DE1138184B

DE1138184B - Verfahren zur Gewinnung der anorganischen Knochensubstanz

Info

Publication number: DE1138184B
Application number: DEA31554A
Authority: DE
Inventors: Edward Rapkin
Original assignee: LAEAEKE FA Oy
Current assignee: LAEAEKE FA Oy
Priority date: 1957-12-09
Filing date: 1959-03-10
Publication date: 1962-10-18
Also published as: US2968593A

Description

Verfahren zur Gewinnung der anorganischen Knochensubstanz Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von anorganischer Knochensubstanz mit verbesserter Qualität und Reinheit.
Aus »Science«, Bd. 119, S. 771 (1954), ist es bekannt, die anorganische Knochensubstanz, d. h. das anorganische Grundgefüge von Knochen, zu isolieren, indem man das Ausgangsmaterial in einem Soxhletapparat durch Extraktion mit z. B. Äthylendiamin vom Knochengewebe befreit. Die anorganische Struktur des Knochens wird dabei nicht verändert.
Bekannt ist weiter die Extraktion von Knochen mit Äthylenglykol-Kaliumhydroxyd (vgl. J. Dent. Research, Bd. 14, S. 251 [1934]).
Dieses Verfahren ist jedoch weniger zweckmäßig als die Extraktion mit Äthylendiamin, wie Vergleichsstudien ergaben (vgl. NMRI Research Report 008 015. 12. 01).
Die organische Knochensubstanz besteht in der Hauptsache aus Proteinen, Polysacchariden und Fetten. Die Hauptmenge an Protein im Knochengewebe besteht dabei aus Collagen, das ungefähr 30 Gewichtsprozent des gesamten Knochens ausmacht. Die Verkittungsstoffe des Knochens dürften Mucopolysaccharide sein, die ungefähr 1,24 bis 0,4 Gewichtsprozent des Knochens ausmachen. Diese organischen Stoffe, hauptsächlich das Protein, führen jedoch, wenn man das Knochengewebe von einer Tierart auf eine andere überträgt, oft zu unerwünschten Reaktionen, während die anorganische Knochensubstanz ohne schädliche Auswirkungen von einer Tierart auf eine andere übertragen werden kann.
Die anorganische Knochensubstanz, wie sie mittels der heute gebräuchlichen Extraktionsverfahren mit Athylendiamin hergestellt wird, ist jedoch sehr spröde und besitzt wenig Festigkeit. Die Oberfläche der Knochenstücke verändert sich bei der Lagerung stark, so daß sie wie erodiert aussehen (Schorfbildung) und leicht abblättern, was oft bis zu 20 Gewichtsprozent des Produktes ausmachen kann. Das Abblättern des Knochenmaterials ist jedoch insofern unerwünscht, weil es die Transplantation kompliziert.
Es wurde weiter festgestellt, daß bei der Extraktion des Knochenmaterials mit Äthylendiamin sich dieses mit den Fetten des Knochens unter Bildung von Diamiden vom Typ des 1,2-bis-(Stearamido)-äthans umsetzt, die sowohl in wäßrigem Äthylendiamin als auch in Wasser unlöslich sind und von dem extrahierten Knochen stark absorbiert werden. Diese Diamide verfärben deshalb leicht das Produkt und werden durch die bisher bekannten Extraktionsverfahren nicht entfernt.
Es wurde nun gefunden, daß man diese Nachteile vermeiden kann, wenn man das Ausgangsmaterial vor der Extraktion mit Athylendiamin zunächst einer Vorbehandlung durch Erhitzen mit Wasser bei 80 bis 1000 C, vorzugsweise bei Siedetemperatur, unterzieht und anschließend trocknet. Bei Anwendung vonDruck können auch Temperaturen gewählt werden, die über dem Siedepunkt des Wassers bei Normaldruck liegen, jedoch den Knochen nicht schädigen. Die so gewonnene anorganische Knochensubstanz ist dann physikalisch fester, blättert nicht ab und enthält kein absorbiertes Diamid.
Die Farbe und Reinheit des Produktes kann man schließlich noch dadurch verbessern, wenn man vor der Äthylendiaminextraktion eine Fettextraktion einschaltet.
Das Knochenmaterial wird für diesen Fall, also nach dem Kochen mit Wasser zunächst getrocknet und dann mit einem üblichen Fettlösungsmittel, beispielsweise einem gradkettigen Kohlenwasserstoff, wie Erdölfraktionen oder Erdöldestillate mit geeigneten Siedebereichen, extrahiert. Auch Äthanol und ähnliche Alkohole können hierbei mit Erfolg verwendet werden. Halogenierte Fettlösungsmittel, wie Chloroform, Trichloräthylen und Dichloräthylen, sind zwar ebenfalls geeignet, aber weniger gern eingesetzt, weil sie mit dem Äthylendiamin unter Bildung von unerwünschten polymeren Substanzen reagieren; sie müssen daher vor der Extraktion des Knochens mit dem Äthylendiamin vollständig aus dem Knochen entfernt werden.
Das Trocknen nach dem Auskochen kann unterbleiben, wenn das verwendete Äthylendiamin konzentrierter als 80 ozon ist.
Eine eindeutige Erklärung dafür, warum das nach dem beanspruchten Verfahren erhaltene anorganische Knochenmaterial eine größere Festigkeit hat und nicht abblättert, ist nicht möglich.
Es kann allerdings sein, daß das anorganische Grundgerüst des Knochens4 das offenbar in Schichten angeordnet ist und mit organischem Material zwischen den Schichten verklebt ist, bei der üblichen Arbeitsweise durch Aufquellen organischen Materials zwischen den anorganischen Schichten gelockert wird, während beim Erhitzen des Knochens mit Wasser ein Teil des organischen Materials ohne Quellen entfernt wird, so daß später kein Abblättern auftritt.
Beispiel 1 Die Schäfte von Rinderoberschenkelknochen werden in Keile zersägt, 24 Stunden in zweimal gewechseltem Wasser gekocht und bei 1000 C getrocknet. Die ausgekochten Keile (3195 g getrocknetes Material) werden dann in einem Soxhletextraktor 24 Stunden mit einer n-Heptan-Fraktion vom Siedebereich etwa 88 bis 980 C entfettet. Die Siedegeschwindigkeit des Lösungsmittels wurde so bemessen, daß dieses in jeder Stunde zweimal vollständig ausgetauscht wurde.
Der Fettgehalt der entfetteten Knochen betrug weniger als 0,01 0/o.
Die organischen Stoffe des Knochens wurden dann mit wäßngem Athylendiamin entfernt und das restliche Äthylendiamin mit Wasser abgetrennt. Es wurde kein Abblättern und Absplittern beobachtet. Das anorganische Knochenmaterial wurde dann aus dem Extraktor genommen und getrocknet.
Die Ausbeute betrug 2363 g. Es gab keine meßbare Menge Splitter. Die Knochen waren farblos und waren frei von 1,2-bis-(Stearamido)-äthan. Der Stickstoffgehalt des Produktes war kleiner als 0,010/o.
Beispiel 2 Die Köpfe der oberen Vorderbeinknochen von Rindern wurden ausgekocht, getrocknet und zersägt.
2120 g solcher netzförmiger Knochen wurden in einen Soxhletextraktor eingebracht und mit einer n-Heptan-Fraktion entfettet und dann mit itthylendiamin extrahiert. Beim Austausch des Fettlösungsmittels durch das Äthylendiamin müssen alle Kohlenwasserstoffe entfernt werden, da - diese wegen ihres niedrigen Siedepunktes die Arbeitstemperatur begrenzen würden.
Nach der Beendigung der Extraktion mit Äthylendiamin wurde das restliche Athylendiamin durch dreitägige Extraktion mit Wasser entfernt. Das nasse anorganische Knochenmaterial wurde aus dem Extraktor herausgenommen und bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an getrocknetem Material betrug 1024 g bei einem Stickstoffgehalt von 0,009°/o. Es wurde kein Abblättern oder Absplittern und keine Bildung von 1,2-bis-(Stearamido)-äthan beobachtet.
Beispiel 3 Oberschenkelknochen von Schafen, deren einer Kopf entfernt war, wurden mehrere Wochen ohne Kühlung aufbewahrt, wobei sie stark verfaulten.
Diese Knochen wurden mit Wasser bedeckt und insgesamt 24 Stunden unter dreimaligem Wasserwechsel ausgekocht und dann getrocknet. Die verbliebenen Köpfe wurden nun abgesägt und verworfen. Die Oberschenkelschäfte wurden in Zylinder von ungefähr 1,25 cm Durchmesser und 2,5 cm Länge geschnitten.
Der Soxhletextraktor wurde mit 2457 g Zylinder aus Oberschenkelröhren von Schafen beschickt, und die Knochen durch eine 24stündige Extraktion mit einer n-Heptan-Fraktion mit einem Siedebereich von ungefähr 64 bis 690 C entfettet. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und die ausgekochten, getrockneten und entfettetenKnochen wurden 2 Tage mit wäßrigem Äthylendiamin extrahiert. Das Athylendiamin wurde dann durch die übliche, sich über vier Tage erstrekkende Extraktion mit Wasser entfernt. Die Knochenteile wurden herausgenommen und getrocknet. Die Ausbeute betrug 1784 g.
Auch bei diesen dünnen Röhrenknochen (ungefähr 0,159 bis 0,141 cm stark) trat während der Verarbeitung und beim Trocknen kein Absplittern oder Abblättern auf. Sie waren völlig wieß und hatten einen Stickstoffgehalt von 0,01 0/o N. Ein Reaktionsprodukt zwischen Athylendiamin und Fett konnte weder auf der Oberfläche noch im Innern des anorganischen Knochenmaterials festgestellt werden. Die Tatsache, daß die Knochen vor der Verarbeitung verfault waren, schien weder die nachfolgenden Arbeitsgänge noch die Qualität des Produktes zu beeinflussen.
Beispiel 4 Schweineoberschenkelknochen wurden durch Herausnehmen des Knochens aus geräucherten Schinken gewonnen. Die Oberschenkelköpfe wurden abgesägt und 24 Stunden unter zsveimaligem Wasserwechsel ausgekocht, getrocknet und in Stücke gesägt.
Der Soxhletextraktor wurde mit 2410 g dieser Stücke beschickt, die 24 Stunden mit Chloroform entfettet wurden. Da frühere Erfahrungen gezeigt hatten, daß restliches Chloroform wie auch andere chlorierte Lösungsmittel mit Äthylendiamin unter Bildung von dunklen, polymeren Substanzen, die das Endprodukt verfärbten, reagierte, war es nötig, die restlichen Mengen des unerwünschten Materials vollständig zu entfernen. Die Schweineknochen wurden deshalb aus dem Extraktor herausgenommen und das Chloroform im Vakuum entfernt. Die vom Lösungsmittel befreiten Schweineoberschenkelköpfe wurden wieder in den Soxhlet getan.
Durch eine 2 Tage dauernde Extraktion mit Äthylendiamin wurden organische Stoffe entfernt, und das Äthylendiamin wurde durch eine 3 Tage dauernde Extraktion mit Wasser entfernt. Die extrahierten Knochen wurden aus dem Soxhlet herausgenommen und getrocknet. Die Ausbeute betrug 877 g. Eine Analyse zeigte einen Stickstoffgehalt von weniger als 0,01 0,01e/o. Es wurde kein Beweis für Absplittern oder Abblättern noch für die Bildung von Reaktionsprodukten zwischen dem Äthylendiamin und Fett gefunden.

Claims

PATENTANSPROCHE 1. Verfahren zur Gewinnung der anorganischen Knochensubstanz, wobei die organischenBestandteile durch Extraktion entfernt werden, dadurch gekennzeichnet, daß man das Knochenmaterial zunächst mit Wasser auf etwa 80 bis 1000 C, vorzugsweise auf Siedetemperatur, erhitzt, trocknet, mit einem Fettlösungsmittel entfettet, dann das Knochengewebe durch Extraktion mit Athylendiamin entfernt, mit destilliertem Wasser wäscht und trocknet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit Wasser mit aufeinanderfolgendem Flüssigkeitswechsel ausgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Fettlösungsmittei Äthanol oder ein ähnlicher Alkohol oder ein halogenierter Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, Trichloräthylen oder Äthylendichlorid, verwendet wird.

In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Patentschrift Nr. 961 654; Chemisches Zentralblatt, 1937/II, S. 108 (UdSSR.-Patentschrift Nur.49051).