DE1568932B - Verfahren zur Herstellung von 1,4 An drostadien 3,17 dion und 4 Androsten 3,17 dion durch mikrobiologischen Abbau - Google Patents

Description

Zur Herstellung von Steroidhormonen werden natürlich vorkommende Steroide als Ausgangsmaterial verwendet. Es fehlte jedoch an einem Verfahren, Steroide, die in 17-Stellung eine aliphatische Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen enthalten, in einfacher Weise in 17-Ketosteroide umzuwandeln, die als Ausgangsverbindungen für die Herstellung von anderen Steroiden mit androgener, östrogener, anabolischer und konzeptionsverhindernder Wirkung dienen können.

Es war bekannt, daß Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium in der Lage sind, Steroide mit einer aliphatischen Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung, wie Cholesterin, vollständig abzubauen (vgl. Zentralblatt Bakteriologie, II, Abt. 37 [1913], S. 595).

Im Jahre 1942 widmete T a k dem gleichen Phänomen eine Forschungsarbeit, in deren Verlauf er ein Bacterium isolierte, das er Mycobacterium cholesterolicum nannte (vgl. Ant. van Leeuwenhoek, Bd. 8 [1942], S. 32). Danach erschien eine Reihe von anderen Veröffentlichungen über die Einwirkung von Mikroorganismen der Gattungen Proactinomyces, Azotobacter, Flavobacterium, Aerobacter, Pseudomonas, Nocardia und Streptomyces auf Cholesterin.

Bei diesen Verfahren wird Cholesterin vollständig zu Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht abgebaut, und es fallen keine nennenswerten Mengen von Verbindungen mit unversehrtem Steroidgerüst an. Bisweilen wurden 4-Cholesten und 7-Dehydrocholesterin in geringen Mengen gefunden. T a k fand bei seinen Untersuchungen geringe Mengen von 4-Cholesten-3,6-dion.

Beim Abbau von Cholesterin mit einer Nocardia-Art in Gegenwart von 8-Hydroxychinolin gelang es, 3-Keto-bisnor-4-cholensäure, 3-Ketonbisnor-l ,4-choladiensäure sowie geringe Mengen von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion nachzuweisen (vgl. Biochemical Journal, Bd. 90 [1964], S. 23P).

Die Einwirkung von Mikroorganismen der Gattungen Nocardia und Mycobacterium auf 1,3,5(10)-Cholestatrien bringt keinen Abbau (vgl. Abstracts of Papers of the 150th Meeting of the American Chemical Society [1965], 13Q). Andererseits wurden 19-Hydroxy-4-cholesten-3-on und 6,19-Oxido-4-cholesten-3-on durch diese Mikroorganismen leicht in Östron bzw. 6,19-Oxido-4-androsten-3,17-dion umgewandelt.

Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß man die Seitenkette in 17-Stellung von Steroiden unter Ausbildung einer 17-Ketogruppe und Erhaltung des Steroidgerüstes mit Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium abbauen kann, wenn man bestimmte Ausgangssteroide verwendet und die mikrobiologische Umwandlung in Gegenwart eines Inhibitors durchführt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von l,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion durch mikrobiologischen Abbau von Steroiden mit einer gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung und einer Sauerstoff-Funktion in 3-Stellung unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Mycobacterium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die mikrobiologische Umwandlung in Gegenwart von Nickel-, Kobalt-, Blei-, Cadmium- oder Selenitionen als Inhibitor durchführt.

Als Ausgangssteroide kommen z. B. Ester von Sterinen, insbesondere Cholesterylbetainchlorid, Cholesterylacetat, Cholesterylhemisuccinat, Sa-Chlorcholestanol, oder auch Sterine, in denen der Α-Ring einen oder mehrere zusätzliche Substituenten enthält, in Frage.

Die Menge des zuzusetzenden Inhibitors hängt von den Umständen ab. Wenn die Konzentration zu gering ist, werden die Steroide vollständig zu Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht abgebaut.

Ist die Konzentration zu hoch, so wird die Umwandlung des Steroids erheblich inhibiert und die Bakterien werden abgetötet. Bei Verwendung von NiSO₄ · 7 H₂O genügt im allgemeinen eine Konzentration von 10 bis 1000 mg pro Liter. Bei Verwendung von Kobaltchlorid, Bleiacetat, Cadmiumsulfat oder Natriumselenit liegt die Konzentration vorzugsweise ebenfalls im vorgenannten Bereich.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Mycobacterium phlei und Mycobacterium butyricum verwendet.

Das Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise folgendermaßen ausgeführt:

Der Mikroorganismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das anorganische oder organische Stickstoffquellen enthält, wie Aminosäuren, Ammoniumsalze, Alkalinitrate oder Erdalkalinitrate. Peptone, Maisquellwasser, Hefeextrakte, Baumwollsaatmehl, Sojabohnenmehl oder lösliche Rückstände der Alkoholherstellung können ebenso mit Vorteil verwendet werden. Die Nährmedien brauchen keine assimilierbare Kohlenstoffquelle wie Zucker, Stärke oder mehrwertige Alkohole enthalten, deren Anwesenheit im übrigen keine nachteilige Wirkung auf den Verlauf des Verfahrens ausübt.

Ein für das Verfahren der Erfindung geeignetes Nährmedium enthält vorzugsweise außerdem die üblichen Mengen von Salzen, wie Phosphate, Sulfate, Alkalichloride und Erdalkalichloride. Die erforderlichen Spurenelemente sind in hinreichenden Mengen dann vorhanden, wenn Leitungswasser verwendet wird.

Wenn als natürliche Stickstoffquelle ein kompliziertes Gemisch wie Maisquellwasser verwendet wird,

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so kann der Zusatz von Mineralsalzen meist unter- Die Kultur wird 48 Stunden bei 30⁰C auf einer

bleiben. Drehschüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von

Die Nährmedien werden in üblicher Weise sterili- 250 Umdrehungen pro Minute und einem Hub von siert und auf einen pH-Wert von 4,0 bis 8,5 ein- 2¹I₂ cm geschüttelt, wonach die Bakterien sich hingestellt. Ein pH-Wert von etwa 7 ist in den meisten 5 reichend vermehrt haben.

Fällen bevorzugt. Das Hauptfermentationsmedium wird durch VerWenn die Bakterien unter konstanter Belüftung in dünnen von 5 g Maisquellwasserfiüssigkeit (berechnet dem Nährmedium sich hinreichend vermehrt haben, als Trockensubstanz) mit Leitungswasser auf 11 und kann das Ausgangssteroid z. B. Cholesterin oder Einstellen der Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 7 /S-Sitosterin, zugegeben werden, entweder gelöst in io mit verdünnter Natronlauge hergestellt. Das Nähreinem geeigneten Lösungsmittel, wie Ν,Ν-Dimethyl- medium wird in drei Flaschen während 30 Minuten formamid, oder in Form einer feinen wäßrigen bei HO⁰C sterilisiert. Jede der drei 21 fassenden Suspension. Flaschen enthält 11 Nährmedium. Die Flaschen

Das Ausgangssteroid wird 0 bis 72 Stunden nach werden nun mit jeweils 50 ml der vorgenannten

der Beimpfung zugegeben; auch bei späterer Zugabe 15 Anzuchtkultur beimpft. Dann werden die Flaschen

werden recht gute Resultate erreicht. Die Zugabe 48 Stunden bei 30⁰C geschüttelt,

des Steroids wird vorzugsweise 24 bis 48 Stunden Hierauf werden in jede der Flaschen 1 g Chole-

nach der Beimpfung des Nährmediums vorgenom- sterin in Form einer wäßrigen Suspension gegeben,

men, wenn die Mikroorganismen sich hinreichend die durch Vermählen des Steroids unter Zugabe von

vermehrt haben. Eine sehr frühe Zugabe, z. B. unmit- 20 Wasser erhalten wurde, das 0,1 °/o eines nichtionischen

telbar nach der Beimpfung, ist ebenfalls möglich und Netzmittels enthielt. Ferner wurde jede Flasche mit

ergibt gute Resultate. einer sterilen wäßrigen Lösung von 750 mg NiSO₄ ■

Die Umwandlung des Steroids findet im allge- 7H₂O versetzt. Diese Menge entspricht 157 mg meinen bei konstanter Belüftung bei Temperaturen Nickelionen. Die Flaschen werden nun weiter gevon 20 bis 45°C statt; das Verfahren verläuft jedoch 25 schüttelt. Bereits 12 Stunden nach der Zugabe von auch bei höheren oder niedrigeren Temperaturen. Cholesterin kann l,4-Androstadien-3,17-dion durch Die Umwandlung läßt man vorzugsweise bei einer Dünnschichtchromatographie an Silikagel G nachTemperatur vor sich gehen, die die Optimaltem- gewiesen werden. Als Lösungsmittel wird ein Geperatur für den betreffenden Mikroorganismus ist. misch von Chloroform und Äthylacetat im Volumen-Diese Temperatur liegt im allgemeinen bei etwa 3° verhältnis 10:1 verwendet.

3O⁰C. Es ist nicht notwendig, daß Wachstum und Nach 3 Tagen Schütteln wird der Inhalt der drei

Umwandlung bei der gleichen Temperatur vor sich Flaschen vereinigt und das Gemisch dreimal mit

gehen. So kann z. B. der Mikroorganismus zuerst einem Fünftel seines Volumens Methylisobutylketon

während 24 Stunden bei 26° C gezüchtet werden, extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem

und nach Zugabe des Steroids und des Inhibitors 35 Druck zur Trockne eingedampft; der Rückstand

wird die Temperatur auf 30⁰C erhöht. wird mit 20 ml siedendem Methanol extrahiert. Aus

Die Umwandlung des Steroids nimmt 1 bis 7 Tage dem Rückstand können 1,6 g Cholesterin wieder-

in Anspruch; im allgemeinen nimmt die Menge des gewonnen werden. Der Methanolextrakt wird zur

Endproduktes nach drei Tagen nicht merklich zu. Trockne eingedampft und der Rückstand in 8 ml

Wenn als Ausgangssteroide Verbindungen ver- 4° Benzol aufgenommen. Die Benzollösung wird säulen-

wendet werden, die im Α-Ring keine weiteren Sub- chromatographisch an 30 g Aluminiumoxid (Al₂O₃

stituenten enthalten, entsteht als Hauptprodukt neutral, Aktivität III) gereinigt. Als Lösungsmittel

l,4-Androstadien-3,17-dion zusammen mit geringen wird ein Gemisch aus Benzol und Aceton (10:1)

Mengen 4-Androsten-3,17-dion. verwendet. Durch Dünnschichtchromatographie wird

Die gebildeten Produkte können aus der Kultur- 45 festgestellt, in welchen Fraktionen das 1,4-Androflüssigkeit gewonnen und nach üblichen Methoden stadien-3,17-dion zugegen ist. Diese Fraktionen werweiter gereinigt werden. Nach Vollendung der Fer- den aufgefangen und eingedampft. Der Rückstand mentierung können sie aus der Kulturflüssigkeit mit wird aus einem Gemisch von Aceton und Heptan einem organischen Lösungsmittel, wie Methyliso- (1: 3) umkristallisiert. Ausbeute 160 mg. Nach nochbutylketon, Äthylacetat, Methylenchlorid oder Chloro- 5° maliger Umkristallisation werden 138 mg reines Proform extrahiert werden. Diese Extrakte werden zur dukt vom F. 137,5 bis 139⁰C erhalten. Ausbeute Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus einem 13,4%, bezogen auf umgesetztes verbrauchtes Cholegeeigneten Lösungsmittel umkristallisiert oder wenn sterin.

nötig z. B. durch Chromatographie und nachfolgende B e i s d i e 1 2

Kristallisation in seine Komponenten getrennt. 55

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Gemäß Beispiel 1 wird eine Anzuchtkultur von

_, . . . „ Mycobacterium phlei, Stamm KNGSF 75-3/53 her-

^BeisP^ie11 gestellt.

Eine Anzuchtkultur von Mycobacterium phlei, Die Hauptfermentation wird in drei 500 ml fas-Stamm KNGSF 70 wird hergestellt durch Über- 60 senden Flaschen durchgeführt, von denen jede 100 ml impfen einer Kultur dieses Bakteriums auf Bouillon- des Nährmediums enthält. Auch hier wird die An-Agar und Inkubieren während drei Tagen bei 3O⁰C zuchtkultur in der gleichen Konzentration, d. h. von in ein Nährmedium, das aus einer Lösung von 10 g 5 % verwendet, bezogen auf das Volumen des Haupt-Hefeextrakt in 11 Leitungswasser vom pH-Wert 6,8 fermentationsmediums. Die Flaschen werden 48 Stunbesteht, das vorher während 30 Minuten bei HO⁰C 65 den geschüttelt. Danach wird jede Flasche mit 200 mg sterilisiert worden ist. Das Nährmedium befindet Cholesterin sowie 50 mg NiSO₄ · 7H₂O versetzt und sich in 2 1 fassenden Flaschen, und jede Flasche ent- weiter geschüttelt. Nach 3 Tagen enthalten die drei hält 500 ml Nährmedium. Flaschen zusammen l,4-Androstadien-3,17-dion in

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einer Menge von 188,9 bis 236 mg. Gewöhnlich sind 5 mg Cadmiumsulfat zu jeder der Flaschen gegeben,

noch geringe Mengen 4-Androsten-3,17-dion vor- Nach Itägigem Schütteln kann die Anwesenheit von

handen. ... """ l,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion

Die Ausbeute liegt zwischen 42,8 und 53,6%, durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen

bezogen auf eingesetztes Cholesterin. 5 werden. Ferner sind zwei andere unbekannte Flecken

sichtbar, die eine positive Zimmerman-Reaktion

Beispiel 3 zeigen.

Die Flaschen enthalten ein Gemisch von 1,4-Andro-

Gemäß Beispiel 2 wird eine Anzuchtkultur von stadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion in einer

Mycobacterium phlei, Stamm KNGSF 70 verwendet. io Menge von 29,4 mg. Ausbeute von 10 %> bezogen

Jede Flasche wird mit 400 mg Cholesterin versetzt. auf eingesetztes Cholesterin.
Nach 4 Tagen können 93 mg 1,4-Androstadien-

3,17-dion auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise Beispiel 9
isoliert werden. Die Menge des nicht umgewandelten

Cholesterins beträgt pro Flasche 230 mg. Es werden 15 Das Verfahren des Beispiels 7 wird wiederholt, also mindestens 170 mg Cholesterin in jeder Flasche jedoch werden an Stelle von Kobaltchlorid 50 mg umgewandelt. Die theoretische Ausbeute würde Bleiacetat zu jeder der Flaschen gegeben. Nach 124 mg l,4-Androstadien-3,17-dion betragen. Diese 2 Tagen kann schon eine Menge an 1,4-Androstadien-Zahlen zeigen, daß die Umwandlung in einer Aus- 3,17-dion durch Dünnschichtchromatographie nachbeute von 75 %> bezogen auf umgewandeltes Chole- 20 gewiesen werden,
sterin, und von 31,6%> bezogen auf eingesetztes Bei s Di el 10
Cholesterin, erfolgt.

_R . . . Das Verfahren des Beispiels 7 wird wiederholt,

Beispiel 4 jedoch werden an Stelle von Kobaltchlorid 50 mg Gemäß Beispiel 2 wird das Verfahren mit Myco- 25 Natriumselenit zu jeder der Flaschen gegeben. Durch bacteriumbutyricum ATCC 11 314 durchgeführt. Die Dünnschichtchromatographie kann die Anwesenheit Isolierung und Reinigung erfolgt gemäß Beispiel 1. von l,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-Es werden 30 mg l,4-Androstadien-3,17-dion in jeder 3,17-dion nachgewiesen werden.
Flasche nach 3tägigem Schütteln erhalten. Die Ausbeute beträgt 20,4 °/₀> bezogen auf eingesetztes Chole- 30 B e i s ρ i e 1 11
sterin. .

B e i s D i e 1 5 ^*^as Verfahren des Beispiels 3 wird wiederholt, an

Stelle von Cholesterin werden jedoch 200 mg 4-Chole-

Gemäß Beispiel 2 wird das Verfahren mit Myco- sten-3-on in jede Flasche gegeben. Nach dreitägigem

bacterium phlei, Stamm KNGSF 70 durchgeführt. 35 Schütteln kann an Hand des UV-Absorptionsspek-

An Stelle von Cholesterin werden jedoch 400 mg trums die Gegenwart von 25 bis 30 mg 1,4-Andro-

/S-Sitosterin in jede Flasche gegeben. Nach 4 Tagen stadien-3,17-dion festgestellt werden. Ausbeute 16,9

werden 37 mg l,4-Androstadien-3,17-dion aus jeder bis 20,2 %, bezogen auf eingesetztes 4-Cholesten-3-on. der Flaschen gemäß Beispiel 1 isoliert. Ausbeute

13,5 %> bezogen auf eingesetztes ^-Sitosterin. 4.0 B e i s ρ i e 1 12

B e i s ρ i e 1 6 _Das verfahren des Beispiels 3 wird wiederholt, an

Es wird nach dem Verfahren des Beispiels 3 gear- Stelle von Cholesterin werden jedoch 200 mg des

beitet, jedoch werden 400 mg Stigmasterin in jede wasserlöslichen Cholesterylbetainchlorids in jede der

der Flaschen. gegeben. Nach 3 Tagen kann durch 45 Flaschen gegeben. Nach 4tägigem Schütteln wird

Dünnschichtchromatographie, wie im Beispiel 1 be- das Produkt auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise

schrieben, l,4-Androstadien-3,17-dion nachgewiesen isoliert und gereinigt. Es werden 20 bis 25 mg 1,4-An-

werden. . drostadien-3,17-dion und kleine Mengen von 4-Andro-

B ei s pi el 7 sten-3,17-dion erhalten. Ausbeute 18,3 bis 22,9%„

50 bezogen auf eingesetztes Cholesterylbetainchlorid.
Gemäß Beispiel 3 wird eine Anzuchtkultur von

Mycobacterium phlei, Stamm KNGSF 70 hergestellt, Beispiel 13
wobei an Stelle von 50 mg Nickelsulfat eine gleiche

Menge Kobaltchlorid in jede der Flaschen gegeben Das Verfahren des Beispiels 4 wird wiederholt, an

wird. Nach 2tägigem Schütteln bei 30° C kann 55 Stelle von Cholesterin werden jedoch 200 mg 5«-Chlor-

durch Dünnschichtchromatographie 1,4-Androstadien- cholestanol in jede der Flaschen gegeben. Die Iso-

3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion nachgewiesen lierung und Reinigung erfolgt gemäß Beispiel 1. Es

werden. werden 16,7 mg l,4-Androstadien-3,17-dion und

Beispiel8 3,9 mg 4-Androsten-3,17-dion erhalten; die Gesamt-

60 ausbeute beträgt 15,3%. bezogen auf eingesetztes

Es wird nach dem Verfahren des Beispiels 7 gear- Sa-Chlorcholestanol. Die gebildeten Produkte ent-

beitet, jedoch werden an Stelle von Kobaltchlorid halten 18,9% 4-Androsten-3,17-dion.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion durch mikrobiologischen Abbau von Steroiden mit einer gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung und einer Sauerstoff-Funktion in der 3-Stellung unter Verwendung eines Mikroorganismum der Gattung Mycobacterium, dadurch gekennzeichnet, daß man die mikrobiologische Umwandlung in Gegenwart von Nickel-, Kobalt-, Blei-, Cadmium- oder Selenitionen als Inhibitor durchführt.