DE1212678B - Verfahren zur Gewinnung von Arzneipraeparaten - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

A61k

Deutsche KL: 30 h-2/04

Nummer: 1212 678

Aktenzeichen: C 20232IV a/30 h

Anmeldetag: 24. November 1959

Auslegetag: 17. März 1966

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Arzneipräparaten mit therapeutischer Aktivität aus tierischem Gewebe. Die in diesen Arzneipräparaten enthaltenen Wirkstoffe von proteolytischer Aktivität besitzen interessante therapeutische Eigenschaften, besonders eine starke Wirkung gegen Lepra und postpoliomyelitische Lähmungen.

Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung eines blutstillenden Mittels, bei dem durch lOständige Mazeration eines paranchymatischen Organs ein alkohollösliches Phosphatid mit blutstillenden Eigenschaften erhalten wird. Dieses Phosphatid besitzt keine enzymatische Aktivität, vergleichbar mit derjenigen der erfindungsgemäßen Wirkstoffe, und zeigt auch sonst ganz anderes Verhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man zerkleinertes tierisches Gewebe unter sterilen Bedingungen in physiologischer Salzlösung mindestens 2 Tage, jedoch so lange mazeriert, bis die Abderhaldensche Mikroreaktion auf organspezifische Fermente bei einer maximalen Anzahl verschiedener Organsubstrate positiv ist, dann entweder

a) die erhaltene Mazerationsflüssigkeit nach Filtration mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Aceton, fällt, den Niederschlag abtrennt und aus dem Niederschlag die Wirkstoffe mit physiologischer NaCl-Lösung eluiert oder

b) das Mazerat im Autoklav etwa 1 Stunde auf 120⁰C erhitzt und sodann filtriert,

worauf das unter a) gewonnene Eluat bzw. das nach b) gewonnene Filtrat schonend getrocknet wird.

Bei der Gewinnung der neuen, erfindungsgemäßen Präparate wurde festgestellt, daß ihre fermentative Aktivität wichtige Änderungen während der Mazeration erfährt. Es ist daher geboten, die Mazerationsflüssigkeit zu kontrollieren, um zu versuchen, die Augenblicke höchster Wirksamkeit zu bestimmen. Zu diesem Ziel führt man in regelmäßigen Zeitabschnitten die Abderhaldensche Mikroreaktion durch, wie sie z. B. beschrieben ist in »Ergebnisse der Enzymforschung«, 11. Band, Leipzig 1950, S. 20ff. Gemäß dieser Reaktion wird die fermenthaltige Flüssigkeit mit verschiedenen reinen Organsubstraten (Eiweiß) in Kontakt gebracht. Falls organspezifische Fermente vorhanden sind, tritt eine Verdauung des korrespondierenden Organsubstrats ein, die z. B. durch die Anwesenheit von Aminosäure nachweisbar ist. Die fermentative Aktivität wird durch die Zahl an Organen, welche die verdauende Wirkung dieser Fermente unter Beweis Verfahren zur Gewinnung von Arzneipräparaten

Anmelder:

Dr. Henri Joseph Marie Clement,
Ettelbrück (Luxemburg)

Vertreter:

Dr.-Ing. A. van der Werth, Patentanwalt,
ίο München 8, Lucile-Grahn-Str. 22

Als Erfinder benannt:

Dr. Henri Joseph Marie Clement, Ettelbrück
(Luxemburg)

Beanspruchte Priorität:

Luxemburg vom 26. November 1958 (36 616) - -

stellen, ausgedrückt. Unter diesen bestimmten, hierfür benutzten Organen sind Leber, Milz, Hypothalmus, Hypophyse, Nebennieren, Schilddrüse, Quadriceps, Eierstöcke, Hoden und Bindehautgewebe zu nennen. Diese Liste ist nicht beschränkend. Die verwendeten Organe können vom Menschen oder Tier stammen.

Es wurde gemäß der Erfindung festgestellt, daß die therapeutische Aktivität der Präparate proportional ihrer fermentativen Aktivität ist.

Die zur Erreichung einer optimalen Aktivität notwendige Mazerationsdauer hängt von den Arbeitsbedingungen und besonders von der Art des in Mazeration gebrachten Gewebes und der Temperatur ab. Die Dauer liegt im allgemeinen zwischen 2 und 30 Tagen. Diese Zahl wird mitunter überschritten, indessen bei den meisten Fällen stellt sich das Maximum zwischen dem 10. und dem 20. Tag ein. Man nimmt an, daß die beste oder nahezu beste Aktivität erreicht ist, wenn die im Mazerationswasser vorhandenen Fermente von zehn Organsubstraten mindestens sieben fermentativ spalten.

Das vom tierischen Ausgangsmaterial am 9. Tage abgetrennte Mazerationswasser ermöglicht beispielsweise, wenn es aus einem Ziegenquadriceps stammt, die Verdauung von drei oder vier Substraten. Diese Aktivität erreicht sieben Substrate bei Abtrennung am 8. Tag und wird nach 22 Tagen null.

Die neuen wasserlöslichen Wirkstoffe müssen zur Erhaltung ihrer fermentativen Aktivität aus der Mazerationslösung abgetrennt werden. Diese Abtrennung ist auf zweierlei Weise möglich.

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Bei der einen Möglichkeit der Abtrennung unter- Milieus ab, in dem sie sich befinden. Sie ist fast null

wirft man die Mazerationsflüssigkeit einer Erwärmung in einem ausgesprochenen sauren Milieu (pH 3,3),

in einem Autoklav auf 12O⁰C während einer Stunde. wird wesentlich bei einem pH von 6 und erreicht ihr

Durch diese Autoklavbehandlung wurde über- Maximum in neutralem Wasser (pH T), nimmt dann raschenderweise eine Zunahme der fermentativen und '5 rasch ab und ist nur noch sehr sehwach in leicht

der therapeutischen Aktivität der Wirkstoffe festge- alkalischen Lösungen (pH 8,5).

stellt, obwohl beim Kochen im offenen Gefäß ein Die Präparate der Erfindung dienen z. B. zur Be-

Aktivitätsverlust auftritt. Die so behandelte Mazera- handlung der Lepra. Zahlreiche klinische Ergebnisse

tionsflüssigkeit wird sodann steril filtriert. Das bei bestätigen ihre erstaunliche Wirksamkeit. Leprakranke

37° C getrocknete Filtrat gibt einen Rückstand, welcher io mit Geschwüren, Flecken und selbst Löchern wurden

in einer verschlossenen Flasche und unter Ausschluß von ihren Krankheiten nach einigen Injektionen ge-

von Licht aufbewahrt wird. Man hat festgestellt, daß heilt. Muskelkontrakturen infolge einer schon alten

das so erhaltene Pulver seine fermentative Aktivität Lepra verschwinden gleichfalls. Während mehrerer

während mehrerer Monate sogar bei Temperaturen Jahre nach der üblichen Art, d. h. mit Injektionen von

von etwa 30° C behält. Beim Auflösen diesen Pulvers 15 SuIfonen ohne irgendeine Besserung ihres Zustandes

in sterilem Wasser findet man die anfängliche enzyma- behandelte Patienten konnten mit den erfindungs-

tische Aktivität wieder. Diese bleibt während mehrerer gemäßen Mitteln schließlich geheilt werden. Die sich

Tage konstant und erleidet dann eine allmähliche, aus der Behandlung der Mazerationsflüssigkeiten mit

aber langsamere Verringerung als diejenige, welche einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel ergeben-

bei der Mazerationsflüssigkeit beobachtet wird. 20 den Stoffe (Niederschlag) besitzen eine stärkere

Die zweite Art der Gewinnung der Wirkstoffe be- therapeutische Wirkung gegen Paralysen, beispiels-

steht darin, daß man die vom tierischen Gewebe weise Muskelkontrakturen als diejenigen, welche aus

abgetrennte Mazerationsflüssigkeit mit einem wasser- im Autoklaven behandelten Flüssigkeiten erhalten

mischbaren, organischen Lösungsmittel, beispielsweise werden.

mit Aceton, Alkoholen oder deren Gemischen, 25 Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können ferner

behandelt. Es bildet sich ein Niederschlag, den man erfolgreich in der Behandlung poliomyelitischer

abtrennt und aus dem man die Wirkstoffe mit physio- Lähmungen angewandt werden,

logischer NaCl-Lösung eluiert, worauf diese Extrak- In den folgenden Beispielen wird die Gewinnung

tionslösung unter den gleichen Bedingungen wie die der aktiven Stoffe gemäß der Erfindung beschrieben,

im Autoklav behandelte Flüssigkeit eingedampft wird. 30 Ausgangsmaterial können dabei sein von der Ziege

Die erhaltenen Pulver lassen sich ebenfalls ohne ein Muskel, Lunge, Cubitalnerv, Niere, Gehirn,

Veränderung aufbewahren und sind leicht löslich in Rückenmark, Haut, Schilddrüse, Leber, Herz; vom

Wasser. Ziegenbock der Hoden; vom Ochsen ein Muskel,

Obwohl also die erfindungsgemäß hergestellten Nebennierendrüse, Leber, Herz; vom Schwein Neben-

Präparate in Pulverform gut haltbar sind, unterliegen 35 nierendrüse; vom Mensch eine Placenta. Das erfin-.

sie in Lösung einem allmählichen Aktivitätsverlust. dungsgemäße Verfahren ist aber keineswegs auf diese

Durch gewisse Zusätze oder gewisse Behandlung kann beispielsweise Liste von Geweben beschränkt, ebenso

diesem Aktivitätsverlust vorgebeugt werden. können die Gewebe anderer Tiere genommen werden.

Empfehlenswert ist die kurzzeitige Behandlung mit Die zur Untersuchung der Aktivitätsschwankungen

Röntgenstrahlen (Abstand 7 cm, 60 kV, 20 mA, 40 während der Mazeration verwendete Mikroreaktion

60 Sekunden) oder mit ultravioletten Strahlen (Ab- von Abderhalden könnte im Prinzip durch andere

stand 10 cm, 500 W, 90 Sekunden). Selbstverständlich Prüfungen auf Fermente ersetzt werden,
sind die vorhergehenden Zahlen nur Beispiele und

können geändert werden. Beispiell

Die in den erfmdungsgemäß gewonnenen Präparaten 45

vorliegenden neuen Wirkstoffe dürfen nicht mit den Unter sterilen Bedingungen wird ein Quadriceps biologischen Reizmitteln von Filatov gleichge- einer frisch geschlachteten Ziege entfernt. Der Muskel stellt werden, die offenbar keine Fermentaktivität wird in kleine Würfel geschnitten und in einen sterilen besitzen (Filatov, La Therapeutique tissulaire, Behälter gebracht. 400 ecm physiologische NaCl-Edit. franc. Moscou, 1955, S. 56). Die Abwehrfermente 50 Lösung und 50000 Kaliumpenicülineinheiten, in 1 ecm von Abderhalden andererseits, welche nur in Wasser gelöst, werden zugesetzt. Die Flasche wird einem lebenden, nicht kachektischen und nicht seiner verstopft, geschüttelt und an einen Platz mit einer Pankreasdrüse beraubten Organismus auftreten Temperatur von ungefähr 5°C gebracht.
(R. Abderhalden und R. W. Martin, Fer- Die für die Aktivitätsversuche notwendigen Mengen mentforschung, 16 [1940], 245), widerstehen nicht der 55 werden am 1., 4., 6., 9. und 12. Tag entnommen. Für Wärme (R. Ab der hai den und S. Buadze, die Adberhalden-Reaktion wählt man die zehn Fermentforschung, 11 [1931], S. 361). Diese Unter- folgenden Organe: Leber, Milz, Hypothalamus, schiede zeigen unbestreitbar, daß die neuen Wirkstoffe Hypophyse, Nebennierendrüse, Schilddrüse, Rinderder .Erfindung den Abwehrfermenten nicht gleichge- und Ziegenquadriceps, Eierstöcke, Hoden, Bindehautstellt werden können. 60 gewebe. Positive Reaktionen ergeben sich bei den

Schließlich besitzen die schon bekannten proteoly- entnommenen Proben jeweils mit zwei, acht, drei, vier

tischen Fermente wie Pepsin, Trypsin nicht die eigen- bzw. acht Organen. Nach dem letzten Ergebnis werden

artigen Eigenschaften der Produkte der Erfindung, 200 ecm Mazerationsflüssigkeit und etwa die Hälfte

nämlich die organspezifische Aktivität, Beständigkeit der Quadriceps-Stücke entnommen,

in der Wärme und das bei pH 7 liegende Aktivitäts- 65 Die Mazeration wird unter den gleichen Bedingun-

maximum. gen wie bisher fortgesetzt. Es werden Versuchsmuster

Die enzymatische Aktivität der neuen Präparate am 15., 18., 24., 31., 48. und 73. Tag entnommen. Die

gemäß der Erfindung hängt von der Azidität des Zahl der verdauten Organe gemäß der Mikroreaktion

von Abderhalden beträgt 5, 8, 0 (24. Tag), 2,5 und 0 (73. Tag). Diese Resultate zeigen deutlich die Aktivitätsschwankungen während der Mazeration.

Wenn man z. B. Leber nimmt, stellt man eine Null-Reaktion am 1., 9., 24., 31. und 73. Tag fest. Ein positives Ergebnis wird am 6. Tag, eine ziemlich starke Wirkung am 4. und 18. Tag und schließlich eine wesentliche Wirkung am 12. und 48. Tag erhalten.

Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Präparate nimmt man 100 ecm der am 12. Tag abgezogenen Flüssigkeit und setzt eine etwa entsprechende Menge an den entnommenen Quadricepsstücken hinzu, d. h. den vierten Teil der Ausgangsstücke. Man erwärmt in einem Autoklav bei 12O⁰C während einer Stunde. Dann läßt man bis auf etwa 50° C erkalten und filtriert bei dieser Temperatur steril. Das Filtrat wird in fünf Petrischalen verteilt, welche man in einen Ofen von etwa 37⁰C bringt. Nach völligem Eintrocknen nimmt man den Rückstand mit Hilfe steriler Instrumente auf und bringt ihn in eine gut verschlossene Flasche. Man bewahrt ihn unter Ausschluß von Licht und, wenn möglich, kühl auf. Diese letztere Bedingung ist nicht unbedingt notwendig.

Die anderen 100 ecm der am 12. Tag entfernten Flüssigkeit filtriert man über sterilem Papier und setzt 150 ecm einer Mischung aus gleichen Teilen Aceton und Äthanol hinzu. Dann läßt man den Niederschlag während 12 Stunden ruhen. Man trennt sorgfältig die überstehende Flüssigkeit ab und eluiert den Niederschlag mit 20 ecm steriler physiologischer NaCl-Lösung während 20 Stunden unter zeitweiligem Rühren mit Hilfe eines sterilen Glasstabes. Man filtriert über sterilem Papier. Das Filtrat wird in Petrischalen gegeben, und bei 37⁰C getrocknet. Die Aufbewahrung des erhaltenen Pulvers erfolgt wie oben beschrieben. Gleiche Ergebnisse erhält man, wenn man die Aceton-Äthanol-Mischung durch Aceton ersetzt.

Beispiel 2

Unter sterilen Bedingungen wird ein Muskel eines frisch geschlachteten Ochsen in kleine Würfel geschnitten und in einen sterilen Behälter gegeben. 400 ecm physiologische NaCl-Lösung und 50000 Einheiten von Kaliumpenicillin, in 1 ecm Wasser gelöst, werden zugegeben. Die Flasche wird verschlossen, geschüttelt und an einen Ort mit einer Temperatur von etwa 5⁰C gebracht. Die nötigen Mengen für die Aktivitätsversuche werden an den in der folgenden Tabelle angegebenen Tagen entnommen. Für die Reaktion nach Ab derhalden werden die im Beispiel 1 genannten Organe verwendet. Die positiven Reaktionen schwanken, wie in der Tabelle angegeben.

Mazerationstage	Zahl von Organen mit positiver Reaktion
1	2
4	8
6	3
9	4
12	8
15	5
18	5
24	0
29	1
47	5
73	0

Um die aktiven Stoffe zu gewinnen, muß die Mazeration am 12. Tage unterbrochen werden, wenn von zehn geprüften Substraten acht eine positive Reaktion ergeben.

Die aktiven Stoffe werden daher aus der Mazera tionsfiüssigkeit am 12. Tage gemäß einem der im Beispiel 1 angegebenen Verfahren extrahiert.

Beispiel 3

Unter sterilen Bedingungen wird ein Lungenlappen einer frisch geschlachteten Ziege in kleine Würfel geschnitten und in einen sterilen Behälter gebracht. Es werden 300 ecm physiologische NaCl-Lösung und 50000 Einheiten Kahumpenicillin, in l.ccm Wasser gelöst, zugegeben. Die Flasche wird verschlossen, geschüttelt und an einen Ort von etwa 5⁰C gebracht. Dann werden die notwendigen Mengen für die Aktivitätsversuche entnommen. Diese werden am 14., ao 15. und 16. Tag durchgeführt. Für die Reaktion nach Abderhalden werden folgende 10 Organe gewählt: Hypothalamus, Hypophyse, Schilddrüse, Leber, Milz, Nebennierendrüse, Hoden, Eierstöcke, Muskelbindegewebe und Muskel. Positive Reaktionen eras geben sich mit zwei, zwei bzw. sieben Organen. Bei diesem letzten Ergebnis wird die Mazeration unterbrochen. Die aktiven Stoffe werden aus der am 16. Tage entnommenen Mazerationsflüssigkeit gemäß einem der im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren extrahiert.

Beispiel 4

Nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren mazeriert man einen Cubitalnerv einer Ziege. Die Mazeration wird am 14. Tage unterbrochen. Für die Reaktion nach Abderhalden hat man die im Beispiel 5 angegebenen Organe genommen. Am 14. Tage ergeben sich positive Reaktionen mit acht Organen. Die aktiven Stoffe werden aus der am 14. Tage entnommenen Mazerationsflüssigkeit gemäß einem der im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren extrahiert.

Beispiel 5

Nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren wird eine Ziegenniere mazeriert. Die Mazeration wird am 16. Tage unterbrochen. Für die Reaktion nach Abderhalden werden die im Beispiel 3 aufgezählten Organe verwendet. Am 16. Tage ergeben sich positive Reaktionen mit sechs Organen. Die aktiven Stoffe werden aus der am 16. Tage entnommenen Mazerationsflüssigkeit nach einem der im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren extrahiert.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Arzneipräparaten mit therapeutischer Aktivität aus tierischem Gewebe, dadurchgekennzeichnet, daß man zerkleinertes tierisches Gewebe unter sterilen Bedingungen in physiologischer Salzlösung mindestens 2 Tage, jedoch so lange mazeriert, bis die Abderhaldensche Mikroreaktion auf organspezifische Fermente bei einer maximalen Anzahl verschiedener Organsubstrate positiv ist, dann entweder

a) die erhaltene Mazerationsilüssigkeit nach Filtration mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Aceton, fällt, den Niederschlag abtrennt und aus dem Niederschlag die Wirkstoffe mit physiologischer NaCl-Lösung eluiert oder

b) das Mazerat im Autoklav etwa 1 Stunde auf 120° C erhitzt und sodann filtriert,

worauf das nach a) gewonnene Eluat bzw. das nach b) gewonnene Filtrat schonend getrocknet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die durch Wiederauflösen des Pulvers hergestellte Lösung der kurzzeitigen Ein·» wirkung von Röntgen- oder ultravioletten Strahlen aussetzt.

IO In Betracht gezogene Druckschriften:

Deutsche Patentschrift Nr. 820 787;
schweizerische Patentschrift Nr. 276 050.

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