DE1238869B

DE1238869B - Process for the production of dried catalase

Info

Publication number: DE1238869B
Application number: DEA41353A
Authority: DE
Inventors: Edward George Samsa
Original assignee: Armour Pharmaceutical Co
Current assignee: Armour Pharmaceutical Co
Priority date: 1961-10-12
Filing date: 1962-10-10
Publication date: 1967-04-20

Description

Verfahren zur Herstellung von getrockneter Katalase Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von getrockneter Katalase durch Gefriertrocknung eines gereinigten wäßrigen Auszugs aus Leber.Process for the preparation of dried catalase The invention relates to a process for the production of dried catalase by freeze drying of a purified aqueous extract from liver.

Die Herstellung von Katalase im Gefriertrocknungsverfahren ist bekannt; sie hat jedoch den Nachteil, daß ein Teil der ursprünglichen Katalasenaktivität des Gefriertrocknungsverfahrens oder nach längerem Lagern von gefriergetrockneter Katalase verlorengeht.The production of catalase in the freeze-drying process is known; however, it has the disadvantage that part of the original catalase activity of the freeze-drying process or, after prolonged storage, of freeze-dried Catalase is lost.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu vermeiden und eine gefriergetrocknete Leberkatalase zu schaffen, die gegenüber den bisher erhältlichen Produkten einen höheren Grad an Katalasenaktivität aufweist und ihre Aktivität im gefriergetrockneten Zustand auch bei längerem Lagern beibehält.The invention is based on the object of avoiding these disadvantages and to create a freeze-dried liver catalase compared to the previous ones available products has a higher degree of catalase activity and their Retains activity in the freeze-dried state even after prolonged storage.

Diese Aufgabe wird gelöst mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von getrockneter Katalase durch Gefriertrocknung eines gereinigten wäßrigen Auszugs aus Leber, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man der Katalaselösung vor der Gefriertrocknung Glycin, Lactose, Natriumchlorid und/oder Natriumcitrat zusetzt.This object is achieved by means of the method according to the invention for the production of dried catalase by freeze-drying a purified one aqueous extract from liver, which is characterized in that the catalase solution glycine, lactose, sodium chloride and / or sodium citrate before freeze-drying clogs.

Es ist bereits bekannt, daß sich gewisse Substanzen als Schutzmittel gegen die beim Tiefgefrieren erfolgende Denaturierung einer frischen Lösung von frischer Katalase bestimmter Konzentrationen wirksam einsetzen läßt, um die Enzymlösungen gegen Inaktivierung beim Gefrieren und anschließenden Wiederauftauen zu schützen. Jedoch war es bisher nicht bekannt, daß sich die Aktivität von Katalase verbessern läßt, wenn man Schutzmittel auch beim Gefriertrocknen von Katalaselösungen zusetzt, und da die Kolloidsysteme, die einerseits beim Gefrieren und Wiederauftauen, andererseits beim Gefriertrocknen vorliegen, verschiedene sind, konnte der Fachmann eine solche, die Aktivität von gefriergetrockneter Katalase verbessernde Wirksamkeit, die beim erfindungsgemäßen Verfahren erreicht wird, nicht voraussehen.It is already known that certain substances act as protective agents against the denaturation of a fresh solution of fresh catalase of certain concentrations can be used effectively to the enzyme solutions to protect against inactivation during freezing and subsequent thawing. However, it has not heretofore been known that the activity of catalase improves if a protective agent is also added to the freeze-drying of catalase solutions, and there the colloid systems, on the one hand during freezing and thawing, on the other hand present in freeze-drying, are different, the skilled person was able to the activity of freeze-dried catalase-enhancing efficacy when Process according to the invention is achieved, do not foresee.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren wird Gewebe von Säugetierleber eingesetzt. Die Gewinnung der Katalase erfolgt in an sich bekannter Weise, wie z. B. in den USA.-Patentschriften 2 834 713 und 2 703 779 beschrieben. Dabei fällt ein gereinigter wäßriger Leberauszug an, der einen wesentlichen Anteil der im Ausgangsmaterial vorhandenen Katalasen enthält. Die in den so gewonnenen Katalaselösungen noch enthaltenen Verunreinigungen sind bei der weiteren erfindungsgemäßen Behandlung nicht störend. Bevor diese Katalaselösungen der ebenfalls an sich bekannten Gefriertrocknung unterzogen werden, die im wesentlichen darin besteht, daß die Katalaselösungen in einem Trockeneisbad tiefgefroren und anschließend in einem geeigneten Vakuumbehälter das darin enthaltene Wasser absublimiert wird, wobei der Behälter während der Sublimation und Evakuierung allmählich auf Zimmertemperatur erwärmt wird, setzt man erfindungsgemäß den Katalaselösungen Glycin, Lactose, Natriumchlorid und/oder Natriumcitrat zu. Es wurde gefunden, das durch Anwesenheit dieser Stoffe die Aktivität der im Gefriertrocknungsprozeß gewonnenen Katalasen erhöht wird, insbesondere bei Verwendung von Rinderleber. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren als trocknes Pulver anfallenden Katalasen sind im wesentlichen stabil und lyophil. Beispiel 1 Als Ausgangsprodukt wurde eine nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2834713 gewonnene Katalaselösung verwendet, die eine Katalaseaktivität von ungefähr 153 Keileinheiten je Milliliter aufwies.Tissue from mammalian liver is used as the starting material for the method according to the invention. The catalase is obtained in a manner known per se, such as, for. Described in U.S. Patents 2,834,713 and 2,703,779. A purified aqueous liver extract is obtained which contains a substantial proportion of the catalases present in the starting material. The impurities still contained in the catalase solutions obtained in this way do not interfere with the further treatment according to the invention. Before these catalase solutions are subjected to the freeze-drying, which is also known per se, which essentially consists in deep-freezing the catalase solutions in a dry ice bath and then sublimating the water contained therein in a suitable vacuum container, the container gradually warming to room temperature during the sublimation and evacuation is, according to the invention, glycine, lactose, sodium chloride and / or sodium citrate are added to the catalase solutions. It has been found that the presence of these substances increases the activity of the catalases obtained in the freeze-drying process, especially when using beef liver. The catalases obtained as a dry powder in the process according to the invention are essentially stable and lyophilic. Example 1 The starting product used was a catalase solution obtained by the process of US Pat. No. 2834713 , which had a catalase activity of approximately 153 wedge units per milliliter.

Zu 500 ml dieser Lösung wurden 20 g Glycin zugesetzt. Dann wurde der diese Lösung enthaltende Behälter in ein Trockeneisbad eingesetzt und die Lösung eingefroren. Danach wurde der Behälter an ein Sublimierrohr angeschlossen, das an seinem anderen Ende mit einem Kondensationsgefäß in Verbindung stand. Die Apparatur wurde anschließend evakuiert, und das in der eingefrorenen Lösung enthaltene Wasser wurde absublimiert und in dem Kondensationsbehälter aufgefangen. In dem Maße, wie das Wasser aus der eingefrorenen Lösung abgezogen wurde, ließ man die Temperatur des Kühlbades ansteigen, bis zum Schluß bei Zimmertemperatur die letzten Spuren an Wasser absublimierten. Das Vakuum wurde aufgehoben, und aus dem Behälter wurde das gefriergetrocknete Produkt als trockenes Pulver in einer Ausbeute von 40,7 g entnommen.20 g of glycine were added to 500 ml of this solution. Then the this solution containing container placed in a dry ice bath and the solution frozen. After that, the container was turned on a sublimation tube connected, which at its other end was connected to a condensation vessel. the Apparatus was then evacuated, and that contained in the frozen solution Water was sublimated and collected in the condensation tank. In this scale, as the water was withdrawn from the frozen solution, the temperature was left of the cooling bath, the last traces up to the end at room temperature sublimated in water. The vacuum was released and the container was turned off the freeze-dried product as a dry powder in a yield of 40.7 g taken.

Die Aktivität betrug 1525; die Erkaltung der Aktivität betrug 810/r,; das gewonnene Trockenpulver hatte in wäßriger Lösung einen pH-Wert von 7,3.The activity was 1525; the activity cooling was 810 / r; the dry powder obtained had a pH of 7.3 in aqueous solution.

Mit »Aktivität« ist die Aktivität der erhaltenen Katalase in Keileinheiten je Gramm Trockensubstanz bezeichnet; mit »Erhaltung der Aktivität« ist die Gesamtzahl der Keileinheiten in der Trockensubstanz multipliziert mit 100 und dividiert durch die Gesamtzahl der Keileinheiten in der Lösung ausgedrückt. Beispiel 2 Zu 500m1 der gleichen Ausgangslösung, wie sie im Beispiel l eingesetzt worden war, wurden 20g Lactose zugesetzt. Wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde diese Lösung gefriergetrocknet. Es wurden 40,0 g Trockenpulver erhalten, das eine Aktivität von 1670 hatte und dessen Erhaltung der Aktivität 871/o betrug. Der pH-Wert der wäßrigen Lösung dieses Trockenpulvers betrug 7,6. Beispiel 3 Zu 500 ml einer gleichen Ausgangslösung, wie sie im Beispiel 1 eingesetzt worden war, wurden 20 g Natriumchlorid zugegeben. Die Lösung wurde anschließend, wie im Beispiel 1 beschrieben, gefriergetrocknet. Es fielen 39,6 eines Trockenpulvers an, dessen Aktivität 1700 betrug und dessen Erhaltung der Aktivität 88 % war. Die wäßrige Lösung dieses Trockenpulvers hatte einen pH-Wert von 7,4."Activity" is the activity of the catalase obtained in wedge units per gram of dry matter; "Maintenance of Activity" is the total number of wedge units in the dry matter multiplied by 100 and divided by the total number of wedge units in the solution. Example 2 To 500m1 the same starting solution as was used in Example l, 20 g of lactose was added. As described in Example 1, this solution was freeze-dried. 40.0 g of dry powder were obtained which had an activity of 1670 and whose activity retention was 871 / o. The pH of the aqueous solution of this dry powder was 7.6. Example 3 20 g of sodium chloride were added to 500 ml of a starting solution identical to that used in Example 1. The solution was then, as described in Example 1, freeze-dried. 39.6 of a dry powder were obtained, the activity of which was 1700 and the retention of the activity was 88%. The aqueous solution of this dry powder had a pH of 7.4.

Beispiel 4 Zu 500 ml einer gleichen Ausgangslösung, wie sie im Beispiel 1 eingesetzt worden war, wurden 20 g Natriumcitrat zugesetzt. Anschließend wurde die Lösung, wie im Beispiel l beschrieben, gefriergetrocknet. Es wurden 39,8 g eines Trockenpulvers erhalten, das eine Aktivität von 1760 hatte und dessen Erhaltung der Aktivität bei 910/0 lag. Die wäßrige Lösung dieses Trockenpulvers wies einen pH-Wert von 7,6 auf. Vergleichsbeispiel 500 ml der gleichen Ausgangslösung, wie sie in den Beispielen 1 bis 4 eingesetzt worden war, wurden ohne Zusatz einer Fremdsubstanz in der gleichen Weise, wie im Beispiel l beschrieben, gefriergetrocknet. Es fielen 20,3 g eines Trockenpulvers an, das eine Aktivität von 2340 hatte und dessen Erhaltung der Aktivität 62 % betrug. Die wäßrige Lösung dieses Trockenpulvers hatte einen pH-Wert von 7,5.Example 4 To 500 ml of the same starting solution as in the example 1 had been used, 20 g of sodium citrate were added. Subsequently was the solution, as described in Example 1, freeze-dried. There was 39.8 g of one Obtained dry powder that had an activity from 1760 and its preservation the activity was 910/0. The aqueous solution of this dry powder had a pH of 7.6. Comparative example 500 ml of the same starting solution as they had been used in Examples 1 to 4 were without the addition of a foreign substance freeze-dried in the same way as described in Example 1. It fell 20.3 g of a dry powder that had an activity of 2340 and its preservation the activity was 62%. The aqueous solution of this dry powder had one pH 7.5.

Dieses Vergleichsbeispiel zeigt, daß der Aktivitätsverlust, der in den Beispielen 1 bis 4 zwischen 9 und 1.91/o lag, bei dem nach dem bekannten Gefriertrocknungsverfahren gewonnenen Vergleichsprodukt um mindestens 1001/o höher, bei 3804, liegt.This comparative example shows that the loss of activity, which in Examples 1 to 4 was between 9 and 1.91 / o, in the case of the comparative product obtained by the known freeze-drying process is at least 1001 / o higher, at 3804 .

Claims

Claim: Process for the production of dried catalase by freeze-drying a purified aqueous extract from liver, d a d u r c h g e -k e n n n n e i c h n e t that the catalase solution is prior to freeze-drying Glycine, lactose, sodium chloride and / or sodium citrate are added. Considered U.S. Patent Nos. 2,689,203; 2,703,779; "Nature" (London), 1961, Vol. 190, pp. 83 and 84; "Science", 1950, vol. 111., p. 655.