DE69321625T2

DE69321625T2 - Verfahren zur selektiven Herstellung von Poly-ungesättigte-Lipiden aus einer Porphyridium Cruentum Mikroalgen Fermentationsbrühe

Info

Publication number: DE69321625T2
Application number: DE69321625T
Authority: DE
Inventors: Claude F-13100 Aix En Provence Gudin; Bruno F-04100 Manosque Sarrobert; Catherine F-04100 Manosque Thepenier
Original assignee: Thallia Pharmaceuticals S A
Current assignee: Thallia Pharmaceuticals S A
Priority date: 1992-01-28
Filing date: 1993-01-26
Publication date: 1999-07-08
Anticipated expiration: 2013-01-27
Also published as: FR2686619B1; ES2125960T3; EP0554162A1; AU3210193A; US5338673A; IL104360A0; JPH05244966A; EP0554162B1; IL104360A; AU661887B2; DE69321625D1; FR2686619A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden ausgehend von einer Mikroalgen-Kultur des Typs Porphyridium cruentum.
Die in einem marinen Milieu (NaCl-Konzentration von mehr als 0,2 M) kultivierten Mikroalgen sind häufig reich an mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren. Diese Fettsäuren weisen wenigstens 20 Kohlenstoffatome und in der Regel mehr als vier Nicht-Sättigungen auf. Dies sind zum Beispiel die Arachidonsäure (C 20 : 4ω6), die Eicosapentaensäure (C 20 : 5ω3) und die Docosahexaensäure (C 22 : 6ω3).
Diese Fettsäuren haben hypocholsesterinäme Eigenschaften und vermindern das Atherogenese-Risiko. Diese Fettsäuren werden derzeit in der Diätetik verwendet und in Form von Fischölen konsumiert. Tatsächlich sind Fische reich an mehrfach ungesättigten Lipiden, da sie diese beim Verzehr der Mikroalgen des Planktons ansammeln. Die Fischöle weisen jedoch zwei Hauptnachteile auf, nämlich das Vorhandensein von Cholesterin und starken unangenehmen Geruch. Es wäre daher sehr interessant, diese Fischöle direkt durch aus Mikroalgen extrahierte Öle zu ersetzen, die selbst kein Cholesterin enthalten und geruchlos sind.
Folglich hat man versucht, Mikroalgen zu kultivieren.
Unter den Mikroalgen enthalten die Rhodophyceen, wie Porphyridium cruentum, hauptsächlich drei Fettsäuren, eine vorherrschende gesättigte Fettsäure (die Palmitsäure C 16 : 0) und zwei gleichermaßen vorherrschende mehrfach ungesättigte Fettsäuren (die Arachidonsäure (C 20 : 4) und die Eicosapentaensäure (C 20 : 5)). Ungefähr 80% des C 20 : 5 befindet sich in den Glycolipiden, die in den Membranen der Chloroplasten vorhanden sind, während sich 65% des C 20 : 4 in den Phospholipiden befinden, die mehrheitlich in den Zellmembranen vorhanden sind. Diese Fettsäuren stellen unter günstigen Herstellungsbedingungen 2 bis 3% der Algen-Trockenmasse dar.
Es ist bereits aus dem Artikel von Tim J. AHERN et al., "Arachidonic Acid Production by the Red Alga Porphyridium cruentum", Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXV, Seiten 1057-1070 (1983) und dem Artikel von Zvi COHEN et al., "Effect of Environmental Conditions on Fatty Acid Composition of the Red Alga Porphyridium cruentum: Correlation to Growth Rate", J. Phycol. 24, 328-332 (1988) bekannt, daß der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren im Innern dieser Mikroalgen in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen und insbesondere von den Temperaturbedingungen stark variiert. Bei diesen vorbekannten Techniken werden die Mikroalgen-Kulturen stets in einem einzigen Schritt erzielt. Daher wird die Optimierung hinsichtlich des Profils der mehrfach ungesättigten Fettsäuren häufig bei einer Temperatur durchgeführt, die von derjenigen bei optimiertem Wachstum der Mikroalgen abweicht. Folglich ergeben Mikroalgen-Kulturen, die bei Temperaturen oberhalb von 15ºC realisiert werden, geringe Mengen an Fettsäuren, während es umgekehrt nicht möglich ist, Kulturen unterhalb einer Temperatur von 15ºC zu erlangen, denn in diesem Fall gibt es kein Wachstum und folglich keine Produktion von Biomasse mehr.
Die Erfindung hat daher zum Ziel, die Produktion von Biomasse ebenso wie die Art und Menge der an mehrfach ungesättigten Fettsäuren reichen Lipide zu optimieren.
Hierzu betrifft die Erfindung ein Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden ausgehend von einer Mikroalgenkultur des Typs Porphyridium cruentum.
Gemäß der Erfindung besteht dieses Verfahren darin:
- die Mikroalge Porphyridium cruentum in einem abgeschlossenen rohrförmigen Photobioreaktor in Suspension in einem flüssigen Kulturmedium zu kultivieren, das eine NaCl-Konzentration oberhalb von 0,2 M und eine Temperatur zwischen etwa 20 und 30ºC aufweist,
- wenigstens einen Teil der gewonnenen Biomasse aus dem Photobioreaktor zu entnehmen und diesen in einen Bottich zur selektiven Anreicherung an mehrfach ungesättigten Lipiden zu geben,
- dieser Biomasse unmittelbar für einen bestimmten Zeitraum derart einen Temperaturunterschied bezüglich der Kulturtemperatur im Photobioreaktor aufzuprägen, daß der Sättigungsgrad der Fettsäuren der Lipide verändert wird.
Dieses Verfahren erlaubt es zunächst, das Wachstum der Mikroalgen zu optimieren, indem diese unter optimalen Bedingungen kultiviert werden, und anschließend, getrennt während des zweiten Verfahrensschritts, eine maximale Produktion an mehrfach ungesättigten Lipiden zu erzielen, wobei zudem noch die Art der in diesen Lipiden enthaltenen Fettsäuren ausgewählt wird.
Gemäß einer ersten Ausführung der Erfindung besteht das Applizieren des Temperaturunterschiedes auf die Biomasse darin, diese auf eine Temperatur zwischen etwa 4ºC und 15ºC zu bringen, um stärker ungesättigte Lipide als im Ausgangszustand in den Mikroalgen zu erhalten.
Mit anderen Worten, während die Mikroalgen des Typs Porphyridium cruentum im Ausgangszustand etwa 57% C 20 : 4 und 43% C 20 : 5 enthielten, enthielten sie nach der Kältebehandlung zwischen 25 und 40% C 20 : 4 und zwischen 60 und 75% C 20 : 5.
Gemäß einer zweiten Ausführung der Erfindung besteht das Aufprägen des Temperaturunterschiedes auf die Biomasse darin, diese auf eine Temperatur zwischen etwa 30 und 40ºC zu bringen, um weniger ungesättigte Lipide als im Ausgangszustand in den Mikroalgen zu erhalten.
Vorteilhafterweise wird dieser Temperaturunterschied für wenigstens 12 Stunden aufgeprägt. So beeinflußt man, nachdem man die Selektion gewisser Fettsäuren begünstigt hat, ebenfalls die Reaktionskinetik.
Vorteilhafterweise wird in das Kulturmedium Luft eingeleitet, die mit CO&sub2; in einer Konzentration von etwa 1 bis 5% angereichert ist.
So werden die Photosynthese begünstigt und die Kulturbedingungen der Mikroalgen im Photobioreaktor verbessert.
Schließlich besteht das Produktionsverfahren gemäß der Erfindung gleichermaßen darin:
- die an mehrfach ungesättigten Lipiden angereicherten Mikroalgen zu konzentrieren,
- die Mikroalgen zu zerkleinern,
- die flüssige Phase von der die Gesamtheit der mehrfach ungesättigten enthaltenden festen Phase zu trennen,
- diese Lipide durch Zugabe eines Lösungsmittels zu extrahieren, und
- besagtes Lösungsmittel zu verdampfen und die gewonnenen mehrfach ungesättigten Lipide zu sammeln.
Die Erfindung wird beim Lesen der folgenden beispielhaft erläuternden Beschreibung einer bevorzugten Ausführung der Erfindung und anhand der beigefügten Zeichnungen besser verstanden, bei denen:
- Fig. 1 ein Gesamtschema einer ersten Ausführung einer Anlage zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden darstellt, die zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird,
- Fig. 2 ein Gesamtschema einer zweiten Ausführung einer Anlage zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden darstellt, die zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, und
- Fig. 3 detaillierter eines der Elemente aus Fig. 1 darstellt, nämlich eine Ausführung des Bottichs zur selektiven Anreicherung an mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
Wie in Fig. 1 dargestellt ist, umfaßt die Einrichtung, die es ermöglicht, das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen, einen Photobioreaktor, in dem die Mikroalgen des Typs Porphyridium cruentum kultiviert werden, und mehrere Apparate, die ein Extrahieren der besagten Lipide aus der gewonnenen Biomasse ermöglichen.
Die Mikroalgenkultur wird in einem Photobioreaktor 1 in kontinuierlicher Arbeitsweise ("chemostatisch" oder "turbidostatisch") realisiert, um eine gleichbleibende Qualität der Biomasse zu erzielen. In diesem Photobioreaktor findet die Photosynthese statt.
Photosynthese ist die durch Sonnenenergie bewirkte Umwandlung von Kohlendioxid in primäre Kohlenwasserstoff-Materie, mit Sauerstoff als hauptsächlichem Nebenprodukt dieser biochemischen Umwandlung. Diese Reaktion kann durch die folgende Myers-Gleichung beschrieben werden:
6,14 CO&sub2; + 3,65 H&sub2;O + NH&sub3; → C6,14H10,3O2,24N + 6,85 O&sub2;
Der Term C6,14H10,3O2,24N entspricht dabei der Biomasse.
Der Stickstoff wird in Form von Nitrat, Harnstoff oder Ammoniumsalzen zugeführt, die in das die Mikroalgen enthaltende flüssige Medium eingebracht werden. Im folgenden wird eine erste Ausführung eines Photobioreaktors beschrieben, der eine optimale Kultivierung der Mikroalgen ermöglicht.
Der abgeschlossene Photobioreaktor 1 umfaßt einen Sonnenrezeptor, der aus parallelen Rohren 3 besteht, die aus einem generell durchsichtigen Kunststoff, wie beispielsweise Polyethylen, ausgeführt sind. Im Innern dieser Rohre 3 zirkuliert das Kulturmedium 5, das die Mikroalgen und die für deren Wachstum notwendigen Nährstoffe enthält.
Vorteilhafterweise besteht das Kulturmedium aus künstlichem Meerwasser des Milieu-Typs "Hémerick", das eine NaCl-Konzentration oberhalb von 0,2 M aufweist. Dieses Meerwasser ist angereichert mit Oligoelementen, wie Phosphat, Kalium oder Stickstoff. Sein pH-Wert liegt etwa zwischen 6 und 8. Seine Temperatur beträgt zwischen etwa 20 und 30ºC. Die mittlere Bestrahlungsstärke liegt bei 500 bis 2000 kcal/m²/d.
Kollektoren 7 und 9 aus Polypropylen ermöglichen es, die Rohre 3 miteinander zu verbinden und so den Durchtritt des Kulturmediums von einem Rohr in das andere sicherzustellen.
Eine Pumpe 11 auf einer Leitung 13 stellt die Kommunikation zwischen dem Eingang und dem Ausgang des Photobioreaktors 1 her. Diese Pumpe stellt die kontinuierliche Zirkulation des Kulturmediums 5 sicher. Bei der in Fig. 1 dargestellten Ausführung arbeitet der Photobioreaktor kontinuierlich. Man könnte aber ebenso eine zweiten Ausführung vorsehen, die diskontinuierlich arbeitet.
Das die Nährstoffe enthaltende Nährmedium wird unter Rühren in einem Behälter 15 zubereitet und dann in das obere Ende eines Karbonators 17 über eine Zufuhrleitung 19 eingeführt, die mit einer Pumpe 21 ausgestattet ist, welche die Regelung der Dosis des Nährmediums sicherstellt. Das CO&sub2;-Gas wird unter Druck aus einem Reservoir 23 injiziert, das am Eingang eines Tauchrohres 25 angeordnet ist, welches im Innern des Karbonators vorgesehen ist. Dieses Tauchrohr 25 ermöglicht die Versorgung des im Gegenstrom über die Leitung 19 ankommenden Nährmediums mit CO&sub2;. Das karbonierte Nährmedium wird durch eine mit einer Pumpe 29 versehene Leitung 27 in den Photobioreaktor injiziert. Das Kulturmedium erhält so Luft, die mit CO&sub2; in einer Konzentration von etwa 1 bis 5% angereichert ist.
Für genauere Details über die Gestaltung und Funktionsweise eines solchen Sonnenkollektors (kontinuierlich oder diskontinuierlich) wird auf das Dokument FR- A-2 621 323 verwiesen.
Die im Innern des Photobioreaktors 1 ablaufende Photosynthese bewirkt eine Anreicherung der Kultur mit gelöstem Sauerstoff, was die Produktion von Anti- Oxidantien des Typs Tokopherol begünstigt.
Am Ausgang des Photobioreaktors 1 ermöglicht eine mit einer Pumpe 43 versehene Leitung 41 ein kontinuierliches Abziehen der gewonnenen Biomasse in einen Bottich 45 zur Anreicherung an mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
Im Innern dieses Anreicherungsbottichs 45 wird die Biomasse einem Temperaturunterschied unterworfen. Eine detailliertere Beschreibung der Struktur dieses Bottichs und seiner Funktionsweise folgt später.
Die mit mehrfach ungesättigten Lipiden angereicherte Biomasse wird aus dem Bottich 45 mittels einer Leitung 47 entnommen, von wo sie durch eine Pumpe 48 zu einer Zentrifuge 49 hin abgezogen wird. Diese Zentrifuge dient zur Durchführung eines Konzentrationsschrittes, in dem die Zellkörper von dem Kulturmedium getrennt werden. Dieser Konzentrationsschritt kann ebenso durch Filtration oder Sedimentation realisiert sein.
In der Folge wird die zentrifugierte Paste durch eine Leitung 51 in einen Homogenisierbehälter 53 abgezogen, der mit Rührmitteln versehen ist, die es ermöglichen, eine homogene Mikroalgen-Suspension zu erzielen. Über die Leitung 55 wird ein Puffermedium zugeführt, d. h. Wasser und ein Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7, 8. Die Mikroalgen-Suspension wird dann in einen Zerkleinerungshomogenisa tor 57 eingebracht. Dieser Zerkleinerer 57 funktioniert mit einem Wechsel aus Druckaufbau und Druckabbau zwischen 300 und 700, sogar 1100.10&sup5; Pa. Die Temperatur wird derart geregelt, daß sie unterhalb von 30ºC bleibt, um die Lipide nicht zu verändern. Dieser Schritt macht es möglich, die Mikroalgen aufplatzen zu lassen, um die festen und flüssigen Fraktionen des Zellinhalts zu trennen.
Die Suspension der zerkleinerten Mikroalgen wird anschließend über eine Leitung 59 in einen Dekantierer 61 abgezogen, der es ermöglicht, die Mikroalgenstücke von dem gepufferten Medium zu separieren. Diese Operation könnte ebenso durch Zentrifugieren realisiert sein. Dieser Verfahrensschritt ermöglicht es somit, die flüssige Phase von der bzw. dem alle mehrfach ungesättigten Lipide enthaltenden festen Phase bzw. Bodensatz zu trennen. Die flüssige Phase wird bei 63 extrahiert und enthält das gepufferte Medium, welches unter anderem Anti-Oxidantien wie Vitamin C und die Superoxiddismutase ebenso wie Pigmente wie die Phycobiliproteine enthält. Der feste Bodensatz wird durch eine Leitung 65 in eine Extraktionskolonne 67 abgezogen, die im Gegenstrom arbeitet.
Der zerkleinerte Mikroalgenrückstand wird vom oberen Bereich dieser Extraktionskolonne 67 her eingeführt, während ein Lösungsmittel am Boden der Kolonne bei 69 zugeführt wird. Dieses Lösungsmittel ist vorzugsweise ein organisches Lösungsmittel, z. B. wahlweise Hexan oder Chloroform. Dieses mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren angereicherte Lösungsmittel tritt bei 71 aus dem oberen Teil der Kolonne aus und wird in die Basis eines Verdampfers 73 geleitet, der in der Umgebung von 40 bis 50ºC arbeitet. Das aus dem Verdampfer 73 über eine Leitung 75 austretende Lösungsmittel wird in der Basis der Extraktionskolonne 67 wieder in den Kreislauf eingeführt.
Man erhält am Ausgang 77 des Verdampfers ein Öl, das mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren und anti-oxidanten Wirkstoffen wie Tokopherolen (α, β, γ) und Karotenoiden (insbesondere β-Karotin). Die Anwesenheit von Anti-Oxidantien im lipiden Extrakt, das die Fettsäuren enthält, schützt letztere gegen Oxidationsphänomene. Der Gehalt an Anti-Oxidantien hängt vom im Kulturmedium des Photobioreaktors vorherrschenden Sauerstoffgehalt ab (siehe auch die französische Patentanmeldung FR-A-2 656 874).
Eine zweite Ausführung des Photobioreaktors wird nunmehr unter Bezugnahme auf Fig. 2 beschrieben. Diese Ausführung ist gegenüber der ersten zu bevorzugen. Der Photobioreaktor 80 umfaßt ein Ensemble an transparenten Rohren 82, die in der Regel aus einem steifen Kunststoff wie Plexiglas (eingetragene Marke) ausgeführt sind. Diese Rohre 82 sind untereinander derart verbunden, daß sie eine Schlangenlinie bilden, und unter einer auf konstanter Temperatur gehaltenen Wasseroberfläche 84 angeordnet. Dieser Photobioreaktor 80 weist ein Eingangsrohr 86 und ein Ausgangsrohr 88 auf.
Der Photobioreaktor 80 ist mit einem Befüllreservoir 90 verbunden, das darüber, auf einem höheren Niveau als demjenigen des besagten Photobioreaktors, angeordnet ist. Das Befüllreservoir 90 ist mit dem Photobioreaktor 80 über eine mit dem Eingangsrohr 86 verbundene absteigende Rohrleitung 92 und zwei mit dem Ausgangsrohr 88 verbundene aufsteigende Rohrleitungen 94 verbunden. Ein Injektor 96 ist an der Basis einer jeden aufsteigenden Rohrleitung 94 angeordnet und ermöglicht die simultane Injektion eines Gases, das aus Luft und CO&sub2; besteht.
Das die Nährstoffe enthaltende Nährmedium wird unter Rühren in einem Behälter 98 vorbereitet und dann über eine Zufuhrleitung 100 oben in das Befüllreservoir 90 eingeführt. Eine peristaltische Pumpe 102 und ein Ventil 104 sind in dieser Zufuhrleitung 100 vorgesehen.
Das Kulturmedium 106 (das die Mikroalgen und das Nährmedium enthält) befindet sich im Befüllreservoir 90, es ergießt sich dank der Schwerkraft über die absteigende Rohrleitung 92 in den Photobioreaktor 80. Nachdem es den Photobioreaktor 80 durchlaufen hat, erreicht das Kulturmedium das Ausgangsrohr 88. Das Medium wird durch eine angemessene Gasinjektion mittels des Injektors 96, welche im Ergebnis die Dichte des flüssigen Mediums herabsetzt, wieder in das Befüllreservoir 90 angehoben. Das injizierte Gas erlaubt es nicht nur, das Kulturmedium im Innern des Photobioreaktors 80 zirkulieren zu lassen, es ermöglicht es zusätzlich, das für die Photosynthese notwendige CO&sub2; hinzuzufügen.
Eine einen Überlauf bildende Leitung 108 ermöglicht es, kontinuierlich das aus dem Befüllreservoir 90 stammende Kulturmedium in einen Zwischenspeicherbehälter 110 abzuziehen. Die Leitung 108 weist ein Ventil 112 auf. Der Zwischenspeicherbehälter 110 ist über eine Leitung 114, in der eine peristaltische Pumpe 116 vorgesehen ist, mit dem Anreicherungsbottich 45 verbunden. Diese Pumpe 116 ermöglicht es, dem Anreicherungsbottich 45 das Kulturmedium in einer gegebenen Rate zuzuführen, die von der Ausflußrate des Befüllreservoirs 90 abweichen kann, je nach Bedarf des Zwischenspeicherbehälters 110.
Der Rest der Extraktionsvorrichtung ist identisch mit demjenigen, der vorangehend zur ersten Ausführung aus Fig. 1 beschrieben wurde.
Die Struktur des Anreicherungsbottichs 45 wird nunmehr, insbesondere bezugnehmend auf Fig. 3, detaillierter beschrieben. Der Bottich ist vorzugsweise zylindrisch und mit einem konischen Boden 120 versehen. Er wird von einer Doppelwand gebildet (Innenwand 122 und Außenwand 124).
Dieser Bottich ist darüber hinaus mit einer Eintrittsöffnung 126 und einer Austrittsöffnung 128 versehen, die es ermöglichen, zwischen den beiden Wänden 122 und 124 eine Kühlflüssigkeit oder im Gegensatz dazu eine Heizflüssigkeit zirkulieren zu lassen, wodurch es möglich ist, einen thermischen Schock zu bewirken.
Die Form dieses Bottichs ist besonders gut dafür angepaßt, eine gute thermische Regulierung und eine gute Strömung der Flüssigkeiten zu erzielen. Darüber hinaus ist dieser Bottich temperaturgeregelt, um die ausgewählte warme oder kalte Temperatur zu halten.
Dieser Bottich 45 umfaßt ebenfalls eine Rühreinrichtung 130, die es ermöglicht, ein Durchmischen der Biomasse sicherzustellen und deren Kontakt mit der Innenwand 122 zu begünstigen, an welcher der Wärmeaustausch stattfindet. Der Bottich 45 umfaßt weiterhin eine Luftinjektionseinrichtung 132, die von einer Leitung gebildet ist, die sich im Innern des Bottichs 45 entlang der Innenwand 122 erstreckt und am Boden des Bottichs (konischer Abschnitt) mit Luftauslaßöffnungen 134 versehen ist. Diese Luftinjektionseinrichtung 132 ermöglicht es, ein Anhaften der Mikroalgen an den Wänden zu verhindern und gegebenenfalls mit Luft gemischtes CO&sub2; zuzuführen.
Dieser Bottich umfaßt einen Schieber 136, der in der Ausgangsleitung 47 vorgesehen ist. Dieser Schieber 136 ermöglicht es, die Kultur zur Durchführung der späteren Extraktionsschritte des Verfahrens abzuzapfen. Die Biomasse kann zu einem Zeitpunkt Null in den Bottich 45 gegeben werden und in ihrer Gesamtheit am Ende einer gegebenen Zeitspanne abgezapft werden (Funktionsweise im "batch"-Typ: diskontinuierlich) oder im Gegensatz dazu ständig erneuert und abgezapft werden (kontinuierlicher Modus). In diesem zweiten Fall wird die Kultur kontinuierlich über eine Pumpe, deren Förderrate in Abhängigkeit von der gewünschten Verweilzeit im Bottich 45 gewählt wird, in den Bottich eingebracht und die Kultur kontinuierlich über einen Überlauf abgezapft. Es ist festzustellen, daß in dieser Fig. 3 weder die Pumpe noch der Überlauf dargestellt sind.
Weiterhin ist dieser Bottich einer Lichtintensität von 20 bis 300 uE/m²/s ausgesetzt.
Die spezielle Form des eben beschriebenen Bottichs ist jedoch nur eine spezielle Ausführungsform. Man könnte den Bottich auch in einer anderen Weise ausführen, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß die bevorzugte Selektion des C 20 : 4 und des C 20 : 5 von der Löserate abhängt, d. h. dem Kehrwert der Verweilzeit der Mikroalgen im Photobioreaktor 1 oder 80.
Diese Löserate beträgt in der Regel zwischen 1 und 0,1 d&supmin;¹, abhängig von der von den Mikroalgen aufgenommenen Lichtintensität, ihrer Photoperiode, der Temperatur, der klimatischen Bedingungen oder der anvisierten Fettsäure. Die mit einer erhöhten Löserate, etwa zwischen 0,3 und 1 d&supmin;¹ (kurze Verweilzeit im Photobioreaktor), kultivierten Mikroalgen enthalten eher mehr C 20 : 5, während im Gegensatz dazu die mit einer geringen Löserate, z. B. etwa zwischen 0,1 und 0,3 d&supmin;¹ (lange Verweilzeit im Photobioreaktor), kultivierten Mikroalgen eher mehr C 20 : 4 enthalten. Die angegebenen Werte stellen jedoch nur Anhaltswerte dar.
Schließlich ist festzustellen, daß die Biomassen-Produktion ansteigt, wenn die Löserate ansteigt.
Es konnte ebenfalls festgestellt werden, daß in Abhängigkeit von der Amplitude des aufgeprägten Temperaturunterschiedes und der Applikationsdauer dieses Temperaturunterschiedes der Gehalt an C 20 : 4 bzw. C 20 : 5 in der Biomasse und das Verhältnis R zwischen C 20 : 5 und C 20 : 4 verändert wurden. Um hauptsächlich C 20 : 5 zu erhalten (Verhältnis R oberhalb von 1), prägt man einen "kalten" Temperaturunterschied auf, d. h. die Biomasse wird bei einer Temperatur unterhalb von 15ºC behandelt, die vorzugsweise zwischen 4ºC und 15ºC liegt. Wird im Gegensatz dazu gewünscht, eine höhere Konzentration an C 20 : 4 zu erhalten (Verhältnis R unterhalb von 1), prägt man einen "warmen" Temperaturunterschied auf, d. h. eine Temperatur oberhalb von 30ºC, die vorzugsweise zwischen 30 und 40ºC liegt.
Die Applikationsdauer dieses Temperaturunterschiedes ist abhängig von dem gewünschten Gehalt an C 20 : 5 oder C 20 : 4, variiert aber in der Regel zwischen 12 Stunden und 5 Tagen (120 Stunden).
In der Regel werden die Löserate und die Richtung der Temperaturunterschiede kombiniert, um das Verhältnis R in der einen oder anderen Richtung zu variieren. Es werden nunmehr vier Beispiele realisierter Kulturen beschrieben.

Beispiel 1

Die Mikroalge Porphyridium cruentum wurde in einem abgeschlossenen Photobioreaktor im kontinuierlichen Modus bei einer Temperatur zwischen 22 und 25ºC kultiviert.
Die Löserate, die dem Kehrwert der Verweilzeit im Photobioreaktor entspricht, lag bei 0,15 d&supmin;¹. Diese Mikroalgen wurden mit anderen Worten über etwa 6 Tage in dem Photobioreaktor kultiviert. Es wurde eine Produktivität an Biomasse von 10 g/m²/d erzielt. Die Aufteilung der hauptsächlichen Fettsäuren ist folgende:
- C 16 : 0 = 30,8% der gesamten Fettsäuren (GF),
- C 20 : 4 = 23,4% der GF,
- C 20 : 5 = 16,8% der GF.

Beispiel 2

Die Mikroalge Porphyridium cruentum wurde in einem abgeschlossenen Photobioreaktor im kontinuierlichen Modus bei einer Temperatur von 26ºC unter starker Lichtintensität kultiviert.
Die Löserate wurde variiert und die Aufteilung der hauptsächlichen Fettsäuren war folgende:
- Löserate = 0,5 d&supmin;¹,
- C 20 : 4 = 4% der gesamten Fettsäuren (GF),
- C 20 : 5 = 15% der GF,
- Verhältnis R = 3,75.
- Löserate = 0,16 d&supmin;¹,
- C 20 : 4 = 6% der gesamten Fettsäuren (GF),
- C 20 : 5 = 8% der GF,
- Verhältnis R = 1,33.
Dies zeigt, daß die Menge C 20 : 5 ansteigt, wenn die Löserate ansteigt.

Beispiel 3

Die Mikroalge Porphyridium cruentum wurde in einem abgeschlossenen Photobioreaktor im kontinuierlichen Modus bei einer Temperatur von 22ºC und einer Löserate von 0,3 d&supmin;¹ kultiviert. Anschließend wurde ein Temperaturunterschied aufgeprägt, wobei die Biomasse unter einer Lichtintensität von 30 uE/m²/s und ohne CO&sub2;- Anreicherung auf eine Temperatur von 12ºC gebracht wurde.
In Abhängigkeit von der Verweilzeit der Kultur bei 12ºC (Dauer des Temperaturunterschiedes) wurde folgende Aufteilung der hauptsächlichen Fettsäuren beobachtet:
Anfangsaufteilung (aus dem Photobioreaktor 1 kommende Kultur):
C 16 : 0 = 31,4% der gesamten Fettsäuren (GF),
C 20 : 4 = 27,1% der GF,
C 20 : 5 = 19,8% der GF und
R = 3,75.
Verweilzeit = 52 Stunden.
C 16 : 0 = 26,9% der GF,
C 20 : 4 = 21,9% der GF,
C 20 : 5 = 30,6% der GF,
R = 1,40.
Verweilzeit = 97 Stunden.
C 16 : 0 = 28,3% der GF,
C 20 : 4 = 16,5% der GF,
C 20 : 5 = 33,4% der GF,
R = 2,02.
Verweilzeit = 144 Stunden.
C 16 : 0 = 27,5% der GF,
C 20 : 4 = 14,5% der GF,
C 20 : 5 = 38,1% der GF,
R = 2,63.
Vergleicht man das Beispiel 1 und das Beispiel 2 vordem Aufprägen des Temperaturunterschiedes, stellt man fest, daß das Verhältnis R trotz einer leicht unterschiedlichen Löserate ähnlich ist, während demgegenüber bei einer höheren Löserate (Beispiel 2) der Prozentsatz der mehrfach ungesättigten Fettsäuren im Verhältnis zu den gesamten Fettsäuren zunimmt.
Ein Temperaturunterschied zum Kalten hin bewirkt eine Zunahme des Gehalts an C 20 : 5 (und folglich eine Zunahme von R). Tatsächlich reagiert die Mikroalge, wenn sie einem solchen Temperaturunterschied unterzogen wird, in einer Weise, um eine gewisse Membran-Fluidität aufrechtzuerhalten, die mit der Photosynthese und den Membranaustauschvorgängen kompatibel ist.

Beispiel 4

Die Mikroalge Porphyridium cruentum wurde in einem abgeschlossenen Photobioreaktor bei einer Temperatur von 22ºC und einer Löserate von 0,3 d&supmin;¹ kultiviert. Anschließend wurde ein Temperaturunterschied aufgeprägt, wobei die Biomasse für 144 h auf eine Temperatur von 12ºC gebracht wurde. Später wurde diese Kultur durch Zentrifugieren bis zu einem Trockenmassegehalt von 20 g/l, konzentriert. Diese Kultur wurde in einem Homogenisator unter einem Druck von 500.10&sup5; Pa und unter Temperaturregelung zerkleinert und dann zentrifugiert oder gefiltert.
Die Lipide wurden aus dem festen Bodensatz mittels eines Gemischs Chloroform : Methanol : Wasser (2 : 2 : 1,8) extrahiert. Die so extrahierte Lipid-Fraktion entspricht 11,5% der Algen-Trockenmasse. Diese Fraktion enthält insgesamt 36% Fettsäuren. Von diesen Fettsäuren beträgt das C 20 : 4 14,5% und das C 20 : 5 38,1%. Das so gewonnene Öl, das durch Karotenoide gefärbt ist, enthält somit insgesamt 5,2% C 20 : 4 und 13,7% C 20 : 5 (R = 2,63).

Claims

1. Verfahren zur selektiven Herstellung von ungesättigten Lipiden ausgehend von einer Mikroalgenkultur des Typs Porphyridium cruentum, gekennzeichnet, durch die folgenden Schritte:

- die Mikroalge Porphyridium cruentum in einem zylindrischen geschlossenen Photobioreaktor (1, 80) in einem flüssigen Kulturmedium (5, 106) mit einer NaCl-Konzentration größer 0,2 M und bei einer Temperatur zwischen ca. 20 und 30ºC kultivieren,

- wenigstens einen Teil der gewonnenen Biomasse aus dem Photobioreaktor herausnehmen und in einen Bottich (45) plazieren zur selektiven Anreicherung in mehrfach ungesättigten Lipiden,

- diese Biomasse sofort und während eines gegebenen Zeitraums einem Temperaturunterschied verglichen mit der Kulturtemperatur im Photobioreaktor unterziehen, um die Nicht-Sättigung der Fettsäuren der Lipide zu modifizieren.

2. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden ergänzenden Schritte:

- die in mehrfach ungesättigten Lipiden angereicherten Mikroalgen konzentrieren,

- die Mikroalgen zerkleinern,

- die flüssige Phase von der die gesamten mehrfach ungesättigten Lipide enthaltenden festen Phase trennen,

- die genannten Lipide durch Zuhilfenahme eines Lösungsmittels extrahieren und

- das genannte Lösungsmittel verdunsten und die gewonnenen mehrfach ungesättigten Lipide sammeln.

3. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Unterziehen der Biomasse einem thermischen Unterschied darin besteht, diese auf eine Temperatur zwischen ca. 4º und 15ºC zu bringen, um auf diese Weise mehr unge sättigte Lipide zu erhalten als ursprünglich in den Mikroalgen enthalten.

4. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Unterziehen der Biomasse einem thermischen Unterschied darin besteht, diese auf eine Temperatur zwischen ca. 30º und 40ºC zu bringen, um auf diese Weise weniger ungesättigte Lipide zu erhalten als ursprünglich in den Mikroalgen enthalten.

5. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der thermische Unterschied während einer Dauer von mehr als 12 Stunden angebracht wird.

6. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der thermische Unterschied während einer Dauer von 12 bis 120 Stunden angebracht wird.

7. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verdünnungsrate der Kultur zwischen 0,1 und 1j-1 liegt.

8. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in das Kulturmedium (5, 106) mit CO&sub2; angereicherte Luft in einer Konzentration von ca. 1 bis 5% einführt.

9. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Kulturmediums (5, 106) in dem Photobioreaktor (1) zwischen ca. 6 und 8 liegt.

10. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb des Photobioreaktors (1, 80) die durchschnittliche Beleuchtung zwischen 400 und 2000 kcal/m²/Tag liegt.

11. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zerkleinerung der Mikroalgen in einem Apparat zum Homogenisieren und Zerkleinern (57) mit einer Temperatur kleiner als ca. 30ºC und einem Druck höher als 300.10&sup5; Pa durchgeführt wird.

12. Verfahren zur selektiven Herstellung von mehrfach ungesättigten Lipiden gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für die Extrahierung verwendeten Lösungsmittel um ein organisches Lösungsmittel wie z. B. Chlorophorm oder Hexan handelt.