DE1211211B - Verfahren zur optischen Spaltung der Ammoniumsalze von N-Acyl-DL-tryptophanen - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

C07d

Deutsche Kl.: 12p-2

Nummer: 1211211

Aktenzeichen: A 38595IV d/12 ρ

Anmeldetag: 18. Oktober 1961

Auslegetag: 24. Februar 1966

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Spaltung der Ammoniumsalze von N-Acyl-DL-tryptophanen in optisch aktive Ammoniumsalze von N-Acyl-D-tryptophanen und N-Acyl-L-tryptophanen.

L-Tryptophan gehört zu den lebenswichtigen Aminosäuren, ist aber nicht durch Hydrolyse natürlicher Proteine herstellbar, weil die übliche Säurehydrolyse die Zersetzung dieser Aminosäure zur Folge hat. Auch die Durchführung der enzymatischen Hydrolyse ist mit ziemlichen Schwierigkeiten verbunden.

Es sind verschiedene synthetische Verfahren zur Herstellung von Tryptophan bekannt, bei denen aber das Tryptophan in seiner racemischen Form (DL-Form) anfällt, welche aus einem Gemisch gleicher Anteile des L- und des D-Isomeren besteht. Es sind auch Verfahren zur optischen Spaltung von racemischen Tryptophanen, insbesondere ausgehend von N-Acylderivaten, beschrieben.

Zur optischen Spaltung von DL-Tryptophanen werden chemische und enzymatische Methoden angewendet.

Das Prinzip der chemischen Methoden beruht auf der Herstellung von Diastereomeren aus der racemischen Verbindung, indem letztere mit einer optisch aktiven organischen Base umgesetzt wird, und der anschließenden Trennung der Diastereomeren durch Ausnutzung ihrer verschieden großen Löslichkeiten. Bei den beschriebenen Verfahren zur optischen Spaltung von DL-Tryptophanen werden beispielsweise Brucin, Chinin, d-Camphersulfonsäure, L-Lysin, (+)-«-Phenyläthylamin, l-(+)-threo-l-p-Methylthiophenyl-2-amino-propandiol-(l,3) oder L-(+)-threol-p-Nitrophenyl-2-amino-propandiol-(l,3) als optisch aktive organische Basen verwendet.

Enzymatische oder biochemische Methoden, die auf der spezifischen Hydrolyse eines der DL-Isomeren, z. B. des N-Acyl-L-tryptophans, durch Acylase und der anschließenden Abtrennung des gebildeten L-Tryptophans vom unverändert zurückbleibenden N-Acyl-D-tryptophan, beruhen, haben den Nachteil, daß die Enzyme nicht mehrmals verwendbar sind und daher immer wieder frisch bereitet werden müssen.

Es wurde nun ein einfaches Verfahren zur optischen Spaltung der Ammoniumsalze von N-Acyl-DL-tryptophanen gefunden, das optisch aktive organische Basen oder Enzyme nicht erfordert.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur optischen Spaltung der Ammoniumsalze von N-Acyl-DL-tryptophanen ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des Ammoniumsalzes eines N-Acyl-DL-tryptophans in Wasser, wäßrigem Methanol oder Äthanol durch Abkühlen in den Übersättigungszustand über-Verf ahren zur optischen Spaltung der
Ammoniumsalze von N-Acyl-DL-tryptophanen

Anmelder:

Ajinomoto Kabushiki Kaisha, Chuo-Ku, Tokio

Vertreter:

Dr. G. W. Lotterhos

und Dr.-Ing. H. W. Lotterhos, Patentanwälte,

Frankfurt/M., Annastr. 19

Als Erfinder benannt:

Ichiro Sasaji, Kowasaki-shi, Kanagawa-Ken;

Ko Ohno, Setagaya-Ku;

Jiro Kato, Ota-Ku, Tokio

führt und durch Beimpfen mit einer der beiden optisch aktiven Komponenten die selektive Kristallisation dieser Komponente auslöst.

Es ist bereits bekannt, L-Natriumammoniumtartrat durch Zugabe von Kristallen der L-Komponente als Impfsubstanz zu einer übersättigten Lösung von racemischen Natriumammoniumtartrat herzustellen. Es handelt sich jedoch bei dieser Methode nicht um eine allgemeine übliche Spaltungsmethode für racemische Gemische in ihre optisch aktiven Komponenten. So läßt sich beispielsweise das Ammonium- oder das Calciumsalz der DL-Pyroglutaminsäure nicht nach dieser Methode in die optisch aktiven Komponenten aufspalten. Es war somit nicht voraussehbar, daß sich die Ammoniumsalze der N-Acyl-DL-tryptophane auf diese einfache Weise in ihre optisch aktiven Komponenten spalten lassen würden.

Bei diesem Verfahren fällt aus der übersättigten Lösung die dem Impfstoff gleiche enantiomorphe Komponente selektiv aus, wogegen die andere enantiomorphe Komponente in der Lösung zurückbleibt.

Außerdem fällt beim Vorhandensein eines leichten Überschusses einer enantiomorphen Komponente im Verhältnis zur anderen enantiomorphen Komponente in der Lösung, die erstere aus der übersättigten Lösung spontan aus, ohne daß eine zusätzliche Zugabe an dieser Komponente nötig ist.

In den erfindungsgemäß zu verwendenden Ammoniumsalzen von N-Acyl-tryptophanen stellt der Acylrest einen niederen Alkanoylrest dar. Es wird

609 509/352

zweckmäßig das Ammoniumsalz des N-Acetyl-tryptophans verwendet, jedoch sind auch die Ammoniumsalze des N-Formyl- und N-Propionyl-tryptophans geeignet.

Das Verfahren gemäß der Erfindung beginnt mit der Bereitung einer warmen Lösung des Ammoniumsalzes eines N-Acyl-DL-tryptophans, gegebenenfalls mit einem Überschuß an einem der. enantiomorphen Salze. Dabei ist die Temperatur auf eine Höhe einzustellen, die zwischen . Zimmertemperatur und der Siedetemperatur der Lösung liegt. Zu dieser Lösung wird dann unter Kühlung eine geringe Menge, vorzugsweise mehr als 0,1 Gewichtsprozent dieser Lösung, an einer der enantiomorphen Komponenten hinzugegeben (Impfung), unter Hervorrufung der Kristallisation der enantiomorphen Komponente. Die ausgefällten Kristalle werden dann z. B-. durch Filtration oder Zentrifugieren von der Lösung abgetrennt.

Das Zuimpfen einer der enantiomorphen Komponenten zur Bewirkung der Ausfällung, welches dann nicht notwendig ist, wenn eine Komponente in der Lösung im Überschuß vorhanden ist, soll mit Vorteil in einem Temperaturbereich erfolgen, der sich von der Sättigungstemperatur bis 30° C darunter erstreckt.

Die Mutterlauge, die nach Abtrennung der kristallisierten enantiomorphen Komponente verbleibt, kann zur Isolierung des optischen Antipoden dienen. Zu diesem Zweck ist es nur erforderlich, die Mutterlauge wieder auf die entsprechende Temperatur zu erhitzen und racemisches Ammoniumsalz des N-Acyl-tryptophans hinzuzugegeben. Beim anschließenden Kühlen dieser ergänzten, gegebenenfalls beimpften Lösung fällt der optische Antipode der vorher ausgefällten enantiomorphen Komponente in kristalliner Form aus.

Nach der Abtrennung des ausgefällten optischen Antipoden, kann die warme Mutterlauge durch Erhitzen und Zugabe der entsprechenden Menge an racemischem Ammoniumsalz des N-Acyl-tryptophans ungefähr wieder auf die gleiche Zusammensetzung gebracht werden, die zu Beginn des Verfahrens bestand. Durch darauf wieder erfolgendes Abkühlen kann die zuerst ausgefällte optisch aktive Komponente ausgefällt werden. Durch Wiederholung dieser Verfahrensführung können schließlich alternativ die beiden optisch enantiomorphen Formen des Ammoniumsalzes des N-Acyl-tryptophans getrennt voneinander erhalten werden.

Die gemäß dem Verfahren der Erfindung gewonnenen Ammoniumsalze von N-Acyl-L-tryptophanen werden vorzugsweise zur Herstellung von L-Tryptophan unter Anwendung an sich bekannter Methoden verwendet. Nach einer Racemisierung nach an sich bekannten Verfahren werden die Ammoniumsalze der N-Acyl-D-tryptophane in ein folgendes Auftrennungsverfahren eingesetzt.

In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.

Beispiel 1

45,8 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-DL-tryptophans werden in 250 ml Wasser von 60° C aufgelöst. Die Lösung wird auf 48° C abgekühlt und ihr dann 1 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-L-tryptophans als Impfkristalle zugegeben. Unter Rühren wird die Lösungsmischung sodann innerhalb von 75 Minuten auf 20°C abgekühlt; das in kristalliner Form sich abscheidende Ammoniumsalz des N-Acetyl-L-tryptophans wird abfiltriert. Diese abfiltrierten Kristalle werden einmal mit 15 ml 95°f_oigem Äthanol gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 10,8 g [<x]f = +25,0° (c = 4, Wasser).

. Beispiel 2

Eine Lösung des Ammöniumsalzes des N-Acetyl-DL-tryptophäns, die durch Auflösen von 63,5 g N-Acetyl-DL-tryptophan in 250 ml Wasser unter Zusatz von 5 g Ammoniak bei einer Temperatur von über 75° C

ίο erhalten worden ist, wird auf 55° C abgekühlt; dann werden 0,5 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-D-tryptophans zu der Lösung gegeben. Unter Rühren wird die Lösung sodann innerhalb von 17 Minuten stufenweise auf 48° C abgekühlt, die ausgefallenen Kristalle des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-D-tryptophans werden abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 11,2 g [<x]f = -24,8° (c = 4, Wasser).

B ei sp i el 3

Ein Gemisch von 22,7 g des Ammöniumsalzes des N-Acetyl-DL-tryptophans, 2,7 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-D-tryptophans und 100 ml Wasser werden bis zur völligen Auflösung erhitzt. Die entstandene Lösung wird sodann auf 32° C unter Rühren abgekühlt unter gleichzeitigem Kratzen zum Zwecke der Induzierung der Kristallisation. Bei dieser Temperatur wird das Rühren fortgesetzt, und das ausgefallene Ammoniumsalz des N-Acetyl-D-tryptophans wird 3,5 Minuten nach Einleitung des Kristallisations-Vorgangs abfiltriert. Die Kristalle werden im Vakuum getrocknet und ergeben 5,35 g; [oi\f — —23,2° (c = 4, Wasser).

Beispiel 4

Eine Lösung von 135 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-DL-tryptophans in 587 ml Wasser von 80° C wird auf 55°C abgekühlt, und zu dieser Lösung werden 2 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-L-tryptophans als Impfkristalle gegeben. Die Lösungsmischung wird innerhalb von 40 Minuten auf 41,5° C abgekühlt und unter Rühren für weitere 10 Minuten auf diese Temperatur belassen. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit 30 ml 95%igem Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 21,7 g an dem Ammoniumsalz des N-Acetyl-L-tryptophans; [«]? = +25,5° (c = 4, Wasser).

Zur Mutterlauge werden 36 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-DL-tryptophans gegeben und diese bis zur Herstellung einer klaren Lösung erhitzt. Sodann wird die Lösung auf 64° C abgekühlt, und es werden 0,5 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-D-tryptophans als Impfkristalle zugegeben. Die Mischung wird innerhalb von 75 Minuten auf 41,5° C abgekühlt und unterRühren weitere 15 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit 30 ml 95%igem Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet unter Erzielung einer Ausbeute von 34 g an dem Ammoniumsalz des N-Acetyl-D-tryptophans; [a]f = -25,8° (c = 4, Wasser).

Die Wiederholung der Verfahrensweise unter Verwendung der Mutterlauge, 36 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-DL-tryptophans und 0,5 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-L-tryptophans ergibt eine Ausbeute von 32 g an letztgenannter Verbindung; [a]f = +25,3° (c = 4, Wasser).

18 g des Ammoniumsalzes des N-Acetyl-L-tryptophans aus der ersten Kristallisation werden aus 100 ml

Wasser umkristallisiert. Es fallen 10 g Kristalle an. Die Verbindung zeigt eine optische Drehung von [oc]f = +26,6° (c = 4, Wasser), die sich bei weiterer Umkristallisation nicht mehr ändert. Die Ammoniumsalze des N-Acetyl-L-tryptophans, N-Acetyl-D-tryptophans und N-Acetyl-DL-tryptophans kristallisieren in farblosen feinen Nadeln mit den Zersetzungspunkten: 199,2, 199,2 und 193,O⁰C.

Beispiel5

5,4 g des Ammoniumsalzes des N-Formyl-DL-tryptophans werden in 15 ml eines 82%igen Äthanols von 55° C aufgelöst. Zu der auf 30⁰C abgekühlten Lösung werden 0,1 g des Ammoniumsalzes des N-Formyl-L-tryptophans als Impfkristalle unter Rühren gegeben. 10 Minuten nach dieser Zugabe werden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert und mit einer geringen Menge von 95%igem kaltem Äthanol gewaschen. Die Kristalle werden im Vakuum getrocknet unter Erzielung einer Ausbeute von 0,85 g an dem Ammoniumsalz des N-Formyl-L-tryptophans, [_Ä]f = +36,9° (e = 1), Wasser).

Beispiel 6

8,3 g des Ammoniumsalzes des N-Propionyl-DL-tryptophans werden in 100 ml Wasser von 73⁰C aufgelöst. Die Lösung wird dann auf 54⁰C abgekühlt, und anschließend werden 0,5 g des Ammoniumsalzes des N-Propionyl-L-tryptophans als Impfkristalle unter Rühren zugegeben. Die Lösung wird innerhalb von Minuten auf 45 ⁰C abgekühlt, und die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert und mit 95%igeni Äthanol gewaschen. Die Kristalle werden im Vakuum getrocknet unter Erzielung einer Ausbeute von 1,5 g des Ammoniumsalzes des N-Propionyl-L-tryptophans; [*]¥ = +28,1° (c = 2, Wasser).

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur optischen Spaltung der Ammoniumsalze von N-Acyl-DL-tryptophanen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des Ammoniumsalzes eines N-Acyl-DL-tryptophans in Wasser, wäßrigem Methanol oder Äthanol durch Abkühlen in den Übersättigungszustand überführt und durch Beimpfen mit einer der beiden optisch aktiven Komponenten die selektive Kristallisation dieser Komponente auslöst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des Ammoniumsalzes eines N-Acyl-DL-tryptophans, die eine der beiden optisch aktiven Komponenten im Überschuß enthält, durch Abkühlung in den Übersättigungszustand überführt.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Auslegeschrift Nr. 1027 673;
USA.-Patentschrift Nr. 2 813 876;
Advances in Protein Chemistry, Bd. IX (1954), S. 129 bis 131.