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DE112009001927T5 - Pflanzen mit gesteigerter ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Pflanzen mit gesteigerter ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung Download PDF

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DE112009001927T5
DE112009001927T5 DE112009001927T DE112009001927T DE112009001927T5 DE 112009001927 T5 DE112009001927 T5 DE 112009001927T5 DE 112009001927 T DE112009001927 T DE 112009001927T DE 112009001927 T DE112009001927 T DE 112009001927T DE 112009001927 T5 DE112009001927 T5 DE 112009001927T5
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DE112009001927T
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Yves Hatzfeld
Christophe Reuzeau
Valerie Frankard
Ana Isabel Sanz Molinero
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BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
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Publication date
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener ökonomisch wichtiger, ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-(Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9-)Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen haben. Die Erfindung stellt auch bisher unbekannte BHLH9-kodierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die diese umfassen, bereit, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener ökonomisch wichtiger, ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-(Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9-)Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen haben. Die Erfindung stellt auch bisher unbekannte BHLH9-kodierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die diese umfassen, bereit, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumseigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-(Imbibition-inducible 1-)Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumseigenschaften relativ zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen haben. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumseigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein PCD-artiges (Pterin-4a-carbinolamin-Dehydratase-artig) kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die für ein PCD-artiges kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumseigenschaften relativ zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen haben. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener ertragsbezogenen Eigenschaften der Pflanze durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein ”Pseudo Response Regulator Typ2'-(PRR2-)Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit erhöhter Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen haben. Die Erfindung betrifft zusätzlich Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenzen enthalten.
  • Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Verfahren für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenswerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken dahingehend mehrere Nachteile auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
  • Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann im Sinne von Quantität und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Früh-Wuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
  • Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Setzlinge). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
  • Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Stellvertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf viele Arten gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stängelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße in einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht für eine Auswahl an diversen Genotypen wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
  • Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Früh-Wuchskraft. Die Verbesserung der Früh-Wuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird und falls die Pflanzen rasch durch das Wasserauftauchen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Früh-Wuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Früh-Wuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais-(Zea Mais L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
  • Der Ernteindex, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kombiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stängels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Einschränkungen auf den Ertrag wegen geringer Bestäubung aufgrund des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügenden Raums für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth) die Anwendung dieser regulierten Umgebungen zum Testen von Ertragsunterschieden begrenzen. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile zu liefern.
  • Eine andere wichtige Eigenschaft ist jene einer verbesserten abiotischen Stresstoleranz. Abiotischer Stress ist eine primäre Ursache des weltweiten Ernteverlusts und verringert durchschnittliche Erträge für die meisten Hauptnutzpflanzen um mehr als 50% (Wang et al. (2003) Planta 218: 1–14). Abiotischer Stress könnte durch Dürre, Salzgehalt, extreme Temperatur, chemische Toxizität, Überschuss oder Mangel an Nährstoffen (Makroelemente und/oder Mikroelemente), Strahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Toleranz einer Pflanze gegenüber abiotischem Stress zu erhöhen, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für Landwirte, und würde die Kultivierung von Nutzpflanzen bei ungünstigen Bedingungen und in Gebieten ermöglichen, wo eine Kultivierung von Nutzpflanzen sonst unmöglich wäre.
  • Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
  • Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen. bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen wie Futtermittel- oder Holzproduktion oder Biotreibstoff-Ressourcen ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegt.
  • Eine Methode zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann die Modifizierung der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze sein, wie des Zellzyklus oder verschiedener Signalleitungswege, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide hat sich nun gezeigt, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-(Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9-)Polypeptid in einer Pflanze kodiert, in Pflanzen verbessert werden können.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide hat sich nun gezeigt, dass verschiedene Wachstumseigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-(Imbibition-inducible 1-)Polypeptid in einer Pflanze kodiert, in Pflanzen verbessert werden können.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide hat sich nun gezeigt, dass verschiedene Wachstumseigenschaften durch Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein PCD-artiges (Pterin-4a-carbinolamin-Dehydratase-artig) in einer Pflanze kodiert, in Pflanzen verbessert werden können.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide hat sich nun gezeigt, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze, die für ein Pseudo Response Regulator Typ 2-(PRR2-)Polypeptid kodiert, in Pflanzen erhöht wenden können. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eine oder mehrere der folgenden: erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhte Früh-Wuchskraft, frühere Blüte, erhöhte Wurzelbiomasse, erhöhte Pflanzenhöhe, erhöhter Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Anzahl gefüllter Samen, erhöhte Gesamtanzahl an Samen, erhöhte Anzahl an primären Rispen, erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispen, erhöhter Ernteindex (HI) und erhöhtes Tausendkerngewicht (Thousand Kernel Weight-TKW).
  • Hintergrund
  • 1. Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9 (bHLH9)
  • Transkriptionsfaktoren sind für gewöhnlich als Proteine definiert, die eine sequenzspezifische DNA-Bindung zeigen und imstande sind, eine Transkription zu aktivieren und/oder zu unterdrücken. Die Basis/Helix-Loop-Helix-(bHLH-)Proteine sind eine Superfamilie von Transkriptionsfaktoren, die als Dimere an spezifische DNA-Zielstellen binden und die in Nicht-Pflanzen-Eukaryonten als wichtige regulatorische Komponenten in verschiedenen biologischen Prozessen gut definiert sind. Das Unterscheidungsmerkmal der bHLH-Familie ist eine zweiteilige Domäne, die aus etwa 60 Aminosäuren besteht. Diese zweiteilige Domäne umfasst eine DNA-Bindungsbasisregion, die an eine Konsensus Hexanukleotid E-Box und zwei a-Helices, die durch eine variable Loop-Region getrennt sind, bindet. Die zwei a-Helices fördern eine Dimerisierung, wodurch die Bildung von Homo und Heterodimeren zwischen verschiedenen Familienmitgliedern möglich ist. Während die bHLH-Domäne evolutionär konserviert ist, ist die Sequenzähnlichkeit außerhalb der Domäne zwischen Mitgliedern in verschiedenen Kladen geringer.
  • Das Arabidopsis-Genom kodiert für mindestens 1533 transkriptionale Regulatoren, die ungefähr 5,9% der geschätzten Gesamtanzahl an Genen ausmachen (Riechmann et al., 2000 (Science Bd. 290, 2105–2109)). Bailey et al., 2003 (The Plant Cell, Bd. 15, 2497–2501) geben die Gesamtanzahl an nachgewiesenen bHLH-Genen in Arabidopsis thaliana mit 162 an, wodurch bHLH-Gene eine der größten Familien von Transkriptionsfaktoren in Arabidopsis werden; das Reis-Genom enthält laut Bericht 131 bHLH-Gene (Buck und Atchley, 2003 (J. Mol. EBd. 56: 742–750)). Heim et al., 2003 (Mol. Biol. EBd. 20(5): 735–747) identifizierten 12 Subfamilien von bHLH-Genen in Arabidopsis thaliana auf der Basis struktureller Ähnlichkeiten. Innerhalb jeder dieser Hauptgruppen gibt es konservierte Aminosäuresequenzmotive außerhalb der DNA-Bindungsdomäne. Es wird angenommen, dass strukturell verwandte Gene, die zu derselben Gruppe gehören, wahrscheinlich ähnliche Funktionen haben (Heim et al. 2003).
  • Tierische und pflanzliche bHLH-Proteine binden an die palindromische Hexanukleotidssequenz CANNTG (E-Box-Motiv), wobei N ein beliebiges Nukleotid und/oder das G-Box-Motiv: CACGTG darstellt. Muster von Aminosäuren wurden an drei Positionen innerhalb der Basisregion des bHLH-Motivs (die 5-9-13 Konfiguration), die die bHLH-Subgruppen (Kladen) definierten, mit einer H-E-R-Konfiguration als die Ahnensequenz gefunden. Die häufigste 5-9-13-Aminosäurekonfiguration von bHLH-Proteinen, die in die Gruppe IX (bHLH9) von Heim et al. 2003 fällt, ist R-E-R.
  • Bei Pflanzen wurde die biologische Funktion einer Anzahl von bHLH-Proteinen von verschiedenen Gruppen berichtet. Zum Beispiel spielen die Proteine von Gruppe III, Arabidopsisgen AtbHLH042 (TT8: Transparant Testa 8) und seines Homologs von Zea mays, Genverstärker I und Antohcyanin I von Petunia hybrida, PhAN1, eine Rolle in der Synthese von Vorläufern von Pflanzenpigmenten, wie Flavonoiden und Anthocyaninen (Heim et al. 2003) und drei Mitglieder von Gruppe XII wurden mit pfadregulierender pflanzlicher Hormonregulation in Zusammenhang gebracht (Friedrichsen et al. 2002, Genetics 162: 1445–1456). Andere Funktionen, die bHLH-Proteine aufweisen, enthalten Signalleitung, Globulinexpression, Fruchtdehiszenz, Fruchtblatt- und epidermale Entwicklung (guck und Atchley, 2003 J Mol EBd. 2003; 56(6): 742–50.). Bisher wurde jedoch keinem der bHLH-Proteine der Gruppe IX von Heim et al. 2003 eine biologische Funktion zugeordnet.
  • 2. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • Von der Bromodomäne, einer konservierten Domäne, die in vielen Chromatin-assoziierten Proteinen und in den meisten nuklearen Acetyltransferasen vorhanden ist, ist bekannt, dass sie als Acetyl-Lysin-Bindungsdomäne fungiert. Die Bromodomäne besteht aus vier linksgängigen Helixbündeln (aZ, aA, aB und aC), mit einer langen Loop (ZA), die die Helices Z und A verbindet, die zur kleinen Loop (BC) orientiert sind, die die Helices B und C verbindet. Diese Loops sind so organisiert, dass sie eine zugängliche hydrophobe Tasche bilden, in der die Wechselwirkung mit dem acetylierten Lysinrest erfolgt (für einen Überblicksartikel siehe Zheng und Zhou, FEBS Letters 513, 124–128, 2002; Loyola und Almouzni, Trends Cell Biol. 14, 279–281, 2004). NMR-Studien haben gezeigt, dass die Acetyl-Lysin-Bindungsstelle zwischen den ZA- und BC-Loops in dieser hydrophoben Tasche liegt. Die Bromodomäne ermöglicht somit Protein-Protein-Wechselwirkungen, die durch die Acetylierung von Lysin reguliert werden können.
  • Bei Hefe ist von Bromodomäne-Proteinen bekannt, dass sie eine Rolle in der Chromatin-Remodellierung spielen. Andere Aktivitäten, bei welchen angenommen wird, dass Bromodomäne-Proteine eine Rolle spielen, enthalten transkriptionale Aktivierung, Gedächtnis der transkriptional aktivierten chromosomalen Regionen und Anti-Silencing. Es ist jedoch wenig über die Auswirkung des Bromodomäne-Proteins auf den Phänotyp von Pflanzen bekannt: Chua et al. (Genes & Development 19, 2245–2254, 2005) berichten, dass eine Überexpression des Bromodomäne-Proteins GTE6 zu länglichen juvenilen Blättern bei Arabidopsis führt. Lightner et al. ( WO 2005/058021 ) beschrieben, dass eine Überexpression des Bromodomäne-Proteins At3g52280 zu einem erhöhten Samenölgehalt führte. IMB1 von Arabidopsis thaliana wird nachweislich während der Samenimbibition (Wasseraufnahme) induziert und es wird angenommen, dass es ABA- und Phytochrom A-vermittelte Keimungsreaktionen reguliert (Duque und Chua, Plant Journal 35, 787–799, 2003).
  • 3. PCD-ARTIG
  • Pterin-4a-carbinolamin-Dehydratasen (PCDs) wirken als ein Enzym im Zwischenmetabolismus und spielen zum Beispiel in der Synthese von Aminosäuren eine relevante Rolle. PCDs recyceln oxidierte Pterin-Kofaktoren, die durch aromatische Aminosäure-Hydroxylasen (AAHs) erzeugt werden. PCD mit einer systematischen Nomenklatur von (6R)-6-(L-Erythro-1,2-dihydroxypropyl)-5,6,7,8-tetrahydro-4a-hydroxypterin-Hydrolyase [(6R)-6-(L-Erythro-1,2-dihydroxypropyl)-7,8-dihydro-6H-pterinbildend] katalysiert die Dehydrierung von 4a-Hydroxytetrahydrobiopterinen gemäß der Reaktion: (6R)-6-(L-Erythro-1,2-dihydroxypropyl)-5,6,7,8-tetrahydro-4a-hydroxypterin = (6R)-6-(L-erythro-1,2-dihydroxypropyl)-7,8-dihydro-6H-Pterin + H2O.
  • Von PCDs ist bekannt, dass sie in einer Vielzahl von Organismen kodiert werden, einschließlich Tiere, Pflanzen und Mikroben. Pterin-4 Alpha-carbinolamin-Dehydratase ist auch als PCD-artig bekannt (Dimerisierungskofaktor von Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha, HNF-1). PCD-artig ist ein bifunktionelles Protein, das als 4a-Hydroxytetrahydrobiopterin-Dehydratase und als Koaktivator einer HNF1alpha-abhängigen Transkription fungiert (Cronk et al. Protein Sci. 1996 Okt; 5(10): 1963–72).
  • Die Pterin-4a-carbinolamin-Dehydratase-Aktivität von PCD-Proteinen von Pflanzen und verschiedenen Mikroorganismen wurde in vivo und in vitro bestimmt, so dass die Definition eines katalytischen Motivs möglich war, [EDKHQN]-x(3)-H-[HN]-[PCS]-x(5,6)-[YWFH]-x(9)-[HW]-x(8,15)-D, das als Signatur für eine PCD-Aktivität verwendet werden kann (Naponelli et al. 2008. Plant Physiol. 2008; 146(4): 1515–1527).
  • Eine phylogenomische und funktionelle Analyse von Pflanzen-PCDS legte laut Berichten fest, dass Pflanzen zwei Arten von PCDs-Proteinen haben. Typ 1 ist durch das Vorhandensein des oben definierten katalytischen Motivs gekennzeichnet, hat PCD-Aktivität und befindet sich in den Mitochondrien. Typ 2 ist für Pflanzen einzigartig, befindet sich in Plastiden und entsteht früh in der Pflanzenevolution offensichtlich aus Typ 1. Typ 2 Proteine haben eine charakteristische subterminale Domäne, die das Motiv [GE]-[DN]-[FL]-G-A-R-D-P-x(3)-E-x(4)-F-G-[DE]K enthält, und ihnen fehlt für gewöhnlich das katalytische Motiv. Laut Berichten hatte die Überexpression des Typ 2 Gens (At5g51110) in Arabidopsis thaliana keine offensichtliche phänotypische Wirkung, und seine Unterdrückung durch RNA-Interferenz führte zu einer geringen Reduktion im Blattpigmentgehalt und einer größeren Reduktion in der Chloroplastzahl pro Mesophyllzelle (Naponelli et al. 2008).
  • 4. Pseudo Response Regulator Typ 2 (PRR2)
  • Gemeinsame Signalleitungsmechanismen, im Allgemeinen als Histidin-zu-Aspartat-(His-zu-Asp-)Phosphorelaissysteme bezeichnet, sind an einer Vielzahl zellulärer Reaktionen auf Umwelt- und Entwicklungsreize vieler Prokaryoten, Pilze, Schleimpilze und Pflanzen beteiligt. Ein His-zu-Asp-Phosphorelaissystem besteht aus zwei oder mehr gemeinsamen Signalwandlern: (1) einem in der Membran liegenden Sensor, der His-Kinase-Aktivität aufweist (HK, erfasst den Ausgang); (2) einem Reaktion regulierenden (RR) Transkriptionsfaktor, der für gewöhnlich ein phospho-akzeptierendes Asp in seiner Empfängerdomäne aufweist (die den Ausgang vermittelt); und (3) und wahlweise einen His-enthaltenden Phosphotransmitter (HP) (Hwang et al. (2002) Plant Phys 129: 500–515, und Referenzen darin).
  • Die Vollendung der Arabidopsis Genomsequenz hat 54 Gene ergeben, die für putative His-Kinase (AHK), His-Phosphotransfer (AHP), Response-Regulator (ARR, Typ-A und Typ-B) und verwandte Proteine kodieren. Zu diesen verwandten Proteinen zählt ein Satz einzigartiger Gene, die für Proteine kodieren, die der ARR-Familie der Response-Regulatoren sehr ähnlich sind, sich aber klar von dieser unterscheiden. Insbesondere fehlt ihnen die Phospho-akzeptierende Aspartatstelle, die in der Empfängerdomäne der klassischen Response-Regulatoren unveränderlich konserviert ist (Makino et al. (2000) Plant Cell Physiol 41: 791–803). Die drei unveränderlichen Aminosäurereste (D-D-K) in typischen Bakterien, Hefe und Pflanzen RRsis sind nicht konserviert: das Phosphatakzeptierende Asp (D) der empfängerartigen Domäne ist durch Glu (E), Asn (N) oder Gln (Q) ersetzt. Trotz signifikanter Sequenzdivergenz haben jedoch viele APRRs andere Asp-Reste in den konservierten Motiven und könnten noch immer als die letztendlichen Ausgänge eines Zweikomponenten-Phosphorelais in Pflanzen wirken. Daher werden diese neuartigen Proteine gemeinsam als 'Arabidopsis-Pseudo-Response-Regulatoren (APRRs, APRR1 bis APRR9)' und Pseudo-Response-Regulatoren (PRR) in anderen Pflanzen bezeichnet.
  • Die APRR-Polypeptide sind des Weiteren insbesondere auf der Basis ihrer unverkennbaren C-terminalen Domäne in zwei Subgruppen klassifiziert: eine ist durch APRR1 dargestellt und die andere durch APRR2. Mitglieder der APRR1-Familie von Pseudo-Response-Regulatoren enthalten eine charakteristische Signaturdomäne, die als C-Motiv bezeichnet wird, und begründen auch CONSTANS-Transkriptionsfaktor-Polypeptide. Das C-Motiv (oder CCT-Motiv) ist reich an basischen Aminosäuren (Arg und Lys) und enthält ein putatives nukleares Lokalisierungssignal. Im Gegensatz dazu haben Mitglieder, die zu der APRR2-Familie gehören, eine andere Signaturdomäne, die als das B-Motiv bezeichnet wird, das der Typ-B-Familie klassischer Response-Regulatoren gemein ist (Imamura et al. (1999) Plant Cell Physiol 40: 733–742; repräsentativ für die pflanzlichen einzelnen Myb-verwandten Domäne, die zu der GARP-Subfamilie gehören). Dieses B-Typ-Motiv findet sich des Weiteren in Golden2-artigen-(GLK2-)Transkriptionsfaktor-Polypeptiden und an der photosynthetischen Entwicklung und Plastidbiogenese beteiligt.
  • APRR1 ist mit TOC1 identisch (Strayer et al. (2000) Science 289: 768–771) und ist nachweislich an der Phytochrom-vermittelten, pflanzlichen, tagesperiodischen Regulierung beteiligt. APRR2 (auch als TOC2 bezeichnet), das zwar zu dieser Familie gehört, die an der tagesperiodischen Rhythmusregulierung beteiligt ist, wird selbst nicht durch Licht reguliert und seine Funktion wurde in höheren Pflanzen noch nicht näher charakterisiert.
  • In US Patent US 7,193,129 ”Stress-related polynucleotides and polypeptides in plants” sind Nukleinsäuresequenzen beschrieben, die für PRR2-Polypeptide (SEQ ID NO: 25) und Konstrukte, die diese umfassen, kodieren. Es werden transgene Pflanzen gezeigt, die ein PRR2-Polypeptid mit erhöhter Toleranz gegenüber Stickstoffbeschränkungsbedingungen im Vergleich zu einer Wildtyp Pflanze derselben Art überexprimieren.
  • Kurze Darstellung der Erfindung
  • 1. Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9 (bHLH9)
  • Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Ertrag relativ zu Kontrollpflanzen, ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften einer Pflanze relativ zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • 2. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • Überraschenderweise hat sich nun gezeigt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Ertrag relativ zu Kontrollpflanzen, ergibt, unter der Voraussetzung, dass ein erhöhter Ertrag den erhöhten Ölgehalt einer Pflanze nicht beeinträchtigt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung ertragsbezogener Eigenschaften einer Pflanze relativ zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • 3. PCD-ARTIG
  • Überraschenderweise hat sich nun gezeigt, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein PCD-artiges Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften einer Pflanze relativ zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein PCD-artiges Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • 4. Pseudo Response Regulator Typ 2 (PRR2)
  • Überraschenderweise hat sich nun gezeigt, dass die Erhöhung der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid wie hierin definiert kodiert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid wie hierin definiert kodiert, in einer Pflanze. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eine oder mehrere der folgenden: erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhte Früh-Wuchskraft, frühere Blüte, erhöhte Wurzelbiomasse, erhöhte Pflanzenhöhe, erhöhter Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Anzahl gefüllter Samen, erhöhte Gesamtanzahl an Samen, erhöhte Anzahl an primären Rispen, erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispen, erhöhter Ernteindex (HI), und erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW).
  • Definitionen
  • Polypeptid(e)/Protein(e)
  • Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
  • Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
  • Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
  • Kontrollpflanze(n)
  • Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
  • Homolog(e)
  • ”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
  • Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren aus einem Protein.
  • Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Beispiele für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder Peptide enthalten die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines transkriptionalen Aktivators, wie in dem Hefe-Zweihybrid-System verwendet, Phage Hüllenproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolat-Reduktase, Tag-100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-Bindungspeptid), HA-Epitop, Protein C-Epitop und VSV-Epitop.
  • Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von a-helikalen Strukturen oder ß-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Einschränkungen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen.
  • Tabellen über konservative Substitution sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman und Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen
    Rest Konservative Substitutionen Rest Konservative Substitutionen
    Ala Ser Leu Ile; Val
    Arg Lys Lys Arg; Gln
    Asn Gln; His Met Leu; Ile
    Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
    Gln Asn Ser Thr; Gly
    Cys Ser Thr Ser; Val
    Glu Asp Trp Tyr
    Gly Pro Tyr Trp; Phe
    His Asn; Gln Val Ile; Leu
    Ile Leu, Val
  • Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von nach dem Stand der Technik allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
  • Derivate
  • ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie des Proteins von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um ihren Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
  • Ortholog(e)/Paralog(e)
  • Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet.
  • Domäne
  • Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges fragliches Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
  • Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
  • Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, können aber ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne hegen).
  • Hybridisierung
  • Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wobei eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithographie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
  • Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenz-Bedingungen so gewählt dass sie etwa 30°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittelstringenz-Bedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unter Tm liegt und Hochstringenz-Bedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unter Tm liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch für ein im Wesentlichen identisches Polypeptid kodieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
  • Der Tm ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Der Tm hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und der Länge der Sonde ab. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird von etwa 16°C bis 32°C unter Tm erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäure-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid ermöglicht, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplices. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt der Tm um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Der Tm kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:
    • 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6xlog10[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] – 500x[Lc]–1 – 0,61x% Formamid
    • 2) DNA-RNA oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5(log10[Na+]a) + 0,58(%G/Cb) + 11,8(%G/Cb)2 – 820/Lc
    • 3) oligo-DNA- oder oligo-RNAd-Hybride: Für < 20 Nukleotide: Tm = 2(In) Für 20–35 Nukleotide: Tm = 22 + 1,46(In) a oder für ein anderes monovalentes Kation, aber nur exakt im 0,01–0,4 M Bereich. b nur exakt für %GC im 30% bis 75% Bereich. c L = Länge des Duplex in Basenpaaren. d oligo, oligoNukleotid; In, = effektive Länge des Primers = 2 × (Anzahl G/C) + (Anzahl A/T).
  • Die nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit RNAse. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%) durchgeführt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nicht-spezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genampliflkations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1×SSC oder bei 42°C in 1×SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3×SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4×SSC oder bei 40°C in 6×SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2×SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen bestimmt werden. 1×SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5x Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
  • Zur Definition des Stringenzniveaus kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
  • Spleiß-Variante
  • Der Begriff ”Spleiß-Variante”, wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins erreicht werden. Derartige Spleiß-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Spleiß-Varianten sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
  • Allelische Variante
  • Allele oder allelische Varianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 Bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
  • Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche für Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität kodieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
  • Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
  • Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptioneile regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließlich der TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”stromaufwärts aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezfischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorsche Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende -10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
  • Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines kodierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise von Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), Insertion(en) und/oder Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und beim erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
  • Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, getestet werden, wobei nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripte pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer kodierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer kodierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
  • Funktionsfähig verbunden
  • Der Begriff funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
  • Konstitutiver Promotor
  • Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele von konstitutiven Promotoren
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    Kleine Rubisco-Untereinheit US 4.962.028
    OCS Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
    SAD1 Jain et al., Crop Science, 39(6), 1999: 1696
    SAD2 Jain et al., Crop Science, 39(6), 1999: 1696
    nos Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
    V-ATPase WO 01/14572
    Super-Promotor WO 95/14098
    G-Box-Proteine WO 94/12015
  • Ubiquitärer Promotor
  • Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
  • Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
  • Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
  • Induzierbarer Promotor
  • Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
  • Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
  • Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen möglich ist. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.
  • Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren sind in der folgenden Tabelle 2b angeführt: Tabelle 2b: Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren
    Genquelle Literatur-Bezugsstelle
    RCc3 Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48
    Arabidopsis PHT1 Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
    Medicago-Phosphat-Transporter Xiao et al., 2006
    Arabidopsis Pyk10 Nitz et al. (2001) Plant Sci 161(2): 337–346
    Wurzelexprimierbare Gene Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
    Tabakauxin-induzierbares Gen Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
    β-Tubulin Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988.
    Tabakwurzelspezifische Gene Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
    B. napus G1-3b-Gen US-Patent Nr. 5 401 836
    SbPRP1 Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993.
    LRX1 Baumberger et al. 2001, Genes & Dev. 15: 1128
    BTG-26 Brassica napus US 20050044585
    LeAMT1 (Tomate) Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
    LeNRT1-1 (Tomate) Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
    Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel) Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991.
    KDC1 (Daucus carota) Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
    TobRB7-Gen W. Song (1997) Doktorarbeit, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
    OsRAB5a (Reis) Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
    ALF5 (Arabidopsis) Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
    NRT2; 1Np (N. plumbaginifolia) Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)
  • Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, wobei diese Offenbarung in ihrer Gesamtheit hierin zum Zwecke der Bezugnahme zitiert wird. Tabelle 2c: Beispiele von samenspezifischen Promotoren
    Genquelle Literatur-Bezugsstelle
    Samenspezifische Gene Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
    Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
    Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
    Paranuss-Albumin Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
    Legumin Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
    Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
    Zein Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
    napA Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
    Weizen LMW- und HMW- Glutenin-1 Mol. Gen. Genet. 216: 81-90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
    Weizen SPA Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
    Weizen, α, β, γ-Gliadine EMBO J. 3: 1409–15, 1984
    Gerste Itr1-Promotor Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5): 592–8
    Gerste B1, C, D, Hordein Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
    Gerste DOF Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
    blz2 EP99106056.7
    Synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
    Reis Prolamin NRP33 Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
    Reis a-Globulin Glb-1 Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
    Reis-OSH1 Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    Reis a-Globulin REB/OHP-1 Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
    Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Trans. Res. 6: 157–68, 1997
    Mais ESR-Genfamilie Plant J. 12: 235–46, 1997
    Sorghum a-Kafirin DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    Reis-Oleosin Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
    Sonnenblumen-Oleosin Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
    PRO0117, putatives Reis 40S ribosomales Protein WO 2004/070039
    PRO0136, Reis Alanin-Aminotransferase unveröffentlicht
    PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste) unveröffentlicht
    PRO0151, Reis WSI18 WO 2004/070039
    PRO0175, Reis RAB21 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    a-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin β-artiges Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Gerste-Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Seliner et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
    Tabelle 2d: Beispiele von endospermspezifischen Promotoren
    Genquelle Literatur-Bezugsstelle
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al. (1986) Mol Gen Genet 208: 15–22; Akaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221: 43–47
    Zein Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
    Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1 Colot et al. (1989) Mol Gen Genet 216: 81–90, Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
    Weizen SPA Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
    Weizen Gliadine Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
    Gerste Itr1-Promotor Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5): 592–8
    Gerste B1, C, D, Hordein Cho et al. (1999) Theor Appl Genet 98: 1253–62; Muller et al. (1993) Plant J 4: 343–55; Sorenson et al. (1996) Mol Gen Genet 250: 750–60
    Gerste DOF Mena et al, (1998) Plant J. 116(1): 53–62
    blz2 Onate et al. (1999) J Biol Chem 274(14): 9175–82
    Synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J 13: 629–640
    Reis Prolamin NRP33 Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
    Reis Globulin Glb-1 Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885–889
    Reis Globulin REB/OHP-1 Nakase et al. (1997) Plant Molec Biol 33: 513–522
    Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Russell et al. (1997) Trans Res 6: 157–68
    Mais ESR-Genfamilie Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J 12: 235–46
    Sorghum Kafirin DeRose et al.1996 Plant Mol Biol 32: 1029–35
    Tabelle 2e: Beispiele von embriospezifichen Promotoren:
    Genquelle Literatur-Bezugsstelle
    Reis-OSH1 Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    PRO0151 WO 2004/070039
    PRO0175 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    Tabelle 2f: Beispiele von aleuronspezifischen Promotoren:
    Genquelle Literatur-Bezugsstelle
    a-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin β-artiges Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Gerste-Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
  • Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen möglich ist.
  • Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren
    Gen Expression Literatur-Bezugsstelle
    Mais, Orthophosphat-Dikinase blattspezifisch Fukavama et al., 2001
    Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase blattspezifisch Kausch et al., 2001
    Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase blattspezifisch Liu et al., 2003
    Reis, kleine Rubisco-Untereinheit blattspezifisch Nomura et al., 2000
    Reis, beta-Expansin EXBP9 sprossspezifisch WO 2004/070039
    Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit blattspezifisch Panguluri et al., 2005
    Erbse RBCS3A blattspezifisch
  • Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen möglich ist. Beispiele von für grünes Meristem spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren
    Genquelle Expressionsmuster Literatur-Bezugsstelle
    Reis-OSH1 Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Setzlingsstadium Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
    Reis-Metallothionein meristemspezifisch BAD87835.1
    WAK1 & WAK2 Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme und in expandierenden Blättern und Kelchblättern Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318
  • Terminator
  • Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abgeleitet sein.
  • Modulierung
  • Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer 5 strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder kodierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachstum der Pflanzen führt.
  • Expression
  • Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem genetischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
  • Erhöhte Expression/Überexpression
  • Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind nach dem Stand der Technik gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse kodiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
  • Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer kodierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryontischen Gen abgeleitet sein.
  • Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die kodierende Sequenz der partiellen kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht nachweislich die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit am größten. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind nach dem Stand der Technik bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N. Y. (1994).
  • Endogenes Gen
  • Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder) eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
  • Verringerte Expression
  • Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, mit zunehmender Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen. Verfahren für die Verringerung der Expression sind nach dem Stand der Technik bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
  • Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen, kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Protein von Interesse kodiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Kodieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, mit zunehmender Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid kodiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen hierin erörterten Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
  • Beispiele von verschiedenen Verfahren zur Verringerung oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze, oder zur Verminderung der Spiegel und/oder Aktivität eines Proteins, sind dem Fachmann bekannt. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
  • Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder substantielle Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren eines genetischen Konstrukts in einer Pflanze, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Kodieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-kodierende DNA), einkloniert ist.
  • In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines ”Inverted Repeat” einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Kodieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist, reduziert oder im Wesentlichen eliminiert. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-kodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker etc.) liegt zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden. Nach der Transkription des ”Inverted Repeat” wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Weitere Einzelheiten finden sich zum Beispiel in Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
  • Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, in einer Pflanze, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
  • Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Abwärtsregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterverarbeitet, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkritpten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
  • Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Kodieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
  • Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stumm gemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”kodierenden Region” und/oder in der ”nicht-kodierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”kodierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-kodierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die kodierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
  • Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Kodieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid kodiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide oder unterschiedlich modifizierter Nukleotide chemisch synthetisiert werden, die zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physischen Stabilität des Duplex, der zwischen den Antisense und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildet wird, bestimmt sind, z. B. können Phosphorothioatderivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt.
  • Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukieotid und einen Terminator umfasst.
  • Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an für ein Polypeptid kodierende genomische DNA und/oder mRNA-Transkripte, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z. B. durch inhibieren einer Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz mit Peptiden oder Antikörpern, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren Zellen zugeführt werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplentärer RNA, wobei, im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander laufen (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215, 327–330) umfassen.
  • Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung einer endogenen Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid kodierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., US-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., US-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist nach dem Stand der Technik bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
  • Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
  • Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem/einer isolierten Gen/Nukleinsäure, welches) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzungen) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zur Bindung an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
  • Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenken von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
  • Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum inhibieren dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
  • Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten für Polypeptide mit verringerter Aktivität kodieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung einer homologen Rekombination angewandt werden.
  • Künstliche und/oder natürliche MikroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MikroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-kodierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Bindung an dessen Hauptkomponente, ein Argonautenprotein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Rasenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
  • Künstliche MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
  • Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welche sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
  • Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
  • Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
  • Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einer Zelle, in der es exprimiert wird, einen Phänotyp verleiht, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz verleihen, welche eine neue metabolische. Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Beispiele für selektierbare Markergene enthalten Gene, die eine Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die zum Beispiel Resistenz gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta® verleiht; aroA oder gox, das Resistenz gegen Glyphosat verleiht, oder die Gene, die zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylurea verleihen) verleihen, oder Gene, die eine metabolische Eigenschaften bereitstellen (wie manA, das Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xyloseisomerase für die Nutzung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (grün fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Marker. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Marker vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
  • Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise durch Deletion mittels herkömmlicher Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die für einen selektierbaren Marker kodieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide kodiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind nach dem Stand der Technik bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
  • Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter das (die) Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst beide Vektoren (bis zu 40% oder mehr der Transformanten). Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf so genannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/lox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den loxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den loxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
  • Transgen/transgen/rekombinant
  • Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”Transgen”, ”transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine kodieren, oder
    • (b) genetische Steuerungssequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
    • (c) a) und b),
    nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung lokalisiert sind oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es möglich ist, dass die Modifikation zum Beispiel die Form einer Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten annimmt. Es versteht sich, dass mit der natürlichen genetischen Umgebung der natürliche genomische oder chromosomale Locus bzw. Genort in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek gemeint ist. Im Falle einer genomischen Bibliothek wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 Bp, vorzugsweise mindestens 500 Bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 Bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 Bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, welche ein in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches Polypeptid kodiert, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch nicht-natürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel mutagene Behandlung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5 565 350 oder WO 00/15815 beschrieben.
  • Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für den Zweck der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
  • Transformation
  • Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutzutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Verfahren können aus dem Kalzium/Polyethylenglykolverfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen ausgewählt werden. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation erzeugt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken zu lassen oder das Pflanzenmeristern mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen, eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für eine Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis enthalten allgemein bekannte Verfahren zur Reistransformation, wie jene, die in einem der folgenden beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271–282, 1994), deren Offenbarungen hiermit in ihrer Gesamtheit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert werden. Im Falle einer Maistransformation, ist das bevorzugte Verfahren wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hiermit in ihrer Gesamtheit zum Zwecke der Bezugnahme zitiert werden. Die Verfahren sind beispielsweise ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143, sowie in Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, die zu exprimieren sind, werden bzw. wird vorzugsweise in einen Vektor geklont, der zur Transformation von Agrobacterum tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die durch einen solchen Vektor transformiert sind, können dann in bekannter Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird im Umfang der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze angesehen), oder Nutzpflanzen wie beispielsweise Tabakpflanzen, zum Beispiel durch Eintauchen zerstampfter Blätter oder geschnittener Blätter in eine agrobakterielle Lösung und anschließendes Kultivieren in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mit Hilfe von Agrobacterum tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
  • Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt und Samen werden von den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von welchen ein gewisse Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen Genet. 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle einer Vakuuminfiltration von Arabidopsis, werden intakte Pflanzen unter vermindertem Druck mit einer agrobakteriellen Suspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”Floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research und plant biotechnology". J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312(3): 425–38 oder Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet das Einfügen von T-DNA, die für gewöhnlich einen Promotor enthält (kann auch ein Translations-Enhancer oder ein Intron sein), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromauf- oder stromabwärts der kodierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens lenkt. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor gestört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird regellos in das Pflanzengenom eingefügt, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zu der modifizierten Expression von Genen nahe der eingefügten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
  • TILLING
  • Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods an Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu ermöglichen; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; im Überblick zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
  • Homologe Rekombination
  • Homologe Rekombination ermöglicht die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die routinemäßig in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, verwendet wird. Verfahren zur Durchführung einer homologen Rekombination in Pflanzen wurden nicht nur für Modellpflanzen beschrieben (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077–84), sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr. Opis. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
  • Ertrag
  • Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließend sowohl geernteter als auch geschätzter Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
  • Früh-Wuchskraft
  • ”Früh-Wuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieressourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Früh-Wuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besserem und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Früh-Wuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
  • Erhöhen/Verbessern/Steigern
  • Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
  • Samenertrag
  • Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der Folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; und f) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), und g) erhöhte Anzahl an Hauptrispen, was aus der gezählten Zahl gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
  • Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Ein erhöhter Samenertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur eintreten.
  • Grünheits-Index
  • Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Kodieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
  • Pflanze
  • Der Begriff wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
  • Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, enthalten alle Pflanzen, die zu der Superfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Rübsamen, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp.; Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., unter anderen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Überraschenderweise hat sich nun gezeigt, dass das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Ferner wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform steht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Ferner wurde nun überraschenderweise festegestellt, dass das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein PCD-artiges Polypeptid kodiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein PCD-artiges Polypeptid kodiert, in einer Pflanze und gegebenenfalls das Selektieren auf Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
  • Ferner wurde nun überraschenderweise festegestellt, dass das Erhöhen der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid wie hierin definiert kodiert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Die Erfindung stellt auch bisher unbekannte Nukleinsäuresequenzen bereit, die für PRR2-Polypeptide und PRR2-Polypeptide kodieren.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das ausgewählt ist aus:
    • (i) einer Nukleinsäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 459;
    • (ii) dem Komplement einer Nukleinsäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 459;
    • (iii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, mit, in zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zu der Polypeptidsequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 460.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, ausgewählt aus:
    • (i) einer Polypeptidsequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 460;
    • (ii) einer Polypeptidsequenz die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zu einer Polypeptidsequenz, dargestellt durch SEQ ID NO 460, aufweist;
    • (iii) Derivate einer der oben unter (i) oder (ii) angeführten Polypeptidsequenzen.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide beinhaltet ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide beinhaltet ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide beinhaltet ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein PCD-artiges Polypeptid kodiert, das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein PCD-artiges Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide beinhaltet ein bevorzugtes Verfahren zum Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide soll jede Bezugnahme in der Folge auf ein ”Protein, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist” ein bHLH9-Polypeptid wie hierin definiert bezeichnen. Jede Bezugnahme in der Folge auf eine ”Nukleinsäure, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist” soll eine Nukleinsäure bezeichnen, die imstande ist, für ein solches bHLH9-Polypeptid zu kodieren. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingebracht wird (und daher zur Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist) ist jede Nukleinsäure, die für den Typ von Protein kodiert, der nun beschrieben wird, in der Folge auch als ”bHLH9-Nukleinsäure” oder ”bHLH9-Gen” bezeichnet.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide soll jede Bezugnahme in der Folge auf ein ”Protein, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist” ein IMB1-Polypeptid wie hierin definiert bezeichnen. Jede Bezugnahme in der Folge auf eine ”Nukleinsäure, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist” soll eine Nukleinsäure bezeichnen, die imstande ist, für ein solches IMB1-Polypeptid zu kodieren. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingebracht wird (und daher zur Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist) ist jede Nukleinsäure, die für den Typ von Protein kodiert, der nun beschrieben wird, in der Folge auch als ”IMB1-Nukleinsäure” oder ”IMB1-Gen” bezeichnet.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide soll jede Bezugnahme in der Folge auf ein ”Protein, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist” ein PCD-artiges Polypeptid wie hierin definiert bezeichnen Jede Bezugnahme in der folge auf eine ”Nukleinsäure, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist” soll eine Nukleinsäure bezeichnen, die imstande ist, für ein solches PCD-artiges Polypeptid zu kodieren. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingebracht wird (und daher zur Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist) ist jede Nukleinsäure, die für den Typ von Protein kodiert, der nun beschrieben wird, in der Folge auch als ”PCD-Nukleinsäure” oder ”PCD-Gen” bezeichnet.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide soll jede Bezugnahme in der Folge auf ein ”Protein, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist” ein PRR2-Polypeptid wie hierin definiert bezeichnen. Jede Bezugnahme in der Folge auf eine ”Nukleinsäure, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist” soll eine Nukleinsäure bezeichnen, die imstande ist, für ein solches PRR2-Polypeptid zu kodieren. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingebracht wird (und daher zur Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist) ist jede Nukleinsäure, die für den Typ von Protein kodiert, der nun beschrieben wird, in der Folge auch als ”PRR2-Nukleinsäuresequenz” oder ”PRR2-Gen” bezeichnet.
  • Ein ”bHLH9-artiges Polypeptid”, wie hierin definiert, bezeichnet jedes Polypeptid, das eine HLH-Domäne umfasst ((HMM)PFam PF00010, ProfileScan PS50888, SMART SM00353) wodurch eine Basis Helix-Loop-Helix Domäne gebildet wird (Interpro IPR001092), wobei die HLH-Domäne, mit zunehmender Präferenz, mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität mit einer von SEQ ID NO: 181 bis SEQ ID NO: 268 aufweist.
  • Vorzugsweise umfasst das bHLH9-Polypeptid ein Motiv mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität mit einem, vorzugsweise beiden, Motiv(en):
    Motiv 1 (SEQ ID NO: 269): VPCKIRAKRGXXXXXXXXCATHPRSIAERVRRTRISERMRKLQELVPNMDKQTNXTADM,
    wobei X unabhängig eine beliebige (natürlich vorkommende) Aminosäure oder eine Lücke (das heißt, X ist gegebenenfalls vorhanden) darstellt;
    und Motiv 2 (SEQ ID NO: 269): LDLAVEYIKXLQKQVQXXXLXEXRXK CTCXX,
    wobei X unabhängig eine beliebige (natürlich vorkommende) Aminosäure oder eine Lücke (das heißt, X ist gegebenenfalls vorhanden) darstellt.
  • bHLH-Transkriptionsfaktor-Polypeptide haben konservierte Muster von Aminosäuren, die an drei Positionen innerhalb der Basisregion des bHLH-Motivs zu finden sind (die 5-9-13-Konfiguration) (Heim at al. 2003). Ein bHLH9-Polypeptid, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, hat vorzugsweise eine 5-9-13-Konfguration, dargestellt durch R-E-R.
  • Alternativ ist ein bHLH9-Polypeptid, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ein beliebiges Polypeptid, das in die Gruppe IX Taut Definition von Heim et al. 2003 fällt.
  • Vorzugsweise hat das Homolog eines bHLH9 Proteins, mit zunehmender Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität mit der Aminosäure eines beliebigen der Polypeptide von Tabelle A1, vorzugsweise mit SEQ ID NO: 2. Zusätzlich umfasst das Homolog eines bHLH9 Proteins eine HLH-Domäne wie oben beschrieben. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie des Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden) ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
  • Alternativ hat ein bHLH9-Polypeptid, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem der in 2 dargestellt ist, Cluster eher mit der Klade (Gruppe) bildet, die durch A.thaliana bHLH130 9 AT2G42280; A.thaliana bHLH122 9 AT1G51140; A.thaliana bHLH081 9 AT4G09180; A.thaliana bHLH080 9 AT1 G35460; A.thaliana bHLH128 9 AT1G05805; und A.thaliana bHLH129 9 AT2G43140 definiert ist, umfassend die Aminosäuresequenz von Arabidopsis thaliana bHLH9-Polypeptiden, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Ein ”IMB1-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein transkriptionales Aktivatorprotein der BET-Familie (Bromodomäne und ET-Domäne), einer der drei Bromodomäne-Proteinfamilien (Loyola und Almouzni, 2004). Ein IMB1-Polypeptid umfasst eine einzige Bromodomäne (Pfam PF00439), gefolgt von einer NET-Domäne (Duque und Chua, 2003). Die NET-Domäne ist ein Teil einer größeren ET-Domäne, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt ist und die aus drei separaten Regionen besteht: der NET-Domäne (für N-terminales ET), einer Zwischensequenz und dem C-terminalen SEED-Motiv. Nur die NET-Domäne ist in allen BET-Proteinen konserviert (Florence und Faller, Frontiers in BioScience 6, d1008–1018, 2001). Die Sequenz der NET-Domäne legt nahe, dass sie zweiteilig ist d. h., zwei konservierte Motive, getrennt durch einen Abstandhalter variabler Länge. Der N-terminale Abschnitt bildet laut Vorhersage zwei Alpha-Helices und die C-terminale Region ein verlängertes Beta-Blatt, gefolgt von einer Alpha-Helix. Der Abstandhalter trennt diese zwei Regionen und bildet wahrscheinlich eine Loop. Die Konservierung der NET-Domäne und Bromodomäne(n) legt nahe, dass alle BET-Proteine eine gewisse Funktion oder Funktionen gemein haben und somit mindestens teilweise innerhalb individueller Spezies redundant sind (Florence und Faller, 2001). Das IMB1-Polypeptid umfasst des Weiteren ein nukleares Targetingsignal.
  • Zusätzlich umfasst das IMB1-Polypeptid ein oder mehrere der folgenden Motive:
    Motiv 3 (Teil der Bromodomäne, SEQ ID NO: 304)
    A(W/Q/E/H/G)PF(L/M)(D/Q/K/E/H)PV(D/N)V(E/V/K)(G/T)L(G/Q/H/C/R)(L/I)(Y/D/P/H/R)DY(Y/H/F/N/)(Q/K/N/E/D)(I/V)(I/V)(E/T/D/Q)(K/Q/R)PMD(F/L)(S/G/R)TI
    Motiv 4 (SEQ ID NO: 305)
    D(V/M)RL(I/V)FXNAM(K/R/N/T)YN
    wobei X in Position 7 jede beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine von K, T, A, E, S, Q oder N;
    Motiv 5 (SEQ ID NO: 306)
    M(A/S)(K/E/R)(T/F/S/K)L(L/M/S)(E/D/G/A)(K/R)FE(G/E/D)(C/K)
    Motiv 6 (SEQ ID NO: 307)
    TL(F/W)(R/K)L
  • Vorzugsweise umfasst das IMB1-Polypeptid auch ein oder mehrere der folgenden Motive:
    Motiv 7 (SEQ ID NO: 308)
    EAKDG
    Motiv 8 (SEQ ID NO: 309)
    (Q/H/K)LEEL
    Motiv 9 (SEQ ID NO: 310)
    LSNEL
    Motiv 10 (SEQ ID NO: 311)
    KAL(E/L)(I/L/M)V
    Motiv 11 (SEQ ID NO: 312)
    VIQII
  • Alternativ hat das Homolog eines IMB1 Proteins, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität mit der Aminosäure dargestellt durch SEQ ID NO: 301, vorausgesetzt, dass das homologe Protein die Bromodomäne, die NET-Domäne und konservierte Motive, wie oben angeführt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie des Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
  • Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem der in 6 dargestellt ist, Cluster mit der Gruppe von Polypeptiden der IMB1/GTE1 Klasse, die die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 301 dargestellt ist, umfasst, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Ein ”PCD-artiges Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf jedes beliebige Polypeptid, umfassend eine Pterin-4-alpha-carbinolamin-Dehydratase-(PCD-)Domäne (Interpro Zugangsnummer: IPR001533; pfam Zugangsnummer: PF01329), wobei die PCD-Domäne vorzugsweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 83 aufweist, die die PCD-Domäne darstellt, wie in SEQ ID NO: 359 vorhanden. Ein ”PCD-artiges Polypeptid” hat gegebenenfalls Pterin-4-alpha-carbinolamin-Dehydratase-Aktivität (EC:4.2.1.96).
  • Vorzugsweise umfasst das PCD-artige Polypeptid ein oder mehr Motive mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität mit einem oder mehreren der folgenden Motive:
    • (i) Motiv 12 (SEQ ID NO: 441): [G/E]-[D/N]-[F/L]-G-A-R-D-P-x(3)-E-x(4)-F-G-[D/E]K;
    • (ii) Motiv 13 (SEQ ID NO: 442): [E/D/K/H/Q/N]-x(3)-H-[H/N]-[P/C/S]-x(5,6)-[Y/W/F/H]-x(9)-[H/W]-x(8,15)-D;
    • (iii) Motiv 14 (SEQ ID NO: 443): WK(V/L)(R/K), wobei Aminosäuren in Klammem alternative Aminosäuren an derselben Stelle darstellen;
    • (iv) Motiv 15 (SEQ ID NO: 444): TDFI;
    • (v) Motiv 16 (SEQ ID NO: 445): (S/V)(V/I)(G/R/S/A)GL(T/S);
    • (vi) Motiv 17 (SEQ ID NO: 446): LGDF(G/R)(A/R)(R/A)(D/G)P;
    • (vii) Motiv 18 (SEQ ID NO: 447): H(R/K)ILIP(T/A)
    wobei Aminosäuren in Klammem alternative Aminosäuren an dieser Position darstellen, wobei die Zahl in Klammern die Anzahl an X Aminosäuren an einer bestimmten Stelle darstellt, und wobei X gegebenenfalls vorhanden sein kann und, wenn vorhanden, unabhängig eine beliebige Aminosäure darstellt. Die Zahlen zwischen Klammem, getrennt durch Komma stellen eine alternative Anzahl an X Aminosäuren an dieser Stelle dar.
  • Vorzugsweise ist das Homolog eines PCD-artigen Polypeptids, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ein Homolog oder ein Ortholog zu einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A3, wobei das Homolog oder Ortholog, mit zunehmender Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Gesamtsequenzidentität mit der Aminosäure eines beliebigen der Polypeptide von Tabelle A3 aufweisen, vorzugsweise mit SEQ ID NO: 359. Zusätzlich umfasst das Homolog eines PCD-artigen Proteins eine PCD-Domäne wie oben beschrieben. Die Sequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie des Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden) ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
  • Alternativ hat ein PCD-Polypeptid, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem der in 3B von Naponelli et al. 2008 dargestellt ist (hierin in 9 wiedergegeben), Cluster innerhalb der Klade bildet, die durch die PCD-Polypeptide definiert ist, die von Organismen des Viridiplantae-Reichs (Grünpflanzen) stammen, d. h. mit Arabidopsis-1; Arabidopsis-2; Pinus-1; Pinus-2; Physcomitrella-1; Physcomitrella-2, Zea-1 und Zea-2, anstatt mit einer anderen Gruppe.
  • Ein ”PRR2-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf jedes Polypeptid, das (i) eine Signaltransduktion-Response Regulator-Empfängerregion mit einem InterPro Entry IPR001789; und (ii) eine Myb-artige DNA-Bindungsregion (SHAQKYF-Klasse) mit einem InterPro Entry IPR006447 umfasst.
  • Alternativ oder zusätzlich bezieht sich PRR2-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf jedes beliebige Polypeptid, das (i) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Pseudo Response Receiver-Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 475 aufweist; und (ii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Myb-artigen DNA Bindungsdomäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 476, aufweist.
  • Zusätzlich umfasst ein ”PRR2-Polypeptid”, wie hierin definiert, des Weiteren, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zu einer C-terminalen konservierten Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 477.
  • Alternativ oder zusätzlich bezieht sich ein ”PRR2-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf jede beliebige Polypeptidsequenz, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einem Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO: 452, aufweist.
  • Alternativ oder zusätzlich bezieht sich ein ”PRR2-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf jede beliebige Polypeptidsequenz, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer beliebigen der hierin in Tabelle A4 angeführten Polypeptidsequenzen aufweist.
  • Alternativ oder zusätzlich bezieht sich ein ”PRR2-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf eine beliebige Polypeptidsequenz, die, wenn sie in der Konstruktion eines Response Receiver-Domäne phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem der in 11 dargestellt ist, Cluster mit der APRR2-(Pseudo Response Regulator Typ 2-)Gruppe von Polypeptiden bildet, die die Polypeptidsequenzen umfassen, die durch SEQ ID NO: 452 und SEQ ID NO: 456 dargestellt sind, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Für die Identifizierung von Domänen gibt es Spezialistendatenbanken, zum Beispiel, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searis D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Ein Satz von Werkzeugen zur in silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASy Proteomics-Server erhältlich (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge und analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide ist ein Alignment der Polypeptide von Tabelle A4 hierin in 13 dargestellt. Solche Alignments sind zur Identifizierung der meisten konservierten Domänen oder Motive zwischen den PRR2-Polypeptiden, wie hierin definiert, nützlich. Zwei solche Domäne sind (i) eine Signaltransduktion-Rresponse Regulator Receiver-Region mit einem InterPro Entry IPR001789 (durch X in 13 gekennzeichnet); und (ii) eine Myb-artige DNA-Bindungsregion (SHAQKYF-Klasse) mit einem InterPro Entry IPR006447 (durch X in 13 gekennzeichnet). Eine andere derartige Domäne ist eine C-terminale konservierte Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 477, ebenso durch X in 13 gekennzeichnet.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mob. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parameter und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29 MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide beschreibt der Abschnitt ”Beispiele” hierin in Tabelle B4 die prozentielle Identität zwischen dem PRR2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO: 452, und den PRR2-Polypeptiden, die in Tabelle A4 angeführt sind, die nur 46% Aminosäure-Sequenzidentität betragen kann. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann unter Verwendung von BLAST der Schwellenwert der statistischen Signifikanz (als ”Erwartungswert” bezeichnet) für den Bericht von Übereinstimmungen gegenüber Datenbanksequenzen erhöht werden, um weniger stringente Übereinstimmungen zu zeigen. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.
  • Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Ist bekannt, wo sich ein Protein befindet, so hilft dies bei der Klärung seiner Funktion. Experimentelle Methoden zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunolokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder Beta-Glucuronidase (GUS). Solche Methoden sind genau, wenn auch im Vergleich zu computergestützten Verfahren arbeitsintensiv. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den dem Fachmann gut bekannten Algorithmen stehen bei ExPASy Proteomics, betrieben vom Schweizer Institut für Bioinformatik, z. B. die Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM und andere zur Verfügung.
  • Ferner haben bHLH9-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) für gewöhnlich DNA Bindungsaktivität. Werkzeuge und Techniken zur Messung der DNA Bindungsaktivität sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Zusätzlich, wie in der vorliegenden Erfindung dargestellt, verleiht ein bHLH9-Protein, wie SEQ ID NO: 2, wenn es in Reis überexprimiert wird, Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften, insbesondere Emergenz, (Früh-)Wuchskraft und/oder erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe. Andere Bioassays sind in Dombrecht et al. (Plant Cell 19, 2225–2245, 2007) angeführt. Weitere Einzelheiten finden sich im Abschnitt ”Beispiele”.
  • Vorzugsweise ist ein bHLH9-Polypeptid, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, imstande, an ein DNA Molekül, mit zunehmender Präferenz, von mindestens 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000 oder mehr Nukleotiden Länge zu binden, umfassend ein oder mehrere Repeats eines E-Box-Motivs, dargestellt durch SEQ ID NO: 273 (CANNTG), vorzugsweise durch SEQ ID NO: 274 (CACGTG: G-Box). Bevorzugter sind die E-Box- und/oder G-Box-Motive in einem Promotor enthalten, das heißt, in einem Polynukleotid, das zum Antreiben der Expression eines Gens, vorzugsweise in einer Pflanzenzelle, imstande ist.
  • Die E-Box und G-Box DNA-Bindungsmotive wie auch Verfahren zum Testen der Bindung eines Polypeptids an Polynukleotidmoleküle, die ein solches E-Box und G-Box-Motiv umfassen, sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt (Heim et al. 2003; Kim et al. 2007 Plant Mol Biol. 64(4): 453–66; Ouwerkek Mol Gen Genet. 1999, 261(4–5): 1635–43).
  • Ferner sind IMB1-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) Transkriptionsfaktoren und haben für gewöhnlich DNA Bindungsaktivität. Werkzeuge und Techniken zur Messung der DNA Bindungsaktivität sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt und enthalten zum Beispiel Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA). Weitere Einzelheiten finden sich im Abschnitt ”Beispiele”.
  • Zusätzlich ergeben IMB1-Polypeptide, wenn sie in Reis nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung überexprimiert sind, wie im Abschnitt ”Beispiele” angeführt, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Samenertrag.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide hat vorzugsweise ein PCD-Polypeptid, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, Pterin-4-alpha-carbinolamin-Dehydratase Aktivität (EC:4.2.1.96). Techniken und Verfahren zur Messung der PCD Aktivität sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt, zum Beispiel in Hauer et al. 1993 J. Biol. Chem. 268 (1993) 4828–4831 oder Cronk et al. 1996. Alternativ ist ein PCD-Polypeptid imstande, den Wachstums-Phänotyp von E. coli Stamm JP2255 (aroF363 pheA361 phe0352 tyrA382 thi1 strR712 lacY1 xyl-15; Zhao et al., 1994) unter Verwendung der Verfahren zu komplementieren, die von Naponelli et al. 2008 beschrieben sind.
  • Zusätzlich ergeben PCD-Polypeptide, wenn sie in Reis nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung überexprimiert sind, wie im Abschnitt ”Beispiele” angeführt, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Gesamtsamengewicht (Samenertrag) pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen pro Pflanze, erhöhtem Ernteindex, erhöhter Gesamtanzahl an Samen pro Pflanze.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide ist die vorliegende Erfindung durch Transformation von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, veranschaulicht, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 2 kodiert. Die Ausführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen bHLH9-kodierenden Nukleinsäure oder jedes HLH9-Polypeptids wie hierin definiert ausgeführt wenden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptidte kodieren, sind in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” hierin angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des bHLH9-Polypeptids, das durch SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Für gewöhnlich beinhaltet diese einen ersten BLAST mit dem BLASTing einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer der in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” aufgelisteten Sequenzen) gegen eine Sequenzdatenbank, wie die öffentlich verfügbare NCBI-Datenbank. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 ist, wäre daher der zweite BLAST gegen Reissequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Obereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide ist die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz veranschaulicht, die durch SEQ ID NO: 300 dargestellt ist, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 301 kodiert. Die Ausführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen IMB1-kodierenden Nukleinsäure oder jedes IMB1-Polypeptids wie hierin definiert ausgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die für IMB1-Polypeptide kodieren, sind in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” hierin angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des IMB1-Polypeptids, das durch SEQ ID NO: 30.1 dargestellt ist, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Für gewöhnlich beinhaltet diese einen ersten BLAST mit dem BLASTing einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer der in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” aufgelisteten Sequenzen) gegen eine Sequenzdatenbank, wie die öffentlich verfügbare NCBI-Datenbank. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmaßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NO: 300 oder SEQ ID NO: 301, wäre der zweite BLAST daher gegen Solanum lycopersicum Sequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide ist die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz veranschaulicht, die durch SEQ ID NO: 358 dargestellt ist, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 359 kodiert. Die Ausführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen PCD-kodierenden Nukleinsäure oder jedes PCD-Polypeptids wie hierin definiert ausgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die für PCD-Polypeptide kodieren, sind in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” hierin angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des PCD-Polypeptids, das durch SEQ ID NO: 359 dargestellt ist, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Für gewöhnlich beinhaltet diese einen ersten BLAST mit dem BLASTing einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer der in Tabelle A des Abschnitts ”Beispiele” aufgelisteten Sequenzen) gegen eine Sequenzdatenbank, wie die öffentlich verfügbare NCBI-Datenbank. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequezen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NO: 358 oder SEQ ID NO: 359 ist, wäre der zweite BLAST daher gegen Reissequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide ist die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz veranschaulicht, die durch SEQ ID NO: 451 dargestellt ist, die für die PRR2-Polypeptidsequenz von SEQ ID NO: 452 kodiert. Die Ausführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können vorteilhaft unter Verwendung jeder Nukleinsäure, die für ein PRR2-Polypeptid wie hierin definiert kodiert, ausgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuren, die für PRR2-Polypeptide kodieren, sind in Tabelle A4 von Beispiel 1 hierin angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angeführt sind, sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des PRR2-Polypeptids, das durch SEQ ID NO: 452 dargestellt ist, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Für gewöhnlich beinhaltet diese einen ersten BLAST mit dem BLASTing einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer der in Tabelle A4 von Beispiel 1 aufgelisteten Sequenzen) gegen eine Sequenzdatenbank, wie die öffentlich verfügbare NCBI-Datenbank. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NO: 451 oder SEQ ID NO: 452 ist, wäre der zweite BLAST daher gegen Lycopersicon esculentum Sequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
  • Hoch eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist nach dem Stand der Technik allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbourjoining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Beispiele für solche Varianten enthalten Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivative einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodieren, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hierin definiert sind, und enthalten auch Varianten, in welchen die Kodon-Nutzung optimiert ist oder in welchen miRNA Zielstellen entfernt sind. Ebenso sind in den Verfahren der Erfindung Nukleinsäuren nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen einer der Aminosäuresequenzen kodieren, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abgeleitet sind.
  • Weitere Nukleinsäurevarianten, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, enthalten Abschnitte von Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die an Nukleinsäuren hybridisieren, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide kodieren, die durch Gen-Shuffling erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleiß-Variante, allelische Variante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben.
  • Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängennukleinsäuren sein, da die Durchführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Volllängennukleinsäuresequenzen beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren eines Teils einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder eines Teils einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, in einer Pflanze.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere kodierende (oder nicht-kodierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide, kodieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, für ein bHLH9-Polypeptid wie hierin definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer beliebigen der Nukleinsäuren, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinander folgender Nukleotide auf, wobei die aufeinander folgenden Nukleotide beliebige der Nukleinsäuresequenzen sind, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Bevorzugter ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 1. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem der in 2 dargestellt ist, Cluster innerhalb der Klade (Gruppe) bildet, die durch defined by A.thaliana bHLH130 9 AT2G42280; A.thaliana bHLH122 9 AT1G51140; A.thaliana bHLH081 9 AT4G09180; A.thaliana bHLH080 9 AT1G35460; A.thaliana bHLH128 9 AT1G05805; und A.thaliana bHLH129 9 AT2G43140 definiert ist, die die Aminosäuresequenz von Arabidopsis thaliana bHLH9-Polypeptiden umfasst, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide kodieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, für ein IMB1-Polypeptid wie hierin definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer beliebigen der Nukleinsäuren, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 aufeinander folgender Nukleotide auf, wobei die aufeinander folgenden Nukleotide beliebige der Nukleinsäuresequenzen sind, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Bevorzugter ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 300. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem der in 6 dargestellt ist, Cluster mit der Gruppe von Polypeptiden der IMB1/GTE1 Klasse bildet, die die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 301 dargestellt ist, umfasst, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide kodieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, für ein PCD-artiges Polypeptid wie hierin definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer beliebigen der Nukleinsäuren, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinander folgender Nukleotide auf, wobei die aufeinander folgenden Nukleotide beliebige der Nukleinsäuresequenzen sind, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Bevorzugter ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 358. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, das, wenn es in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem der in 3B von Naponelli et al. 2008 dargestellt ist (hierin in 9 wiedergegeben), Cluster in der Klade bildet, die durch die PCD-Polypeptide definiert ist, die von Organismen des Viridiplantae-Reichs (Grünpflanzen) stammen, d. h. mit Arabidopsis-1; Arabidopsis-2; Pinus-1; Pinus-2; Physcomitrella-1; Physcomitrella-2, Zea-1 und Zea-2, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide kodieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, für ein PRR2-Polypeptid wie hierin definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen, die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Polypeptidsequenzen kodiert, die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge, mit zunehmender Präferenz, von mindestens 800, 900, 1000, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650 oder mehr aufeinander folgender Nukleotide auf, wobei die aufeinander folgenden Nukleotide beliebige der Nukleinsäuresequenzen sind, die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Polypeptidsequenzen kodiert, die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, die (i) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Pseudo Response Receiver Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 475; und (ii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Myb-artigen DNA Bindungsdomäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 476, umfasst. Bevorzugter ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit dem PRR2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO: 452, oder mit einer beliebigen der Polypeptidsequenzen aufweist, die hierin in Tabelle A4 angeführt sind. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 451.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die unter verringerten Stringenzbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid, wie hierin definiert, kodiert oder mit einem Abschnitt wie hierin definiert hybridisieren kann.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung und/oder Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure in einer Pflanze, die imstande ist an eine der Nukleinsäuren zu hybridisieren, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele in einer Pflanze” angeführt sind, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure in einer Pflanze, die imstande ist an eine Nukleinsäure zu hybridisieren, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der Nukleinsäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide kodieren hybridisierende Sequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, für ein bHLH9-Polypeptid wie hierin definiert, mit im Wesentlichen derselben biologischen Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz imstande, an das Komplement einer beliebigen der Nukleinsäuren zu hybridisieren, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder an einen Abschnitt einer beliebigen dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz ist imstande, an das Komplement einer Nukleinsäure zu hybridisieren, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz imstande, an das Komplement einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, oder an einen Abschnitt davon zu hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn in voller Länge und in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet, wie jenem der in 2 dargestellt ist, Cluster innerhalb der Klade (Gruppe) bildet, die durch A.thaliana bHLH130 9 AT2G42280; A.thaliana bHLH122 9 AT1G51140; A.thaliana bHLH081 9 AT4G09180; A.thaliana bHLH080 9 AT1G35460; A.thaliana bHLH128 9 AT1G05805; und A.thaliana bHLH129 9 AT2G43140 definiert ist, umfassend die Aminosäuresequenz von Arabidopsis thaliana bHLH9-Polypeptiden, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide kodieren hybridisierende Sequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, für ein IMB1-Polypeptid wie hierin definiert, mit im Wesentlichen derselben biologischen Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz imstande, an das Komplement einer beliebigen der Nukleinsäuren zu hybridisieren, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder an einen Abschnitt einer beliebigen dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz ist imstande, an das Komplement einer Nukleinsäure zu hybridisieren, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz imstande, an das Komplement einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 300 dargestellt ist, oder an einen Abschnitt davon zu hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn in voller Länge und in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet, wie jenem der in 6 dargestellt ist, Cluster mit der Gruppe von Polypeptiden der IMB1/GTE1 Klasse bildet, die die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 301 dargestellt ist, umfasst, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide kodieren hybridisierende Sequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, für ein PCD-artiges Polypeptid wie hierin definiert, mit im Wesentlichen derselben biologischen Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz imstande, an das Komplement einer beliebigen der Nukleinsäuren zu hybridisieren, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele angeführt sind, oder an einen Abschnitt einer beliebigen dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz ist imstande, an das Komplement einer Nukleinsäure zu hybridisieren, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz imstande, an das Komplement einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 358 dargestellt ist, oder an einen Abschnitt davon zu hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn in voller Länge und in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet, wie jenem der in 3B von Naponelli et al. 2008 dargestellt ist (hierin in 2 wiedergegeben), Cluster innerhalb der Klade bildet, die durch die PCD-Polypeptide definiert ist, die von Organismen des Viridiplantae-Reichs (Grünpflanzen) stammen, d. h. mit Arabidopsis-1; Arabidopsis-2; Pinus-1; Pinus-2; Physcomitrella-1; Physcomitrella-2, Zea-1 und Zea-2, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide kodieren hybridisierende Sequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, für ein PRR2-Polypeptid wie hierin definiert, mit im Wesentlichen derselben biologischen Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz imstande, an eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen, die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder an ein Komplement davon zu hybridisieren, oder an einen Abschnitt einer beliebigen dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz imstande ist, an eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog einer der Polypeptidsequenzen kodiert, die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder an ein Komplement davon zu hybridisieren. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz imstande, Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, die (i) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Pseudo Response Receiver Domäne aufweist, dargestellt durch SEQ ID NO: 475; und (ii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Myb-artigen DNA Bindungsdomäne aufweist, dargestellt durch SEQ ID NO: 476. Bevörzugter ist die hybridisierende Sequenz imstande, an eine Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit dem PRR2-Polypeptid aufweist, dargestellt durch SEQ ID NO: 452 oder mit einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die hierein in Tabelle A4 angeführt sind. Ganz besonders bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NO 451 dargestellt, oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Spleißvariante, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid wie hierin definiert kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hierin definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung und/oder Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Spleißvariante einer der Nukleinsäuresequenzen, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder einer Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide sind bevorzugte Spleißvarianten Spleißvarianten einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise, bildet die Aminosäuresequenz, für die die Spleißvariante kodiert, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem, der in 2 dargestellt ist, Cluster innerhalb der Klade (Gruppe), die durch A.thaliana bHLH130 9 AT2G42280; A.thaliana bHLH122 9 AT1G51140; A.thaliana bHLH081 9 AT4G09180; A.thaliana bHLH080 9 AT1G35460; A.thaliana bHLH128 9 AT1G05805; und A.thaliana bHLH129 9 AT2G43140 definiert ist, die die Aminosäuresequenz von Arabidopsis thaliana bHLH9-Polypeptiden umfasst, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide sind bevorzugte Spleißvarianten Spleißvarianten einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 300 dargestellt ist, oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 301 kodiert. Vorzugsweise, bildet die Aminosäuresequenz, für die die Spleißvariante kodiert, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem, der in 6 dargestellt ist, Cluster mit der Gruppe von Polypeptiden der IMB1/GTE1 Klasse, die die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 301 dargestellt ist, umfasst, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide sind bevorzugte Spleißvarianten Spleißvarianten einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 358 dargestellt ist, oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 359 kodiert. Vorzugsweise, bildet die Aminosäuresequenz, für die die Spleißvariante kodiert, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem, der in 3B von Naponelli et al. 2008 dargestellt ist (hierin in 9 wiedergegeben), Cluster innerhalb der Klade, die durch die PCD-Polypeptide definiert ist, die von Organismen des Viridiplantae-Reichs stammen (Grünpflanzen), d. h. mit Arabidopsis-1; Arabidopsis-2; Pinus-1; Pinus-2; Physcomitrella-1; Physcomitrella-2, Zea-1 und Zea-2, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide sind bevorzugte Spleißvarianten Spleißvarianten einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 451 dargestellt ist, oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 452 kodiert. Vorzugsweise ist die Spleißvariante eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, umfassend (i) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Pseudo Response Receiver Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 475; und (ii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Myb-artigen DNA Bindungsdomäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 476. Bevorzugter ist eine Spleißvariante eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit dem PRR2-Polypeptid aufweist, dargestellt durch SEQ ID NO: 452 oder mit einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die hierin in Tabelle A4 angeführt sind. Bevorzugter ist die Spleißvariante eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 451, oder einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 452, kodiert.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid kodiert, wie hierin oben definiert, wobei eine allelische Variante wie hierin definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung und/oder Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer allelischen Variante einer der Nukleinsäuren, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer allelischen Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide haben die Polypeptide, die von allelischen Variante kodiert werden, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das bHLH9-Polypeptid von SEQ ID NO: 2 und eine der Aminosäuren, die in Tabelle A1 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Allelische Varianten sind in der Natur vorhanden und in den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieser natürlichen Allele enthalten. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NO: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem, der in 2 dargestellt ist, Cluster innerhalb der Klade (Gruppe), die durch A.thaliana bHLH130 9 AT2G42280; A.thaliana bHLH122 9 AT1G51140; A.thaliana bHLH081 9 AT4G09180; A.thaliana bHLH080 9 AT1G35460; A.thaliana bHLH128 9 AT1G05805; und A.thaliana bHLH129 9 AT2G43140 definiert ist, umfassend die Aminosäuresequenz von Arabidopsis thaliana bHLH9-Polypeptiden, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide haben die Polypeptide, die von allelischen Varianten kodiert werden, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das IMB1-Polypeptid von SEQ ID NO: 301 und eine der Aminosäuren, die in Tabelle A2 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Allelische Varianten sind in der Natur vorhanden und in den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieser natürlichen Allele enthalten. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NO: 300 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 301 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem, der in 6 dargestellt ist, Cluster mit der Gruppe von Polypeptiden der IMB1/GTE1 Klasse, die die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 301 dargestellt ist, umfasst, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide haben die Polypeptide, die von allelischen Varianten kodiert werden, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das PCD-Polypeptid von SEQ ID NO: 359 und eine der Aminosäuren, die in Tabelle A3 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Allelische Varianten sind in der Natur vorhanden und in den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieser natürlichen Allele enthalten. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NO: 358 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 359 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem, der in 3B von Naponelli et al. 2008 dargestellt ist (hierin in 9 wiedergegeben), Cluster innerhalb der Klade, die durch die PCD-Polypeptide definiert ist, die von Organismen des Viridiplantae-Reichs (Grünpflanzen) stammen, d. h. mit Arabidopsis-1; Arabidopsis-2; Pinus-1; Pinus-2; Physcomitrella-1; Physcomitrella-2, Zea-1 und Zea-2, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide haben die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das PRR2-Polypeptid von SEQ ID NO: 452 und eine der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind. Allelische Varianten sind in der Natur vorhanden und in den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieser natürlichen Allele enthalten. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz, die (i) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Pseudo Response Receiver Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 475; und (ii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Myb-artigen DNA Bindungsdomäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 476, umfasst. Bevorzugter ist die allelische Variante eine allelische Variante, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit dem PRR2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO: 452, oder mit einer der Polypeptidsequenzen, die hierin in Tabelle A4 angeführt sind, aufweist. Insbesondere ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NO: 451 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NO: 452 kodiert.
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution kann ebenso zur Erzeugung von Varianten von Nukleinsäuren verwendet werden, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-Polypeptide oder PRR2-Polypeptide wie oben definiert kodieren; wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hierin definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Variante einer der Nukleinsäuresequenzen, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der Aminosäuresequenzen kodiert, die in Tabelle A1 bis A4 des Abschnitts ”Beispiele” angeführt sind, wobei die variante Nukleinsäure durch Gen-Shuffling erhalten wird.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide bildet vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die durch die variante Nukleinsäure kodiert wird, die durch Gen-Shuffling erhalten wird, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem, der in 2 dargestellt ist, Cluster innerhalb der Klade (Gruppe), die durch A.thaliana bHLH130 9 AT2G42280; A.thaliana bHLH122 9 AT1G51140; A.thaliana bHLH081 9 AT4G09180; A.thaliana bHLH080 9 AT1G35460; A.thaliana bHLH128 9 AT1G05805; und A.thaliana bHLH129 9 AT2G43140 definiert ist, umfassend die Aminosäuresequenz von Arabidopsis thaliana bHLH9-Polypeptiden, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide bildet vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die durch die variante Nukleinsäure kodiert wird, die durch Gen-Shuffling erhalten wird, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem, der in 6 dargestellt ist, Cluster mit der Gruppe von Polypeptiden der IMB1/GTE1 Klasse, die die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 301 dargestellt ist, umfasst, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide bildet vorzugsweise die Aminosäuresequenz, die durch die variante Nukleinsäure kodiert wird, die durch Gen-Shuffling erhalten wird, wenn sie in der Konstruktion eines phylogenetischen Stamms verwendet wird, wie jenem, der in 3B von Naponelli et al. 2008 dargestellt ist (hierin in 9 wiedergegeben), Cluster innerhalb der Klade, die durch die PCD-Polypeptide definiert ist, die von Organismen des Viridiplantae-Reichs (Grünpflanzen) stammen, d. h. mit Arabidopsis-1; Arabidopsis-2; Pinus-1; Pinus-2; Physcomitrella-1; Physcomitrella-2, Zea-1 und Zea-2, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide kodiert vorzugsweise die variante Nukleinsäuresequenz, die durch Gen-Shuffling erhalten wird, für eine Polypeptidsequenz, die (i) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Pseudo Response Receiver Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 475; und (ii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Myb-artigen DNA Bindungsdomäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 476, umfasst. Bevorzugter kodiert die variante Nukleinsäuresequenz, die durch Gen-Shuffling erhalten wird, für eine Polypeptidsequenz, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit dem PRR2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO: 452, oder mit einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die hierin in Tabelle A1 angeführt sind, aufweist. Insbesondere kodiert die Nukleinsäuresequenz, die durch Gen-Shuffling erhalten wird, für eine Polypeptidsequenz, die durch SEQ ID NO: 452 dargestellt ist.
  • Ferner lassen sich Nukleinsäurevarianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten. Zum Erzielen einer ortsgerichteten Mutagenese sind mehrere Verfahren verfügbar, wobei die üblichsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide kodieren, können von natürlichen oder künstlichen Quellen abgeleitet sein. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die bHLH9-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure von einer Pflanze, weiter bevorzugt von einer monokotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt von der Familie Poaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure von Oryza sativa.
  • Vorzugsweise stellt die Erfindung auch bisher unbekannte bHLH9-kodierende Nukleinsäuren und bHLH9-Polypeptide bereit.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, ausgewählt aus:
    • (i) einer durch eine von SEQ ID NO: 19, 45, 47, 165, 167 und 169 dargestellten Nukleinsäure;
    • (ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, dargestellt durch eine von SEQ ID NO: 19, 45, 47, 165, 167 und 169;
    • (iii) einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, das durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist, vorzugsweise als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Kodes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz abgeleitet sein kann, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist, und ferner vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (iv) einer Nukleinsäure die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit einer der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A1 und Tabelle C2 aufweist und ferner vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (v) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül aus (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, und ferner vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (vi) einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, das, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168, 170 dargestellt ist, und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1 und Tabelle C2 aufweist und die vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, ausgewählt aus:
    • (i) einer Aminosäuresequenz, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist;
    • (ii) einer Aminosäuresequenz die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist, und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1 und Tabelle C2 aufweist und die vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (iii) Derivaten der oben unter (i) oder (ii) angeführten Aminosauresequenzen.
  • Nukleinsäuren, die für IMB1-Polypeptide kodieren, können von jeder natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die IMB1-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure von einer Pflanze, weiter bevorzugt von einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt von der Familie Solanaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure von Solanum lycopersicum.
  • Nukleinsäuren, die für PCD-Polypeptide kodieren, können von jeder natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die PCD-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure von einer Pflanze, weiter bevorzugt von einer monokotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt von der Familie Poaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure von Oryza sativa.
  • Nukleinsäuresequenzen, die für PRR2-Polypeptide kodieren, können von jeder natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Die Nukleinsäuresequenz die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, stammt von einer Pflanze, weiter bevorzugt von einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt vor Familie Solanaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure von Lycopersicon esculentum.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Eine Bezugnahme hierin auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften soll eine Erhöhung in der Biomasse (im Gewicht) eines oder mehrerer Teile einer Pflanze bedeuten, die oberirdische (erntfähige) Teile und/oder (erntfähige) unterirdische Teile beinhalten können. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen. Bezüglich IMB1-Polypeptide beinhaltet der Begriff ”ertragsbezogene Eigenschaften”, ”Ertrag” oder ”Samenertrag”, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, nicht einen erhöhten Ölgehalt einer Pflanze oder eines Pflanzensamens.
  • Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehrere der Folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/des Durchmessers, Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der Folgenden manifestieren: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist), Erhöhung des Tausendkerngewichts.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, relativ zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-Polypeptid, wie hierin definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften von Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, wie hierin definiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung einen erhöhten Ertrag und/oder erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften aufweisen, ist wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus), relativ zu der Wachstumsrate von Kontrollpflanzen in der entsprechenden Stufe ihres Lebenszyklus aufweisen.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann so verstanden werden, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann durch Faktoren, wie Geschwindigkeit der Keimung, Früh-Wuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst sein. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, wodurch Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden können, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei derartige Parameters folgende sein können: T-Mid (Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 50% ihrer maximalen Größe benötigen) und T-90 (Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 90% ihrer maximalen Größe benötigen), unter anderen.
  • Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid, oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid, wie hierin definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Eine Erhöhung im Ertrag und/oder in der Wachstumsrate und/oder erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften treten ein, egal ob die Pflanze unter Nicht-Stressbedingungen ist oder ob die Pflanze unterschiedlichen Stresssituationen ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gezüchtet werden. Pflanzen reagieren in der Regel auf eine Stressbelastung, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten in der landwirtschaftlichen Praxis (Bewässerung, Düngung und/oder Pestizidbehandlungen) wird starker Stress bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig vorgefunden. Als eine Konsequenz ist das von mäßigem Stress induzierte beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressfaktoren sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressfaktoren, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressfaktoren können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen ermöglichen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit.
  • Im Besonderen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen mit milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig mit hoher oder niedriger Temperatur, Salzgehalt oder Dürre verbunden ist, kann die Denaturierung von funktionellen Proteinen und Struktur-Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressfaktoren häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von StressProteinen, die Aufwärtsregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen ermöglichen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden) ergeben typischerweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer beliebigen gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, die unter Nicht-Stressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen gezüchtet wurden, mit erhöhtem Ertrag und/oder ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gezüchtet wurden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen bereitgestellt, die unter Nicht-Stressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen gezüchtet wurden, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen gezüchtet wurden, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, mit erhöhtem Ertrag relativ zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gezüchtet wurden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen bereitgestellt, die unter Nährstoffmangelbedingungen gezüchtet wurden, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Ein Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor resultieren.
  • Es versteht sich, dass der Begriff ”abiotischer Stress”, wie hierin definiert, ein oder mehrere beliebige von Folgenden bedeutet: Wasserstress (wegen Dürre oder überschüssigem Wasser), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (durch heiße, kalte oder Frost-Temperaturen), Stress durch chemische Toxizität und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionischem Stress. Vorzugsweise ist der Wasserstress ein Dürrestress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um einen beliebigen Stress handeln, der unter anderem von einem oder mehreren von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2 verursacht wird.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, die unter Bedingungen von Salzstress gezüchtet wurden, mit erhöhtem Ertrag relativ zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gezüchtet wurden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen bereitgestellt, die unter Bedingungen von Salzstress gezüchtet wurden, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern kann sich unter anderem auch auf eine oder mehrere der folgenden Substanzen beziehen: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, die erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften unter abiotischen Stressbedingungen relativ zu Kontrollpflanzen aufweisen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gezüchtet wurden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, die unter abiotischen Stressbedingungen gezüchtet wurden, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress ausgewählt aus einem oder mehreren der folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
  • Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen. welche von den Pflanzen für das Wachstum und die Entwicklung assimiliert werden müssen. Wegen des starken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine gewaltige Menge an Düngemitteln über Feldern verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird für gewöhnlich von drei Hauptnährstoffen limitiert, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff. der, unter diesen dreien, gewöhnlich das geschwindigkeitslimitierende Element beim Pflanzenwachstum ist. Deshalb ist das für Pflanzenwachstum erforderliche hauptsächliche Nährstoff-Element der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil zahlreicher wichtiger Verbindungen, welche in lebenden Zellen vorgefunden werden, einschließlich Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Chlorophyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der Pflanzen-Trockensubstanz und ungefähr 16% des gesamten Pflanzenproteins aus. Somit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein Haupteinschränkungsfaktor für das Wachstum und die Produktion von Nutzpflanzen (Frink et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4): 1175–1180) und besitzt außerdem einen sehr großen Einfluss auf die Proteinakkumulation und Aminosäure-Zusammensetzung. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, wenn sie unter Stockstoffeinschränkungsbedingungen gezüchtet werden, von großem Interesse.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, die unter Bedingungen einer verringerten Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen einer verringerten Stickstoffverfügbarkeit gezüchtet wurden, mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen gezüchtet wurden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, die unter Bedingungen einer verringerten Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen einer verringerten Stickstoffverfügbarkeit gezüchtet wurden, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst. Die verringerte Nährstoffverfügbarkeit kann aus einem Mangel oder Überschuss an Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der verringerten Nährstoffverfügbarkeit um eine verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen) oder Zellen. die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon oder Zellen davon umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, das für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid. wie oben definiert. kodiert. das funktionsfähig an einen Promotor gebunden ist, der in Pflanzen wirkt.
  • Die Erfindung stellt auch genetische Konstrukte und Vektoren bereit, die das Einbringen und/oder die Expression of Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artige Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren, in Pflanzen erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines wie hier definierten Genkonstrukts in den Verfahren der Erfindung vor.
  • Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert;
    • (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid kodiert, wie oben definiert. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide ist vorzugsweise eine der Steuerungssequenzen eines Konstrukts ein konstitutiver Promotor, der von einem Pflanzengenom isoliert ist. Ein Beispiel für einen konstitutiven Promotor ist ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor von Reis, insbesondere eine GOS2-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 478.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der jedwede der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
  • Vorzugsweise kann jede Art von Promotor, egal, ob natürlich oder synthetisch. zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden, aber vorzugsweise ist der Promotor pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor ebenfalls um einen ubiquitären Promotor mittlerer Stärke. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide, kann vorzugsweise jede Art von Promotor, egal, ob natürlich oder synthetisch, zum Erhöhen der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren, vorzugsweise ein aus einem Pflanzengenom isolierter konstitutiver Promotor. Der konstitutive Pflanzenpromotor steuert die Expression einer Kodierungssequenz auf einem Niveau, das in allen Fällen unter dem liegt, welches man unter der Kontrolle eines viralen 35S-CaMV-Promotors erhält. Ein Beispiel für einen solchen Promotor ist ein GOS2-Promotor. der durch SEQ ID NO: 478 dargestellt ist.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide sind organspezifische Promotoren, zum Beispiel für eine bevorzugte Expression in Blättern, Stängeln, Knollen, Meristemen, Samen, in der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Entwicklungsgesteuerte und induzierbare Promotoren eignen sich ebenfalls zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die bHLH9-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure begrenzt ist, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, und die Anwendbarkeit der Erfindung auch nicht auf die Expression einer bHLH9-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure begrenzt ist, wenn diese durch einen konstitutiven Promotor angetrieben wird.
  • Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke, besonders bevorzugt aus einer Pflanze, wie einen GOS2-Promotor: besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den GOS2-Promotor von Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch ein Nukleinsäuresequenz dargestellt, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 275 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NO: 275 dargestellt. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die IMB1-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure begrenzt ist, die durch SEQ ID NO: 300 dargestellt ist, und die Anwendbarkeit der Erfindung auch nicht auf die Expression einer IMB1-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure begrenzt ist, wenn diese durch einen konstitutiven Promotor angetrieben wird.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, bevorzugter ein von einer Pflanze abgeleiteter Promotor mittlerer Stärke, wie ein GOS2-Promotor. und insbesondere ist der Promotor der GOS2-Promotor von Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch ein Nukleinsäuresequenz dargestellt. die im Wesentlichen SEQ ID NO: 313 ähnelt. ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NO: 313 dargestellt. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die den Reis-GOS2-Promotor umfasst, der funktionsfähig an die Nukleinsäure gebunden ist, die für das IMB1-Polypeptid kodiert.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die PCD-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure begrenzt ist, die durch SEQ ID NO: 358 dargestellt ist, und die Anwendbarkeit der Erfindung auch nicht auf die Expression einer PCD-artiges Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure begrenzt ist, wenn diese durch einen konstitutiven Promotor angetrieben wird.
  • Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke, besonders bevorzugt aus einer Pflanze, wie einen GOS2-Promotor; besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den GOS2-Promotor von Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch ein Nukleinsäuresequenz dargestellt, die im Wesentlichen SEQ ID NO: 450 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NO: 450 dargestellt. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die PRR2-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure begrenzt ist, die durch SEQ ID NO: 451 dargestellt ist, und die Anwendbarkeit der Erfindung auch nicht auf die Expression einer PRR2-Polypeptid-kodierende Nukleinsäure begrenzt ist, wenn diese durch einen konstitutiven Promotor angetrieben wird. Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden.
  • Zusätzliche regulatorische Elemente können transkriptionale wie auch translationale Verstärker enthalten. Fachleute in dem Gebiet kennen Terminator- und Verstärkersequenzen, die zur Verwendung in der Durchführung der Erfindung geeignet sein mögen. Zur Erhöhung der Menge an reifer Nachricht, die sich im Zytosol anreichert, kann man in der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der Kodierungssequenz außerdem eine Intronsequenz einfügen, wie im Definitionsabschnitt beschrieben. Andere Steuerungssequenzen (außer Promotor-, Verstärker-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR und/oder 5'UTR Regionen) können Protein und/oder RNA stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sollten dem Fachmann bekannt sein oder sollten sich von diesem leicht in Erfahrung bringen lassen.
  • Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel besteht darin, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind nach dem Stand der Technik bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
  • Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert (wie jene, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die für einen selektierbaren Marker kodieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide kodiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht mehr benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind nach dem Stand der Technik bekannt. verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Einbringen und die Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid. wie hierin oben definiert, kodiert. in einer Pflanze.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide stellt die vorliegende Erfindung insbesondere ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert in einer Pflanze; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls
    • (iii) Selektieren auf Pflanzen mit erhöhtem Ertrag.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann jede der Nukleinsäuren sein, die imstande ist, für ein bHLH9-Polypeptid wie hierin definiert zu kodieren.
  • Bezüglich IMB1-Polypeptide stellt die vorliegende Erfindung insbesondere ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen-)Ertrag bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer IMB1-Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure in einer Pflanze oder Pflanzenzelle; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann jede der Nukleinsäuren sein, die imstande ist. für ein IMB1-Polypeptid wie hierin definiert zu kodieren.
  • Bezüglich PCD-artiger Polypeptide stellt die vorliegende Erfindung insbesondere ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen-)Ertrag bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer PCD-artiges Polypeptid-kodierenden Nukleinsäure in einer Pflanze oder Pflanzenzelle; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann jede der Nukleinsäuren sein, die imstande ist, für ein PCD-artiges Polypeptid wie hierin definiert zu kodieren.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide stellt die vorliegende Erfindung insbesondere ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteil bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann jede der Nukleinsäuren sein, die imstande ist, für ein PRR2-Polypeptid wie hierin definiert zu kodieren.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich einer Einbringung in ein Gewebe, ein Organ oder einen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen auf das Vorhandensein eines oder mehrerer Markern selektiert, welche von pflanzlich exprimierbaren Genen kodiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines selektierbaren Markers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
  • Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, auf das Vorhandensein des Gens von Interesse, die Kopienzahl und/oder die genomische Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
  • Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Verfahrenen vermehrt werden. wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Pfropfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepfropft wird) sein.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht. dass die Nachkommen dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
  • Die Erfindung enthält auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure beinhalten, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid, wie hierin oben definiert, kodiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die in den Verfahren gemäß der Erfindung. der Expressionskassette oder dem Konstrukt oder Vektor verwendet werden, sind im Prinzip vorzugsweise alle Pflanzen, die imstande sind, die Polypeptide zu synthetisieren. die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
  • Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Leinsamen, Baumwolle. Tomate. Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen. Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer.
  • Die Erfindung betrifft auch erntfähige Teile einer Pflanze wie, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Wurzelstämme, Knollen und Zwiebel, wobei die erntfähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäure umfassen, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid kodiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind nach dem Stand der Technik gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Wie oben erwähnt, umfasst ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder PRR2-Polypeptid kodiert, das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften, können jedoch auch unter Anwendung anderer, allgemein bekannter Techniken erreicht werden, einschließlich, ohne aber darauf beschränkt zu sein, T-DNA Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide wie hierin beschrieben kodieren, und die Verwendung dieser bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artigen Polypeptide zur Steigerung einer der oben genannten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die für PRR2-Polypeptide wie hierin beschrieben kodieren, und die Verwendung dieser PRR2-Polypeptide zur Steigerung einer der oben genannten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stresswachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stresswachstumsbedingungen) und unter Wachstumsbedingungen verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
  • Nukleinsäuren. die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artige Polypeptide oder PRR2-Polypeptide, wie hierin beschrieben, kodieren oder die bHLH9-Polypeptide selbst können Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in welchen ein DNA Marker identifiziert wird, der genetisch an ein Gen gebunden sein kann, das für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid kodiert. Die Nukleinsäuren/Gene oder die bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artigen Polypeptide oder PRR2-Polypeptide können selbst zur Definition eines Molekularmarkers verwendet werden. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die bzw. das für ein bHLH9-Polypeptid oder ein IMB1-Polypeptid oder ein PCD-artiges Polypeptid oder ein PRR2-Polypeptid kodiert, können auch in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen Anwendung finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern manchmal das Einbringen einer allelischen Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten mit unabsichtlich verursachtem, so genanntem ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen. die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
  • Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artige Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden für eine genetische und physikalische Kartierung der Gene. deren Teil sie sind, und als Marker für Eigenschaften. die mit diesen Genen verbunden sind, verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine derartige Verwendung von Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artige Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artige Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren, können als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsaufgeschlossener, pflanzlicher, genomischer DNA kann mit den Nukleinsäuren sondiert werden, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artige Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodieren. Die erhaltenen Bandenmuster können dann unter Verwendung von Computerprogrammen. wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) genetischen Analysen unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Zusätzlich können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die mit Restriktionsendonuklease behandelte, genomische DNAs eines Satzes von Individuen enthalten. die Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA Polymorphismen wird festgehalten und zur Berechnung der Position der Nukleinsäure, die für bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artige Polypeptide oder PRR2-Polypeptide kodiert, in der genetischen Karte, die zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde, verwendet (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Anwendung von pflanzengenabgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Intercross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h., Anordnung von Sequenzen auf physikalischen Karten verwendet werden; siehe Hoheisel et al. In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996. S. 319–346, und darin zitierte Referenzen).
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden in direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridierungs-(FISH)Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl gegenwärtige Verfahren der FISH Kartierung die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20) begünstigen, könnten Verbesserungen in der Empfindlichkeit die Durchführung einer FISH Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
  • Eine Reihe von Verfahren auf der Basis einer Nukleinsäureamplifikation für eine genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren ausgeführt werden. Beispiele enthalten eine allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96). Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS: Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080). Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure zum Entwerfen und Herstellen von Primerpaaren zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerugnsreaktionen verwendet. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein. DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren. die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
  • Bezüglich bHLH9-Polypeptide oder IMB1-Polypeptide oder PCD-artiger Poylpeptide führen die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressfaktoren, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • Bezüglich PRR2-Polypeptide führen die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressfaktoren, Toleranz gegen Herbizide, Insektizide, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • Punkte
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Punkte beschrieben:
  • 1. Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9 (bHLH9)
    • 1. Ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-(Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9-)Polypeptid kodiert, umfassend eine HLH-Domäne (Pfam Zugangsnummer: PF00010), die. mit zunehmender Präferenz, mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität mit einer von SEQ ID NO: 181 bis SEQ ID NO: 268, vorzugsweise mit SEQ ID NO: 225 aufweist.
    • 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das bHLH9 an ein E-Box-Motiv bindet, wie, mit zunehmender Präferenz. durch SEQ ID NO: 273 (CANNTG) oder SEQ ID NO: 274 (CACGTG) dargestellt.
    • 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, für eines der Proteine kodiert. die in Tabelle A1 aufgelistet sind, oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure, die zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure in der Lage ist.
    • 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog eines der Proteine kodiert, die in Tabelle A1 angeführt sind.
    • 6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Früh-Wuchskraft und/oder erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stressbedingungen erhalten werden.
    • 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Dürrestress, Salzstress oder Stickstoffmangel erhalten werden.
    • 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor von Reis, verbunden ist.
    • 10. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure. die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise von einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt von der Familie Poaceae, besonders bevorzugt von der Gattung Oryza, ganz besonders bevorzugt von Oryza sativa.
    • 11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 10, wobei die Pflanze oder ein Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert.
    • 12. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure. die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, wie in den Punkten 1 oder 2 definiert: (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
    • 13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor von Reis handelt.
    • 14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zum Herstellen von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen.
    • 15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
    • 16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) Selektieren auf Pflanzen mit erhöhtem Ertrag.
    • 17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, relativ zu Kontrollpflanzen, der aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure resultiert. die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle. die von der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
    • 18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
    • 19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • 20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
    • 21. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert. bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung der Früh-Wuchskraft und/oder bei der Erhöhung der Biomasse und/oder Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen, relativ zu Kontrollpflanzen.
    • 22. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus: (i) einer durch eine von SEQ ID NO: 19, 45, 47, 165, 167 und 169 dargestellten Nukleinsäure; (ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, dargestellt durch eine von SEQ ID NO: 19, 45, 47, 165, 167 und 169; (iii) einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, dargestellt durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170, vorzugsweise infolge der Degeneriertheit des genetischen Kodes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist, und des Weiteren vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht; (iv) einer Nukleinsäure die, mit zunehmender Präferenz mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität mit einer der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A1 und Tabelle C2 aufweist und des Weiteren vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht: (v) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht; (vi) einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, das, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168, 170 dargestellt ist, und einer der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A und Tabelle C2 aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht.
    • 23. Ein isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus: (i) einer Aminosäuresequenz, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist; (ii) einer Aminosäuresequenz, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist, und einer der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1 und Tabelle C2 aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht. (iii) Derivaten einer der Aminosäuresequenzen, die oben unter (i) oder (ii) angeführt sind.
  • 2. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
    • 1. Ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, wobei das IMB1-Polypeptid eine einzelne Bromodomäne umfasst.
    • 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das IMB1-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: Motiv 3 (SEQ ID NO: 304), Motiv 4 (SEQ ID NO: 305), Motiv 5 (SEQ ID NO: 306) und Motiv 6 (SEQ ID NO: 307).
    • 3. Verfahren gemäß Punkt 2, wobei das IMB1-Polypeptid zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: Motiv 7 (SEQ ID NO: 308), Motiv 8 (SEQ ID NO: 309), Motiv 9 (SEQ ID NO: 310), Motiv 10 (SEQ ID NO: 311) und Motiv 11 (SEQ ID NO: 312).
    • 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert. in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, für eines der Proteine kodiert, die in Tabelle A2 aufgelistet sind, oder einen Abschnitt einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure, die zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure in der Lage ist.
    • 6. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 5, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog eines der Proteine kodiert, die in Tabelle A2 angeführt sind.
    • 7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag. vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 7, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stressbedingungen erhalten werden.
    • 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 4 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor von Reis, verbunden ist.
    • 10. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise von einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt von der Familie Solanaceae, besonders bevorzugt von der Gattung Solanum, ganz besonders bevorzugt von Solanum lycopersicon.
    • 11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 10, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert.
    • 12. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, wie in einem der Punkte 1 bis 3 definiert: (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
    • 13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, insbesondere ein GOS2-Promotor von Reis ist.
    • 14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
    • 16. Verfahren für die Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhter Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen. umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Nukleinsäure. die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, wie in einem der Punkte 1 bis 3 definiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
    • 17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, relativ zu Kontrollpflanzen, der aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure resultiert, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, wie in einem der Punkte 1 bis 3 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
    • 18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
    • 19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • 20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
    • 21. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein IMB1-Polypeptid kodiert, in der Erhöhung des Ertrags, insbesondere in der Erhöhung des Samenertrags und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, relativ zu Kontrollpflanzen.
  • 3. PCD-artig
    • 1. Ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein PCD-Polypeptid kodiert, umfassend a Pterin-4-alpha-carbinolamin-Dehydratase (PCD) Domäne (Interpro Zugangsnummer: IPR001533: pfam Zugangsnummer: PF01329), wobei die PCD-Domäne vorzugsweise. mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 440 aufweist.
    • 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das PCD-Polypeptid ein oder mehrere Motive umfasst, mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% mit einem der folgenden Motive: (i) Motiv 12 (SEQ ID NO: 441): [G/E]-[D/N]-[F/L]-G-A-R-D-P-x(3)-E-x(4)-F-G-[D/E]K: (ii) Motiv 13 (SEQ ID NO: 442): [E/D/K/H//Q/N]-x(3)-H-[H/N]-[P/C/S]-x(5,6)-[Y/W/F/H]-x(9)-[H/W]-x(8,15)-D; (iii) Motiv 14 (SEQ ID NO: 443): WK(V/L)(R/K) wobei Aminosäuren in Klammem alternative Aminosäuren an derselben Stelle darstellen; (iv) Motiv 15 (SEQ ID NO: 444): TDFI; (v) Motiv 16 (SEQ ID NO: 445): (SN)(V/I)(G/R/S/A)GL(T/S); (vi) Motiv 17 (SEQ ID NO: 446): LGDF(G/R)(A/R)(R/A)(D/G)P; (vii) Motiv 18 (SEQ ID NO: 447): H(R/K)ILIP(T/A)
    • 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein PCD-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die für ein PCD-Polypeptid kodiert, für eines der Proteine kodiert, die in Tabelle A3 aufgelistet sind, oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure, die zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure imstande ist.
    • 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A3 angegebenen Proteine kodiert.
    • 6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Früh-Wuchskraft und/oder erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stressbedingungen erhalten werden.
    • 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Dürrestress, Salzstress oder Stickstoffmangel erhalten werden.
    • 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor von Reis, verbunden ist.
    • 10. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die für ein PCD-Polypeptid kodiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise von einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt von der Familie Poaceae, besonders bevorzugt von der Gattung Oryza, ganz besonders bevorzugt von Oryza sativa.
    • 11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 10, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein PCD-Polypeptid kodiert.
    • 12. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein PCD-Polypeptid kodiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
    • 13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor von Reis handelt.
    • 14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen.
    • 15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
    • 16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein PCD-Polypeptid kodiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) Selektieren auf Pflanzen mit erhöhtem Ertrag.
    • 17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, relativ zu Kontrollpflanzen. der aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure resultiert, die für ein PCD-Polypeptid kodiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
    • 18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
    • 19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • 20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
    • 21. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein PCD-Polypeptid kodiert, in der Erhöhung des Ertrags, insbesondere in der Erhöhung der Früh-Wuchskraft und/oder in der Erhöhung der Biomasse und/oder Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen, relativ zu Kontrollpflanzen.
  • 4. Pseudo Response Regulator Typ 2 (PRR2)
    • 1. Ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen, umfassend die Erhöhung der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Pseudo Response Regulator Typ 2 (PRR2) Polypeptid kodiert, wobei das PRR2-Polypeptid (i) eine Signaleitungs-Response Regulator Rreceiver Region mit einem InterPro Entry IPR001789; und (ii) eine Mybartige DNA Bindungsregion (SHAQKYF-Klasse) mit einem InterPro Entry IPR006447 umfasst, und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften.
    • 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das PRR2-Polypeptid (i) mit zunehmender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Pseudo Response Receiver Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 475; und (ii) mit zunehmender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Myb-artigen DNA Bindungsdomäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 476, umfasst.
    • 3. Verfahren gemäß Punkt 2, wobei das PRR2-Polypeptid des Weiteren, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer C-terminalen konservierten Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 477, umfasst.
    • 4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei das PRR2-Polypeptid. wenn es in der Konstruktion eines Response Receiver Domäne phylogenetischen Stammes verwendet wird, wie jenem. der in 11 dargestellt ist. Cluster mit der APRR2 (Pseudo Response Regulator Typ 2) Gruppe von Polypeptiden bildet, die die Polypeptidsequenzen umfasst, die durch SEQ ID NO: 452 und SEQ ID NO: 456 dargestellt sind, anstatt mit irgendeiner anderen Gruppe.
    • 5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei das PRR2-Polypeptid, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einem PRR2-Polypeptid, dargestellt durch SEQ ID NO: 452. oder einer der Polypeptidsequenzen, die hierin in Tabelle A4 angeführt sind, aufweist.
    • 6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, durch eine der Nukleinsäuresequenzen mit der SEQ ID NR, die in Tabelle A4 angeführt sind, dargestellt ist, oder ein Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer der Nukleinsäuresequenzen der SEQ ID NR, die in Tabelle A4 angeführt sind, oder an ein Komplement davon in der Lage ist.
    • 7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog einer der Polypeptidsequenzen der SEQ ID NR. die in Tabelle A4 angeführt sind. kodiert.
    • 8. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die erhöhte Expression durch eines oder mehrere der Folgenden bewirkt wird: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination.
    • 9. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, bewirkt wird.
    • 10. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft eine oder mehrere der Folgenden ist: erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhte Früh-Wachskraft, frühere Blüte, erhöhte Wurzelbiomasse, erhöhte Pflanzenhöhe, erhöhter Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Anzahl gefüllter Samen, erhöhte Gesamtanzahl an Samen, erhöhte Anzahl an primären Rispen, erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, erhöhter Ernteindex (HI) und erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW).
    • 11. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig an einen konstitutiven Promotor gebunden ist.
    • 12. Verfahren gemäß Punkt 11, wobei der konstitutive Promotor ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor von Reis, insbesondere eine GOS2-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 478 ist.
    • 13. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz. die für ein PRR2-Polypeptid kodiert. von einer Pflanze stammt, weiter bevorzugt von einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt von der Familie Solanaceae, und ganz besonders bevorzugt die Nukleinsäuresequenz von Lycopersicon esculentum ist.
    • 14. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, die durch ein Verfahren gemäß einem der vorangehenden Punkte erhältlich sind, wobei die Pflanze, der Teil oder die Zelle davon ein isoliertes Nukleinsäure-Transgen umfasst, das für ein PRR2-Polypeptid kodiert.
    • 15. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus: (i) einer Nukleinsäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 459; (ii) dem Komplement einer Nukleinsäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 459; (iii) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, das, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit der Polypeptidsequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 460 dargestellt ist.
    • 16. Isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus: (i) einer Polypeptidsequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 460; (ii) einer Polypeptidsequenz, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit einer Polypeptidsequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 460 dargestellt ist; (iii) Derivaten einer der Polypeptidsequenzen, die oben unter (i) oder (ii) angeführt sind.
    • 17. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, wie in einem der Punkte 1 bis 7, oder 15 definiert: (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
    • 18. Konstrukt gemäß Punkt 17 wobei die Steuerungssequenz ein konstitutiver Promotor ist.
    • 19. Konstrukt gemäß Punkt 18 wobei der konstitutive Promotor ein GOS2-Promotor ist. vorzugsweise ein GOS2-Promotor von Reis, insbesondere eine GOS2-Sequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 28.
    • 20. Verwendung eines Konstrukts gemäß einem der Punkte 17 bis 19 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften eine oder mehrere der Folgenden sind: erhöhte oberirdische Biomasse. erhöhte Früh-Wuchskraft, frühere Blüte, erhöhte Wurzelbiomasse, erhöhte Pflanzenhöhe, erhöhter Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Anzahl gefüllter Samen, erhöhte Gesamtanzahl an Samen, erhöhte Anzahl an primären Rispen, erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, erhöhter Ernteindex (HI) und erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW).
    • 21. Pflanze. Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt gemäß einem der Punkte 17 bis 19.
    • 22. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, wie in einem der Punkte 1 bis 7, oder 15 definiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
    • 23. Transgene Pflanze mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen, die aus einer erhöhten Expression einer isolierten Nukleinsäuresequenz resultieren, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, wie in einem der Punkte 1 bis 7, oder 15 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, der von der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
    • 24. Transgene Pflanze gemäß Punkt 14, 21. oder 23, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen. Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine transgene Pflanzenzelle. die von der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
    • 25. Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, einer Pflanze gemäß Punkt 24, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
    • 26. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 24 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 25 abgeleitet sind.
    • 27. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, wie in einem der Punkte 1 bis 7, oder 15 definiert, in der Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften. umfassend eine oder mehrere der Folgenden: erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhte Früh-Wuchskraft, frühere Blüte, erhöhte Wurzelbiomasse. erhöhte Pflanzenhöhe, erhöhter Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Anzahl gefüllter Samen. erhöhte Gesamtanzahl an Samen. erhöhte Anzahl an primären Rispen. erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, erhöhter Ernteindex (HI) und erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW).
  • Beschreibung der Figuren
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
  • 1 ein mehrfaches Sequenz-Alignment von bHLH9-Polypeptiden darstellt. Die Position der HLH-Domäne ist über der Konsensussequenz (unterstrichene Sequenz) angegeben. Die Position der 5-9-13 Konfiguration ist in der Konsensussequenz eingerahmt.
  • 2 zeigt den phylogenetischen Stamm von bHLH9-Polypeptiden.
  • 3 stellt den binären Vektor dar, der für eine erhöhte Expression in Oryza sativa einer bHLH9-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis GOS2-Promotors (pGOS2) verwendet wird.
  • 4 stellt die Domänenstruktur des IMB1-Polypeptids dar. Tafel a zeigt die Position der Domänen in SEQ ID NO: 301. Domäne 7 fehlt als solche in SEQ ID NO: 301. tritt aber in anderen IMB1-Proteinen auf. Das vorhergesagte Nuclear Localization Signal ist kursiv dargestellt. Tafel b zeigt ein Alignment zwischen SEQ ID NO: 301 und IMB1 von Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 336: Duque und Chua, 2003), wobei die Position der Bromodomäne (identifiziert durch Pfam, fett unterstrichen) und der NET Domäne angegeben sind (identifiziert in Duque und Chua, 2003, fett).
  • 5 stellt ein mehrfaches Alignment verschiedener IMB1-Proteine dar. Konservierte Regionen unter den Proteinen sind leicht zu erkennen.
  • 6 zeigt einen phylogenetischen Stamm, in dem die Gruppe von IMB1-Proteinen als IMB1/GTE1 angegeben ist.
  • 7 stellt den binären Vektor dar, der für eine erhöhte Expression in Oryza sativa einer IMB1-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis GOS2-Promotors (pGOS2) verwendet wird.
  • 8 stellt ein mehrfaches Alignment von PCD-Polypeptiden dar.
  • 9 zeigt einen phylogenetischen Stamm von PCD-Polypeptiden wie in 3B von Naponelli et al.
  • 10 stellt den binären Vektor dar, der für eine erhöhte Expression in Oryza sativa einer PCD-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis GOS2-Promotors (pGOS2) verwendet wird.
  • 11 stellt das phylogenetische Verhältnis unter Response Regulatoren und Pseudo Response Regulatoren von Arabidopsis thaliana dar, basierend auf der Aminosäuresequenz der Receiver Domäne. Zahlen geben den Prozentsatz an Bootstrap-Replikaten an, die denselben Zweig nach 1.000 Iterationen ergeben (nach Mason et al. (2004) Plant Phys 135: 927–937). Polypeptide, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, bilden Cluster mit APRR2, markiert durch einen schwarzen Pfeil.
  • 12 stellt eine Zeichnung eines PRR2-Polypeptids dar, dargestellt durch SEQ ID NO: 452, das die folgenden Merkmale aufweist: (i) eine Signalleitungs-Response Regulator Receiver Region mit einem InterPro Entry IPR001789, wobei der kanonische D Rest der Response Regulator Receiver Region durch einen E Rest einer Pseudo Response Regulator Receiver Region ersetzt ist; und (ii) ein B Motiv oder eine GARP-Domäne oder Myb-artige DNA-Bindungsregion (SHAQKYF-Klasse) mit einem InterPro Entry IPR006447.
  • 13 zeigt ein AlignX (von Vektor NTI 10.3, Invitrogen Corporation) Mehrfach-Sequenz-Alignment der PRR2-Polypeptide von Tabelle A4. Eine Signalleitungs-Response Regulator Receiver Region mit einem InterPro Entry IPR001789, ein B Motiv (oder eine GARP-Domäne oder Myb-artige DNA-Bindungsregion (SHAQKYF-Klasse) mit einem InterPro Entry IPR006447) und eine C-terminale konservierte Domäne, sind mit X's unter der Konsensussequenz markiert. Der Pseudo Response Regulator Receiver Rest E ist eingerahmt.
  • 14 zeigt den binären Vektor für eine erhöhte Expression in Oryza sativa Pflanzen einer Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines Promotors, der in Pflanzen wirkt.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche nur der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
  • DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994). Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
  • Beispiel 1: Identifizieren von Sequenzen, die mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurden unter jenen, die in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) und anderen Datenbanken geführt werden, unter Verwendung von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das durch die in der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure kodierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter, so dass Sequenzen geringer Komplexität ignoriert wurden. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.
  • 11. Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9 (bHLH9)
  • In Tabelle A1 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A: Beispiele für bHLH9-Nukleinsäuren und Polypeptide:
    Name Nukleinsäure SEQ ID NO: Polypeptid SEQ ID NO:
    O.sativa_Os01g0900800 1 2
    A:thaliana_bHLH130_9AT2G42280 3 4
    A.thaliana_bHLH122_9_AT1G51140 5 6
    A.thaliana_bHLH081_9_AT4G09180 7 8
    A.thaliana_bHLH080_9_AT1G35460 9 10
    A.thaliana_bHLH128_9_AT1G05805 11 12
    A.thaliana_bHLH129_9_AT2G43140 13 14
    A.formosa_TA12011_338618 15 16
    A.formosa_TA18296_338618 17 18
    B.napus_BPS_9258 19 20
    B.oleracea_EH428573 21 22
    B.oleracea_TA6610_3712 23 24
    C.clementina_TA5735_85681 25 26
    C.intybus_EH689338 27 28
    C.obtusa_BW987363 29 30
    C.sinensis_TA15236_2711 31 32
    C.sinensis_TA15331_2711 33 34
    C.solstitialis_EH761577 35 36
    C.tinctorius_EL407531 37 38
    E.esula_TA10959_3993 39 40
    G.hirsutum_TA24161_3635 41 42
    G.hybrid_AJ763309 43 44
    G.max_BPS_22716 45 46
    G.max_BPS_39182 47 48
    G.max_TA56453_3847 49 50
    G.max_TA57335_3847 51 52
    G.max_TA63030_3847 53 54
    G.raimondii_TA12344_29730. 55 56
    G.soja_CA783858 57 58
    H.ciliaris_EL431737 59 60
    H.paradoxus_EL487892 61 62
    H.petiolaris_DY944559 63 64
    H.vulgare_TA45248_4513 65 66
    H.vulgare_TA47636_4513 67 68
    I.nil_TA15694_35883 69 70
    I.nil_TA8920_35883 71 72
    I.nil_TA9081_35883 73 74
    I.nil_TA9289_35883 75 76
    L.saligna_TA4923_75948 77 78
    L.sativa_TA5039_4236 79 80
    L.serriola_DW114802 81 82
    M.truncatula_AC141114_16.2 83 84
    M.truncatula_AC149471_36.2 85 86
    M.truncatula_TA37090_3880 87 88
    N.benthamiana_TA8284_4100 89 90
    N.benthamiana_TA8285_4100 91 92
    O.sativa_LOC_Os02g39140.1 93 94
    O.sativa_Os04g0489600 95 96
    O.sativa_Os08g0506700 97 98
    O.sativa_Os09g0487900 99 100
    P.patens_121037_e_gw1.34.393.1 101 102
    P.patens_148201_e_gw1.273.42.1 103 104
    P.patens_TA27139_3218 105 106
    P.patens_TA32785_3218 107 108
    P.taeda_TA15788_3352 109 110
    P.tremula_DN488299 111 112
    P.tremula_TA18674_47664 113 114
    P.trichocarpa_scaff_I.1785 115 116
    P.trichocarpa_scaff_III.1580 117 118
    P.trichocarpa_scaff_IX.1004 119 120
    P.trichocarpa_scaff_XIV.978 121 122
    P.trichocarpa_scaff_XIX.717 123 124
    P.trichocarpa_scaff_XVI.437 125 126
    R.communis_EG683575 127 128
    S.bicolor_TA33134_4558 129 130
    S.lycopersicum_TA38189_4081 131 132
    S.lycopersicum_TA46743_4081 133 134
    S.offcinarum_CA143325 135 136
    S.officinarum_TA45654_4547 137 138
    S.tuberosum_CV506096 139 140
    S.tuberosum_TA26686_4113 141 142
    S.tuberosum_TA29368_4113 143 144
    S.tuberosum_TA37004_4113 145 146
    S.tuberosum_TA40158_4113 147 148
    T.aestivum_TA88301_4565 149 150
    T.officinale_DY832981 151 152
    V.vinifera_GSVIVT00001847001 153 154
    V.vinifera_GSVIVT00005670001 155 156
    V.vinifera_GSVIVT00008845001 157 158
    V.vinifera_GSVIVT00024649001 159 160
    V.vinifera_GSVIVT00025522001 161 162
    V.vinifera_TA49422_29760 163 164
    Z.mays_BPS_3797 165 166
    Z.mays_BPS_30292 167 168
    Z.mays_BPS_52761 169 170
    Z.mays_TA16655_4577999 171 172
    Z.officinale_TA2571_94328 173 174
    Z.officinale_TA334_94328 175 176
    Z.officinale_TA5709_94328 177 178
    Z.officinale_TA6615_94328 179 180
  • 1.2. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • In Tabelle A2 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A2: Beispiele für IMB1 Nukleinsäuren und Polypeptide:
    Ursprungspflanze Nukleinsäure SEQ ID NO: Protein SEQ ID NO:
    Arabidopsis thaliana_AT2G34900_GTE1 314 336
    Arabidopsis thaliana AT3G52280_GTE6 315 337
    Centaurea solstitialis_TA2829 316 338
    Gossypium hirsutum_TA31156 317 339
    Gossypium raimondii_CO070884 318 340
    Gossypium raimondii_TA13411 319 341
    Lactuca saligna_DW067496 320 342
    Medicago truncatula_AC174355 321 343
    Medicago truncatula_GTE1302 322 344
    Oryza sativa_GTE2201 323 345
    Oryza sativa_GTE701 324 346
    Physcomitrella patens_GTE1501 325 347
    Physcomitrella patens_GTE1502 326 348
    Physcomitrella patens_GTE1505 327 349
    Populus trichocarpa_GTE907 328 350
    Populus trichocarpa_GTE908 329 351
    Populus trichocarpa_GTE909 330 352
    Sorghum bicolor_TA26028 331 353
    Triticum aestivum_TA83944 332 354
    Vitis vinifera_GSVIVT00002627001 333 355
    Vitis vinifera_GSVIVT00008344001 334 356
    Zea mays_GTE110 335 357
  • In manchen Fällen wurden verwandte Sequenzen von Forschungsinstitutionen wie The Institute for Genomic Research (TIGR) provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht. Mit der Datenbank ”Eukaryontic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren.
  • 1.3. PCD-artig
  • In Tabelle A3 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A3: Beispiele für PCD-Nukleinsäuren und Polypeptide:
    Name Nukleinsäure SEQ ID NO: Polypeptid SEQ ID NO:
    O.sativa_Os03g0100200 358 359
    A.cepa_CF450468#1 360 361
    A.thaliana_AT1G29810.1#1 362 363
    A.thaliana_AT5G51110.1#1 364 365
    AT1G29810.1#1 366 367
    AT5G51110.1#1 368 369
    H.vulgare_BQ462597#1 370 371
    H.vulgare_TA37167_4513#1 372 373
    H.vulgare_TA39366_4513#1 374 375
    M.truncatula_TA24237_3880#1 376 377
    O.sativa_Os01g0390600#1 378 379
    O.sativa_Os01g0663500#1 380 381
    P.trichocarpa_DCOH like 382 383
    P.trichocarpa_scaff_232.30#1 384 385
    P.trichocarpa_scaff_XI.475#1 386 387
    S.lycopersicum_BP905715#1 388 389
    S.lycopersicum_DB718111#1 390 391
    S.lycopersicum_TA38587_4081#1 392 393
    S.officinarum_CA113975#1 394 395
    S.officinarum_CA275526#1 396 397
    S.officinarum_CA275597#1 398 399
    T.aestivum_CA600360#1 400 401
    T.aestivum_CA631555#1 402 403
    T.aestivum_CA636226#1 404 405
    T.aestivum_CA678224#1 406 407
    T.aestivum_CA721065#1 408 409
    T.aestivum_CA729021#1 410 411
    T.aestivum_CK206167#1 412 413
    T.aestivum_CK211978#1 414 415
    T.aestivum_CK212253#1 416 417
    T.aestivum_CK212754#1 418 419
    T.aestivum_CN012063#1 420 421
    T.aestivum_CV761453#1 422 423
    T.aestivum_CV768439#1 424 425
    T.aestivum_CV772309#1 426 427
    T.aestivum_TA70795_4565#1 428 429
    T.aestivum_TA70797_4565#1 430 431
    T.aestivum_TA70798_4565#1 432 433
    T.aestivum_TA70799_4565#1 434 435
    T.aestivum_TA70800_4565#1 436 437
    T.aestivum_TA92660_4565#1 438 439
  • In manchen Fallen wurden verwandte Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht. Mit der Datenbank ”Eukaryontic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Ferner hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
  • 1.4. Pseudo Response Requlator Typ 2 (PRR2)
  • In Tabelle A4 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen. Tabelle A4: Beispiele für PRR2-Nukleinsäuren und Polypeptidsequenzen
    Name Öffentl. Datenbanks-Zugangsnummer Nukleinsäure SEQ ID NO: Polypeptid SEQ ID NO:
    Lyces_PRR2 NA 451 452
    Aqufo_PRR2 DT734703 DR929648.1 DR949155.1 453 454
    Arath_APRR2 At4g18020 455 456
    Eucgr_PRR2 NA 457 458
    Glyma_PRR2 BE330069.1 BE659830.1 BE661803.1 FK011978.1 proprietary 459 460
    Lotja_PRR2 AP004489 461 462
    Lyces_PRR2 II AC226015 463 464
    Medtr_PRR2 AC144516.5 465 466
    Poptr_PRR2 I Icl_scaff_29.152 467 468
    Poptr_PRR2 II Icl_scaff_118.53 469 470
    Vitvi_PRR2 AM443941 471 472
    Orysa_PRR2 like AK242722 473 474
  • In manchen Fällen wurden verwandte Sequenzen von Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht. Mit der Datenbank ”Eukaryontic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Ferner hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
  • Beispiel 2: Alignment von Sequenzen, die mit den in den Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptidsequenzen verwandt sind
  • 2.1. Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9 (bHLH9)
  • Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des AlignX Programms von Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem beliebten Clustal W Algorithmus eines progressives Alignments beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Vorgabewerte sind für Gap Open Penalty 10, für Gap Extension Penalty 0,1 und die gewählte Gewichtsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Eine Sequenzkonservierung unter bHLH9-Polypeptiden findet sich im Wesentlichen in der HLH-Domäne der Polypeptide. Die bHLH9-Polypeptide sind in 1 aligniert.
  • Es wurde ein phylogenetischer Stamm von bHLH9-Polypeptiden (2) mit Hilfe eines Nachbarn verbindenden Clusterbildungs-Algorithmus konstruiert, wie in dem AlignX Programme von Vector NTI (Invitrogen) vorgesehen. Wie in dem Stamm dargestellt, bildet SEQ ID NO: 2 (O.sativa_Os01g0900800) innerhalb der bHLH9-Klade (Gruppe), die durch A.thaliana bHLH130 9 AT2G42280; A.thaliana bHLH122 9 AT1G51140; A.thaliana bHLH081 9 AT4G09180; A.thaliana bHLH080 9 AT1G35460; A.thaliana bHLH128 9 AT1G05805; und A.thaliana bHLH129 9 AT2G43140 definiert ist, Cluster.
  • Die Sequenzen, die in der Konstruktion des Stamms verwendet werden, sind SEQ ID NO: 2, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298 und 299. Es sollte festgehalten werden, dass Sequenzen, die durch SEQ ID NO: 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298 und 299 dargestellt sind, bHLH-Proteine darstellen, die nicht zu der bHLH9-Klade (Gruppe) gehören und somit nicht Teil der Erfindung sind.
  • 2.2. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des MUSCLE 3.7 Programms (Edgar, Nucleic Acids Research 32, 1792–1797, 2004) durchgeführt. Vorgabewerte sind für Gap Open Penalty 10, für Gap Extension Penalty 0.1 und die gewählte Gewichtsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die Sequenzkonservierung unter IMB1-Polypeptiden findet sich im Wesentlichen in der Bromodomäne der Polypeptide und in the NET Domäne, während der Rest der Proteinsequenz für gewöhnlich in der Sequenzlänge und -zusammensetzung variabler ist. Die IMB1-Polypeptide sind in 5 aligniert.
  • Es wurde ein phylogenetischer Stamm von IMB1-Polypeptiden (6) konstruiert: Die Proteine wurden mit Hilfe von MUSCLE (Edgar (2004), Nucleic Acids Research 32(5): 1792–97) aligniert. Ein Nachbarn verbindender Stamm wurde mit Hilfe von QuickTree (Howe et al. (2002), Bioinformatics 18(11): 1546–7) berechnet. Eine Bestätigung der Hauptverzweigung nach 100 Bootstrap-Wiederholungen ist angezeigt. Mit Hilfe eines Dendroskops wurde ein kreisförmiges Kladogramm erstellt (Huson et al. (2007), BMC Bioinformatics 8(1): 460). 4 verschiedene Unterklassen von GTE können mit guter statistischer Bestätigung definiert werden. Andere GTEs und Bromodomäne-Proteine sind schwierig, einer Klasse mit Konfidenz zuzuordnen.
  • Eine MEME Analyse (Bailey et al. Nucleic Acids Research 34, W369–W373, 2006), die die in Tabelle A angeführten Sequenzen verwendete, ergab die folgenden Motive:
    Figure 01080001
    Figure 01090001
  • 2.3. PCD-artig
  • Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des AlignX Programms von Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem beliebten Clustal W Algorithmus eines progressives Alignments beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003), Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Vorgabewerte sind für Gap Open Penalty 10, für Gap Extension Penalty 0,1 und die gewählte Gewichtsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Eine Sequenzkonservierung unter PCD-Polypeptiden findet sich im Wesentlichen in der C-terminalen PCD-Domäne der Polypeptide, wobei die N-terminale Domäne für gewöhnlich in der Sequenzlänge und -zusammensetzung variabler ist. Die PCD-Polypeptide sind in 9 aligniert.
  • 2.4. Pseudo Response Regulator Tvp 2 (PRR2)
  • Ein mutliples Sequenzalignment aller PRR2-Polypeptidsequenzen in Tabelle A4 wurde unter Verwendung des AlignX Algorithmus (von Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt. Ergebnisse der Alignments sind in 3 der vorliegenden Anmeldung gezeigt. Eine Signalleitungs-Response Regulator Receiver Region mit einem InterPro Entry IPR001789, einem B Motiv (oder einer GARP-Domäne oder Myb-artigen DNA-Bindungsregion (SHAQKYF-Klasse) mit einem InterPro Entry IPR006447), und einer C-terminalen konservierten Domäne sind mit X's unter der Konsensussequenz markiert. Der Pseudo Response Regulator Receiver Rest E ist eingerahmt.
  • Beispiel 3: Berechnung von globaler prozentualer Identität zwischen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Polypeptidsequenzen
  • 3.1. Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9 (bHLH9)
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind. wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics, 2003 4: 29, MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einer Gap Open Penalty von 12 und einer Gap Extension Penalty von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
    Wertungsmatrix: Blosum62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist unter der Diagonale angegeben und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist über der Diagonale angegeben.
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den bHLH9-Polypeptidsequenzen von Tabelle B1 kann lediglich 21,2% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 betragen.
  • Figure 01110001
  • 3.2. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, 5 nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics, 2003 4: 29, MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences, Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einer Gap Open Penalty von 12 und einer Gap Extension Penalty von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
    Wertungsmatrix: Blosum62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B2 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der 25 Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den IMB1-Polypeptidsequenzen, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, kann lediglich 31% Aminosäureidentität im Vergleich zu SEQ ID NO: 301 betragen. Durchschnittlich ist die Identität innerhalb des Clusters von IMB1/GTE1 Proteinen 47%; die maximale Identität mit Proteinen außerhalb dieses Clusters ist 30% und die minimale Identität ist 8%. Tabelle B2: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.
    Figure 01120001
    Figure 01130001
    Figure 01130002
    Figure 01140001
    Figure 01140002
  • 3.3. PCD-artig
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics, 2003 4: 29, MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einer Gap Open Penalty von 12 und einer Gap Extension Penalty von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix.
  • Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
    Wertungsmatrix: Blosum62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Es kann auch eine MATGAT Tabelle für das lokale Alignment einer spezifischen Domäne, oder für Daten zur % Identität/Ähnlichkeit zwischen spezifischen Domänen erstellt werden.
  • 3.4. Pseudo Response Regulator Tvp 2 (PRR2)
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einer Gap Open Penalty von 12 und einer Gap Extension Penalty von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
    Wertungsmatrix: Blosum62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle 63 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt (mit Ausnahme der Polypeptid-Teilsequenzen).
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten Volllängenpolypeptidsequenzen kann, verglichen mit der SEQ ID NO: 452 lediglich 46% Aminosäureidentität betragen. Tabelle B3: MatGAT-Ergebnisse für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen von Tabelle A4.
    Figure 01160001
  • Die prozentuale Aminosäureidentität lässt sich signifikant erhöhen, wenn man die am meisten konservierte Region der Polypeptide vergleicht. Wenn zum Beispiel die Aminosäuresequenz einer Pseudo Response Receiver Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 475, oder einer Myb-artigen DNA Bindungsdomäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 476, oder einer C-terminalen konservierten Domäne, dargestellt durch SEQ ID NO: 477 mit den entsprechenden Domänen der Polypeptide von Tabelle A4 verglichen wird, erhöht sich der Prozentsatz der Aminosäureidentität signifikant (mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität).
  • Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, die in Polypeptidsequenzen enthalten sind, die sich für die Durchführung der Verfahren der Erfindung eignen
  • Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains und Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modelle, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird vor Sanger Institute Server im United Kingdom betrieben. Interpro wird vom European Bioinformatics Institute im United Kingdom betrieben.
  • 4.1. Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9 (bHLH9)
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NO: 2 repräsentiert, sind in der Tabelle C1 dargestellt. Tabelle C1: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird.
    Databank Zugangsnummer Name der Domäne Aminosäurekoordinaten T[Start–Ende] E-Wert
    InterPro IPR001092 Basis-Helix-Loop-Helix Dimerisationsregion bHLH
    HMMPfam PF00010 HLH oder bHLH T[318–366] 6.4E-5
    HMMSmart SM00353 HLH T[321–371] 1.2E-12
    ProfileScan PS50888 HLH T[309–366] 0.0
    InterPro IPR011598 Helix-loop-helix DNA-Bindung
    Gene3D G3DSA:4:10.280.10 HLH_DNA_bd T[311–377] 7.4E-5
    Superfamily SSF47459 HLH_Basis T[311–385] 2.2E-12
  • Zusätzlich ermöglichte ein Vergleich von SEQ ID NO: 2 (O.sativa_Os01g0900800) mit anderen bHLH9-Pölypeptidsequenzen von Tabelle A1 die Identifizierung der hochkonservierten HLH Domäne in den bHLH9-Polypeptiden. Tabelle C2 zeigt die Gegenwart der Aminosäuresequenz der HLH Domäne in bHLH9-Polypeptiden von Tabelle A1. Tabelle C2. Aminosäureseuenz der HLH Domäne in bHLH9-Polypeptiden.
    bHLH9-Polypeptid bHLH9-Polypeptid SEQ ID NO: HLH Domäne SEQ ID NO:
    O.sativa_Os01g0900800 2 225
    A.thaliana_bHLH130_9_AT2G42280 4 181
    A.thaliana_bHLH122_9_AT1 G51140 6 182
    A.thaliana_bHLH081_9_AT4G09180 8 183
    A.thaliana_bHLH080_9_AT1G35460 10 184
    A.thaliana_bHLH128_9_AT1G05805 12 185
    A.thaliana_bHLH129_9_AT2G43140 14 186
    B.napus_BPS_9258 20 187
    B.oleracea_EH428573 22 188
    B.oleracea_TA6610_3712 24 189
    C.clementina_TA5735_85681 26 190
    C.intybus_EH689338 28 191
    C.obtusa_BW987363 30 192
    C.sinensis_TA15236_2711 32 193
    C.sinensis_TA15331_2711 34 194
    C.solstitialis_EH761577 36 195
    C.tinctorius_EL407531 38 196
    E.esula_TA10959_3993 40 197
    G.hirsutum_TA24161_3635 42 198
    G.hybrid_AJ763309 44 199
    G.max_BPS_22716 46 200
    G.max_BPS_39182 48 201
    G.max_TA56453_3847 50 202
    G.max_TA57335_3847 52 203
    G.max_TA63030_3847 54 204
    G.raimondii_TA12344_29730 56 205
    G.soja_CA783858 58 206
    H.ciliaris_EL431737 60 207
    H.paradoxus_EL487892 62 208
    H.petiolaris_DY944559 64 209
    H.vulgare_TA45248_4513 66 210
    H.vulgare_TA47636_4513 68 211
    I.nil_TA15694_35883 70 212
    I.nil_TA8920_35883 72 213
    I.nil_TA9081_35883 74 214
    I.nil_TA9289_35883 76 215
    L.saligna_TA4923_75948 78 216
    L.sativa_TA5039_4236 80 217
    L.serriola_DW114802 82 218
    M.truncatuta_AC141114_16.2 84 219
    M.truncatula_AC149471_36.2 86 220
    M.truncatula_TA37090_3880 88 221
    N.benthamiana_TA8284_4100 90 222
    N.benthamiana_TA8285_4100 92 223
    O.sativa_LOC_Os02g39140.1 94 224
    O.sativa_Os04g0489600 96 226
    O.sativa_Os08g0506700 98 227
    O.sativa_Os.09g0487900 100 228
    P.patens_121037_e_gw1.34.393.1 102 229
    P.patens_148201_e_gw1.273.42.1 104 230
    P.patens_TA27139_3218 106 231
    P.patens_TA32785_3218 108 232
    P.taeda_TA15788_3352 110 233
    P.tremula_DN488299 112 234
    P.tremula_TA18674_47664 114 235
    P.trichocarpa_scaff_I.1785 116 236
    P.trichocarpa_scaff_III.1580 118 237
    P.trichocarpa_scaff_IX.1004 120 238
    P.trichocarpa_scaff_XIV.978 122 239
    P.trichocarpa_scaff_XIX.717 124 240
    P.trichocarpa_scaff_XVI.437 126 241
    R.communis_EG683575 128 242
    S.bicolor_TA33134_4558 130 243
    S.Iycopersicum_TA38189_4081 132 244
    S.lycopersicum_TA46743_4081 134 245
    S.officinarum_CA143325 136 246
    S.officinarum_TA45654_4547 138 247
    S.tuberosum_CV506096 140 248
    S.tuberosum_TA26686_4113 142 249
    S.tuberosum_TA29368_4113 144 250
    S.tuberosum_TA37004_4113 146 251
    S.tuberosum_TA40158_4113 148 252
    T.aestivum_TA88301_4565 150 253
    T.officinale_DY832981 152 254
    V.vinifera_GSVIVT00001847001 154 255
    V.vinifera_GSVIVT00005670001 156 256
    V.vinifera_GSVIVT00008845001 158 257
    V.vinifera_GSVIVT00024649001 160 258
    V.vinifera_GSVIVT00025522001 162 259
    V.vinifera_TA49422_29760 164 260
    Z.mays_BPS_3797 166 261
    Z.mays_BPS_30292 168 262
    Z.mays_BPS_52761 170 263
    Z.mays_TA16655_4577999 172 264
    Z.officinale_TA2571_94328 174 265
    Z.officinale_TA334_94328 176 266
    Z.officinale_TA5709_94328 178 267
    Z.offcinale_TA6615_94328 180 268
  • 4.2. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NO: 301 repräsentiert, sind in der Tabelle C3 dargestellt. Tabelle C3: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NO: 301 repräsentiert wird.
    Databank Zugangsnummer Zugangsname Aminosäurekoordinaten zu SEQ ID NR 301
    InterPro IPR001487 Bromodomain
    FPrintScan PR00503 BROMODOMAIN T[114–127] T[130–146] T[167–186]
    Gene3D G3DSA:1.20.920.10 nicht beschrieben T[75–234]
    HMMPfam PF00439 Bromodomain T[99–191]
    HMMSmart SM00297 nicht beschrieben T[92–205]
    Superfamily SSF47370 Bromodomain T[73–216]
  • 4.3. PCD-artig
  • Die Proteinsequenzen, die GRP darstellen, werden als Abfrage zum Durchsuchen der InterPro Datenbank verwendet.
  • 4.4 Pseudo Response Regulator Typ 2 (PRR2)
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NO: 452 repräsentiert, sind in der Tabelle C4 dargestellt. Tabelle C4: InterPro-Scan Ergebnisse der Polypeptidsequenz, die durch SEQ ID NO: 452 dargestellt ist
    InterPro Zugangsnummer und Name Integrierter Datenbankname Integrierte Datenbank-Zugangsnummer Integrierter Datenbank-Zugangsname
    IPR001789 Signal transduction response regulator, receiver region ProDOM PD000039 Q9LKL2_Arath
    PFAM PF00072 Response_reg
    SMART SM00448 REC
    IPR006447 Myb-like DNA-binding region, SHAKYF TIGR TIGR01557 Myb_SHAQKYF; myb-like DNA-binding domain
    IPR012287 Homeo-domain related G3DSA G3DSA/1.10.10.60 unbeschrieben
    IPR014778 Myb, DNA-binding PFAM PF00249 Myb_DNA-binding
  • Beispiel 5: Topologie-Vorhersage der für die Durchführung der Erfindung geeigneten Polypeptidsequenzen
  • 5.1. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP).
  • Bewertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten und sie müssen nicht unbedingt Eins ergeben. Die Stelle mit der höchsten Bewertung ist jedoch die wahrscheinlichste laut TargetP, und das Verhältnis zwischen den Bewertungen (die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class”) kann ein Hinweis darauf sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
  • Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
  • Eine Anzahl von Parameter wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NO: 301 dargestellten Polypeptidsequenz sind in Tabelle D1 angeführt. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Polypeptidsequenz kann es sich um das Zytoplasma oder den Zellkern handeln, wobei kein Transitpeptid vorhergesagt wird. Tabelle D1: TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NO: 301 dargestellten Polypeptidsequenz. Abkürzungen: Len, Länge; cTP, Chloroplasten-Transit-Peptid; mTP, mitochondriales Transit-Peptid; SP, Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid; other, anderes subzelluläres Targeting; Loc, vorhergesagte Stelle; RC, Zuverlässigkeitsklasse; TPIen, vorhergesagte Transit-Peptidlänge.
    Name Len cTP mTP SP other Loc RC TPIen
    Le_IMB1 378 0,080 0,110 0,033 0,921 - 1 -
    Cutoff 0,000 0,000 0,000 0,000
  • Bei einer Analyse mit anderen Algorithmen wird eine nukleare Lokalisierung vorhergesagt, in Übereinstimmung mit der Funktion als Transkriptionsfaktor.
  • Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
    • • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
    • • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • PSORT (URL: psort.org);
    • • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
  • 5.2. PCD-artig
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Bewertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten und sie müssen nicht unbedingt Eins ergeben. Die Stelle mit der höchsten Bewertung ist jedoch die wahrscheinlichste laut TargetP, und das Verhältnis zwischen den Bewertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann ein Hinweis darauf sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
  • Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
  • Eine Anzahl von Parametern wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
  • Die Proteinsequenzen, die GRP darstellen, werden zur Abfrage von TargetP 1.1 verwendet. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert.
  • Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
    • • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
    • • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark.
  • Beispiel 6: Subzelluläre Lokalisierungsvorhersage der für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten Polypeptidsequenzen
  • 6.1. Pseudo Response Requlator Typ 2 (PRR2)
  • Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunolokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder Beta-Glucuronidase (GUS). Solche Verfahren zur Identifizierung subzellulärer Kompartimentierung von GRF Polypeptiden sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt.
  • Ein vorhergesagtes nukleares Lokalisierungssignal (NLS) wurde durch Mehrfach-Sequenz-Alignment, gefolgt von einer visuellen Überprüfung, in den Polypeptidsequenzen von Tabelle A4 gefunden (für SEQ ID NO: 452 KSNRKKIK). Ein NLS ist eine oder sind mehrere kurze Sequenzen positiv geladener Lysine oder Arginine.
  • Es wurde eine rechnerische Vorhersage einer Proteinlokalisierung von Sequenzdaten durchgeführt. Unter den Algorithmen, die einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind, sind jene, die bei ExPASy Proteomics Tools erhältlich sind, betrieben vom Swiss Institute for Bioinformatics, zum Beispiel, PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM, TMpred und andere.
  • Beispiel 7: Assay im Zusammenhang mit den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten Polypeptidsequenzen
  • 7.1. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • Chua et al. (2005) beschreiben einen Chromatin-Immunopräzipitation(ChIP)-Assay zur Analyse der Funktionalität eines IMB1-Polypeptids (in casu GTE6 fusioniert an GFP und den AS1-Promotor). AS1-Transkripte waren in den 35S::GTE6-GFP Pflanzen, wie auch in den 35S::GTE6 Pflanzen erhöht, was darauf hinweist, das sowohl GTE6-GFP wie auch GTE6 die Expression von AS1 aufwärts regulierten.
  • Etwa 0,1–0,8 g Blätter von 21 Tage alten Arabidopsis-Pflanzen, die auf 1/2 MS Agar in Gewebekulturplatten gezüchtet wurden, wurden mit 1% Formaldehyd (Sigma) unter Vakuum 15 min fixiert. Das Pflanzenmaterial wurde in flüssigem Stickstoff gemahlen und Chromatin wurde extrahiert. Das Chromatin wurde zu Fragmenten im Bereich von 400 Bp bis 1 kBp durch Beschallung geschert. Das beschallte Chromatin wurde mit 10 μL anti-acetyliertem Histon H4 (Upstate Biotechnology), 10 μL anti-acetyliertem Histon H3 (Upstate Biotechnology) oder 5 μL anti-GFP (Abcam) immunopräzipitiert. DNA wurde unter Verwendung von Primern, die für 18S rDNA und verschiedene Regionen von AS1 spezifisch waren, amplifiziert. PCR-Reaktionen wurden zuerst mit verschiedenen Verdünnungen der Template-DNA durchgeführt um sicherzustellen, dass die PCR-Bedingungen innerhalb des quantitativen Bereichs der Amplifikationsreaktion lagen. Co-präzipitierte DNA wurde in 20 μL TE aufgelöst und üblicherweise wurde 1 μL für PCR-Analysen verwendet. Für die gesamten eingebrachten Proben wurde DNA aus eine Teilmenge von beschalltem Chromatin extrahiert, in 80 μL TE aufgelöst, und 1 μL wurde für die PCR verwendet. Achtundzwanzig Zyklen wurden zur Amplifikation der verschiedenen Regionen von AS1 verwendet und 20 Zyklen wurden zur Amplifikation der 18S rDNA Sequenz verwendet. Regionen von AS1 wurden zuerst mit Hilfe von AS1-Primern in 8 Zyklen amplifiziert, gefolgt von der Zugabe von 18S rDNA Primern, und die PCR wurde weitere 20 Zyklen ausgeführt. In drei unabhängig transformierten Linien von 35S::GTE6-GFP Pflanzen co-präzipitierten die GFP-Antikörper den Promotor, und das 3' Ende des Introns und das 5' Ende von Exon 2 von AS1. Die GFP-Antikörper co-präzipitierten nicht die Regionen P3 und P0 von AS1; diese Sequenzen waren selbst nach vierzig Runden PCR nicht nachweisbar. GTE6 reguliert somit die Expression durch Verknüpfung mit einer 1-kBp Region, die den Promotor und den Start der transkribierten Region von AS1 enthält, die wahrscheinlich wichtige regulatorische Regionen für die transkriptionale Steuerung sind.
  • 7.2. Pseudo Response Regulator Typ 2 (PRR2)
  • PRR2-Polypeptide, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung (zumindest in ihrer nativen Form) nützlich sind, haben für gewöhnlich, aber nicht unbedingt, transkriptionale regulatorische Aktivität und die Kapazität mit anderen Proteinen zu interagieren. DNA-Bindungsaktivität und Protein-Protein Wechselwirkungen können leicht in vitro oder in vivo unter Verwendung von Techniken, die nach dem Stand der Technik allgemein bekannt sind, bestimmt werden (zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology, Band 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). PRR2 Domäne enthalten eine Myb DNA-Bindung von SHAQYKF.
  • Beispiel 8: Klonieren der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz
  • 8.1. Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9 (bHLH9)
  • Die Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wurde, wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Template eine maßgefertige Oryza sativa Setzling cDNA Bibliothek verwendet wurde (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK). Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Template in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaacaggatgacggc-3' (SEQ ID NO: 271; Sense) und 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttacaacattagctcggaga-3' (SEQ ID NO: 272; Revers, komplementär), die die AttB Stellen für eine Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardverfahren aufgereinigt. Der erste Schritt der Gateway-Prozedur, die BP Reaktion, wurde dann durchgeführt, in dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201 Plasmid rekombiniert wurde, um, nach der Gateway-Terminologie, einen ”Entry-Klon”, pbHLH9, zu erzeugen. Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway® Technologie erworben.
  • Der Entry-Klon, der den längsten ORF (offenen Leserahmen) in SEQ ID NO: 1 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion verwendet, wobei ein Zielvektor für die Oryza sativa Transformation verwendet wurde. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der Nukleinsäuresequenz von Interesse, die bereits in den ”Entry Klon” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 275) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::bHLH9 (3) in Agrobacterium Stamm LBA4044 nach Verfahren transformiert, die nach dem Stand der Technik allgemein bekannt sind.
  • 8.2. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • Die Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wurde, wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Template eine maßgefertige Solanum lycopersicum Setzling cDNA Bibliothek verwendet wurde (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK). Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Template in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm10548 (SEQ ID NO: 302; Sense, Startkodon fett): 5'-ggggacaagtttgt acaaaaaagcaggcttaaacaatggagaatctaaacggctta-3' und prm10549 (SEQ ID NO: 303; Revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgtaaaatcaggatggcttttt-3', die die AttB Stellen für eine Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardverfahren aufgereinigt. Der erste Schritt der Gateway-Prozedur, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, in dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201 Plasmid rekombiniert wurde, um, nach der Gateway-Terminologie, einen ”Entry-Klon”, pIMB1, zu erzeugen. Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway® Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NO: 300 umfassende Entry-Klon wurde dann in einer LR-Reaktion verwendet, wobei ein Zielvektor für die Oryza sativa Transformation verwendet wurde. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der Nukleinsäuresequenz von Interesse, die bereits in den ”Entry Klon” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein ReisGOS2-Promotor (SEQ ID NO: 313) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::IMB1 (7) in Agrobacterium Stamm LBA4044 nach Verfahren transformiert, die nach dem Stand der Technik allgemein bekannt sind.
  • 8.3. PCD-artig
  • Die Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wurde, wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Template eine maßgefertige Oryza sativa Setzling cDNA Bibliothek verwendet wurde (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK). Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Template in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer hatten eine Sequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 448 (Sense, Startkodon fett): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgctcaccaacc-3' und SEQ ID NO: 449 (Revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaggggatatatgtgaatgaaga-3', die die AttB Stellen für eine Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardverfahren aufgereinigt. Der erste Schritt der Gateway-Prozedur, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, in dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201 Plasmid rekombiniert wurde, um, nach der Gateway-Terminologie, einen ”Entry-Klon”, pPCD, zu erzeugen. Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway® Technologie erworben.
  • Der Entry-Klon, der den längsten ORF (offenen Leserahmen) in SEQ ID NO: 358 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion verwendet, wobei ein Zielvektor für die Oryza sativa Transformation verwendet wurde. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der Nukleinsäuresequenz von Interesse, die bereits in den ”Entry Klon” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 450) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::PCD (10) in Agrobacterium Stamm LBA4044 nach Verfahren transformiert, die nach dem Stand der Technik allgemein bekannt sind.
  • 8.4. Pseudo Response Requlator Typ 2 (PRR2)
  • Die Lycopersicon esculentum Nukleinsäuresequenz, die für eine PRR2-Polypeptidsequenz kodiert, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Template eine cDNA Bank verwendet wurde, die mit Hilfe von RNA von Tomatenpflanzen in verschiedenen Entwicklungsstufen konstruiert wurde. Für die PCR-Amplifikation wurden die folgenden Primer, die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten, verwendet: prm10843 (SEQ ID NO: 479, Sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgatttgcattgagaatgaa-3' und prm10844 (SEQ ID NO: 480, Revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacatgtcatctcatctccgac-3'. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (einschließlich attB-Stellen) wurde amplifiziert und aufgereinigt, ebenfalls nach Standardverfahren. Der erste Schritt der Gateway-Prozedur, die BP Reaktion, wurde dann durchgeführt, in dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201 Plasmid rekombiniert wurde, um, nach der Gateway-Terminologie, einen ”Entry-Klon” zu erzeugen. Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway® Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NO: 451 umfassende ”Entry Klon” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der Nukleinsäuresequenz von Interesse, die bereits in den ”Entry Klon” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 478) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::PRR2 (14) zur konstitutiven Expression in Agrobacterium Stamm LBA4044 nach Verfahren transformiert, die nach dem Stand der Technik allgemein bekannt sind.
  • Beispiel 9: Pflanzentransformation
  • Transformation von Reis
  • Das Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren über 1 Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von einer sechsmaligen 15 minütigen Waschung mit sterilem destilliertem Wasser ausgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
  • Der Agrobacterium Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt, wurde zur Cokultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB Medium mit den passenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann gesammelt und in flüssigem Cokultivierungsmedium auf eine Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt und die Calli 15 Minuten in die Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungsmedium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab einzelne Genort-Transformanten bei einer Rate von mehr als 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
  • Transformation von Mais
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Modifizierung des Verfahrens durchgeführt das von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50, beschrieben ist. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden von der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Befruchtung (”days after pollination” – DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryonen etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryonen werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erdreich umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Weizen
  • Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, das von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50, beschrieben ist. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexiko) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erdreich umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Sojabohne
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U.S.-Patent 5, 164, 310 von Texas A & M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Aussäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jungsämlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden ausgeschnitten unt mit Agrobacterium tumefaciens, enthaltend den Expressionsvektor, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erdreich umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Raps/Canola
  • Kotyledonäre Blattstieln bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Aussäen oberflächensterilisiert. Die Kotyledon-Blattstielexplantate mit dem angehefteten Kotyledon werden aus den In-vitro-Setzlingen ausgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des geschnittenen Endes des Blattstielexplantat in die bakterielle Suspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstielexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium überführt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden im Gewächshaus in Erdreich umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Alfalfa
  • Ein regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie von Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Blattstielexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zur Hemmung des Agrobacteriumwachstums ausgestrichen. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens nach dem Verfahren transformiert, das in US 5,159,135 beschrieben ist. Baumwollsamen werden in 3% Natriumhypochloritlösung 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf bzw. in SH-Medium mit 50 μg/ml Benornyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (etwa 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, die mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern transformiert ist) wird für die Inokulation der Hypokotylexplantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCL2, und mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin, um restliche Bakterien abzutöten. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
  • Beispiel 10: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 10.1 Auswertungsansatz
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, die unter Nicht-Stressbedingungen gezüchtet wurden, wurden in regelmäßigen Intervallen bewässert um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht einschränkend waren, und um die Bedürfnisse der Pflanze zu erfüllen, dass sie Wachstum und Entwicklung vollenden konnte.
  • Vier T1-Ereignisse wurden unter Befolgen derselben Auswertungsprozedur wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignisin der T2-Generation weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Dürre-Screen
  • Pflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens nähern. Dann werden sie in einen ”trockenen” Abschnitt überführt, wo eine Bewässerung vorenthalten wird. Feuchtigkeitssonden werden in regellos gewählte Töpfe eingesetzt, um den Bodenwassergehalt (”soil water content” – SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter gewisse Schwellenwerte fällt, werden die Pflanzen automatisch kontinuierlich wiederbewässert, bis ein normaler Spiegel erreicht ist. Die Pflanzen werden dann wieder zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist derselbe wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stressbedingungen gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Screen der Stickstoffverwendungseffizienz
  • Reispflanzen von T2-Samen werden Blumentopferde unter normalen Bedingungen mit Ausnahme der Nährstofflösung wachsen gelassen. Die Töpfe werden von der Verpflanzung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, die einen verringeren N Stickstoff(N)-Gehalt aufweist, für gewöhnlich 7 bis 8 mal geringer. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist derselbe wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Salzstress-Screen
  • Pflanzen wurden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird in den ersten zwei Wochen nach dem Verpflanzen der Pflänzchen in das Glashaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugegeben, bis die Pflanzen geerntet werden. Dann werden samenbezogene Parameter gemessen.
  • 10.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parameter von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
  • Weil zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war eine Misch-Modell-Methode, die die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment-Ereignis-Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
  • 10.3 Gemessene Parameter
  • Messung von biomassebezogenen Parametern
  • Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungskammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche zu dem Zeitpunkt gemessen wird, zu dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Früh-Wuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Die Früh-Wuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Messungen von samenbezogenen Parametern
  • Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller von einer Pflanze abgeernteten gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (HI) ist in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Bodenfläche (mm2), multipliziert mit Faktor 106 definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen primären Rispen. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
  • Beispiele 11: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • 11.1. Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9 (bHLH9)
  • Die Auswertungsergebnisse unter Nicht-Stressbedingungen von T1 transgenen Reispflanzen, die den längsten offenen Leserahmen ORF der O.sativa_Os01g0900800 Nukleinsäure exprimieren, die für SEQ ID NO: 2 kodiert, sind unten angeführt. Es wurde eine Erhöhung von mindestens 5% für die oberirdische Biomasse (AreaMax), Emergenz-Wuchskraft (Früh-Wuchskraft) und Anzahl an Gesamtsamen (Tabelle E1) beobachtet. Tabelle E1
    Ertragsbezogene Eigenschaft % Erhöhung in transgenen Pflanzen relativ zur Kontrollpflanze
    AreaMax 20
    Früh-Wuchskraft 32
    Anzahl an Gesamtsamen 17
  • 11.2. Imbibition-inducible 1 (IMB1)
  • Die Auswertungsergebnisse von transgenen Reispflanzen, die eine IMB1-Nukleinsäure unter Nicht-Stressbedingungen exprimieren, sind unten angeführt. Es wurde eine Erhöhung von mindestens 5% (mit einem p-Wert ≤ 0,05) für Gesamtgewicht an Samen, Anzahl an gefüllten Samen, Blüten pro Rispe, Ernteindex und Gesamtanzahl an Samen beobachet. Die Gesamterhöhung für diese Parameter im Bestätigungsexperiment ist in Tabelle E2 angeben. Es wurde auch eine Erhöhung für die oberirdische Biomasse und Füllrate beobachtet. Tabelle E2:
    Parameter Gesamterhöhung
    Gesamtgewicht an Samen 18,2
    Anzahl gefüllter Samen 15,7
    Blüten pro Rispe 11,2
    Ernteindex 13,9
    Gesamtanzahl an Samen 11,7
  • 10.3. PCD-artig
  • Die Auswertungsergebnisse von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation und das Exprimieren einer Nukleinsäure, die den längsten ORF umfasst, in SEQ ID NO: 358 unter Nichtstressbedingungen, sind unten gezeigt. Bezüglich Einzelheiten zur Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe vorangehende Beispiele.
  • Es wurde eine Erhöhung von mindestens 5% für Gesamtsamenertrag, Anzahl gefüllter Samen, Füllrate, Anzahl an Samen pro Pflanze, Ernteindex beobachtet (Tabelle E3). Tabelle E3
    Parameter % Erhöhung in transgenen Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen
    Gesamtgewicht an Samen 14,6
    Anzahl gefüllter Samen 13,1
    Ernteindex 9,8
    Gesamtanzahl an Samen 10,6
  • 10.4. Pseudo Response Regulator Typ 2 (PRR2)
  • Die Auswertungsergebnisse der T2-Erzeugung transgener Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz, die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, das durch SEQ ID NO: 452 dargestellt ist, unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors exprimieren und unter normalen Wachstumsbedingungen gezüchtet werden, sind unten angeführt.
  • Es gab eine signifikante Erhöhung in oberirdischer Biomasse, in Früh-Wuchskraft, Blütezeit, Wurzelbiomasse, Pflanzenhöhe, Samenertrag pro Pflanze, Anzahl an gefüllten Samen, Gesamtanzahl an Samen, Anzahl an primären Rispen, Anzahl an Blüten pro Rispen, Ernteindex (HI) und Tausendkerngewicht (TKW). Tabelle E4: Auswertungsergebnisse der T2-Erzeugung von transgenen Reispflanzen, die die Nukleinsäuresequenz die für ein PRR2-Polypeptid kodiert, das durch SEQ ID NO: 452 dargestellt ist, unter der Kontrolle eines Promotors für eine konstitutive Expression exprimieren.
    Merkmal Durchschnittliche Gesamterhöhung in % in 4 Ereignissen in der T2-Erzeugung
    Oberirdische Biomasse der Pflanze 18%
    Früh-Wuchskraft 10%
    Blütezeit –4%
    Wurzelbiomasse 14%
    Pflanzenhöhe 9%
    Gesamtsamenertrag pro Pflanze 38%
    Anzahl von gefüllten Samen 32%
    Gesamtanzahl an Samen 29%
    Anzahl an primären Rispen 11%
    Anzahl an Blüten pro Rispe 19%
    Ernteindex 19%
    Tausenkerngewicht 5%
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2005/058021 [0024]
    • US 7193129 [0033]
    • US 5811238 [0064]
    • US 6395547 [0064]
    • WO 2004/070039 [0069, 0075, 0075, 0075, 0075, 0075, 0075, 0075, 0075, 0075, 0077]
    • WO 2004/065596 [0069]
    • US 4962028 [0069]
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Claims (23)

  1. Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen relativ zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-(Basis-Helix-Loop-Helix Gruppe 9-)Polypeptid kodiert, umfassend eine HLH-Domäne (Pfam Zugangsnummer: PF00010), die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität mit einer von SEQ ID NO: 181 bis SEQ ID NO: 268, vorzugsweise mit SEQ ID NO: 225 aufweist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das bHLH9 an ein E-Box-Motiv bindet, wie, mit zunehmender Präferenz, durch SEQ ID NO: 273 (CANNTG) oder SEQ ID NO: 274 (CACGTG) dargestellt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, für eines der Proteine kodiert, die in Tabelle A aufgelistet sind, oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure, die zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure in der Lage ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog eines der Proteine kodiert, die in Tabelle A angeführt sind.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Früh-Wuchskraft und/oder erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen umfassen.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stressbedingungen erhalten werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Dürrestress, Salzstress oder Stickstoffmangel erhalten werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor von Reis, verbunden ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise von einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt von der Familie Poaceae, besonders bevorzugt von der Gattung Oryza, ganz besonders bevorzugt von Oryza sativa.
  11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Pflanze oder ein Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert.
  12. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, wie in den Ansprüchen 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
  13. Konstrukt nach Anspruch 12, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor von Reis handelt.
  14. Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 12 oder 13 in einem Verfahren zum Herstellen von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen.
  15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt nach Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.
  16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag relativ zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) Selektieren auf Pflanzen mit erhöhtem Ertrag.
  17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Früh-Wuchskraft und/oder erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, relativ zu Kontrollpflanzen, der aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure resultiert, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
  18. Transgene Pflanze nach Anspruch 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, immer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
  19. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
  20. Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 19 abgeleitet sind.
  21. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung der Früh-Wuchskraft und/oder bei der Erhöhung der Biomasse und/oder Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen, relativ zu Kontrollpflanzen.
  22. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus: (i) einer durch eine von SEQ ID NO: 19, 45, 47, 165, 167 und 169 dargestellten Nukleinsäure; (ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, dargestellt durch eine von SEQ ID NO: 19, 45, 47, 165, 167 und 169; (iii) einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, dargestellt durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170, vorzugsweise infolge der Degeneriertheit des genetischen Kodes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz abgeleitet werden kann, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist, und des Weiteren vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht; (iv) einer Nukleinsäure die, mit zunehmender Präferenz mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität mit einer der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A und Tabelle C2 aufweist und des Weiteren vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht; (v) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht; (vi) einer Nukleinsäure, die für ein bHLH9-Polypeptid kodiert, das, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168, 170 dargestellt ist, und einer der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A und Tabelle C2 aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht.
  23. Isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus: (i) einer Aminosäuresequenz, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist (ii) einer Aminosäuresequenz, die, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz, die durch eine von SEQ ID NO: 20, 46, 48, 166, 168 und 170 dargestellt ist, und einer der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A und Tabelle C2 aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften relativ zu Kontrollpflanzen verleiht. (iii) Derivaten einer der Aminosäuresequenzen, die oben unter (i) oder (ii) angeführt sind.
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