DE1642592B

DE1642592B - Process for the production of glucose oxidase which is practically free of extraneous oxidase

Info

Publication number: DE1642592B
Authority: DE
Inventors: Hans Ulrich Dr.rer.nat 8132 Tutzing; Gruber Wolfgang Dr.phil. nat. 8132 Garatshausen; Moellering Hans; Thum Waldemar; 8132 Tutzing. B21b 13-08 Bergmeyer
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von praktisch fremdoxydasefreier Glucoseoxydase. The invention relates to a method for obtaining glucose oxidase which is practically free of foreign oxidases.

Es sind bereits mehrere Verfahren zur Gewinnung von Glucoseoxydase bekannt. Bei einem Verfahren wird die Glucoseoxydase aus dem wäßrigen Extrakt mit einer Suspension von Natriumgluconat in Äthanol gefällt. Dieses Verfahren führt jedoch zu einem Produkt, welches eine für die Glucosebestimmung zu hohe Menge an Aminoxydasen enthält. Auch andere Laboratoriumsmethoden sind bekannt, die zwar in zahlreichen Reinigungsschritten zu einem verhältnismäßig stark angereicherten Präparat führen, welches jedoch immer noch unerwünscht hohe Aminoxydasegehalte aufweist.Several processes for the production of glucose oxidase are already known. In one proceeding the glucose oxidase is obtained from the aqueous extract with a suspension of sodium gluconate in ethanol like. However, this method results in a product which is one for glucose determination contains high levels of amine oxidases. Other laboratory methods are also known, although they are described in numerous purification steps lead to a relatively highly enriched preparation, which however, it still has undesirably high amine oxidase levels.

Es besteht daher ein Bedarf nach einem Verfahren zur Gewinnung von praktisch fremdoxydasefreier Glucoseoxydase.There is therefore a need for a process for obtaining practically free of foreign oxidases Glucose oxidase.

Die Wirkung verschiedener Fällungsmittel auf die Ausfällung des Enzyms Glucoseoxydase ist bereits untersucht worden. Neben vielen anderen Fällungsmitteln wurde dabei auch schon Methanol auf seine Brauchbarkeit untersucht. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß Methanol zu diesem Zweck rehr schlecht geeignet ist und bei einem Zusatz von 50 Volumprozent nur zu einer Ausbeute von etwa 11 °/o führt und auch mit wesentlich höheren Konzentrationen Ausbeuten von 5O°/o nur knapp erreicht werden. Andere Fällungsmiltel, insbesondere andere Alkohole, liefern demgegenüber wesentlich bessere Ausbeuten.The effect of various precipitants on the precipitation of the enzyme glucose oxidase is already there been investigated. In addition to many other precipitants, methanol was also used on his Usefulness examined. The results obtained indicated that methanol was stirring for this purpose is poorly suited and with an addition of 50 percent by volume only to a yield of about 11% leads and also with considerably higher concentrations Yields of 50% can only just be achieved. Other precipitants, especially others Alcohols, on the other hand, give significantly better yields.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei ganz bestimmten Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen und Einhaltung einer ganz scharf begrenzten Fällungsmittelkonzentration das Methanol sich völlig anders verhält, als die bekannten Untersuchungen erwarten ließen, und zu einem Glucoseoxydaseprodukt führt, welches praktisch frei ist von Fremdoxydase (Aminooxydase) und in ausgezeichneter Ausbeute anfällt.Surprisingly, it has been found that under very specific temperature and pH conditions and maintaining a very sharply limited precipitant concentration, the methanol completely behaves differently than the known investigations lead one to expect, and leads to a glucose oxidase product leads, which is practically free from foreign oxidase (amino oxidase) and in excellent Yield is incurred.

Das erfindungsgemnße Verfahren zur Gewinnung von praktisch fremdoxydasefreier Glucoseoxydase aus einer in an sich bekannter Weise vorgereinigte Glucoseoxydase enthaltenden wäßrigen Lösung ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 unter Einhaltung einer Temperatur von 15 bis 25" C, vorzugsweise von 19 bis 21° C, mit Methanol auf 58 bis 62 Volumprozent versetzt und den gebildeten Niederschlag abtrennt. Hierbei ist es vorteilhaft, einen pH-Wert von 7,0 einzuhalten.The process of the present invention for obtaining glucose oxidase practically free from foreign oxidases from an aqueous solution containing glucose oxidase prepurified in a manner known per se now characterized in that the aqueous solution at a pH of 6.5 to 7.5 while observing a temperature of 15 to 25 "C, preferably from 19 to 21 ° C, mixed with methanol to 58 to 62 percent by volume and the precipitate formed separates. It is advantageous to maintain a pH of 7.0.

Als Ausgangsmalerial für das erfindungsgemäßc Verfahren eignen sieh sowohl frisch gewonnene Glucoseoxydaseextrakte als auch Lösungen handelsüblicher Präparate, die erhebliche Mengen an Aminoxydasen enthalten. Die Glucoseoxydase findet sich zwar in zahlreichen Geweben, besonders günstige Ausgangsmaterialien zu ihrer Gewinnung sind jedoch Penicillium- und AspergUlus-Stämme, insbesondere Aspergillus niger und Penicillium notatum. Durch einfache wäßrige Extraktion dieser Mikroorganismen und Abtrennung der unlöslichen Feststoffe in bekannter Weise lassen sich vorgereinigte Glucoseoxydase enthaltende wäßrige Lösungen gewinnen, auf die das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft anwendbar ist.
Das Verfahren der Erfindung läßt sich aber ebenso vorteilhaft zur Reinigung von bereits angereicherten handelsüblichen Glucoseoxydasepräparaten verwenden. Hierbei erfolgt nicht nur eine Beseitigung der störenden Aminoxydasen, sondern auch eine weitere beträchtliche Anreicherung.Both freshly obtained glucose oxidase extracts and solutions of commercially available preparations which contain considerable amounts of amine oxidases are suitable starting materials for the process according to the invention. Although glucose oxidase is found in numerous tissues, particularly favorable starting materials for its production are Penicillium and AspergUlus strains, in particular Aspergillus niger and Penicillium notatum. By simple aqueous extraction of these microorganisms and separation of the insoluble solids in a known manner, pre-purified aqueous solutions containing glucose oxidase can be obtained, to which the process according to the invention can advantageously be applied.
However, the method of the invention can also be used advantageously for the purification of commercially available glucose oxidase preparations which have already been enriched. This not only eliminates the disruptive amine oxidases, but also leads to a further considerable accumulation.

Gut geeignet für das Verfahren der Erfindung sind Glucoseoxydasepräparate mit einer Mindestaktivität von etwa 7 bis 10 U/mg. Ausgezeichnet sind handelsübliche Glucoseoxydasepräparate mit einer spezifischen Aktivität um 20 U mg. Bei Verwendung von rohen Extrakten sollte vorteilhaft eine Anreicherung nach einem der bekannten Verfahren durchgeführt werden, falls die Aktivitätswerte wesentlich unter dem oben angegebenen Bereich von etwa 7 bis 10 U/mg liegen. Hierfür eignet sich beispielsweise das in CoI ο wick und Kaplan »Methods in Enzymology«, Vol. I, S. 340 bis 345, beschriebene Verfahren. Für das Verfahren der Erfindung können auch Glucoseoxydasepräparate mit wesentlich höheren Aktivitätswerten verwendet werden.Glucose oxidase preparations with a minimum activity are well suited for the process of the invention from about 7 to 10 U / mg. Commercially available glucose oxidase preparations with a specific one are excellent Activity around 20 U mg. When using raw extracts, fortification should be beneficial be carried out according to one of the known methods, if the activity values are significantly below the range given above from about 7 to 10 U / mg. For example, this is suitable for this in CoI ο wick and Kaplan "Methods in Enzymology", Vol. I, pp. 340 to 345. For the method of the invention can also Glucose oxidase preparations with much higher activity values can be used.

Von besonderer Bedeutung für das erfindungsgemäße Verfahren ist eine genaue Einhaltung der Temperatur und pH-Wert Bedingungen. Die Temperatur sollte zur Erzielung bester Ergebnisse auf 20 ± Γ C gehalten werden. Brauchbare Ergebnisse werden auch noch zwischen 15 und 25' C erhalten. Der pH-Wert soll zwischen pH 6,5 und 7,5 liegen, vorzugsweise bei pH 7,0. Da sich der pH-Wert während der Methanolfällung zum alkalischen Bereich hin verschiebt, muß zur Einhaltung des erwähnten Bereiches zumeist etwas Säure zugesetzt werden. Bei einer Verschiebung des pH-Wertes auf die saure Seite des angegebenen Bereiches wird zwar die Filtrierbarkeit der erhaltenen Fällung verbessert, die Abtrennung der unerwünschten Fremdoxydasen wird hierbei jedoch verschlechtert. Die günstigsten Ergebnisse werden bei pH 7,0 erzielt.Of particular importance for the method according to the invention is an exact adherence to the Temperature and pH conditions. The temperature should be based on for best results 20 ± Γ C must be maintained. Useful results are still obtained between 15 and 25 ° C. The pH should be between pH 6.5 and 7.5, preferably at pH 7.0. As the pH changes during the methanol precipitation shifts towards the alkaline range, must to comply with the above A little acid can usually be added to the area. When the pH value shifts to the acidic side In the specified range, the filterability of the precipitate obtained is improved, the separation the undesired foreign oxidases is worsened in this case, however. The best results are achieved at pH 7.0.

Der Methanolzusatz erfolgt auf 58 bis 62 Volumprozent. Um eine vollständige Abtrennung der Aminoxydasen zu gewährleisten, sollen etwa 5 bis 10% der Glukoseoxydaseaktivität im Überstand verbleiben. Bei den obenerwähnten bevorzugten Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen wird bei einem Zusatz von 58 Volumprozent Methanol eine Ausbeute von etwa 90 bis 95% eines hochgereinigtcn Produktes erhalten.The methanol is added to 58 to 62 percent by volume. To ensure complete separation of the amine oxidases To ensure that about 5 to 10% of the glucose oxidase activity should remain in the supernatant. At the preferred temperature and pH conditions mentioned above, when an additive from 58 percent by volume of methanol a yield of about 90 to 95% of a highly purified product receive.

Zwischen der Temperatur, bei der die Methanolfällung durchgeführt wird, und dem Volumprozenlsatz an zugesetztem Methanol besteht ein Zusammenhang insofern, als bei den höheren Temperaturen im angegebenen Bereich auch der Methanolprozentsatz an der oberen Grenze ausgenutzt werden kann, d. h.. bei einer Temperatur von 24 bis 25⁰C können bis 62 Volumprozent Methanol zugesetzt werden.There is a relationship between the temperature at which the methanol precipitation is carried out and the volume percentage of added methanol insofar as the methanol percentage at the upper limit can also be used at the higher temperatures in the specified range, ie. at a temperature of 24 to 25 ^0C, methanol may be added to 62 volume percent.

Die Ausfällung der Glucoseoxydase unter den angegebenen Bedingungen erstreckt sich über einen gewissen Zeitraum. Es ist daher vorteilhaft, die mit Methanol versetzte Lösung noch einige Zeit unter exakter Einhaltung der angegebenen Bedingungen stehenzulassen, vorzugsweise mindestens 1 Stunde lang. Anschließend wird der Niederschlag unter Aufrechterhaltung der Temperatur abgetrennt.The precipitation of glucose oxidase among those indicated Conditions extends over a period of time. It is therefore advantageous to use the Methanol was added to the solution for some time while the specified conditions were precisely observed let stand, preferably for at least 1 hour. Subsequently, the precipitate is maintained the temperature separated.

Zur Abtrennung des Niederschlages werdea vorteilhaft Filtrierhilfsmittel zugesetzt. Hierzu eignen sich die bekannten handelsüblichen Filtrierhilfsmittel. Es ist jedoch darauf zu achten, daß keine Filtrierhilfen verwendet werden, welche auf die Aktivität des Enzyms eine schädliche Einwirkung hdben.It is advantageous to separate the precipitate Filter aid added. The known commercially available filter aids are suitable for this purpose. Care should be taken, however, that no filter aids are used which could affect the activity of the Enzymes have a harmful effect.

Bei Verwendung von Filtrierhilfsmitteln läßt sich der Niederschlag leicht abfiltrieren bzw. mittels Filterpressen abtrennen. Wenn keine Filtrierhilfsmittel angewendet werden, kann das Produkt direkt abzentrifugiert und in der so gewonnenen Form nach Trocknen aiii Luft verwendet werden.When using filter aids, the precipitate can be easily filtered off or by means of Disconnect filter presses. If no filter aids are used, the product can be used directly centrifuged off and used in the form thus obtained after drying aiii air.

Bei Verwendung von Filtrierhilfsmitteln erfolgt nach der Ausfällung eine Abtrennung des Enzyms durch Auflösen in Wasser mit neutralem bis schwachsaurem pH-Wert, Abtrennung des Unlöslichen, Einengen des Filtrats und Lyophilisieren. Vorzugsweise wird zur Auflösung bzw. Aufschlämmung des filtrierhilfsmittelhaltigen Präparates Wasser von pH 5 bis 6 verwendet. Es können jedoch auch außerhalb des Bereiches liegende pH-Werte angewendet werden, wobei jedoch die bekannten Grenzen der pH-Wertstabilität des Enzyms eingehalten werden sollen. Diese Grenzen liegen bei etwa pH 3,5 und 8,0. Wenn vor der Lyophilisierung die Glucoseoxydaselösung konzentriert wird, so erfolgt dies vorzugsweise im Vakuum bei nur mäßig erhöhten Temperaturen. Vorteilhaft sollte eine Temperatur von etwa 45^C C nicht überschritten werden. Besonders gute Ergebnisse werden bei etwa 37° C erzielt.If filter aids are used, the enzyme is separated off after the precipitation by dissolving it in water with a neutral to weakly acidic pH, separating off the insolubles, concentrating the filtrate and lyophilizing. Preferably, water with a pH of 5 to 6 is used to dissolve or slurry the preparation containing the filter aid. However, pH values outside the range can also be used, although the known limits of the pH value stability of the enzyme should be adhered to. These limits are around pH 3.5 and 8.0. If the glucose oxidase solution is concentrated before the lyophilization, this is preferably done in a vacuum at only moderately elevated temperatures. A temperature of around 45 ^° C. should advantageously not be exceeded. Particularly good results are achieved at around 37 ° C.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einem von Fremdoxydasen praktisch freien Produkt. Als frei von störender Fremdoxydase, insbesondere Aminoxydase, wird im Rahmen der Erfindung ein Produkt angesehen, welches bei 25° C. einer Aktivität von 10 U /ml, bei 436 nm und 1 cm Weglänge im Photometer eine Extinktionsdifferenz von weniger als 0,010 pro Stunde ergibt.The process according to the invention leads to a product which is practically free of extraneous oxidases. When free from interfering foreign oxidase, in particular amine oxidase, is a Product viewed, which at 25 ° C. an activity of 10 U / ml, at 436 nm and 1 cm path length im Photometer gives an absorbance difference of less than 0.010 per hour.

Die Durchführung der photometrischen Reinheitsbestimmung wird in einem Reagens durchgeführt, welches wie folgt zusammengesetzt ist:The photometric purity determination is carried out in a reagent, which is composed as follows:

100 ml Phosphatpuffer (0,1 Mol, pH 7,0)
1 mg Peroxydase100 ml phosphate buffer (0.1 mol, pH 7.0)
1 mg peroxidase

6,6 mg o-Dianisidin (in Form einer Lösung von 6,6 mg/ml)6.6 mg o-dianisidine (in the form of a solution of 6.6 mg / ml)

Abgesehen von der Entfernung der Fremdoxydasen, welche bei der Verwendung der Glucoseoxydase zur Bestimmung von Glucose erhebliche Störungen verursachen und bisher die Herstellung von Testpräparaten, welche in Lösung einen ganzen Tag lang verwendbar bleiben, unmöglich machten, führt das erfindungsgemäße Verfahren auch zu einer weiteren Anreicherung um etwa 300%. Bei Verwendung einer handelsüblichen Glucoseoxydase von 20 U/mg als Ausgangsprodukt führt das Verfahren zu einem Produkt von etwa 60 U/mg.Apart from the removal of extraneous oxidases, which occurs when using glucose oxidase for the determination of glucose cause considerable disturbances and so far the production of test preparations, which remain usable in solution for a whole day, made impossible, the method according to the invention also leads to a further enrichment of about 300%. Using The process is carried out using a commercially available glucose oxidase of 20 U / mg as the starting product to a product of about 60 U / mg.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es auch in technischem Maßstab ohne Schwierigkeiten durchführbar ist und ίο keine teuren Hilfsreagenzien benötigt.Another advantage of the process according to the invention is that it is also technically Scale can be carried out without difficulty and ίο does not require expensive auxiliary reagents.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.The following examples are intended to explain the invention further.

example 1

10 kg handelsübliche Glucoseoxydase mit einer spezifischen Aktivität von 20 U/mg werden in 195 1 voll entsalztem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,0 und die Temperatur auf 20° C eingestellt. Dann wird unter laufender pH-Wertkorrektur mit 2 η-Salzsäure auf 7,0 bis 2701 Methanol auf eine Methanolkonzentration von 58 Volumprozent versetzt. Die mit Methanol versetzte Lösung wird bei genau 20° C anschließend etwa 1 Stunde lang stehengelassen. Dann werden 5 kg Hyflo-Supereel (Filtrierhilfsmittel der Firma Mansfield USA) zugesetzt und der Niederschlag in einer Filterpresse abgetrennt. 10 kg of commercial glucose oxidase with a specific activity of 20 U / mg are used in 195 1 fully desalinated water. The pH of the solution is increased to 7.0 and the temperature to 20 ° C set. Then, with ongoing pH correction with 2η hydrochloric acid, to 7.0 to 270 l of methanol added to a methanol concentration of 58 percent by volume. The solution mixed with methanol is then left to stand at exactly 20 ° C for about 1 hour. Then 5 kg of Hyflo Supereel (Filter aid from Mansfield USA) was added and the precipitate was separated off in a filter press.

Der Filterkuchen wird mit 50 1 kaltem voll entsalztem Wasser 15 Minuten schaumfrei homogenisiert. Dann wird der pH-Wert der Suspension mit 2n-Salzsäure auf 6,0 eingestellt und die erhaltene Suspension filtriert.The filter cake is homogenized foam-free for 15 minutes with 50 liters of cold, fully demineralized water. The pH of the suspension is then adjusted to 6.0 with 2N hydrochloric acid and the resulting suspension is adjusted to 6.0 Suspension filtered.

Das Filtrat wird bei 35 bis 40° C im Glasumlaufverdampfer auf etwa 20 1 eingeengt und lyophilisiert.The filtrate is at 35 to 40 ° C in a glass circulation evaporator concentrated to about 20 l and lyophilized.

Ausbeute etwa 3 kg Glucoseoxydase mit einer Aktivität von etwa 60 U/mg. Dies entspricht einer Ausbeute von 9O°/o der Ausgangsaktivität.Yield about 3 kg of glucose oxidase with an activity of about 60 U / mg. This corresponds to a yield 90 per cent of the initial activity.

Das erhaltene Produkt zeigt bei 436 nm in der 1-cm-Küvette bei 25° C eine Extinktionsdifferenz von weniger als 0,010 pro Stunde. Das eingesetzte handelsübliche Präparat ergibt unter den gleichen Bedingungen eine Extinktionsdifferenz von etwa 0,08 pro Stunde.The product obtained shows an absorbance difference of 436 nm in the 1 cm cuvette at 25 ° C less than 0.010 per hour. The commercially available preparation used gives under the same conditions an absorbance difference of about 0.08 per hour.

Example 2

5 g einer aus Mycel durch direkte Extraktion mit5 g of one made from mycelium by direct extraction with

salzhaltigem Wasser und Fällung der Proteine mit Alkohol erhaltenen Rohoxydase wurden in 100 ml H.,O gelöst und auf pH 6,0 eingestellt. Der SalzgehaltSalty water and precipitation of the proteins with alcohol obtained crude oxidase were in 100 ml H., O and adjusted to pH 6.0. The salinity

de'r Lösung war <0,01 · U/mg = 1,23.the solution was <0.01 · U / mg = 1.23.

97 ml dieser Lösung = 4,85 g wurden bei 20^r C auf 61 % Methanol gebracht, der pH-Wert mit wenig HCl auf 6,9 zurückgestellt und zentrifugiert. Der aufgenommene Niederschlag enthielt die Glucoseoxydase. Nach einer Glucoseoxydase- und Aminooxydasebestimmung wurde eingeengt und der Rückstand getrocknet.97 ml of this solution = 4.85 g were ^{brought to 61% methanol at 20 °} C., the pH was reset to 6.9 with a little HCl and centrifuged. The collected precipitate contained the glucose oxidase. After determination of glucose oxidase and amino oxidase, the mixture was concentrated and the residue was dried.

In der folgenden Tabelle werden die hierbei erzielte Anreicherung und Reinigung dargestellt.The table below shows the achieved Enrichment and purification shown.

Schrittstep GewichtWeight Glucoseoxydase-
AktiviiätGlucose oxidase
Activity U/mgU / mg Fremd
oxydasenForeign
oxidases Aus
beuteOut
prey Gelöste Glucoseoxydase . ....Dissolved glucose oxidase. .... 4.85 g
0,150 g4.85 g
0.150 g 6 -10³
4,5 · 10²
5,5 · 10³ 6 -10 ³
4.5 · 10 ²
5.5 · 10 ³ 1,23
36,51.23
36.5 0,015
<0,0010.015
<0.001 100 °/₀
7,5 °/o
91°/o100 ° / ₀
7.5%
91 ° / o Methanolzusatz auf über 61 Volumprozent
Nach Methanolzusatz auf 61 Vnlvmprozent erhaltener
Niederschlau Addition of methanol to over 61 percent by volume
After addition of methanol to 61 percent by volume
Downfall

Znm Nachweis des technischen Fortschrittes wurden Vergleichsversuche durchgeführt, bei denen ein bestimmtes zu reinigendes Glucoseoxyda&ipräparat einerseits nach dem Verfahren der Erfindung und andererseits nach den bekannten Verfahren gereinigt und jeweils die nach der Reinigung verbleibende Fremdoxydaseaktivität in gleicher Weise bestimmt wurde.As evidence of technical progress, comparative tests were carried out in which a certain glucose oxide preparation to be cleaned on the one hand by the method of the invention and on the other hand cleaned according to the known method and in each case the foreign oxidase activity remaining after the cleaning was determined in the same way.

Zur Durchführung der Versuche wurde in allen Fällen ein GGD-Präparat mit einer Aktivität von 1,95 U/mg und einem Fremdoxydasewert von Δ EIh = 0,050 eingesetzt. Der Wert Δ EIh wurde bei 25° C, 1 cm Meßlänge, 436 nm, bei 10 U GOD/ml Testvolumen mit Peroxydase und o-Dianisidin, wie oben beschrieben, gemessen.To carry out the experiments, a GGD preparation with an activity of 1.95 U / mg and a foreign oxidase value of Δ EIh = 0.050 was used in all cases. The value Δ EIh was measured at 25 ° C., 1 cm gauge length, 436 nm, at 10 U GOD / ml test volume with peroxidase and o-dianisidine, as described above.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Versuche gemäß der deutschen Auslegeschrift 1198 772. Bei den Versuchen wurde ein Gewichtsverhältnis GOD:Natriu!U-gluconat von 1:1 eingehalten. Die Versuche entsprechen den in Tabellen der deutschen Auslegeschrift 1198 772 angegebenen Bedingungen, jedoch ίο wurden je Fällungsmittel nur drei verschiedene Volumina eingesetzt.Table 1 shows the results of the tests according to German Auslegeschrift 1198 772. In the tests a weight ratio of GOD: sodium gluconate of 1: 1 was maintained. The trials correspond those in tables of the German interpretative document 1198 772 specified conditions, however ίο were only three different volumes per precipitant used.

table FällungsmittelPrecipitants

Volumenvolume

Im NiederschlagIn the precipitation

GODGOD

VoVo

FremdoxydasenForeign oxidases Δ E/hΔ E / h

GOD**GOD **

U/mgU / mg

GOD-Lösung, 50 mg/ml
Äthanol 95°/_oig GOD solution, 50 mg / ml
Ethanol 95 ° / _o ig

Isopropanol 99°/_oig Isopropanol 99 ° / _o ig

Methanol 99°/_oig Methanol 99 ° / _o ig

Aceton 99°/_oig Acetone 99 ° / _o ig

1,5
2,0
3,01.5
2.0
3.0

1,0
1,5
2,51.0
1.5
2.5

1,5
2,0
3,01.5
2.0
3.0

100
100100
100

9797

76
10076
100

92,5
10092.5
100

9292

96,5
10096.5
100

8282

82
10082
100

0,0500.050

0,0550.055

0,0730.073

0,0550.055

0,0400.040

0,0600.060

0,100*0.100 *

0,0200.020

0,0240.024

0,0670.067

0,060 0,103 0,136*0.060 0.103 0.136 *

1,941.94

1,621.62

0,750.75

0,940.94

4,34.3

1,01.0

0,590.59

1,12 0,78 0,33 1,22 0,63 0,441.12 0.78 0.33 1.22 0.63 0.44

* Mögliche Aktivierung der Fremdoxydase.* Possible activation of the external oxidase.

*♦ Bei steigender Zugabe von organischen Lösungsmitteln wird Na-Gluconat mit ausgefällt. Die spezifische Aktivität der GOD sinkt dabei.* ♦ With increasing addition of organic solvents, Na-gluconate is also precipitated. The specific activity of the GOD sinks.

Tabelle 2 zeigt die nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2 926122 erhaltenen Werte. Die verwendeten Fällungsmittel entsprechen deren Beispielen 3, 4 und 5 und deren Patentanspruch 3.Table 2 shows the values obtained by the method of U.S. Patent 2,926,122. The used Precipitants correspond to their examples 3, 4 and 5 and their patent claim 3.

table

FällungsmittelPrecipitants

Volumenvolume Imin the NiederschlagPrecipitation GODGOD zugesetztadded GOD
Vo GOD
Vo U/tngU / tng 00 100100 Fremdoxydasen
Δ EIh Foreign oxidases
Δ EIh 1,941.94 22 64,564.5 ! 0,050! 0.050 4,24.2 33 72,272.2 3,13.1 11 76,576.5 4,134.13 22 7272 1,771.77 11 9090 7,17.1 22 70,470.4 2,42.4 0,0700.070 0,0500.050 0,1070.107 0,0800.080 0,0430.043 0,1000.100

GOD-Lösung, 50 mg/ml GOD solution, 50 mg / ml

1 Volumen Isopropanol mit 1 Volumen Methanol ί gemischt \ 1 volume of isopropanol mixed with 1 volume of methanol ί \

n-Propanol \ n-propanol \

1 Volumen n-Propanol mit 2 Volumen Isopropanol ( gemischt \1 volume of n-propanol with 2 volumes of isopropanol (mixed \

Tabelle 3 zeigt die Durchführung des Verfahrens gemäß USA.-Patentschrift 3 265 587. Hierbei ist zu bemerken, daß die Messung der Fremdoxydasen und damit auch die Verwendung der erhaltenen GOD zu diagnostischen Zwecken nach einer BaCl„-Abtrennung nicht möglich ist, denn bei Einsatz der GOD-Lösung in das zur Diagnose verwendete Testsystem fällt ein gefärbter Niederschlag durch überschüssige Bariumionen aus. Um diese Schwierigkeit zu beseitigen, wurde zur Bestimmung von GOD und Fremdoxydase nach der Bariumionenzugabe vorher erschöpfend dialysiert.Table 3 shows the implementation of the method according to US Pat. No. 3,265,587. It should be noted that the measurement of the foreign oxidases and thus also the use of the GOD obtained for diagnostic purposes after a BaCl “separation is not possible, because when using the GOD solution in the test system used for diagnosis a colored precipitate precipitates out due to excess barium ions. To overcome this difficulty, was previously exhaustive for the determination of GOD and extraneous oxidase after the addition of barium ions dialyzed.

table

Fällungsmittel (NH₁I₂SO₁
MolPrecipitants (NH ₁ I ₂ SO ₁
Mole

Im Überstand GODIn the supernatant GOD

VoVo

Fremdoxydasen J E/h Foreign oxidases J E / h

GOD-Lösung, 50 mg/ml ..
CaCl₂, 93°/₀ der Theorie .
BaCl₂, 100 °/₀ der TheorieGOD solution, 50 mg / ml ..
CaCl _2, 93 ° / ₀ of theory.
BaCl _2, 100 ° / ₀ of theory

0,880.88

0,1750.175

100
80
47,5100
80
47.5

0,040 0,050 0,1200.040 0.050 0.120

Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 3 269 918. Zu bemerken ist, daß dieses Verfahren so aufwendig ist, daß eine Übertragung in den technischen Maßstab kaum möglich ist.Table 4 shows the results according to the method of U.S. Patent 3,269,918. Note that this process is so complex that it can hardly be transferred to an industrial scale.

table

Schritt GOD, »/„Step GOD, »/"

Fremdoxydasen, Δ E/h Foreign oxidases, Δ E / h

Enzymlösung, 50 mg/ml Enzyme solution, 50 mg / ml

Ammoniumsulfatfraktion nach Dialyse pH =4,5 Ammonium sulfate fraction after dialysis pH = 4.5

Chromatographie (DE-52)Chromatography (DE-52)

a) Durchlauf a) pass

b) Waschwasser (0,07 Mol Acetatpuffer pH = 4,5)b) washing water (0.07 mol acetate buffer pH = 4.5)

c) Eluate vereinigt (0,1 Mol Acetatpuffer pH = 3,7)c) Eluates combined (0.1 mol acetate buffer pH = 3.7)

100
86100
86

3,2
25
663.2
25th
66

0,050
0,0530.050
0.053

nicht getestet 0,025
0,030not tested 0.025
0.030

Tabelle 5 zeigt unter den oben erwähnten Bedingungen die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse.Table 5 shows those obtained by the process of the present invention under the above-mentioned conditions Results.

table FällungsmittelPrecipitants

Gehalt der der GOD-Lösung an MethanolMethanol content of the GOD solution GODGOD

VoVo

Im Niederschlag U/mgIn the precipitation U / mg

FremdoxydaseForeign oxidase AEIhAEIh

GOD-Lösung, 50 mg/ml
Methanol GOD solution, 50 mg / ml
Methanol

Die obigen Vergleichsversuchsergebnisse zeigen, daß nach der erwähnten deutschen Auslegeschrift nur eine völlig unbefriedigende Abtrennung der Fremdoxydasen, nach den Verfahren der USA.-Patentschriften praktisch überhaupt keine Abtrennung derThe above comparative test results show that according to the aforementioned German interpretation only a completely unsatisfactory separation of the foreign oxidases, according to the process of the USA patents practically no separation at all

59%
6O°/o59%
6O ° / o

100
88100
88

8585

1,95
10,8
8,61.95
10.8
8.6

0,0500.050

0,00160.0016

0,00450.0045

Fremdoxydasen möglich ist Beim erfindungsgemäßen Verfahren hingegen wird in einem einzigen Arbeitsschritt eine Verringerung des Fremdoxydasegehaltes bis auf weniger als 5 °/o des Ausgangswertes bei gleichzeitig mehr als vierfacher Reinigung der GOD erzieltForeign oxidases is possible In the method according to the invention, on the other hand, a reduction in the foreign oxidase content is achieved in a single work step achieved to less than 5% of the initial value with more than fourfold cleaning of the GOD

209537A209537A

Claims

Patent claims:

1. Process for the production of glucose oxidase practically free of foreign oxidase from an in aqueous solution containing pre-purified glucose oxidase in a manner known per se, thereby characterized that the aqueous solution is at a pH of 6.5 to 7.5 while maintaining a temperature of 15 to 25 ° C, preferably 19 to 21 ° C, with methanol added to 58 to 62 percent by volume and the precipitate formed is separated off.

2. The method according to claim 1, characterized in that a pH of 7.0 is maintained will.