Die Zellkonzentration erhöht sich gegen die oberen KaoMem zu. In den unteren Kammern wurde keine Dipicolinsäure festgestellt, sondern nur in den Kammern oberhalb der sechsten.

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Der* Diplcolinsäuregehalt wurde bei 60 γ/ml gehalten. Dies ermöglichte, dass mehr als 80 % der Gesamtzellen unter den 2üchtungsbedingungen Sporen bilden. Die Sporen enthaltende Brühe wurde zentrifugiert oder es wurden die Sporen aus der Sporensuspension durch die Schaurflotationsmethode geeainmelt.

Beispiel 6

Unter Verwendung einer Kulturlösung von Escherichia colii XAM-1253i die in einem 2 # GIu- öse und 1 % Hefeextrakt enthaltenden Medium 24 Stunden bei 30^aC gezüchtet worden waren» wurden BaIcterienzellen konzentriert und/oder fraktioniert. Zu der obigen Kulturlösung wurden 0,2 g/l an Aluminiumsulfat und 40 mg/1 an Laurinsäure (Äthanollösung) zugegeben. Das Gemisch wurde auf pH 7?2 eingestellt und in einen zylindrischen mehrstufigen Fermenter mit einer Höhe von 120 cm und einem Durchmesser von 6 cn» gegossen* der durch 10 Platten in 11 Kammern unterteilt war. wobei in jeder Paltte die Löcher von 5 mm Durchmesser 11 % de?- gesamten Plafctenflache ausmachten. luft wurde in den obigen ψ Permenter nach dessen Füllen mit dem Gemisch mit einer G^e~ schwindigkeit von efcwa 7 cm/Sekunde eingeführt. Nach 25-minütiger Belüftung wurde eine Probe der Lösung aus jeder Kammer entnommen, und die Anzahl der Zellen wurde darin bestimmt. Die Ex*- gebnisse zeigten» dass die Anzahl der Zellen in der obersten Kammer diejenige in der Bodenkammer um etwa das 10-fache überstieg. Die Anzahl der Zellen in den dazwischen liegenden Kammern differierte stufenweise von einer Kammer zur nächsten vom Boden

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aus nach oben ansteigend. Obgleich die Zellkörper in den verschiedenen Kammern durch ein Mikroskop nicht sichtbar waren, waren nichtbakterielle Festsubstanzen in den unteren Kammern sichtbar» deren Anzahl gegen den Boden zunahm. Die physiologischen Aktivitäten der aus den jeweiligen Kammern entnommenen Zellkörper wurden in Termen des Oxydationavermögens einer Zellerreinheit mit Glucose als Substrat bestimmt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die erhaltenen Werte.Die Gesamt-U.0.D./ml wurde durch Multiplizieren der optischen Dichte bei 610 mu der verdünnten Probe mit der Anzahl der Verdünnungen erhalten.' Sie betrug in allen Kammern vor der Belüftung 5,0. Nach Belüftung variierte sie jedoch von 1*0 am Boden bis 10,4 in der neunten Kammer.

Die nachfolgende Tabelle zeigt auch die Anzahl der Zellen in jeder Kammer gegenüber der Gesamtanzahl an Zellen: 73 % der Gesamtanzahl der Zellen fanden sich in den Kammern 7 bis 10 und die restlichen 27 % in der ersten bis sechsten Kammer. Q-;₂ in der Tabelle, diet Rate der Sauerstoff absorption je Zelleneinheit, ist im Vergleich zu dem Wert in der ersten Kammer mit 1,00 als Basiswert angegeben. Es ist ersichtlich, dass die Aktivität in der ersten Kammer am niedrigsten ist und nach den oberen Kammern hin zunimmt.

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Tabelle IXI

Kammer U.0.D.(6tQ ναμ) Verteilung der (vqra Boden aus) Seilen, $

Nr. 1
Nr. 3
Nr» 5
Nr. 7
9

1	1,97	1,00
2,1	4,13	1₉10
3,8	7,48	n3o
8,1	15,95	1,38
10,4	20,47	1,50

Beispiel 7

Ein Züchtungsmadium (pH 7,0), das 0,5 # Glucose, 1₃3 % Hefeextrakt, 0,1 # KH₂IPO₄, 0,01 % MnSO₄-HgO, 0,001 % FeSO₄^H₃O und O,OO5S6 MgSO₄.7H₂O enthielt, wurde mifc Bacillus subtilis IAM/1214 beimpft und unter Belüftungsbewegung 24 Stunden bei 30^eC geattchteto Nach dieser Zeitspanne waren 1,9 x lOVoom Sporen aus insgesamt 2,1 χ 10Vcera Zellen gebildet. 2 1 der obigen Lösung, in der die Sporen und vegetativen Zellen des obigen Stammes gemischt waren, wurden in einen mehrstufigen Fermenter mit einem Volumen von 3,2 1 eingebracht, der durch 8 Platten (bei denen die Löcher von jeweils 4 mm Durchmesser 16 % ihrer Gesamtfläche ausmachten) in 9 Kammern unterteilt war. Die Luft wurde durch eine Belüftungsdüse am Böden mit einer Rate von 4 1/ Minute eingeführt. Bei einem pH-Wert von 7,3 und einer Temperatur von 28 ®C begann das Schäumen in den Kammern, und es wurde unmittelbar unterhalb von jeder Platte ein fortgeschrittenes Schäumen beobachtet. Die Luftmenge wurde alle 5 Minuten um 0,5 l/Minute erhöht, bis schliesslich I9 l/Minute erreicht waren. Hierdurch wurde das Volumen der Schaumschichten<fcn den fortge-

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schrittenen Stellen erhöht, so dass eine gewisse Menge der Kulturlösung in jeder Kammer gehalten wurde. Naoh 120-minütiger Belüftung unter den obigen Bedingungen wurden die Anzahl der Sporen für die oberen beiden und unteren beiden Kanunern bestimmt: 1,1 χ 10 /ecm und 1,0 χ 10 /ecm für die beiden

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oberen Kammern und 2 χ 10' /com und 1,2 χ 10 /ecm für die beiden unteren Kammern. Mit anderen Worten zeigen die obigen Ergebnisse, dass ei;wa 90 % oder mehr der Qesaratsporen in den oberen beiden Kammern gesammelt waren. Sie zeigen auch, dass, da die Anzahl der Zellen in den Jeweiligen Kammern sich nicht stark unterschied, die Anzahl der Sporen je Anzahl der Zollen in diesen oberen Kammern betrUchtlich erhöht war . Die Flüssigkeit in diesen Kammern wurde abgezogen und als Sporensuspension verwendet .

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur diskontinuierlichen Fermentation* dadurch gekennzeichnet, dass eine oiehrstufige Fermentationsvor-ri ohtung verwendet wird und Luft in die mehrstufige Fermentationsvorrichtung vom Boden aus eingeführt und so durch die Fermentationsvorrichtung geleitet wird.» dass sie in dem oberen Teil jedes unterteilten Abschnitts in dieser Fermentationsvorrich-tung einen freien Raum bildet, wobei die mehrstufige Fermentetionsvorrichtung einen Satz von senkrecht übereinander angeordneten Kaminern aufweist, die durch eine oder mehrere sich horizontal erstreckende Platten getrennt sind, und wobei jede der Platten mit einer oder mehreren Öffnungen ver3ehen ist.

2. Verfahren zur kontinuierlichen Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass eine mehrstufige Fermentationsvorrichtung verwendet wird und ein Medium unter Belüftung mit Luft vom Boden der Ferraentationsvorrichtung zugeführt und aufwärts durch die Fermentationsvorrichtung geführt wird ν.Ά am oberen Ende der Fermentationsvorrichtung überfliesst_P während die Luft im oberen Teil von jedem unterteilten Abschnitt in der Fermentat lötvorrichtung einen Raum einnimmt und so einen freien Raum bildet» wobei die mehrstufige Fermentationsvorrichtung einen Satz von senkrecht übereinander angeordneten Kammern aufweist, die durch eine oder mehrere sich horizontal erstrekkende Platten getrennt sind,und wobei jede dieser Platten eine oder mehrere öffnungen aufweist.

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3· Verfahren zur kontinuierlichen Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass eine mehrstufige Fermentationsvorrichtung verwendet wird und ein Medium vom oberen Ende dieser Fennentationsvorriohtung und Luft ira Gegenstrom vom unteren Ende aus zugeführt werden, wobei die mehrstufige Fermentation«Vorrichtung einen Satz von senkrecht übereinander angeordneten Kammern aufweist, die durch eine oder mehrere sich horizontal erstreckende Platten getrennt sind.und wobei jede dieser Platten eine oder mehrere Öffnungen aufweist.

4. Mehrstufige Fermentationsvorrichtung, gekennzeichnet durch einen Satz von senkrecht übereinander angeordneten Kammern, die durch eine oder mehrere sich horizontal erstreckende Platten getrennt sind, wobei jede dieser Platten eine oder mehrere Öffnungen aufweist.

5. Verfahren zur Fermentation naoh einem der Ansprüche 1 - 3# dadurch gekennzeichnet, dass ein festes Substratmaterial in den jeweiligen Kammern der mehrstufigen Fermentationsvorrichtung suspendiert und gehalten wird.

6. Verfahren zur Fermentation nach einem der Ansprüche 1-3* dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Erdölprodukt als Mediumkomponente eingeführt wird.

7· Verfahren zur kontinuierlichen Fermentation nach einem der Ansprüche 2, 2, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikro-

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Organismus so gezüchtet wird* dass eine untersohiedliche Verteilung der Zellenkonzentration, des Zellenalters oder der Konzentration an Produkt in den jeweiligen Kammern in der mehrstufigen Fermentetionsvorrichtung unter stationärem Zustand erzielt wird.

8. Verfahren zur Fermentation nach einem der Ansprüche 1 - 3_t. dadurch gekennzeichnet., dass das Produkt, das aus zumindest einer Art von mikrobiellen Zellen* einer Suspension von Zellfraktionen und Sporen besteht? aus den geeigneten Kammern entnommen und am Ende der Fermentation getrennt wird.

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