DE1130113B - Verfahren zur Abtrennung von therapeutisch verwendbaren, mindestens 80% ª†-Globulin enthaltenden Praeparaten von anderen Blutproteinen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Abtrennung von therapeutisch verwendbaren, mindestens 80% y-Globulin enthaltenden Präparaten von anderen Blutproteinen Die Globuline teilte man früher auf Grund ihres verschiedenen Verhaltens bei der Aussalzung in Euglobuline und Pseudoglobuline ein. Heute unterscheidet man sie nach ihrer verschiedenen elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit als a-, B-und y-Globuline, wobei y-Globuline als die am langsamsten wandernden Globuline charakterisiert sind. Für die präparative Herstellung der y-Globuline ist die von Cohn und Mitarbeiter ausgearbeitete Methode wichtig. Ihre Grundlage ist die Fraktionierung von Blutserum oder Plasma mit Alkohol bei bestimmtem pH und bestimmtem Salzgehalt und bei niedrigen Temperaturen. Das Verfahren ist aber umständlich und kostspielig und hat deshalb verschiedene Modifikationen notwendig werden lassen.
• Auch andere Herstellungsmethoden sind bekannt, z. B. die Ausfällung mit Metallsalzen oder Säuren, die Behandlung mit Adsorptionsmitteln und Ionenaustauschern.
• Die Vielzahl der bisher bekanntgewordenen Methoden ist schon ein Hinweis darauf, daß diese mit Mängeln behaftet sind und daß ein Bedarf nach einem einfachen und zuverlässigen Verfahren besteht.
• Es wurde nun gefunden, daß man mindestens 80% aus y-Globulin bestehende Präparate aus Blut oder aus Blut hergestelltem Plasma, Serum oder einzelnen Fraktionen derselben in einfacher Weise gewinnen kann, wenn man diese Ausgangsmaterialien mit quaternären Ammoniumverbindungen, die am Ammoniumstickstoffatom einen aliphatischen Rest von mindestens 8 Kohlenstoffatomen tragen und die zur Gruppe der kationaktiven Kolloidelektrolyte gehören, behandelt, den dabei entstehenden Niederschlag, der vorwiegend Albumin, a- und ß-Globuline enthält, entfernt und gegebenenfalls das in Lösung gebliebene Protein, das weitgehend einheitliches ,y-Globulin ist, nach an sich bekannten Methoden gewinnt.
• Dieses Ergebnis ist überraschend, weil das Verhalten von Proteinen und Mucopolysacchariden gegenüber quaternären Ammoniumverbindungen schon öfter untersucht wurde, wobei sich wegen der zunehmenden Verwendung der letzteren als Desinfektionsmittel am lebenden Organismus die Frage nach dem Wirkungsorganismus dieser Verbindungen und nach ihrem Verhalten gegenüber den Einzelbestandteilen des Organismus ergab. Man fand dabei eine fällende Wirkung dieser Desinfektionsmittel gegenüber Proteinen und Mucopolysacchariden, ohne aber die erfindungsgemäße selektive Fraktionierungswirkung zu finden. Kuhn und B i e 1 i g, Ber., 73, S. 1080 (1940), untersuchten das Verhalten von Invertseifen, wie die quaternären Ammoniumverbindungen auch genannt werden, gegenüber Symplexen und Proteinen und geben an, daß sie mit Lauryldimethylbenzylammoniumbromid und Pseudoglobulin in stark oder schwach saurer Lösung keine, in alkalischer Lösung dagegen eine vollständige Ausfällung erhielten. P o 1 o n o v s k i und Macheboeuf, Ann. Inst. Past., 74, S.203 (1948), haben das Fällungsverhalten von Serum, Albumin und -y-Globulin gegenüber Zephirol speziell hinsichtlich der erforderlichen Mengen- und pH-Verhältnisse untersucht. Bei keinem der Autoren findet sich ein Hinweis darauf, daß das Filtrat der jeweiligen Fällungslösung Globuline mit einem Gehalt von mindestens 800% y-Globulin enthält, daß damit eine Herstellungsmethode für das y-Globulin gegeben ist. Einige Autoren glaubten, daß alle Serumeiweißkörper durch die Behandlung mit Invertseifen denaturiert werden. Tatsächlich werden aber nur die durch die Invertseifen ausgefällten Serumeiweißkörper denaturiert. So berichtet Schmidt, Ztschr. physiol. Chem., 277, S.117 (1943), »daß durch Invertseifen gefälltes Eiweiß in höchstem Maße denaturiert und daher für viele anschließende Versuche wertlos sei«. Zu einem analogen Ergebnis kommen Jerchel und Scheurer, Ztschr. Naturf., 86, S. 541 (1953). Sie fanden auf Grund von Elektrophorese-Dialyse- und Löslichkeitsversuchen, »daß bei der Einwirkung von Invertseife auf Albumin tiefgreifende Veränderungen im Eiweißgefüge auftreten, welche nach Entfernung der Invertseife zu denaturiertem Albumin führen«. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß durch Zugabe der obengenannten quaternären Ammoniumverbindungen zum Serum nur die ausgefällten Eiweißkörper, nicht aber die in der Lösung verbleibenden Serumeiweißkörper denaturiert werden. Das in Lösung verbleibende Eiweiß verhält sich nach der Dialyse elektrophoretisch und in der Ultrazentrifuge wie natives -y-Globulin, Denaturierungserscheinungen sind nicht nachweisbar, so daß also im Gegensatz zu der Ansicht der erwähnten Autoren durchaus die Voraussetzungen für die Gewinnung intakter y-Globulinpräparate aus den Fällungsfiltraten gegeben sind.
• Aus Schmidt, »Fortschritte der Serologie«, 1955, S. 1029, ist zwar bereits ein Verfahren zur Gewinnung von y-Globulin bekannt, dieses Verfahren ist jedoch recht umständlich, wie aus folgendem hervorgeht: Zunächst werden mit Hilfe von Ammoniumsulfat a-, ß- und y-Globuline ausgefällt. Aus der Lösung der Globuline wird dann bei einer Ionenstärke von 0,07 und bei pH von 5,3 das ß-Globulin ausgefällt. Anschließend müssen bei einer geringen Ionenstärke und bei pH 5,0 die a-Globuline ausgefällt werden. Die dann verbleibende Lösung muß zur Entfernung restlicher a- und ß-Globuline anschließend mit Aluminiumhydroxyd behandelt werden, wobei man ein Filtrat erhält, in welchem die y-Globuline vorhanden sind. Gegenüber diesen umständlichen Manipulationen werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einem Arbeitsgang die unerwünschten Proteinen ausgefällt, und man erhält sofort ein Filtrat, welches lediglich -y-Globulin enthält.
• Die praktische Durchführung des Verfahrens erfolgt so, daß man das Ausgangsmaterial, z. B. frisches Rinderserum, bei Zimmertemperatur mit einer wäßrigen Lösung der Invertseife so lange versetzt, wie noch ein Niederschlag entsteht. Diesen entfernt man durch Filtration oder Zentrifugieren; das Filtrat enthält das y-Globulin in weitgehend einheitlicher Form. Man kann die erhaltene Lösung gegebenenfalls nach einer schonenden Eindampfung direkt verwenden, man kann sie aber auch durch Lyophilisierung oder Sprühtrocknung in ein Trockenpulver überführen. Das y-globulinhaltige Filtrat kann man nach den bei der Herstellung von Reinproteinen üblichen Methoden noch weiterfraktionieren, z. B. durch Behandlung mit Alkohol nach C o h n , durch Aussalzung, chromatographische Reinigung u. a. m.
• Als 7#-globulinhaltige Ausgangsmaterialien eignen sich Blut von Menschen und Tieren und alle daraus herstellbaren y-globulinhaltigen Zubereitungen, wie Serum, Plasma oder einzelne Fraktionen derselben.
• Als quaternäre Ammoniumverbindungen finden die zu der Gruppe der kationaktiven Kolloid-Elektrolyte oder Invertseifen gehörigen oberflächenaktiven Präparate, die am Ammoniumstickstoffatom einen aliphatischen Rest von mindestens 8 Kohlenstoffatomen tragen, Verwendung, z. B. das am Anmeldetag unter dem geschützten Namen »Zephirol« oder »Riseptin®« bekannte Präparat. Vorzugsweise werden 1%ige wäßrige Lösungen verwendet, jedoch sind auch andere Konzentrationen oder Lösungsformen brauchbar. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen y-Globuline sollen therapeutische Verwendung finden, vor allem in der Veterinärmedizin. Sie eignen sich zur Unterstützung der Therapie mit Antibiotiea.
• Für die therapeutische Anwendung ist es erforderlich, daß die nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten Zubereitungen des y-Globulins keine Beimengungen von Invertseife enthalten. Dies ist im allgemeinen auch nicht der Fall, da man nicht mehr Invertseife zugibt, als zur Ausfällung der Begleitproteine erforderlich ist, und da das Fällungsmittel an den Eiweißniederschlag gebunden wird. Gegebenenfalls kann man aber überschüssige Invertseife durch Dialyse entfernen, wobei die erstere in die Außenflüssigkeit abwandert, oder durch Aussahen oder Ausfällung mit Alkohol, wobei sich die Invertseife im Filtrat befindet, oder mit Ionenaustauschern. Beispiel 1 Zu 150 ccm Rinderserum gibt man insgesamt 540 ccm wäßrige 0,4%ige Cetylpyridiniumchloridlösung und zentrifugiert nach 2stündigem Rühren bei Zimmertemperatur vom entstandenen Niederschlag ab. Die klare überstehende Lösung wird gefriergetrocknet. Man erhält 9,8 g Trockenprodukt, die in 500 ccm dest. Wasser aufgenommen und 44 Stunden bei Zimmertemperatur gegen öfter erneuertes dest. Wasser im Cellophanschlauch dialysiert werden. Durch Gefriertrocknung der Innenflüssigkeit erhält man ein Trockenpulver, dessen Eiweißgehalt 59,7% beträgt. Es ist frei von Albumin und a-Globulin und enthält 17,6% ß-Globulin und 82,4% y-Globulin. Beispiel 2 Das durch Ausfällen von 100 ccm Rinderserum mit 300 ccm einer l%igen wäßrigen »Riseptin@«-Lösung erhaltene Filtrat wird 24 Stunden gegen fließendes und 24 Stunden gegen stehendes dest. Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Das erhaltene Endprodukt enthält 920% Eiweiß, 2% davon sind ß-Globulin, 98% y-Globulin.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Abtrennung von therapeutisch verwertbaren, mindestens 80% y-Globulin enthaltenden Präparaten von anderen Blutproteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man Blut oder aus Blut gewonnenes Plasma, Serum oder einzelne Fraktionen derselben mit quaternären Ammoniumverbindungen, die am Ammoniumstickstoffatom einen aliphatischen Rest von mindestens 8 Kohlenstoffatomen tragen und die zur Gruppe der kationaktiven Kolloidelektrolyte gehören, behandelt, den dabei entstehenden Niederschlag entfernt und gegebenenfalls das in Lösung gebliebene Protein nach an sich bekannten Methoden gewinnt. In Betracht gezogene Druckschriften H. Schmidt, »Fortschritte der Serologie«, 1955, S. l029.