DE1642598C3 - Züchten von Mikroorganismen - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen auf Kohlenwasserstoffmaterialien in Gegenwart eines wäßrigen Nührmcdiums und Sauerstoff, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Kohlenwasserstoffmaterial Methan und ein Gemisch von Methan verzehrenden Bakterien einsetzt, wobei in dieser Mischung wenigstens ein Haktcricnstamm vorliegt, dessen Zellen kleiner als die Zcllgröße eines zweiten Baktcrienstammes im Mikroorganismengemisch sind, daß man das Produkt der Kultivierung kontinuierlich aus der Kultivierungsstufc abzieht und mit oder ohne Zwischenbchandlung eine den großen Mikroorganismus und den kleinen Mikroorganismus enthaltende Fraktion zentrifugiert und dabei eine Zentrifugierfraktion erhält, in der das Zahlcnvcrhältnisdes Baktcrienstammes mit den größeren Zellen /um Bakterienstamm mit den kleineren Zellen größer als das entsprechende Zahlcnverhiiltnis in der Kultivierungsstufc ist, und wobei weiterhin aus der Zenlrifugierungsstufc eine Zentrifugierkreislauffraktion gewonnen wird, die clcn Baktcricnstamm mit den kleineren Zellen enthält, wobei wenigstens ein Teil dieser/entrifugierten Kreislauf fraktion mit oder ohne /wischcnhchandlung in die Kiiltivieriingsstiife zurückgeführt wird.

Durch die erfindungsgemüße Arbeitsweise ist es möglich, die Vorteile /u erzielen, die in der Symbiose von zwei Stummen von Mikroorganismen liegen, wobei jedoch nur ein Mikroorganismus gewonnen wird, der sich durch Zentrifugieren abscheiden läßt. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen insbesondere darin, daß es gelingt, das Wachstum des Bakterienstammes mit größeren Zellen optimal zu fördern und damit diesen Bakterienstamm als Ernteprodukt zu gewinnen. Der in Symbiose mitwachsende und im Kreislauf rückgeführte Bakterienstamm mit kleineren Zellen begünstigt das Wachstum des größeren Stammes in vielfacher Weise. Die Wachstumsgeschwindigkeit und die Ausbeute des größeren Stammes werden erhöht bzw. verbessert. Es zeigt sich, daß das Kulturmedium eine erhöhte Resistenz gegen Infektionen aufweist. Die Schaumbildung bei der Wachstumsstufe wird herabgesetzt. Offenbar verzehren die kleineren Stämme schaumbildende Stoffwechseiprodukte aus dem Wachstum des größeren Mikroorganismus. Für die praktische Durchführung eines Verfahrens, bei dem zwei Gasströme — nämlich Methan und sauerstoffhaltiges Gas — eingesetzt werden, ist dieses von besonderer Bedeutung.

Der Bakterienstamm mit den größeren Zellen hat vorzugsweise einen mittleren Zellendurchmesser im Bereich von 1 bis 3 μ, während der mittlere Zellendurchmesser des Bakterienstammes mit den kleineren Zellen vorzugsweise geringer ist als 1 μ.

Natürlich können Gemische von Mikroorganismen verwendet werden, die mehrere Bakterienstämme der einen Art und/oder mehrere Stämme der anderen Art enthalten.

Das Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterial ist Methan.

Die hier genannten Bakterien sind nach dem Klassifizierungssystem eingeteilt, das in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« von R.S.Breed, E.G.D. Murray und N.R. Smith, herausgegeben von Williams und Wilkins (Baltimore, USA), 7. Auflage 1957, beschrieben ist.

Zu den vorstehend genannten Bakterien mit größeren Zellen, die sich zur Symbiosekultur auf Methan eignen, gehören Mikroorganismen der Ordnung Pseudomonadalcs. Zweckmäßig hiervon sind Mikroorganismen der Familie Pseudomonadaceac, insbesondere der Gattung Pseudomonas. Eine sehr gute Spezies ist Pseudomonas mcthanica.

Zu den vorstehend genannten ßakterienstämmen mit kleineren Zellen, die sich für die Symbiosekultur auf Methan eignen, gehören Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales. Zweckmäßig hiervon sind Mikroorganismen der Familie Mycobac·* jriaecae, insbesondere der Gattung Mycobacterium. Sehr gute Spezies sind Mycobatcrium sp. und M. methanicum.

Für das Wachstum der Mikroorganismen sind außer dem Einsatzmalerial ein wäßriges Nährmedium und Sauerstoff, am besten in Form von Luft, erforderlich.

Ein typisches Nährmedium für das Wachstum von Nocardia hat die folgende Zusammensetzung:

(NH₄J₂SO₄

MgSO, 7H₁O

FeSO₄ 7H,Ο

MnSO₁-H₁O

KH₁PO₁

NaHPO₁- I 211,0

CaCI₁

Na₂CO,

Hefeextrakt

Destilliertes Wasser (zur

0.20 g
0,05 μ
0.002 μ
~ μ
μ
μ
μ

.008 μ
Auffüllung auf 1000 ml).

0.1
0.1
0.(

For andere Bakterien kann ein Medium der folgen- wie in den den Zusammensetzung verwendet werden: schrieben.

DE-PSen 1470507 und 1442070 be-

KH₂PO. MgSO₄ ·7Η,Ο

7g 0,2 g 0,1g

NH₄CI

Leitungswasser (Spurenelemente) 100 ml Hefeextrakt 0,025 g Destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml).

Ein weiteres geeignetes Nährmedium für die Kultivierung von Bakterien hat die folgende Zusammensetzung:

NH₄Cl 0,5 g

NaCl 4 g

MgSO₄ 0,5 g

Na₂HPO₄ 0,5 g

KH₂PO₄ 0,5 g Wasser zur Auffüllung auf 1000 ml.

Beispiel

Die folgenden Mikroorganismen wurden gemäß der Erfindung als Symbiosekultur gezüchtet: a) Ein Stamm der Spezies Pseudomonas methanicum mit einem mittleren Durchmesser von 3 μ und

i" b) ein Stamm der Spezies Mycobacterium methanicum mit einem mittleren Durchmesser von 1 μ. Ein Impfmaterial wurde in einer 2-1-Charge in einem mit Rührwerk versehenen Fermenter gezüchtet. Nach 72 Stunden betrug die Zelldichte 3,5 g/l. Dieses r> Impfmaterial wurde in einen mit Leitblechen und Rühi werk versehenen 20-1-Fermenter überführt, der kontinuierlich in Gegenwart eines Kulturmediums betrieben wurde, das bei Zuführung zum Fermenter die folgende Zusammensetzung hatte, wobei die Ver- -'" dünnungsrate 0,05 betrug:

Das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wird begünstigt, wenn man zum Kulturmedium eine sehr geringe Menge eines Hefeextrakts oder essentielle Nutrilite zusetzt. Zu den essentiellen Nutriliten r> gehören Biotin, Pantothensäure, Nicotinsäure, Thiamin, Inosit und Pyridoxin. Die zugesetzte Menge des Hefeextraktes liegt am besten in der Größenordnung von 25 Teilen pro Million. Die erforderliche Menge jedes Nutriliten liegt zwischen etwa 0,1 Teilen pro κι Million für Biotin und etwa 10 Teilen pro Million für Inosit.

Das wäßrige Nährmedium in jedem Fermenter wird zweckmäßig beim gewünschten pH-Wert gehalten, indem ein wäßriges Medium von hohem oH-Wert stu- π fenweise oder kontinuierlich zugesetzt wird.

Die optimale Temperatur des Kultivierungsgemisches ist verschieden je nach der Art des verwendeten Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25 bis 35° C. in

Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum des Mikroorganismus wesendich. Der Sauerstoff wird gewöhnlich als Luft zugeführt.

Günstige Verfahren für die Kultivierung der Mikroorganismen und für die Abscheidung des Produkts π sind z. B. in den britischen Patentschriften 914567 und 914568, in den DE-OSen 1 545238, 1 545239, 1 517736 und I 545 252, in der DE-AS 1 442212 so-

(NH₄J₂SO₄ i g/i

MgSO₄-7H₂O 0,2 g/l

FeSO₄ · 7H₂O 0,005 g/l

MnSO₄ H₂O 0,002 g/l

KH₂PO₄ 2 g/l

Na₂HPO₄-12H,O 3 g/l

CaCI₂ ' 0,1 g/l

Hefeextrakt 0,008 g/l Leitungswasser zur Auffüllung auf 1000 ml.

Dem Fermenter wurde ein Gasgemisch, das 20 Vol.-% Methan und 80 VoI.-% Luft enthielt, in einer Menge von 10 V/V/Stunde zugeführt. Der Mikroorganismus bestand in dieser Kultivicrungsphase aus einem Gemisch von 15% des kleineren Mikroorganismus (Trockengewicht) und 85% des größeren Mikroorganismus.

Durch Zentrifugieren wurden pro Liter 3 g des Mikroorganismus vom Kulturmedium abgurennt. Diese Produktfraktion bestand zu 90% aus großen Mikroorganismen und zu 10% aus kleinen Bakterien (Trockengewicht). Die im Kreislauf geführte Fraktion enthielt pro Liter 0,2 g Zellen, die sich aus 90% kleinen Bakterien und aus 10% großen Mikroorganismen (Trockengewicht) zusammensetzten. Durch die im Kreislauf geführte Fraktion wurde eine ständig erneute Impfung bewirkt.

Claims (2)

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen auf Kohlenwasserstoff materialien in Gegen- ' wart eines wäßrigen Nährmediums und Sauerstoff, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoffamterial Methan und ein Gemisch von Methan verzehrenden Bakterien einsetzt, wobei in dieser Mischung wenigstens ein Bakterien- '" stamm vorliegt, dessen Zellen kleiner als die Zellgröße eines zweiten Bakterienstammes im Mikroorganismengemisch sind, daß man das Produkt der Kultivierung kontinuierlich aus der Kultivierungsstufe abzieht und mit oder ohne Zwischen- ^:· behandlung eine den großen Mikroorganismus und den kleinen Mikroorganismus enthaltende Fraktion zentrifugiert und dabei eine Zentrifugierfraktion erhält, in der das Zahlenverhältnis des Bakterienstammes mit den größeren Zellen zum -" Bakterienstamm mit den kleineren Zellen größer ais das entsprechende Zahietiverhäitnis in der Kultivierungsstufe ist, und wobei weiterhin aus der Zentrifugierungsstufe eine Zentrifugierkreislauffraktion gewonnen wird, die den Bakterienstamm -· mit den kleineren Zellen enthält, wobei wenigstens ein Teil dieser zentrifugierten Kreislauffraktion mit oder ohne Zwischenbehandlung in die Kultivierungsstufe zurückgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- i" kennzeichnet, daß man als Bakterienstamm mit den größeren Zellen einen solchen mit einem mittleren Zellendurchmesser im Bereich von I bis 3 Mikron und als Bakterienstamm mit den kleineren Zellen einen solchen mit einem mittleren ZeI- r. lendurchmesser unter 1 Mikron einsetzt.