DE1126397B - Verfahren zur Herstellung neuer MSH-aktiver Oktadekapeptide - Google Patents
Verfahren zur Herstellung neuer MSH-aktiver OktadekapeptideInfo
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Classifications
-
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Description
DEUTSCHES
PATENTAMT
C 21514 IVb/12q
BEKANNTMACHUNG
DER ANMELDUNG
UND AUSGABE DER
AUSLEGESCHRIFT: 29. M Ä R Z 1962
Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung eines neuen Oktadekapeptids der Formel L-Asparaginyl-L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl-L-lysyl-L-methionyl-L-glutaminyl
-L- histidyl - L- phenylalanyl - L - arginyl - L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-L-lysyl-
L-asparaginsäure sowie der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutaminylrestes den Rest der
Glutaminsäure aufweist, und ihrer Derivate und Säureadditionssalze. Die neuen Verbindungen haben
die Wirkung des natürlichen melanocyten-stimulierenden Hypophysenhormons /?-MSH, weisen aber
diesem gegenüber den Vorteil auf, daß sie leichter synthetisiert werden können. Die neuen Oktadekapeptide
können an Stelle der natürlichen MSH als Heilmittel oder als Zwischenprodukte zur Herstellung von
/?-MSH verwendet werden.
Es bestehen verschiedene Möglichkeiten bezüglich des Aufbaues der Oktadekapeptide aus den einzelnen
Aminosäuren oder kleineren Peptideinheiten.
So kann man beispielsweise (s. Fig. 1) das Hep tapeptid H-Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-Lys-Met-O H mit geschützten
Aminogruppen oder dessen reaktionsfähige % Derivate mit dem Undekapeptid H-GIu(N H2)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Ser-Pro-Pro-Lys-AspO
H, dessen Carboxylgruppen funktionell abgewandelt und dessen e-Aminogruppe des Lysylrestes geschützt ist, bzw. der
entsprechenden Verbindung, die statt des Glutaminylrestes den Rest der Glutaminsäure enthält, oder deren
reaktionsfähigen Derivaten unter Bildung einer Peptidbindung zwischen dem L-Methionyl- und dem L-Glutaminyl-
bzw. Glutamylrest verknüpfen. Die Abkürzungen Asp, Ser, Pro, Tyr usw. bezeichnen die
Aminosäurereste der Asparaginsäure, des Serins, Prolins, Tyrosins usw. in der L-Form.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Heptapeptid wird, wie in Fig. 1 gezeigt, durch Kondensation des
Tripeptids H-Asp-Ser-Gly-0 H, dessen sc-Aminogruppe
geschützt ist, mit einem Ester des Tetrapeptids H-Pro-Tyr-Lys-Met-OH, dessen ε-Aminogruppe geschützt
ist, hergestellt. Es wird ferner erhalten, wenn man das Hexapeptid H-Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-Lys-OH,
dessen \- und ε-Aminogruppe geschützt sind, mit einem Methioninester kondensiert.
Das Undekapeptid kann durch Kondensation des in der deutschen Patentschrift 1 108 232 beschriebenen
Hexapeptids H-GIu-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH mit
einem Diester des Pentapeptids H-Ser-Pro-Pro-Lys-Asp-OH,
dessen e-Aminogruppe geschützt ist, hergestellt werden. Fig. 1 veranschaulicht die Synthese.
Z bedeutet die Carbobenzoxygruppe, Tos die Tosylgruppe,
BOC die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und
PNBz den para-Nitrobenzylrest.
Verfahren zur Herstellung neuer MSH-aktiver Oktadekapeptide
Anmelder: CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)
Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt,
Hamburg 36, Neuer Wall 10
Beanspruchte Priorität: Schweiz vom 28. Mai 1959 (Nr. 73 685)
Dr. Robert Schwyzer, Dr. Beat Iselin, Riehen, Dr. Heini Kappeier, Birsfelden,
Dr. Werner Rittel, Basel,
und Dr. Herbert Zuber, Riehen (Schweiz),
sind als Erfinder genannt worden
Die Herstellung der Peptidbindung erfolgt vorzugsweise in Gegenwart eines Carbodiimids als Kondensationsmittel.
In den Ausgangsmaterialien vorhandene, an der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionell Gruppen
werden zweckmäßigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbare
Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, Benzylalkohol,
p-Nitrobenzylalkohol, oder "durch Amidierung, die
Aminogruppen beispielsweise durch Einführung des Tosyl- oder Tritylrestes oder insbesondere der Carbobenzoxygruppe
oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe. Zum Schutz
der ε-Aminogruppe der Lysylreste verwendet man vorzugsweise den Tosylrest.
209 557-424
| -OH Z- | Ser | z- | Ser | H- | Ser | GIy | H- | GIy | 1 126 397 | Tos | -OCH3H- | Tos I |
-OCH3 | Tos | -OH | Tos | Met | -OCH3 Z | |
| - Asp | -OPNBz H- | Pro Tyr Lys | Pro Tyr Lys | Pro Tyr Lys | Pro Tyr Lys | ||||||||||||||
| Ser | GIy | Tos | |||||||||||||||||
| -OPNBz BOC- | Pro Tyr Lys | ||||||||||||||||||
| Ser | GIy | Tos | |||||||||||||||||
| -OPNBz BOC- | Pro Tyr Lys | ||||||||||||||||||
| Ser | GIy | Tos | Met | -OCH3 | |||||||||||||||
| -OPNBz BOC- | Pro Tyr Lys | ||||||||||||||||||
| GIy | Met | -OH | |||||||||||||||||
| Asp | -OPNBz BOC- | ||||||||||||||||||
| GIy | Met | -OH | |||||||||||||||||
| Asp | -OH H- | ||||||||||||||||||
| Met | -OH | ||||||||||||||||||
| Asp | |||||||||||||||||||
| Asp | 1 | Asp | Ser | GIy | Tos I |
Met | NH2 I |
|
| Z- | 1 Pro Tyr Lys |
I GIu |
||||||
| Ser | GIy | Met | NHS | |||||
| Pro Tyr Lys | CL | |||||||
Phe Arg Try GIy
OH Z-
OH Z
Pro
OHZ-
Pro
H-
Pro
Pro
Pro
Pro
OHZ-
Tos
I
OCHS
Lys
OH H
Tos
Lys
Pro
Pro
Pro
Pro
Tos
_J
Lys
Tos
Tos
I
ι Lys
Tos
Lys
Tos
Lys
Tos
Lys
Tos
Asp
OCH3
OCH3
Asp
OCH3
OCH3
Asp
OCH,
OCH,
| Pro | I | I | |
| Z- | I Lys |
Asp | |
| Pro | Tos I |
OCH i |
|
| H- | I Lys |
Asp | |
OCH3
OCH3
OCH3
Asp
OCH3
OCH3
Asp
OCH3
OCH3
Asp
-OCH3
OCH3
Asp
- OCH3
OCH3
Phe Arg Try GIy
Pro
Pro
Lys
Asp
OCH.
Tos
OCH3
Phe Arg Try GIy
Pro
Pro
Lys
Asp
OCH3
Tos
OCH8
J
Phe Arg Try GIy
Pro
Pro
Lys
Asp
OCH3
OH
OH
Phe Arg Try GIy
Pro
Pro
Lys
Asp
Die Umwandlung einer geschützten NH2-Gruppe
in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine
freie Carboxylgruppe erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden
bzw. reduzierenden Mitteln.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen.
Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise
Zur Überführung in den freien Ester werden 58 g
(0,2 Mol) des Hydrobromids in 100 ml Wasser gelöst, mit 300 ml Essigester überschichtet und bei 0° unter
Umschütteln mit 50 ml kalter, gesättigter Kalium-5 carbonatlösung versetzt. Die Essigesterphase wird
abgetrennt und die wäßrige Lösung nach Absättigen mit festem Kaliumcarbonat noch zweimal mit Essigester
extrahiert. Die vereinigten Essigesterphasen werden getrocknet und ergeben nach vorsichtigem
die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum io Eindampfen im Vakuum bei Zimmertemperatur 36,4 g
lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur (87%) H-GIy-OPNBz als kristallinen Rückstand
Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geiegnet vom F. 50 bis 52°, der direkt weiterverarbeitet werden
sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorga- kann. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus viel
nischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B. Äther ist der Schmelzpunkt des analysenreinen
Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, 15 Materials unverändert.
Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder 1 ν q π πηκτή
Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder 1 ν q π πηκτή
mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, '· Z-Ser-Gly-OPNBz
Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxal- 12 g (0,05 Mol) Z-Ser-OH und 10,5 g (0,05 Mol)
säure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fu- H-GIy-OPNBz werden in 120 ml Methylenchlorid
marsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, 20 gelöst und auf 0° gekühlt, wobei sich rasch ein salz-Zimtsäure,
Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy- artiger Komplex der beiden Reaktionspartner ausscheidet
(diese Reaktion tritt in verstärktem Maße bei Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel auf,
etwas langsamer in Dimethylformamid). Das Gemisch 25 wird mit einer Lösung von 11,3 g (0,055 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid
in 20 ml Methylenchlorid versetzt und über Nacht bei 0° geschüttelt; dabei geht das
Salz allmählich in Lösung, und gleichzeitig scheidet sich ein Gemisch des Reaktionsproduktes und Dicyclo-Verbindung,
die statt des Glutaminylrestes den Rest 30 hexylharnstoff aus, das nach Zugabe von 0,5 ml Eisder
Glutaminsäure enthält, können auf Grund ihrer essig (zur Zerstörung von überschüssigem Carbodi-MSH-Aktivität
in Form von pharmazeutischen imid) abfiltriert und mit Methylenchlorid gewaschen
Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die wird. Zur Abtrennung von Dicyclohexylharnstoff
Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder wird das Material mit 150 ml Tetrahydrofuran verparenterale
Applikation geeigneten pharmazeutischen 35 rührt, der ungelöste Harnstoff abfiltriert und das
benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder
Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäuren, Sulfanilsäure.
Die verfahrensgemäß erhaltenen Oktadekapeptide sowie auch das als Zwischenprodukt hergestellte
Undekapeptid H-GIu(N H2)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Ser-Pro-Pro-Lys-Asp-O
H bzw. die entsprechende
organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden
angegeben.
Filtrat im Vakuum eingedampft. Beim Versetzen des Rückstandes mit Essigester kristallisiert das Reaktionsprodukt und wird nach Stehen über Nacht bei 0°
abfiltriert. Nach Umkristallisieren aus Äthanol werden 15,0 g (70%) reines Material vom F. 121 bis 123°
erhalten, [«]s 0° = —8,5° (c = 2,01 in Eisessig); die
Mutterlauge ergibt nur amorphes, teilweise racemisiertes Produkt.
Wird die Reaktion in Dimethylformamid ausgeführt, (0,6 Mol) p-Nitrobenzylchlorid und 85 ml (0,6 Mol) 45 so entsteht als Nebenprodukt etwa 15% Carbobenz-Triäthylamin
in 1000 ml Essigester wird während oxy-i--seryl-N, N'-dicyclohexylharnstoff vom F. 170 bis
15 Stunden unter Rückfluß erhitzt, darauf gekühlt 171° (aus Methanol), der sich nur schwer vom Haupt-
und von ausgeschiedenem Triäthylamin-hydrochlorid produkt abtrennen läßt.
abfiltriert. Das Filtrat wird unter Eiskühlung mit Zur Prüfung der optischen Rinheit wird eine Probee
2 n-Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen, 50 des Z-Ser-Gly-Q P N Bz in Gegenwart von Palladium-
Beispiel
Z-GIy-OPNBz
Z-GIy-OPNBz
Eine Lösung von 105 g (0,5 MoI) Z-GIy-OH, 103 g
getrocknet und im Vakuum auf etwa 300 ml eingeengt, wobei sich das Reaktionsprodukt in kristalliner Form
abscheidet; eine zweite Fraktion wird durch weiteres Einengen der Mutterlauge und Zusatz von Äther
gewonnen, total 146 g. Nach Umkristallisieren aus Alkohol: 139 g (81%), F. 108 bis 110°.
kohle hydriert. Das nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff (5 Äquivalente) erhaltene H-Ser-GIy-OH
zeigt [*]jf = +31,3° (c = 3,17 in 1 n-Salzsäure).
4. H-Ser-Gly-OPNBz
2. H-GIy-OPNBz
103 g (0,3 Mol) Z-GIy-OPNBz werden in 600 ml
warmem Eisessig gelöst und bei 10 bis 15° mit 215 ml
4,2 n-Bromwasserstoff in Eisessig (0,9 Mol) versetzt. Beim Stehen bei Raumtemperatur scheidet sich das
kristalline Hydrobromid des H-GIy-OPNBz aus;
nach 2 Stunden wird abfiltriert und das Kristallisat' mit Eisessig und Alkohol gewaschen; Ausbeute 80,5 g
(92 %), F. 197 bis 200°. Das Produkt wird aus Methanol umkristallisiert: F. 202 bis 205°.
Eine Lösung von 43,1 g (0,1 Mol) Z-Ser-Gly-OPNBz
in 100 ml Essigester wird mit 200ml einer frisch bei 0° hergestellten 2 η-Lösung von Bromwasserstoff
in Essigester versetzt. Nach etwa 10 Minuten beginnt die Abscheidung von Kristallen, nach
2 Stunden wird das Lösungsmittel abdekantiert, das kristalline Material mit Essigester gewaschen, filtriert
und im Vakuum getrocknet. Das rohe Hydrobromid, 30,0 g (79%), schmilzt bei etwa 140° und ist für die
nachfolgende Überführung in den freien Dipeptidester
genügend rein.
Durch Umkristallisieren aus Alkohol wird analysenreines Material vom F. 148 bis 150° erhalten;
[<x]% = +12° (c = 2,02 in Wasser).
Die Reaktion läßt sich auch mit Bromwasserstoff in Dioxan durchführen, doch kristallisiert dabei das
Hydrobromid nicht aus der Reaktionslösung und ist dementsprechend schwieriger isolierbar; mit Bromwasserstoff
in Eisessig oder Nitromethan entsteht nur öliges Material.
Zur Überführung in den freien Ester werden 29,0 g
(0,077 Mol) des Hydrobromids in 450 ml trockenem Chloroform suspendiert und bei 0° mit 40 ml einer
2,5 η-Lösung von Ammoniak in Methanol (etwa 1,3 Äquivalent) versetzt. Beim Rühren des Gemisches
bei 0° geht das Ausgangsmaterial rasch in Lösung unter gleichzeitiger Ausscheidung von Ammoniumbromid.
Nach 15 Minuten wird filtriert, das Lösungsmittel im Vakuum bei Raumtemperatur abdestilliert
und der kristalline Rückstand mit kaltem Essigester und Äther gewaschen. Der rohe Ester, 16,9 g (74 0I0),
F. etwa 85°, kann direkt für weitere Umsetzungen verwendet werden.
Zweimaliges Umkristallisieren aus Acetonitril ergibt den analysenreinen Dipeptidester vom F. 94 bis 96°.
5. Z-(/?-NH2)-Asp-Ser-Gly-OPNBz *5
26,6 g (0,1 Mol) Z-(^-N H2)-Asp-0 H und 19,3 g
(0,065 Mol) frisch hergestelltes H-Ser-Gly-0 P N Bz werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst und unter
Rühren bei —10° mit einer vorgekühlten Lösung von 20,6 g (0,1 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid in 200 ml
Acetonitril versetzt. Das Reaktionsgemisch wird innerhalb 10 Minuten mit weiteren 300 ml kaltem Acetonitril
versetzt und 1 Stunde bei —10° und über Nacht bei 0° gerührt. Nach Zugabe von 0,5 ml Eisessig wird
das ausgeschiedene Gemisch von amorphem Reaktionsprodukt und Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, mit
Dimethylformamid—Acetonitril 1: 5, Acetonitril und
Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Zur Abtrennung von eventuell vorhandenem Ausgangsmaterial
wird das feinpulverisierte Gemisch mit 1 η-Salzsäure und darauf mit kaltem 1 n-Natriumbicarbonat
verrührt, filtriert und mit Wasser und kaltem Alkohol gewaschen. Das trockene Material wird
mit 100 ml Dimethylformamid verrührt, der unlösliche
Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, mit Dimethylformamid gewaschen und das Filtrat im Vakuum auf etwa
50 ml eingeengt. Bei Zugabe von 150 ml heißem Methanol kristallisiert die Substanz in Form von
feinen Nadeln, F. 210 bis 212°, [*]% = -12,2°
(c = 2,38 in Eisessig); Ausbeute 15,8 g (45%).
6. Z-(,9-NH2)~Asp-Ser-Gly-OH
Eine Suspension von 8,2 g (15mMol) Z-(^-NH2)-Asp-Ser-Gly-OPNBz
in 75 ml Dioxan wird unter Rühren innerhalb 30 Minuten tropfenweise mit 36 ml 0,5 η-Natronlauge versetzt (ph Π bis 11,2). Nach
weiteren 15 Minuten wird die klare Lösung mit 1 η-Salzsäure auf ph 7 gestellt und im Vakuum auf
etwa 10 ml eingeengt. Das ausgeschiedene kristalline Material wird durch Zugabe von 20 ml Wasser gelöst
und die Lösung zur Entfernung von p-Nitrobenzylalkohol zweimal mit Essigestci extrahiert und bei 40°
mit 15 ml 2 η-Salzsäure angesäuert. Bei raschem
Kühlen scheidet sich das Reaktionsprodukt in Form von verfilzten Nadeln aus, die nach 1 Stunde bei 0°
abfiltriert und mit kaltem Wasser neutral gewaschen werden (5,0 g, F. 176 bis 178°). Nach Umkristallisieren
aus Wasser:4,l g(67%),F. 185bis 186°, [x]%° = -8,4°
(c = 1,90 in Eisessig).
7. Z-Pro-Tyr-OCH3
Eine Lösung von 100 g (0,4 Mol) Z-Pro-OH und
78 g H-Tyr-OCH3 in 1000 ml Methylenchlorid wird
bei 0° mit 86,5 g (0,42 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und über Nacht bei 0° stehengelassen. Nach
Zugabe von 3 ml Eisessig wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat unter
Kühlung mit 1 η-Salzsäure, I n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft.
Der Rückstand liefert beim Versetzen mit Essigester 160 g (91%) kristallines Material vom
F. 72 bis 74°. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Aceton—Äther ist der Schmelzpunkt des analysenreinen
Materials unverändert, [λ] % = — 24° (c = 4,08
in Alkohol).
8. Z-Pro-Tyr-OH
149 g (0,35MoI) Z-Pro-Tyr-OCH3 werden in
750 ml Methanol gelöst, auf 0° gekühlt und mit 900 ml vorgekühlter 1 η-Natronlauge versetzt. Die Lösung
wird 2 Stunden bei 0° stehengelassen, mit 2 n-Salzsäure
auf ph 7 gestellt, im Vakuum vom Methanol befreit und bei 0° mit 2 η-Salzsäure angesäuert. Das
ausgeschiedene ölige Material wird in Essigester aufgenommen, mit 1 n-Natriumbicarbonatlösung extrahiert,
durch Zugabe von 2 η-Salzsäure bei 0° aus der alkalischen wäßrigen Lösung als Öl ausgefällt und wiederum
in Essigester aufgenommen. Die getrocknete Essigesterlösung ergibt nach Eindampfen im Vakuum 135 g
(94%) Substanz als farblosen Schaum, der direkt für die weiteren Umsetzungen verwendet werden kann.
9. Z-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-OCH3
Eine Lösung von 135 g (0,33 Mol) Z-Pro-Tyr-OH und 109 g (0,35 Mol) (N6-Tos)-Lys-OCH3 in 1000 ml
Acetonitril wird bei 0° mit 72 g (0,35 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt, über Nacht bei 0° stehengelassen
und nach Zugabe von 2,5 ml Eisessig vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das
Filtrat wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in 1000 ml Essigester aufgenommen, die Lösung unter
Kühlung mit 1 η-Salzsäure, I n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und im Vakuum auf
etwa 500 ml eingeengt. Beim Stehen bei 0° scheidet sich das Reaktionsprodukt langsam in amorpher
Form ab (163 g, F. 131 bis 133°). Nach Umkristallisieren aus Methanol erhält man 139,5 g (60%) feinkristallines Material vom F. 134 bis 136°, [λ]|8= -47°
(c = 4,01 in Alkohol).
Acetylierung mit Essigsäureanhydrid in Pyridin liefert Z-Pro-(O-C O C H3)-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-O C H3
vom F. 109 bis 111° (aus Essigester), [x]*D° = -42,3°
(c = 1,80 in Äthanol).
10. Z-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-OH
7,1g (lOmMol) Z-Pro-Tyr-(N6-Tos)-Lys-OCH3
werden in 30 ml Methanol gelöst, mit 30 ml 1 n-Natronlauge versetzt und 2 Stunden bei Zimmertemperatur
stehengelassen. Die Aufarbeitung der Reaktionslösung geschieht in der für Z-Pro-Tyr angegebenen
Weise und ergibt nach Verreiben des Rohproduktes
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mit Äther 6,9 g (98 %) Substanz als farbloses, amorphes
Pulver, [*]D = -33,2° (c = 4,76 in Alkohol).
11. H-Pro-Tyr-(N6-Tos)-Lys-OCH3
50 g (0,07MoI) Z-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-OCH3
werden in 200 ml Methanol gelöst, mit 1 Äquivalent einer Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol versetzt
und in Gegenwart von 1,5 g Palladiumkohle (10%ig) bei Zimmertemperatur und Normaldruck
hydriert, wobei das gebildete Kohlendioxyd in Natronlauge absorbiert wird. Nach Aufnahme der berechneten
Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Die vom Katalysator abfiltrierte Lösung
wird im Vakuum eingedampft und der teilweise kristalline Rückstand mit Essigester verrieben. Zweimaliges
Umkristallisieren aus Methanol liefert das analysenreine Tripeptidesterhydrochlorid vom F. 178
bis 180c (bei raschem Aufheizen) bzw. 198 bis 200°
(bei langsamem Aufheizen), [x]d = —19,4: (c = 2,16
in Wasser); Ausbeute 37,0 g (87%).
Zur Überführung in den freien Ester werden 33,5 g (0,055 Mol) des Hydrochlorids in 350 ml Essigester
suspendiert und mit 30 ml einer 2,5 η-Lösung von Ammoniak in Methanol versetzt und 30 Minuten bei
Zimmertemperatur gerührt, wobei das Ausgangsmaterial vollständig in Lösung geht. Das ausgeschiedene
Ammoniumbromid wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft und der Rückstand
in 100 ml Essigester aufgenommen. Beim Stehen über Nacht bei 0; scheidet sich der Tripeptidester in kristalliner
Form ab: 31,3g (99%). F. 82 bis 84°. Nach zweimaligem Umkristallisieren einer Probe F. 85 bis
87"; [rv]f? = -15,8C (c = 5,44 in Alkohol).
Sowohl das Hydrochlorid als auch der freie Ester sind papierchromatographisch einheitlich.
12. BOC-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-OH
Eine Lösung von 31,3g (54 mMol) frisch hergestelltem
H-Pro-Tyr-(N'-Tos)-Lys-OCH3 in 60 ml
trockenem Pyridin wird mit 13,1 g (55 mMol) tert.-Butyl-p-nitrophenylcarbonat
versetzt und über Nacht bei 20" stehengelassen. Die Reaktionslösung wird im
Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, mit Essigester versetzt und unter Eiskühlung dreimal mit
2 η-Salzsäure, zweimal mit 1 n-Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen, getrocknet und im
Vakuum eingedampft. Der Rückstand liefert nach mehrmaligem Verreiben mit Äther 35,5 g (98 %) eines
schwach gelblichen Schaums. Die Substanz erweist sich papierchromatographisch (nach Hydrolyse der
tert.-Butyloxycarbonyl- und der Estergruppe mit konz. Salzsäure, 60 Minuten bei 40°) und bei
der Gegenstromverteilung nach Craig (System Methanol —Wasser—Chloroform —-Tetrachlorkohlenstoff
8:2:5:5) als einheitlich.
13, H-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-OH
a) Eine Lösung von 6,11 g (10 mMol) H-Pro-Tyr-(N6-Tos)-Lys-OCH3,
HCl in 40 ml 1 n-Natronlauge wird 1 Stunde bei O3 stehengelassen und darauf mit
1 η-Salzsäure auf ph 5 gestellt. Das ausgeschiedene
Material wird abfiltriert und mit Wasser und Alkohol gewaschen: 4,67 g (83 %), F. 222 bis 224°. Zur weiteren
Reinigung wird die Substanz in 20 ml heißem Dimethylformamid gelöst, von wenig unlöslichem Material
abfiltriert und mit 50 ml heißem Methanol versetzt, wobei sich das Ns-Tosyl-tripeptid in Form von
feinen Nadeln vom F. 224 bis 226° abscheidet: 4,40 g (79o/o); [«ß7 = -16,6° (c = 3,99 in Dimethylformamid),
—36,4° (c = 2,36 in 0,5 n-Kaliumbicarbonatlösung);
papierchromatographisch einheitlich.
b) 3,47 g (5 mMol) Z-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-OH
werden in 35 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10%ig) hydriert (Kohlendioxyd
in Natronlauge adsorbiert). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff wird das ausgeschiedene
Reaktionsprodukt durch Zugabe von 20 ml heißem Wasser gelöst, heiß vom Katalysator abfiltriert,
das Filtrat im Vakuum eingedampft und der kristalline Rückstand mit Alkohol gewaschen: 1,90 g
(68%), F. 219 bis 222°. Nach Umkristallisieren aus Dimethylformamid—Methanol identisch mit dem
nach a) hergestellten Material.
14. BO C-Pro-Tyr-(Nf-Tos)-Lys-O H
34,0 g (5OmMoI) B O C-Pro-Tyr-(NE-Tos)-Lys-OCH3
werden in einem auf 10= gekühlten Gemisch
von 50 ml Methanol und 150 ml 1 n-Natronlauge gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei
Zimmertemperatur stehengelassen, mit 2 n-Salzsäure auf Ph 7 gestellt, im Vakuum von Methanol befreit,
mit Essigester überschichtet und bei 0° unter Umschütteln mit 2n-Salzsäure angesäuert. Die abgetrennte
Essigesterphase wird mit Wasser gewaschen und dreimal mit 0,5 n-Kaliumbicarbonatlösung extrahiert.
Nach Überschichten der vereinigten wäßrigen Extrakte mit Essigester wird wiederum bei 0° mit
2 η-Salzsäure schwach angesäuert (Kongo), die Essigesterlösung mit Wasser gewaschen (bis neutral), getrocknet
und im Vakuum eingedampft. Der als Rückstand erhaltene Schaum ergibt nach Verreiben mit
Äther 32,2 g (96 %) eines farblosen Pulvers, das sich papierchromatographisch (nach Hydrolyse derSchutzgruppen)
als einheitlich erweist.
Zur Analyse wird eine Probe in wenig Essigester bei 30° gelöst, auf 0° gekühlt, das ausgeschiedene Öl durch
Abdekantieren von der überstehenden Lösung getrennt und mit Äther verrieben. Titration mit 0,1 n-Natronlauge
in Methanol ergibt das erwartete Äquivalentgewicht von 660.
15. B O C-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-Met-O CH3
Eine Lösung von 33,0 g (5OmMoI) BOC-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-OH
und 9,0 g (55 mMol) frisch hergestelltem H-Met-OCH-j in 250 ml Acetonitril wird auf
— 10c gekühlt und mit 11,4 g (55 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid
versetzt. Nach 15 Stunden bei —5° und 24 Stunden bei 0° wird 1 ml Eisessig zugegeben, der
ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand
wird in Essigester aufgenommen, unter Eiskühlung mit 1 n-Salzsäure, 0,5 n-Kaliumbicarbonatlösung und
Wasser gewaschen, getrocknet, im Vakuum eingedampft und das als Öl erhaltene Material mit Äther
verrieben. Das gelbliche, amorphe Pulver (38,3 g, 95%) zeigt bei der papierchromatographischen Prüfung
(nach Hydrolyse der Schutzgruppen) etwa 10% Verunreinigungen, die sich durch Gegenstromverteilung
nach Craig (System Methanol—Wasser—
Chloroform—Tetrachlorkohlenstoff 12: 3 : 4: 8) nicht
abtrennen lassen.
In gleicher Weise entsteht beim Umsetzen mit
H-Met-OPNBz [hergestellt aus Z-Met-OPNBz, F. 62 bis 64°, [<x]D = -15° (c = 2,02 in Aceton)
durch Decarbobenzoxylierung mit Bromwasserstoff in Essigester und Überführung des H-Met-OPNBz,
HBr, F. 149 bis 151°, [x]f = +4C (c = 1,97 in
Methanol) in den freien Ester] BOC-Pro-Tyr-(N6-Tos)-Lys-Met-OPNBz
in 96°/oiger Ausbeute als gelblicher Schaum, der einen dem oben beschriebenen
Methylester entsprechenden Reinheitsgrad aufweist.
16. B O C-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-Met-O H
20,1g (25 mMol) BOC-Pro-Tyr-(N6-Tos)-Lys-Met-OCH3
werden in 40 ml Methanol gelöst, bei etwa 10° mit 75 ml 1 η-Natronlauge versetzt und 45 Minuten
bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach Aufarbeitung in der für B O C-Pro-Tyr-(N€-Tos)-Lys-OH
angegebenen Weise ergibt das als Schaum erhaltene Rohprodukt beim Verreiben mit Äther
15,4 g (78%) eines schwach gelblichen Pulvers, das direkt weiterverarbeitet wird. Äquivalentgewicht 824
(berechnet 791).
Das gleiche Produkt entsteht bei der Verseifung des entsprechenden p-Nitrobenzylesters (Ausbeute 83%).
17. H-Pro-Tyr-(Nf-Tos)-Lys-Met-OH
15,0 g (19 mMol) BOC-Pro-Tyr-(N6-Tos)-Lys-Met-O
H werden in 75 ml warmem Essigester gelöst, auf Zimmertemperatur gekühlt und unter Umschütteln
in 300 ml einer 2,5n-Lösung von Salzsäure in Essigester eingegossen. Nach 1 Minute beginnt die Abscheidung
eines anfänglich öligen, dann kristallisierenden Materials, das nach 30 Minuten abfiltriert
und mit Essigester und Äther gewaschen wird. Das etwas hygroskopische Hydrochlorid (12,6 g) wird zur
Überführung in das freie Tetrapeptidderivat in 50 ml Wasser gelöst und mit 1 n-Ammoniumhydroxyd auf
Ph 6 gestellt. Das ausgeschiedene ölige Material verfestigt sich beim Verreiben bei 0° und wird durch
Zentrifugieren abgetrennt. Nach mehrmaligem Waschen
mit Wasser wird das feuchte, amorphe Produkt mit 50 ml heißem Alkohol verrieben und das feinkristalline
Material nach 2 Stunden abfiltriert und mit Alkohol gewaschen. 8,9 g (75%), F. 208 bis 21Γ. Zur weiteren
Reinigung wird die Substanz in 150 ml heißem Dimethylformamid gelöst und mit 300 ml Methanol
versetzt; das Tetrapeptidderivat scheidet sich rasch in Form von feinen Nadeln vom F. 229 bis 231° aus,
Ausbeute nach Isolierung einer zweiten Fraktion aus der Mutterlauge: 8,65 g (66%); [*]« = -42,0°±0,2°
(c = 2,02 in 0,5n-Kaliumbicarbonat). Die gereinigte
Substanz zeigt die erwarteten analytischen Werte, enthält aber etwa 5 % eines papierchromatographisch
nachweisbaren Nebenproduktes.
Die gleiche Substanz wird erhalten durch Behandlung von BOC-Pro-Tyr-iN^-Tos^Lys-Met-OPNBz
mit Salzsäure in Essigester (Ausbeute 71 %) und Verseifung des entstandenen H-Pro-Tyr-(NS-Tos)-Lys-Met-OPNBz,
HCl (Ausbeute 60%).
18. Z-Q3-N H2)-Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-(Nf-Tos)-Lys-Met-OH
Eine Lösung von 1,03 g (2,5mMol) Z-QO-NH2)-Asp-Ser-Gly-OH
(vgl. Ziffer 6) und 0,38 ml (0,28 mMol) Triäthylamin in 5 ml Dimethylformamid wird
unter Feuchtigkeitsausschluß auf 10° gekühlt und unter Rühren innerhalb 5 Minuten tropfenweise mit
einer Lösung von 0,35 g (2,5 mMol) Isobutylchlorocarbonat in 2 ml Tetrahydrofuran versetzt. Die Lösung
wird weitere 10 Minuten bei —10° und 20 Minuten bei 20 ° gerührt, auf 0 ° gekühlt und innerhalb 10 Minuten
tropfenweise eine Lösung von 1,73 g (2,5 mMol) Pro-Tyr~(Ne-Tos)-Lys-Met-O Hund 0,41 ml (3 mMol)
Triethylamin in 15 ml Dimethylformamid (Lösung hergestellt durch Erhitzen in verschlossenem Gefäß
auf etwa 120° und rasches Kühlen) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei 0° und über Nacht
bei Zimmertemperatur stehengelassen, darauf bei 0,1mm auf etwa 4 ml eingeengt und mit 20 ml
1 η-Essigsäure versetzt. Das ausgeschiedene ölige Material wird mehrmals mit 1 η-Essigsäure und Wasser
ίο gewaschen, wobei es sich teilweise verfestigt, und im
Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet. Zweimaliges Umkristallisieren aus Alkohol liefert 1,25 g
(46%) amorphe Substanz vom F. 167 bis 172°, die etwa 10% einer papierchromatographisch nachweisbaren
Verunreinigung enthält. Zur weiteren Reinigung wird das Produkt in einer Craig-Apparatur im
System Methanol—Wasser—Chloroform—Tetrachlorkohlenstoff
(3 : 1 : 3 : 1) über 60 Schritte mit je 10 ml Unter- bzw. Oberphase verteilt (Maximum bei
G = 0,63). Die vereinigten Spitzenfraktionen liefern nach Umkristallisieren aus Methanol 0,54 g papierchromatographisch
einheitliche Substanz vomF. 175 bis 1773 (leichtes Sintern bei 171°); [<%]|6 = -30,1°
(c = 2,06 in Dimethylformamid).
In gleicher Weise entsteht beim Umsetzen von Z-Q9-NH2)-Asp-Ser-Gly-OH mit H-Pro-Tyr-(N>Tos)-Lys-OH
(vgl. Ziffer 13) das Z-QS-N H2)-Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-(Nf-Tos)-Lys-OH,
das nach zweimaligem Umkristallisieren aus Alkohol papierchromatographisch reine Substanz vom F. 138 bis 143°
(leichtes Sintern bei 133°) liefert; [x]d = —31,1° (c = 2,16 in Dimethylformamid). H yd ro genoly tische
Decarbobenzoxylierung liefert H-Q3-N H2)-Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-(N-Tos)-Lys-OH.
Nach Umkristallisieren aus Dimethylformamid—Methanol F. 192 bis
196° (Braunfärbung ab 180°).
19. (N«-Z)-(N"-Tos)-Lys-QS-O C H3)-Asp-0 C H3
45,0 g (0,28 Mol) H-Q3-OCH3)-Asp-OCH3 und
126 g (0,29 Mol) (N"-Z)-(NE-Tos)-Lys-O H werden im
1,5 1 Acetonitril gelöst. Die auf —15° gekühlte Lösung wird mit 60,0 g (0,29 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid
versetzt und dann 30 Minuten bei — 15° und 48 Stunden
bei 3° belassen. Der ausgeschiedene Kristallbrei (Gemisch des Dipeptiddimethylesters mit Dicyclohexylharnstoff)
wird abgenutscht (203,5 g, Weiterverarbeitung vgl. unten). Das Filtrat wird mit 2 ml Eisessig
versetzt und weitere 2 Stunden bei 3° belassen, hierauf eingedampft und der Rückstand in Essigester
aufgenommen. Nach Waschen mit verdünnter Salzsäure, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser,
Trocknen und Eindampfen werden 35,0 g Rückstand erhalten. Kristallisation aus Essigester ergibt 11,8g
der obigen Verbindung vom F. (130°) 137 bis 140°. Bei Chromatographie der Mutterlauge dieser Kristalle an
Aluminiumoxyd wird ein Nebenprodukt vom F. 122 bis 124° erhalten; es handelt sich um l-(Na-Carbobenzyloxy-N-f-tosyl-L-lysyl)-1,3-dicyclohexylharnstoff.
Das aus der Reaktionslösung ausgeschiedene Gemisch des obigen Dipeptidesters und Dicyclohexylharnstoff
(203,5 g) wird mit kaltemChloroform zerrieben und der ungelöste Harnstoff abgenutscht (57,5 g, F. 222 bis
225°). DasFiltrat wird eingedampft und der Rückstand aus Methanol kristallisiert, wobei 136,8 g (Na-Z)-(Ni-Tos)-Lys-(^-OCH3)-Asp-OCH3
erhalten werden, F. (140) 144 bis 146°. Totalausbeute: 148,6 g (92% der Theorie).
15 16
Umkristallisation aus Essigester, dann Methanol Insgesamt werden 42,0 g (83 %) kristallines Triergibt
analysenreines Produkt vom F. 144 bis 146°, peptidderivat erhalten. Mn = +27°±0,6° (c = 1,11 in Chloroform). ^ z.pro_(Ne_Tos)_Lys_(^NH2)_Asp-NH2
20. (N6-Tos)-Lys-(^-OCH3)-Asp-OCH3 5 Das Tripeptidderivat von Ziffer 21 wird mit viel
überschüssigem Ammoniak in Methanol 48 Stunden
50,0 g (0,087 Mol) (Na-Z)-(N6-Tos)-Lys- bei Zimmertemperatur belassen. Eindampfen und
(/?-OCH3)-Asp-OCH3 werden unter Feuchtigkeits- Kristallisieren aus Methanol gibt in 85%iger Ausbeute
ausschluß in 200 ml absolutem Eisessig gelöst, mit Z-Pro-(Ne-Tos)-Lys-(/S-N H2)-ASp-NH2, F. 196 bis
90 ml 4,2n-Bromwasserstofflösung in Eisessig versetzt io 202°, [x]D = —20,8° ± 0,7° (c = 1,30 in Dimethyl-
und bei Zimmertemperatur bis zum Aufhören der formamid). Gasentwicklung belassen (2V2 Stunden). Die Reaktionslösung
wird dann bei 0,1 Torr und 35° Bad- 23· H-Pro-(N<-Tos)-Lys-(£-O CHg)-ASp-OCH3
temperatur zur Trockne verdampft und der Rück- 2,00 g (2,97 mMol) Z-Pro-(N6-Tos)-Lys-(/3-O CH3)-stand
unter Eiskühlung mit Essigester so lange zer- 15 Asp-OCH3 werden in 25 ml Methanol gelöst, 2 ml
rieben, bis er durchkristallisiert. Dabei werden 44,37 g 2n-Salzsäurelösung in Methanol zugegeben und die
(97% der Theorie) rohes kristallines (N6-Tos)-Lys- Lösung in Gegenwart von 100 mg Palladium-Kohle
(/3-OCHa)-ASp-OCH3, HBr vom F. (140°) 142 bis (10% Pd) bei Zimmertemperatur und Normaldruck hy-146°
erhalten. Das Produkt ist für die weiteren Um- driert. (Das entwickelte Kohlendioxyd wird gleichzeitig
Setzungen genügend rein:< Zweimaliges Umkristalli- 20 in Natronlauge absorbiert.) Die Hydrierung kommt nach
sieren aus Methanol—Äther gibt analysenreines Aufnahme von etwas weniger als der berechneten
Material vom F. 144 bis 146°; [x]D = +7,0°±0,3° Menge Wasserstoff nach 5 Stunden zum Stillstand.
(c = 2,14 in Methanol). Abfiltrieren des Katalysators und Eindampfen gibt
44,0 g (0,084 Mol) (N6-Tos)-Lys-(/J-OCH3)-Asp- das Hydrochlorid des obigen Tripeptiddimethylesters
OCH3, HBr werden in 120 ml Wasser gelöst, die 25 (1,66 g) als farbloses Harz. Zur Überführung in die
Lösung klar filtriert, mit viel Chloroform versetzt freie Base wird das Hydrochlorid in wenig Wasser
und unter Eiskühlung mit kalter, konzentrierter gelöst, die wäßrige, klare Lösung mit viel Essigester
Kaliumcarbonatlösung stark alkalisch gemacht. Der überschichtet und unter Kühlung auf etwa 5° durch
als Öl ausgeschiedene freie Dipeptidester wird in Zugabe von kalter konzentrierter Pottaschelösung
Chloroform aufgenommen, die Chloroformlösung 30 stark alkalisch gemacht. Das Reaktionsprodukt
zweimal mit wenig kalter Natriumsulfatlösung ge- scheidet sich dabei in öliger Form ab und löst sich beim
waschen, getrocknet und eingedampft. Dabei werden Umschütteln in Essigester. Die Essigesterlösung wird
33,Og (89%) (N6-Tos)-Lys-(/3-OCH3)-Asp-OCH3 mit kalter Natriumsulfatlösung gewaschen, getrocknet
als zähes, klares Öl erhalten und sofort, wie unter und eingedampft. Der als farbloses Harz erhaltene
beschrieben, weiterverarbeitet. 35 H-Pro-(NE-Tos)-Lys-(/5-OCH3)-Asp-OCH3(l,27g)
wird direkt weiter umgesetzt.
21. Z-Pro-eN-Tos)-Lys-(/3-O C H3)-Asp-0 C H3
24. H-Pro-(N*-Tos)-Lys-(/3-NH2)-Asp-NH2
In einer auf —15° gekühlten Lösung von 33,Og
(0,075 Mol) (Nf-Tos)-Lys-(/?-OCH3)-Asp-OCH3 40 Das in Ziffer 22 beschriebene Z-Pro-(NE-Tos)-
und 20,4 g (0,082 Mol) Z-Pro-0 H in 500 ml Aceto- Lys-(/3-NH2)-Asp-NH2 gibt unter den gleichen
nitril wird 17,0 g (0,082MoI) Dicyclohexylcarbo- Hydrierungsbedingungen, wie oben angegeben, H-Prodiimid
gegeben. Nach 30 Minuten bei -15° und (Ne-Tos)-Lys-(/?-NH2)-Asp-NH2, NCl, F. 236 bis
20 Stunden bei 3° wird der Dicyclohexylharnstoff ab- 238° (aus Wasser—Aceton), [«)b = —37,9° ± 1,2°
genutscht (16,4 g, F. 223 bis 226°) und das Filtrat nach 45 (c = 1,08 in Wasser). Aus dem Hydrochlorid wird die
Zugabe von 2 ml Eisessig weitere 2 Stunden bei 3° freie Base bereitet durch Verteilen zwischen n-Butanol
belassen. Dabei scheiden sich noch 0,98 g Dicyclo- und 2n-Sodalösung. Die Butanollösung gibt nach
hexylharnstoff aus. Das Filtrat wird eingedampft, Eindampfen und Zerreiben des Rückstandes mit
der Rückstand in Essigester gelöst und die Lösung mit Äther H-Pro-(Ne-Tos)-Lys-(/3-NH2)-Asp-NH2 als
verdünnter Salzsäure, Wasser, Natriumbicarbonat- 50 farbloses Pulver vom F. 117 bis 135°, [x]d = —40,4°
lösung und Wasser gewaschen, getrocknet und ein- ± 0,6° (c = 1,09 in Wasser),
gedampft. Der Rückstand (50,0 g) wird mehrmals mit
viel Äther zerrieben. (Aufarbeitung der ätherlöslichen 25.
Anteile [8,0 g Harz] vgl. unten.) Das ätherunlösliche
Material (41,7 g) ergibt nach längerem Stehen in 55 Zu einer Lösung von 20,50 g (0,038 Mol) H-Pro-Methanol—Wasser 35,0 g Z-Pro-(Ne-Tos)-Lys- (N6-Tos)-Lys-(/?-OCH3)-Asp-OCH3 und 11,35 g (^-OCH3)-Asp-OCH3 in Nadelform, F. (96°) 110 bis (0,0455 Mol) Z-Pro-OH in 300 ml Acetonitril bei 113°. Beim Umkristallisieren aus Aceton—Äther und —15° werden 9,40 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,0455 Methanol erhält man ein analysenreines Produkt vom Mol) gegeben. Hierauf wird die Reaktionslösung F. 126 bis 129°, [x)D = —22,6° ± 0,8° (c = 1,02 in 60 1 Stunde bei —15° und 24 Stunden bei 3° belassen. Chloroform). Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes (7,77 g,
viel Äther zerrieben. (Aufarbeitung der ätherlöslichen 25.
Anteile [8,0 g Harz] vgl. unten.) Das ätherunlösliche
Material (41,7 g) ergibt nach längerem Stehen in 55 Zu einer Lösung von 20,50 g (0,038 Mol) H-Pro-Methanol—Wasser 35,0 g Z-Pro-(Ne-Tos)-Lys- (N6-Tos)-Lys-(/?-OCH3)-Asp-OCH3 und 11,35 g (^-OCH3)-Asp-OCH3 in Nadelform, F. (96°) 110 bis (0,0455 Mol) Z-Pro-OH in 300 ml Acetonitril bei 113°. Beim Umkristallisieren aus Aceton—Äther und —15° werden 9,40 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,0455 Methanol erhält man ein analysenreines Produkt vom Mol) gegeben. Hierauf wird die Reaktionslösung F. 126 bis 129°, [x)D = —22,6° ± 0,8° (c = 1,02 in 60 1 Stunde bei —15° und 24 Stunden bei 3° belassen. Chloroform). Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes (7,77 g,
Die Mutterlaugen des Rohkristallisats (35,0 g) 90% der Theorie) wird das Filtrat mit 1 ml Eisessig
werden vereint mit dem obigen (8,0 g) ätherlöslichen versetzt und 1 Stunde bei 3° belassen. Dabei scheiden
Material, total 13,2 g und an der 50fachen Gewichts- sich weitere 100 mg Harnstoff aus. Das Filtrat wird
menge Silikagel chromatographiert. Die mit Chloro- 65 eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenomform—Methanol
eluierten Fraktionen geben noch men und wie üblich neutral gewaschen. Die Essig-7,0
g kristallinen Tripeptidester vom F. etwa 120 bis esterlösung gibt nach Eindampfen 28,44 g Rückstand
126°. (Harz). Das Rohprodukt wird mehrmals mit viel
17 18
Äther zerrieben und der ätherunlösliche Anteil Zur Bereitung des freien Pentapeptidesters werden
(24,29 g) einer Gegenstromverteilung unterworfen. 5,00 g (6,58 mMol) des obigen Hydrochloride unter
Die 78stufige Verteilung zwischen 80 % Methanol und Eiskühlung zwischen 500 ml Chloroform und 50 ml
Chloroform — Tetrachlorkohlenstoff = 1:1 ergibt 2n-Sodalösung verteilt. Das Reaktionsprodukt löst
17,0 g reines Tetrapeptidderivat (Verteilungszahl G 5 sich in Chloroform. Der Chloroformauszug wird
= 0,351), als farbloses Harz; [<%]d = — 70,6° ± 1° zweimal mit kalter Natriumsulfatlösung gewaschen,
(c = 2,09 in Methanol). die Soda- und Natriumsulfatlösung mit weiteren
xj ρ ρ 200 ml Chloroform nachgewaschen; die vereinigten
aii _ Λ T 26· γ-*7^nu\°~ nru Chloroformlösungen geben nach Trocknen und Ein-
(N*-Tos)-Lys-(£-OCH3)-Asp-OCH3 10 dampfen 4j00g (84o/o) H-Ser-Pro-Pro-(N'-Tos)-
10,00 g (12,95 mMol) Z-Pro-Pro-(NE-Tos)-Lys- Lys-(^-OCH3)-Asp-OCH3als farbloses Harz, welches
((S-OCH3)-Asp-OCH3 werden in 200 ml Methanol direkt weiter umgesetzt werden kann,
gelöst, 10 ml 2normale methanolische Salzsäure zugegeben und die Lösung in Gegenwart von 500 mg 29. Z-(y-NH2)-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Ser-Palladium-Kohle (10% Pd) bei Zimmertemperatur 15 Pro-Pro-iN^-Tos^Lys-dS-OCH^-Asp-OCHg, HCl und Normaldruck hydriert (unter Verwendung eines
gelöst, 10 ml 2normale methanolische Salzsäure zugegeben und die Lösung in Gegenwart von 500 mg 29. Z-(y-NH2)-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Ser-Palladium-Kohle (10% Pd) bei Zimmertemperatur 15 Pro-Pro-iN^-Tos^Lys-dS-OCH^-Asp-OCHg, HCl und Normaldruck hydriert (unter Verwendung eines
zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäßes 1,36 g (1,4 mMol) Z-(y-NH2)-Glu-His-Phe-Argzur
Absorption des entwickelten Kohlendioxydes). Try-Gly-OH (vgl. deutsche Patentschrift 1 108 232)
Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff werden in 16 ml frisch destilliertem Dimethylformwird
die Lösung vom Katalysator abfiltriert und ein- 20 amid in der Wärme gelöst, wieder auf Zimmergedampft.
Dabei wird das Hydrochlorid des obigen temperatur abgekühlt, mit 1,6 g (2,1 mMol) H-Ser-Tetrapeptidesters
als farbloses Harz erhalten. Es wird, Pro-Pro-(Ne-Tos)-Lys-(/?-OCH3)-Asp-OCH3, HCl
wie in Ziffer 23 beschrieben, in den freien H-Pro-Pro- versetzt und anschließend bei Zimmertemperatur ge-(Ne-Tos)-Lys-(/?-OCH3)-Asp-OCH3
übergeführt. rührt. Nach 2stündigem Rühren resultiert eine klare Ausbeute 6,86 g (83 %). Das als farbloses Harz er- 25 Lösung. Man gibt 590 mg (2,9 mMol) Dicyclohexylhaltene
Produkt wird direkt weiter umgesetzt. carbodiimid in 3,5 ml Dimethylformamid dazu und
läßt 3 Tage bei Zimmertemperatur reagieren.
27. Z-Ser-Pro-Pro- Die vom Dicyclohexylharnstoff befreite Lösung
(NE-Tos)-Lys-(/S-OCH3)-Asp-OCH3 versetzt man mit 500 ml Essigester, filtriert das aus-
30 gefällte Material durch eine feine Glasfritte ab und
6,86 g (10,8 mMol) H-Pro-Pro-(Ne-Tos)-Lys- erhält nach dem Trocknen im Hochvakuum bei 40°
(ß-OCH3)-Asp-OCH3 werden gelöst in 150 ml 2,3 g Rohprodukt, das noch mit Ausgangsmaterial
Acetonitril und 2,61g (12,OmMoI) Z-Ser-OH zu- verunreinigt ist.
gegeben. Die Lösung wird auf —15° gekühlt, mit Zur Reinigung werden die 2,3 g einer multiplika-
2,47 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und sodann 35 tiven Verteilung über 60 Stufen, zwischen den Phasen
1 Stunde bei —15° und 60 Stunden bei 3° belassen. n-Butanol—1 % Essigsäure = 1:1, unterworfen (G
Hierauf wird vom abgeschiedenen Dicyclohexyl- = 0,8).
harnstoff abgenutscht (2,33 g entsprechen 91 % der Die Hauptmenge des geschützten papierchromato-
Theorie) und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand graphischreinen Carbobenzoxyundekapeptid-dimethyl-
wird in Essigester gelöst und wie üblich neutral 40 ester-hydrochlorids befindet sich in den Elementen
gewaschen. Die Essigesterlösung ergibt 9,06 g Rück- 15 bis 30. Diese Fraktionen werden vereinigt, zur
stand; dieser wird mit viel Petroläther, dann Äther Trockne eingedampft und noch zweimal aus wenig
zerrieben. Das ätherunlösliche Rohprodukt (8,35 g) Dimethylformamid mit viel Essigester ausgefällt,
wird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung unter- Die Ausbeute ist 1,34 g (=60% der Theorie)
worfen. Die 48stufige Verteilung zwischen 80% 45 amorphes, weißes Pulver. [a]%5 = -53,8° ±1,8° (c
Methanol und Chloroform—Tetrachlorkohlenstoff = 0,9475 in Dimethylformamid).
= 1:1 gibt 84% reinen Pentapeptidester als farbloses
= 1:1 gibt 84% reinen Pentapeptidester als farbloses
Harz ^ (Verteilungszahl G — 0,507). Nach Zerreiben In den drei Systemen
mit Äther zeigt das analysenreine Produkt den tert.-Amylalkohol—Isopropanol—Wasser
Schmelzpunkt von etwa 70 bis 105°, [<x]D = —92,0° 50 = 100: 40: 55,
±0,6° (c = 2,16 in Methanol). sek.-Butanol—Isopropanol—Monochloressig-
28 H Ser Pro Pro säure-Wasser = 70: 10: 3 g: 40,
,.I(T w^TSTT nru sek.Butanol—Isopropanol—5% Veronal-Na—
(N*_Tos)-Lys-(/?-OCH3)-Asp-OCH3 Wasser = m T15 1T10. 60
8,00 g (9,33 mMol) Z-Ser-Pro-Pro-(Nf-Tos)- 55
Lys-((S-OCH3)-Asp-OCH3 werden gelöst in 200 ml zeigt der geschützte Ester folgende Rf-Werte (DurchMethanol,
4 ml 3,3normale methanolische Salzsäure schnittswerte): 0,55 bzw. 0,62 bzw. 0,67.
zugegeben und die Lösung in Gegenwart von 500 mg Die quantitative Aminosäurebestimmung nach Palladium-Kohle (10% Pd) bei Zimmertemperatur Stein und Moore an einer Amberlite XE-69-Säule und Normaldruck (Absorption des Kohlendioxyds in 60 (Handelsbezeichnung) ergibt das erwartete Amino-Lauge) hydriert. Die Hydrierung wird nach 4V2 Stun- Säureverhältnis,
den und Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Wasserstoffmenge beendet. Abfiltrieren des 30. H-iy-NH^-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Ser-Katalysators und Eindampfen gibt das Hydrochlorid Pro-Pro-(N6-Tos)-Lys-((8-OCH3)-Asp-OCH3,
des obigen Pentapeptidesters als farbloses Harz. Mehr- 65 3 HCl
maliges Ausfällen aus Acetonlösung mit Äther gibt
zugegeben und die Lösung in Gegenwart von 500 mg Die quantitative Aminosäurebestimmung nach Palladium-Kohle (10% Pd) bei Zimmertemperatur Stein und Moore an einer Amberlite XE-69-Säule und Normaldruck (Absorption des Kohlendioxyds in 60 (Handelsbezeichnung) ergibt das erwartete Amino-Lauge) hydriert. Die Hydrierung wird nach 4V2 Stun- Säureverhältnis,
den und Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Wasserstoffmenge beendet. Abfiltrieren des 30. H-iy-NH^-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Ser-Katalysators und Eindampfen gibt das Hydrochlorid Pro-Pro-(N6-Tos)-Lys-((8-OCH3)-Asp-OCH3,
des obigen Pentapeptidesters als farbloses Harz. Mehr- 65 3 HCl
maliges Ausfällen aus Acetonlösung mit Äther gibt
6,53 gamorphes Pulver, F. HObis 150°; [<x]b — —86,7° 1,25 g (0,72 mMol) Carbobenzoxyundekapeptid-di-
± 0,7° (c = 2,41 in Methanol). methylester-hydrochlorid werden in 70 ml Methanol,
Claims (5)
19 20
die 2,2 Äquivalente Salzsäuregas enthalten, in Gegen- papierchromatographischer Auftrennung die zu erwart
von 200 mg 10%igem Palladium-Kohle-Kataly- wartenden ninhydrin-positiven Aminosäureflecken,
sator mit Wasserstoff geschüttelt. Zur Absorption
des gebildeten Kohlendioxyds wird eine zweite mit 32· H-OS-NH^-Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-Lys-Met-
konzentrierter Kalilauge gefüllte Hydrierente da- 5 (y-NH2)-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Ser-Pro-
zwischengeschaltet. Nach 6 Stunden ist die Wasser- Pro-Lys-Asp-OH, CH3COOH
Stoffaufnahme beendet. Die methanolische Lösung 400 mg (0,15 mMol) geschütztes Oktadekapeptid-
wird vom Katalysator befreit, das Lösungsmittel bei dimethylester-hydrochlorid werden in 8 ml 75%igem
40° im Vakuum abgedampft und der Verdampfungs- Dioxan gelöst und unter Stickstoff mit 0,4 ml 0,46n-
rückstand einmal aus abs. Methanol—Äther um- io Bariumhydroxydlösung während 14 Minuten bei Zim-
gefällt. mertemperatur versetzt (ph 11,4). Die Verseif ungs-
Nach dem Trocknen erhält man 1,19 g amorphes, lösung wird mit 1,84 ml VwH-Schwefelsäure neutrali-
leichtrosagefärbtes Trihydrochlorid des Undekapep- siert und das Lösungsmittel bei 40° unter vermindertem
tiddiesters. Druck abgedampft.
Die Verbindung zeigt in den drei in Ziffer 29 be- 15 Den Verdampfungsrückstand nimmt man in 10 ml
schriebenen Chromatographiesystemen nur einen 50%igem Dioxan auf, trennt durch eine feine Glas-
Pauly- und ninhydrin-positiven Fleck; mit den fritte vom unlöslichen Bariumsulfat ab und wäscht
folgenden R1-Werten (Durchschnittswerte) 0,57 bzw. noch zweimal mit 5 ml 50%igem Dioxan nach. Nach
0,68 bzw. 0,71. dem Verdampfen im Vakuum bei 40° und Trocknen
20 des Rückstandes über Phosphorpentoxyd im Hoch-
31. Z~03-NHo)-Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-(Nc-Tos)- vakuum erhält man 385 mg Verseifungsprodukt.
Lys-Met-(y-NH2)-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Ser- Obige 385 mg werden in 80 ml über Natrium
Pro-Pro-(Nf-Tos)-Lys-(^-OCH3)-Asp-OCH3, HCl getrocknetem flüssigem Ammoniak gelöst und mit
Calcium bei der Siedetemperatur des Ammoniaks
210 mg (0,128 mMol) Undekapeptid-dimethylester- 25 reduziert. Nach der Zugabe von 110 mg Calcium
trihydrochlorid werden in 2 ml frisch destilliertem bleibt die Lösung ungefähr 10 Minuten dunkelblau.
Dimethylformamid aufgelöst, bei 0° mit 0,28 ml Anschließend versetzt man das Reaktionsgemisch mit
In-Lösung Triäthylamin in Dimethylformamid ver- viel Ammoniumbicarbonat, worauf die Blaufärbung
setzt und 2 Stunden bei 0° belassen. Langsam scheidet langsam verschwindet und die Reaktionslösung milchig
sich das Triäthylamin-hydrochlorid ab. Nach etwa 30 bleibt. Das Ammoniak dampft man bei Zimmer-
90 Minuten ist die Salzabscheidung beendigt. Dann temperatur ab und entfernt die letzten Reste im
gibt man 152 mg (0,14 mMol) Z-(/3-NH2)-Asp-Ser- Hochvakuum über Schwefelsäure.
Gly-Pro-Tyr-(Ne-Tos)-Lys-Met-O H (vgl. Ziffer 18) Der Rückstand wird wiederholt mit 1 n-Ammonium-
dazu und nach weiteren 15 Minuten 0,21ml einer bicarbonatlösung (dreimal 10 ml) und zweimal mit
In-Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethyl- 35 5 ml Wasser extrahiert, durch Cellit filtriert, die klare
formamid. Man läßt 3 Tage bei 0° und 1 Tag bei wäßrige Lösung (pH = 8,4) mit Eisessig auf pH 4,2
Zimmertemperatur reagieren, filtriert anschließend gestellt und das Wasser bei 40° im Vakuum abge-
vom abgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab und dampft. Den Rückstand dampft man noch fünfmal
fällt mit 60 ml Essigester. mit je 10 ml Wasser ab und sublimiert zum Schluß das
Nach dem Trocknen im Hochvakuum bei 40° 40 Ammoniumacetat im Hochvakuum bei 40° ab.
gewinnt man 290 mg amorphes weißes Pulver. Zur weiteren Reinigung wird das rohe Oktadeka-
Das Papierchromatogramm zeigt neben dem peptid zwischen sek.-Butanol und 0,5°/0iger wäßriger
Z-03-NH2)-Asp-Ser-Gly-Pro-Tyr-(NE-Tos)-Lys- Trichloressigsäure 1: 1 über 160 Stufen verteilt.
Met- (y-N H2)-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Ser-Pro- Die Bestimmung der optimalen Dichte der einzelnen
Pro-(Nf-Tos)-LyS-OS-OCHs)-ASp-OCH3, HCl 45 Fraktionen bei 277m/tt zeigt die Hauptmenge des
noch beträchtliche Mengen von Ausgangsmaterial. Oktadekapeptids in den Elementen 49 bis 65. Der
Zur Reinigung werden 360 mg Rohmaterial (aus Verteilungskoeffizient beträgt 0,53.
zwei gleich angeführten Ansätzen) an einer Cellulose- Die Phasen der Verteilungselemente 49 bis 54,
säule (Durchmesser 2,5 cm, Länge 90 cm) mit n-But- 55 bis 60 und 61 bis 65 werden vereinigt und unter
anol, gesättigt mit 1 % Essigsäure, chromatographiert. 50 vermindertem Druck bei 40° auf ein kleines Volumen
Die Eluiergeschwindigkeit beträgt 3 bis 4 ml je eingedampft. Zur Entfernung der Trichloressigsäure
20 Minuten. Die Fraktionen 81 bis 175 zeigen Pauly- läßt man die drei Fraktionen durch je eine Säule
positive Reaktion. von 10 ml Amberlit IR-4B (Acetatform) und wäscht
Es werden die Fraktionen 82 bis 84, 85 bis 93, 94 bis das Peptid mit 25 ml Wasser aus. Die drei Fraktionen
122, 123 bis 132 und 133 bis 175 vereinigt. Die Frak- 55 geben 100 mg Oktadekapeptidacetat.
tionen 85 bis 93 bestehen aus einem Gemisch von
tionen 85 bis 93 bestehen aus einem Gemisch von
Carbobenzoxyheptapeptid neben Carbobenzoxyokta- PATENTANSPRÜCHE:
dekapeptidester, dagegen enthalten die Fraktionen 1. Verfahren zur Herstellung neuer MSH-
94 bis 122 den reinen geschützten Oktadekapeptid- aktiver Oktadekapeptide der Formel L-Aspara-
ester, während in den restlichen Fraktionen zur Haupt- 60 ginyl-L- seryl-glycyl -L- prolyl-L- tyrosyl - l - lysyl-
sache Undekapeptidester enthalten ist. l-methionyl- L- glutaminyl-l- histidyl -L- phenyl-
Die vereinigten Fraktionen 94 bis 122 ergeben alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-pro-
113 mg weißes, amorphes Pulver, das im Papier- lyl-L-prolyl-L-lysyl-L-asparaginsäure sowie der ent-
chromatogramm nur einen Pauly- und einen Ehrlich- sprechenden Verbindung, die statt des Glutaminyl-
positiven Fleck zeigt. 65 restes den Rest der Glutaminsäure aufweist, und
Eine Probe des gereinigten, geschützten Peptid- ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man das
esters, mit 6n-Salzsäure während 15 Stunden bei Heptapeptid L-Asparaginyl-L-seryl-glycyl-L-prolyl-
105° hydrolysiert, ergibt nach elektrophoretischer und L-tyrosyl-L-lysyl-L-methionin mit geschützten Ami-
nogruppen, erhalten durch Kondensation des Tripeptids L-Asparaginyl-L-seryl-L-glycin mit geschützter
a-Aminogruppe, mit einem Ester des Tetrapeptids L-Prolyl-L-tyrosyl-L-lysyl-L-methioninmit
geschützter ε-Aminogruppe und Verseifung der Estergruppe, oder durch Kondensation
des Hexapeptids L-Asparaginyl-L-seryl-glycyl-L-prolyl-L-tyrosyl-L-lysin
mit geschützter «- und ε-Aminogruppe, mit einem L-Methioninester und Verseifung
der Estergruppe, kondensiert mit einem Diester des Undekapeptids L-Glutaminyl- bzw.
L - Glutaniyl -L-histidyl-L- phenylalanyl - l - arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-seryl-L-prolyl-L-prolyl-L-lysyl-L-asparaginsäure
mit geschützter ε-Aminogruppe, erhalten durch Kondensation des Hexapeptids L-Glutaminyl- bzw. L-Glutamyl-L-histidyl-L
- phenylalanyl - l - arginyl - l - tryptophyl - glycin mit geschützter «-Aminogruppe mit einem Diester des
Pentapeptid s L-Seryl-L-prolyl-L-prolyl-L-lysyl-L-asparaginsäure
mit geschützter ε-Aminogruppe und Abspaltung der «-Aminoschutzgruppe, und, wenn
erwünscht, die Carboxylgruppen des Asparaginsäurerestes und die Aminogruppen des Asparaginylrestes
und der Lysylreste in Freiheit setzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verknüpfung des Heptapeptids
mit dem Undekapeptid in Gegenwart eines Carbodiimids durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die freie Aminogruppe
des Asparaginrestes durch einen reduktiv abspaltbaren Rest schützt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die ε-Aminogruppe der
Lysinreste durch die Tosylgruppe schützt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Diester des Pentapeptids
mit geschützter ε-Aminogruppe durch stufenweisen Aufbau vom Carboxylende her, beginnend
mit dem Asparaginsäurediester und Ankondensation jeweils einer weiteren Aminosäure,
herstellt.
© 209 557/424 3.62
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH1126397X | 1959-05-28 |
Publications (1)
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|---|---|
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Family
ID=4558916
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE1126397B (de) |
-
1960
- 1960-05-24 DE DEC21514A patent/DE1126397B/de active Pending
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