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DE112008001326T5 - Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung Download PDF

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DE112008001326T5
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plant
nucleic acid
increased
plants
polypeptide
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Application number
DE112008001326T
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English (en)
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Yang Do Choi
San Yeol Lee
Ho Hee Jang
Ohkmai K. Park
Sun Mi Huh
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CropDesign NV
Crop Functional Genomics Center
Original Assignee
CropDesign NV
Crop Functional Genomics Center
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Publication date
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Abstract

Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in den Wurzeln einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX) kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht, wobei das 2-Cys-PRX-Polypeptid vom N-Terminus zum C-Terminus Folgendes umfasst: (1) ein Plastiden-Transitpeptid und (2) eine 2-Cys-PRX-Domäne, und gegebenenfalls Pflanzen mit erhöhtem Ertrag selektiert.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen durch Modulation, vorzugsweise Erhöhung, der Expression einer Nukleinsäure, die ein 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX) kodiert, in den Wurzeln einer Pflanze oder durch Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit modulierter, vorzugsweise erhöhter, Expression einer Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX kodiert, in den Wurzeln oder mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Da die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfläche für die Landwirtschaft verfügbar ist, muss die Forschung gezwungenermaßen die Effizienz der Landwirtschaft verbessern. Herkömmliche Maßnahmen für kulturpflanzen- und gartenbauliche Verbesserungen nutzen Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken gewöhnlich arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Protoplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (gewöhnlich in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung von diesem genetischen Material in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Kulturpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen produzieren.
  • Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel die Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen können, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
  • Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle für Zucker, Öle und vielen Arte von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimlinge). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt; sie erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Pflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist eine wichtige Aufgabe bei modernen Reiszüchtungsprogrammen bei gemäßigten sowie tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind für die richtige Bodenverankerung bei wassergesetztem Reis wichtig. Wird Reis direkt auf geflutete Felder gesät, und müssen die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen, sind längere Stängel mit Wüchsigkeit gepaart. Bei der Ausführung von Drill- bzw. Reihensaat sind längere Mesokotyle und Koleoptile wichtig für ein gutes Auflaufen des Keimlings. Die Fähigkeit zu gentechnischen Einbringung von Jungpflanzenvitalität in Pflanzen ist in der Landwirtschaft von großer Bedeutung. Eine schlechte Jungpflanzenvitalität war beispielsweise eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea mays L.)-Hybriden auf Basis des im Maisgürtel vorherrschenden Protoplasmas im europäischen Atlantikraum.
  • Die Pflanzenbiomasse gibt den Ertrag bei Futterkulturen, wie Alfalfa, Silagemais und Heu an. Bei Getreidekulturen hat man zahlreiche stellvertretende Größen für den Ertrag verwendet. Die wichtigste davon ist die Einschätzung der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf vielerlei Weise je nach der Art und dem Entwicklungsstadium gemessen werden, sie umfasst jedoch die Pflanzentrockenmasse, die oberirdische Trockenmasse, die oberirdische Frischmasse, die Blattfläche, das Stängelvolumen, die Pflanzenhöhe den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, die Wurzellänge, die Wurzelmasse, die Anzahl der Wurzelsprosse und die Anzahl der Blätter. Viele Arten behalten ein gleich bleibendes Verhältnis zwischen der Größe verschiedener Pflanzenteile in einem gegebenen Entwicklungsstadium bei. Diese allometrischen Beziehungen werden dazu verwendet, aus einer dieser Maßzahlen eine andere zu extrapolieren (z. B. Tittonell et al. 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). Die Pflanzengröße korreliert auf einem frühen Entwicklungsstadium üblicherweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung. Eine größere Pflanze mit größerer Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze und erreicht deshalb wahrscheinlich ein höheres Gewicht in demselben Zeitraum (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt noch zu der möglichen Fortdauer des Vorteils in Bezug auf die Mikroumgebung oder die Genetik hinzu, die es der Pflanze zu Beginn überhaupt ermöglichten, größer zu werden. Die genetische Komponente trägt stark zur Pflanzegröße und zur Wachstumsrate bei (z. B. ter Steege et al 2005 Plant Physiology 139: 1078) und deshalb ist es wahrscheinlich, dass bei einem Spektrum verschiedenster Genotypen die Pflanzengröße unter einer Art der Umweltbedingungen mit der Größe unter einer anderen Art der Umweltbedingungen korreliert (Hittalmani et al 2003 Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standard-Umgebung als Annäherung für die verschiedenen und dynamischen Umgebungen verwendet, denen Kulturpflanzen an unterschiedlichen Orten und zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Feld ausgesetzt sind.
  • Der Harvest-Index, das Verhältnis zwischen Samenertrag und oberirdischer Trockenmasse, ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil, so dass man oft eine belastungsfähige Korrelation zwischen Pflanzegröße und Kornertrag erhalten kann (z. B. Rebetzke et al 2002 Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind in sich miteinander verknüpft, weil der überwiegende Teil der Kornbiomasse von der derzeitigen oder der gespeicherten Photosynteseproduktivität durch die Blätter und den Stängel der Pflanze abhängt (Gardener et al 1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Daher hat man eine Selektion hinsichtlich der Pflanzengröße sogar auf frühen Entwicklungsstadien als Indikator für den potenziellen zukünftigen Ertrag verwendet (z. B. Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). Zum Testen der Auswirkung genetischer Unterschiede auf die Stresstoleranz ist die Möglichkeit, Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit und Lichtintensität zu standardisieren, ein wesentlicher Vorteil von Gewächshaus- und Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen verglichen mit dem Feld. Die Verwendbarkeit dieser kontrollierten Umgebungen zur Untersuchung von Ertragsunterschieden wird jedoch dadurch beschränkt, dass künstliche Einschränkungen des Ertrags aufgrund von schlechter Befruchtung durch das Fehlen von Wind oder Insekten oder durch unzureichenden Platz für das Wachstum ausgereifter Wurzeln und Kronen existieren. Daher ist die Messung der Pflanzengröße früh in der Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder im Gewächshaus die Standardpraxis, mit der sich ein Hinweis auf potenzielle genetische Ertragsvorteile erhalten lässt.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die verbesserte abiotische Stresstoleranz. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Ernteverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al., Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Trockenheit, Versalzung, Temperaturextreme, chemische Toxizität, Überschuss oder Mangel an Nährstoffen (Makroelementen und/oder Mikroelementen), Bestrahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Pflanzentoleranz gegenüber abiotischen Stress zu verbessern, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
  • Der Kulturpflanzenertrag kann somit durch Optimierung von einem der vorstehend genannten Faktoren gesteigert werden.
  • Je nach dem Endgebrauch kann die Modifikation bestimmter Ertragsmerkmale gegenüber anderen bevorzugt sein. Für Anwendungen, wie Viehfutter- oder Holzproduktion, oder für den Rohstoff Biokraftstoff kann zum Beispiel eine Steigerung der vegetativen Pflanzenteile gewünscht sein, und für Anwendungen, wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion, kann eine Steigerung der Samenparameter besonders gewünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können je nach der Anwendung einige anderen gegenüber bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Steigerung des Samenertrags beitragen, und zwar in Form einer erhöhten Samengröße oder einer gesteigerten Samenanzahl.
  • Ein Ansatz zur Steigerung von Ertragsmerkmalen (zum Beispiel Steigerung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags und/oder der Biomasse) in Pflanzen kann über die Modifikation interner Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie Zellzyklus oder verschiedene Signalwege, die an dem Pflanzenwachstum oder Verteidigungsmechanismen beteiligt sind.
  • Es wurde nun überraschend gefunden, dass verschiedene Ertragsmerkmale von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen verstärkt werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX) kodiert, in den Wurzeln einer Pflanze moduliert, vorzugsweise erhöht, oder indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung verschiedener Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX) kodiert, in den Wurzeln einer Pflanze moduliert, vorzugsweise erhöht, oder indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht.
  • Hintergrund
  • 1. 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX)
  • Thiolperoxidasen (PRX) sind ubiquitäre häm-freie Peroxidasen, die die Reduktion von Peroxynitrilen und verschiedenen Peroxiden mithilfe katalytischer Cysteinreste und thiolhaltiger Proteine als Reduktanden katalysieren. In Pflanzen lassen sich fünf verschiedene Klassen je nach der Anzahl und der Position konservierter katalytischer Cysteine unterscheiden. Vier Klassen sind als Peroxiredoxine definiert und wurden bereits mittels phylogenetischer Sequenzanalyse identifiziert: 1-Cys-, 2-Cys-, Typ-II- und Typ-Q-Peroxiredoxine; die vierte Klasse bilden die Glutathionperoxidasen, von denen vor kurzem gezeigt wurde, dass sie in Pflanzen eine Thioredoxin-abhängige Aktivität besitzen (Rouhier & Jacquot (2005) Free Radic Biol Med 38(11): 1413–21). Die Analyse des Arabidopsis thaliana-Genoms deutet darauf hin, dass mindestens 17 Isoformen von Thioredoxin-abhängigen Peroxidasen in verschiedenen Pflanzenkompartimenten exprimiert werden.
  • Unter 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX) versteht man eine Gruppe von Proteinen, die an der Zellproliferation, -differenzierung, -apoptose und an der Photosynthese beteiligt sind. Diese Enzyme reduzieren H2O, Peroxinitrit und Alkylhydroperoxid zu Wasser bzw. Alkohol (Netto et al., (1996) J Biol Chem 271(26): 15315–15321) mit Thioredoxin (Trx) als Elektronendonor. Dadurch regulieren 2-Cys-PRX die Signaltransduktionswege oder schützen Makromoleküle vor oxidativer Beschädigung. Diese Proteine sind Homodimere, wobei jede Untereineinheit zwei konservierte Cysteine aufweist (Choi et al., (1998) Nature Struct Biol 5: 400–406). Das Peroxid oxidiert das N-terminale Cystein einer Untereinheit zu Sulfensäure, die mit dem C-terminalen Cystein der anderen Untereinheit unter Bildung eines intramolekularen Disulfids reagiert. Zum Abschluss des Katalysezyklus wird das Enzym über einen Thiol/Disulfid-Austausch reduziert (Chae et al., (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 7017–7021).
  • Transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen (Baier et al. (2000) Plant Physiol 124(2): 823–32) mit verringerten 2-Cys-PRX-Spiegeln wurden mittels Antisense-Suppression erzeugt. Die Suppression der 2-Cys-PRX-Expression führt zu einer erhöhten Expression anderer anti-oxidativer Gene, was zeigt, dass das Enzym ein integraler Bestandteil des anti-oxidativen Netzwerks von Chloroplasten und mit anderen Abwehrsystem funktionell vernetzt ist.
  • Die internationale Patentanmeldung WO 05/116082 beschreibt die Gewinnung transgener Arabidopsis-Pflanzen, die ein (als BAS1 bezeichnetes) Arabidopsis-2-Cys-PRX überexprimieren, unter Verwendung des konstitutiven 35S-Promotors aus dem Blumenkohlmosaikvirus. Es wird beschrieben, dass die transgenen Pflanzen eine höhere potenzielle Resistenz gegen Hitzeschock und Pathogene haben als Wildtyp-Pflanzen.
  • Es wurde jetzt überraschend gefunden, dass die Modulation, vorzugsweise die Erhöhung, der Expression einer Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, in den Wurzeln einer Pflanze Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze gegenüber Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation, vorzugsweise die Erhöhung, der Expression einer Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, in den Wurzeln einer Pflanze. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassen eines oder mehrere aus: (i) verbesserte Jungpflanzenvitalität, (ii) erhöhte oberirdische Biomasse, (iii) erhöhte Biomasse der (dünnen und dicken) Wurzeln, (iv) erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, (v) erhöhte Samenfüllungsrate, (vi) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (vii) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen, (viii) erhöhter Harvest-Index oder (ix) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG).
  • 2. Annexin-ählich (ANN)
  • Die Annexine bilden eine Familie calciumabhängiger Phospholipid-Bindungsproteine, die man in Pflanzen und Tieren findet. In allen getesteten Pflanzenarten wurde das Vorliegen von mindestens zwei verschiedenen Annexinen gezeigt. Strukturell gesehen sind Pflanzen-Annexine weniger divergent als tierische Annexine. Vergleichende Studien zeigten, dass Pflanzen-Annexine untereinander eine signifikante Homologie ein einer Kerndomäne aufweisen, die mindestens eine, üblicherweise vier konservierte Wiederholungen umfasst, die etwa 70 Aminosäuren lang sind. Für die Annexine als calciumbindende Proteine wird postuliert, dass sie eine Rolle in Calcium-Signalwegen spielen. Heutzutage ist zwar die Struktur der Annexine gut bekannt, aber funktionell sind sie noch nicht gut charakterisiert. Es wurde beschrieben, dass Annexine in Pflanzen an der Golgi-vermittelten Sekretion, der Zellexpansion, der Valuolenbiogenese, der Chloroplastenmembranbindung, am Zellzyklus, an der Signalgebung bei der Knöllchenbildung, an Stresssignalwegen beteiligt sind.
  • US20050089872 beschreibt T-DNA-Insertionsmutanten (anx1 und anx4-1) für die Gene aus Arabidopsis thaliana, die Annexin 1 bzw. Annexin 4 kodieren. Die Mutanten waren sensitiv gegenüber Salzstress und osmotischen Stress. Auch Abszisinsäure hatte eine negative Wirkung auf die Keimung und das Wachstum der anx1- und anx4-1-Mutanten. Eine Expressionsanalyse zeigte, dass das ANX-1-Protein hauptsächlich in der Wurzel und nicht in Blüten-, Stängel- oder Blattgewebe exprimiert wurde. Es wird postuliert, dass die Proteine ANX1 und ANX4 eine Rolle bei der Transduktion von Signalen von osmotischem Stress und ABA spielen.
  • Es wurde jetzt überraschend gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere mit verbessertem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze. Die verbesserten Ertragsmerkmale umfassen einen gesteigerten Samenertrag.
  • Definitionen
  • Polypeptid(e)/Protein(e)
  • Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, welche über Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
  • Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
  • Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül(e)” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nlukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination davon, in einer polymeren unverzweigten Form mit einer beliebigen Länge.
  • Kontrollpflanze(n)
  • Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Gewöhnlich gehört die Kontrollpflanze zu derselben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Eine ”Kontrollpflanze” steht im vorliegenden Zusammenhang nicht nur für ganze Pflanzen, sondern auch Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
  • Homologon/Homologa
  • ”Homologa” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen nichtmodifizierten Protein, sie weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das nichtmodifizierte Protein, von dem sie stammen, auf.
  • Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
  • Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide gehören die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
  • Eine Substitution bezieht sich auf den Austausch von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch je nach den funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Clustern vorliegen; Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten vor. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen konservativer Substitutionen sind im Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen
    Rest konservative Substitutionen Rest konservative Substitutionen
    Ala Ser Leu Ile; Val
    Arg Lys Lys Arg; Gln
    Asn Gln; His Met Leu; Ile
    Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
    Gln Asn Ser Thr; Gly
    Cys Ser Thr Ser; Val
    Glu Asp Trp Tyr
    Gly Pro Tyr Trp; Phe
    His Asn; Gln Val Ile; Leu
    Ile Leu, Val
  • Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Peptidsynthese-Techniken, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch DNA-Rekombination herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind im Stand der Technik bekannt. So kennt der Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA, wozu M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder andere Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese gehören.
  • Derivate
  • ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie das interessierende Protein, Substitutionen von Aminosäuren durch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nicht natürlich verkommenden Aminosäureresten umfassen. ”Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nicht natürlicherweise veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es stammt, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das bzw. der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden wird, damit es leichter nachgewiesen werden kann, und nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins umfassen.
  • Ortholog(a)/Paralog(a)
  • Orthologa und Paraloga umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Stammbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloga sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Urgens entstanden sind, und Orthologa sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind, und die auch von einem gemeinsamen Urgen abstammen.
  • Domäne
  • Der Begriff ”Domäne” steht für einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionsmäßig verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologa variieren können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essenziell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologa identifiziert und können als Identifikatoren verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
  • Motiv/Konsensussequenz/Signatur
  • Der Begriff ”Motiv” oder ”Konsensussequenz” oder ”Signatur” steht für eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
  • Hybridisierung
  • Der Begriff ”Hybridisierung” ist wie hier definiert als ein Vorgang, bei dem im Wesentlichen homologe komplementär Nukleotidsequenzen Basenpaarungen eingehen. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix, wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem anderen Harz, immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann außerdem stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einen festen Träger, wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran, immobilisiert ist oder z. B. mittels Photolithographie zum Beispiel auf einem Quarzglasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder ”micorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um ”hairpins” oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
  • Der Begriff ”Stringenz” steht für diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch Bedingungen, wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers, beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelztemperatur (Tm) für das thermische Aufschmelzen der 2-Cys-PRX-nt für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter der Tm liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter der Tm liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden gewöhnlich zur Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt. Die Nukleinsäuresequenzen können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes in ihrer Sequenz Zusammensetzung voneinander abweichen und dennoch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid kodieren. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
  • Bei dem Tm-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisiert. Der Tm-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und der Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen hybridisieren zum Beispiel spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei etwa 16°C bis 32°C unter dem Tm-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid ermöglicht eine Hybridisierung bei 30 bis 45°C, obwohl die Hybridisierungsrate gesenkt wird. Basenfehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für lange Sonden, sinkt der Tm-Wert um ungefähr 1°C pro % Basenfehlpaarung. Der Tm-Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:
    • 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6 × log10[Na+]a + 0,41 × %[G/Cb] – 500 × [Lc]–1 – 0,61 × % Formamid
    • 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 – 820/Lc
    • 3) oligo-DNA- oder oligo-RNAd-Hybride: Für < 20 Nukleotide: Tm = 2 (In) Für 20–35 Nukleotide: Tm = 22 + 1,46 (In)
    • a oder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau.
    • b nur für %GC im Bereich von 30% bis 75% genau.
    • c L = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren.
    • d oligo, Oligonukleotid; In, effektive Primerlänge = 2 (Anz. G/C) + (Anz. A/T).
  • Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit RNase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach senkt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach senkt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung gewöhnlich auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der durch unspezifische Hybridisierung entsteht, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu entscheidenden Faktoren solcher Waschvorgänge gehören die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden gewöhnlich bei oder unterhalb der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie der Hintergrund ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungsassays oder Genamplifikationsnachweisverfahren wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Dem Fachmann sind die verschiedenen Parameter geläufig, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Übliche hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen zum Beispiel Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid und anschließendes Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für das hybridisierende Nukleinsäuremolekül. Werden Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
  • Zur Bestimmung des Stringenzausmaßes können Sambrook et al., (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
  • Spleißvariante
  • Der Begriff ”Spleißvariante”, wie er hier verwendet wird, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in der ausgewählte Introns und/oder Exons ausgeschnitten, ersetzt, versetzt oder hinzugefügt wurden oder in der Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten bleibt die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten; dies lässt sich erzielen, indem man funktionelle Segmente des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten findet man in der Natur oder können künstlich hergestellt werden. Verfahren zur Vorhersage und Isolation dieser Spleißvarianten sind im Stand der Technik bestens bekannt (siehe beispielsweise Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
  • Allelvariante
  • Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die sich an der gleichen Chromosomenposition befinden. Allelvarianten umfassen Einzelnukleotid-Polymorphismen (Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)), sowie Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen (Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs)). Die Größe der INDELs ist gewöhnlich kleiner als 100 bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz an Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
  • Genshuffling/gerichtete Evolution
  • Genshuffling oder gerichtete Evolution besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Teilen davon zu erzeugen, die Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al., (2004), Science 304(5674): 1151-4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
  • Regulationselement/Kontrollsequenz/Promotor
  • Die Begriffe ”Regulationselement”, ”Kontrollsequenz” und ”Promotor” werden im vorliegenden Text jeweils austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die eine Expression derjenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, bewirken können. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich gewöhnlich auf eine Nukleinsäurekontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die an der Erkennung und Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig mit ihnen verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die von einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen stammen (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz), sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression als Reaktion auf Umweltreize und/oder von außen wirkende Reize oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, die in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhalten kann. Der Begriff ”Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression einer Nukleinsäuresequenz in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verstärkt.
  • Ein ”pflanzlicher Promotor” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines Abschnitts einer kodierenden Sequenz in pflanzlichen Zellen vermitteln. Ein pflanzlicher Promotor muss daher nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen, zum Beispiel von Viren, die Pflanzenzellen angreifen, stammen. Der ”pflanzliche Promotor” kann auch von einer Pflanzenzelle stammen, z. B. von der Pflanze, die mit der Nukleinsäuresequenz transformiert ist, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hier beschrieben ist. Dies trifft auch auf andere ”pflanzliche” Regulationssignale, wie ”pflanzliche” Terminatoren zu. Die Promotoren, die sich stromaufwärts der bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Nukleotidsequenzen befinden, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne dass die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promotoren, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion, wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, gestört wird. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promotoren durch Modifizieren ihrer Sequenz steigern oder sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar durch Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzen. Für die Expression in Pflanzen muss die Nukleinsäuresequenz, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder einen geeigneten Promotor umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
  • Zur Identifikation funktionell äquivalenter Promotoren kann die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, indem man zum Beispiel den Promotor funktionsfähig mit einem Reportergen verknüpft und das Expressionsausmaß und das Muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze untersucht. Geeignete bekannte Reportergene umfassen beispielsweise beta-Glucuronidase oder beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird untersucht, indem man die Enzymaktivität der beta-Glucuronidase oder beta-Galactosidase misst. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit der- bzw. demjenigen eines Referenz-Promotors (wie er beispielsweise in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird) verglichen werden. Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren der mRNA-Spiegel oder durch Vergleich der mRNA-Spiegel der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Housekeeping-Genen, wie 18S rRNA, untersucht werden, wobei Verfahren des Standes der Technik, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse der Autoradiogramme, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR verwendet werden (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994). Ein ”schwacher Promotor” soll allgemeinen einen Promotor darstellen, der die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem niedrigen Niveau steuert. Ein ”niedriges Niveau” soll für Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis zu etwa 1/100000 Transkripten, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle stehen. Ein ”starker Promotor” steuert dagegen die Expression einer kodierenden Sequenz dagegen auf einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle.
  • Funktionsfähig verknüpft
  • Der Begriff ”funktionsfähig verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotorsequenz die Transkription des interessierenden Gens einleiten kann.
  • Konstitutiver Promotor
  • Ein ”konstitutiver Promotor” steht für einen Promotor, der während der meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionell aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promotoren finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promotoren
    Herkunftsgen Literaturangabe
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    V-ATPase WO 01/1 4572
    Superpromotor WO 95/14098
    G-Box-Proteine WO 94/12015
  • Ubiquitärer Promotor
  • Ein Ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
  • Entwicklungsregulierter Promotor
  • Ein entwicklungsregulierter Promotor ist während gewisser Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsrelevante Veränderungen auftreten, aktiv.
  • Induzierbarer Promotor
  • Ein induzierbarer Promotor weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation als Reaktion auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz auf oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder ”pathogen induzierbar”, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
  • Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
  • Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein Promotor, der die Transkription bevorzugt in bestimmten Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw., initiieren kann. Ein ”wurzelspezifischer Promotor” ist beispielsweise ein Promotor, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch eine ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Promotoren, die die Transkription nur in bestimmten Zellen initiieren können, werden im vorliegenden Text als ”zellspezifisch” bezeichnet.
  • Beispiele für wurzelspezifische Promotoren sind in Tabelle 2b unten angeführt: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promotoren
    Herkunftsgen Literaturangabe
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    CDC27B/hobbit aus Arabidopsis Blilou et al. (2002) Genes & Dev 16: 2566–2575
  • Ein samenspezifischer Promotor ist in erster Linie in Samengewebe, jedoch nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (bei ”leaky”-Expression) transkriptionell aktiv. Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann eine oder mehrere der folgenden Spezifitäten aufweisen: endosperm-, aleuron- und/oder embryospezifisch. Beispiele für samenspezifische Promotoren sind in den Tabellen 2c, 2d, 2e, 2f unten angegeben. Weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren sind bei Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, und ihre Offenbarung ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen als wäre sie hier vollständig beschrieben. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promotoren
    Herkunftsgen Literaturangabe
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    PRO0136, Alanin-Aminotransferase aus Reis unveröffentlicht
    PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste) unveröffentlicht
    PRO0151, WSI18 aus Reis WO 2004/070039
    PRO0175, RAB21 aus Reis WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    α-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin β-ähnliches Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Ltp2 aus Gerste Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
    Tabelle 2d: Beispiele für endospermspezifische Promotoren
    Herkunftsgen Literaturangabe
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al., (1987), FEBS Letts. 221: 43–47
    Zein Matzke et al., (1990), Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
    LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen Colot et al., (1989), Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al., (1989), NAR 17: 461–2
    SPA aus Weizen Albani et al., (1997), Plant Cell 9: 171–184
    Gliadine aus Weizen Rafalski et al., (1984), EMBO 3: 1409–15
    Itr1-Promotor aus Gerste Diaz et al., (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
    B1, C, D, Hordein aus Gerste Cho et al., (1999), Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al., (1993), Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al., (1996), Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
    DOF aus Gerste Mena et al., (1998), Plant J. 116(1): 53–62
    blz2 Onate et al., (1999), J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
    Synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al., (1998), Plant J. 13: 629–640
    Reis-Prolamin NRP33 Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
    Reis-Globulin Glb-1 Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
    Reis-Globulin REB/OHP-1 Nakase et al., (1997), Plant Molec. Biol. 33: 513–522
    Reis-ADP-Glucosepyrophosphorylase Russell et al., (1997), Trans. Res. 6: 157–68
    Mais-ESR-Genfamilie Opsahl-Ferstad et al., (1997), Plant J. 12: 235–46
    Sorghum-Kafirin DeRose et al., (1996), Plant Mol. Biol. 32: 1029–35
    Tabelle 2e: Beispiele für embryospezifische Promotoren:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    PRO0151 WO 2004/070039
    PRO0175 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    Tabelle 2f: Beispiele für aleuronspezifische Promotoren:
    Herkunftsgen Literaturangabe
    α-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin-β-ähnliches Gen Cejudc et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Ltp2 aus Gerste Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
  • Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie im vorliegenden Text definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch eine ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.
  • Beispiele für Promotoren, die für grüne Gewebe spezifisch sind und die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in der Tabelle 2g dargestellt. Tabelle 2g: Beispiele für Promotoren, die für grüne Gewebe spezifisch sind
    Gen Expression Literaturangabe
    Orthophosphatdikinase aus Mais Blattspezifisch Fukavama et al., 2001
    Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Mais Blattspezifisch Kausch et al., 2001
    Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Reis Blattspezifisch Liu et al., 2003
    Kleine Rubisco-Untereinheit aus Reis Blattspezifisch Nomura et al., 2000
    Beta-Expansin EXBP9 aus Reis Sprossspezifisch WO 2004/070039
    Kleine Rubisco-Untereinheit aus Straucherbse Blattspezifisch Panguluri et al., 2005
    RBCS3A aus Erbse Blattspezifisch
  • Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promotor ist ein meristemspezifischer Promotor, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch eine ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Beispiele für Promotoren, die für das grüne Meristem spezifisch sind und die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in Tabelle 2h unten dargestellt. Tabelle 2h: Beispiele für meristemspezifische Promotoren
    Herkunftsgen Expressionsmuster Literaturangabe
    Reis-OSH1 apikales Sprossmeristem, vom globulären Embryonalstadium bis zum Keimlingsstadium Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
    Reis-Metallothionein WAK1 & WAK2 Meristemspezifisch apikale Spross- und Wurzelmeristeme sowie in expandierenden Blättern und Kelchblättern BAD87835.1 Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318
  • Terminator
  • Der Begriff ”Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA stammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus dem Nopalinsynthase-Gen oder dem Octopinsynthase-Gen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
  • Modulation
  • Der Begriff ”Modulation” bedeutet in Bezug auf die Expression oder die Genexpression einen Vorgang, bei dem das Expressionsniveau durch die Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze dahingehend verändert worden ist, dass das Expressionsniveau erhöht oder gesenkt ist. Die ursprüngliche unmodulierte Expression kann jede Art der Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit nachfolgender Translation sein. Der Begriff ”Modulation der Aktivität” soll jede beliebige Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der davon kodierten Proteine bedeuten, die zu erhöhten Ertragsmerkmalen (zum Beispiel erhöhter Ertrag und/oder gesteigertes Wachstum) der Pflanzen führt.
  • Erhöhte Expression/Überexpression
  • Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie er hier verwendet wird, steht für eine beliebige Form der Expression, die über den Spiegel der ursprünglichen Wildtyp-Expression hinausgeht.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik gut dokumentiert und beinhalten beispielsweise die Überexpression, die durch geeignete Promotoren angetrieben wird, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuresequenzen, die als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können an einer geeigneten Position (gewöhnlich stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die das interessierende Polypeptid kodiert, hinaufreguliert wird. Endogene Promotoren können beispielsweise in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al., WO9322443 ) oder isolierte Promotoren können in der korrekten Orientierung und im korrekten Abstand von einem erfindungsgemäßen Gen in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
  • Wird eine Polypeptidexpression gewünscht, ist es im Allgemeinen wünschenswert, dass man eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer Polynukleotid-kodierenden Region einbringt. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von einer Reihe anderer Pflanzengene oder von T-DNA hergeleitet sein. Die hinzuzufügende 3'-Endsequenz kann beispielsweise vom Nopalinsynthase- oder vom Octopinsynthase-Gen oder alternativ von einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, von einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen stammen.
  • Eine Intronsequenz kann ebenfalls an der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz der partiellen kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft zu erhöhen, die sich im Cytosol ansammelt. Das Einführen eines spleißbaren Introns in die Transkriptionseinheit in pflanzliche und tierische Expressionskonstrukte steigert Befunden zufolge die Genexpression auf mRNA- und Protein-Ebene bis zu 1000fach (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183–1200). Eine solche Intronverstärkung der Genexpression ist gewöhnlich am größten, wenn es nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit eingebracht wird. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6, des Bronze-1-Introns sind im Stand der Technik bekannt. Allgemeine Informationen siehe in: The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N.Y. (1994).
  • Endogenes Gen
  • Wird im vorliegenden Text ein ”endogenes” Gen erwähnt, betrifft dies nicht nur das fragliche Gen, wie man es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form findet (d. h. ohne dass ein menschlicher Eingriff vorliegt), sondern betrifft auch das gleiche Gen (oder ein im Wesentlichen homologes Gen bzw. eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäuresequenz) in einer isolierten Form, das anschließend in eine Pflanze (wieder) eingebracht wird (ein Transgen). Bei einer transgenen Pflanze, die ein solches Transgen enthält, kann es zum Beispiel zu einer wesentlichen Reduktion der Transgenexpression und/oder einer wesentlichen Reduktion der Expression des endogenen Gens kommen. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder von Menschenhand hergestellt werden, beispielsweise durch chemische Synthese.
  • Verringerte Expression
  • Wird im vorliegenden Text eine ”verringerte Expression” oder ”Verringerung oder im Wesentlichen Ausschaltung” der Expression erwähnt, soll dies eine Abnahme der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten. Die Verringerung oder im Wesentlichen Ausschaltung bedeutet, in steigender Reihenfolge der Präferenz, um mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%. 96%, 97%, 98%, 99% oder noch mehr verringert im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Für die Verringerung oder im Wesentlichen die Ausschaltung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine hinreichende Länge von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Zur Durchführung von Gensilencing können diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide betragen, alternativ können sie bis zu dem gesamten Gen betragen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, und zwar entweder teilweise oder vollständig). Die Abfolge der im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotide kann von der Nukleinsäuresequenz, die das interessierende Protein kodiert, (Zielgen) oder von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz hergeleitet sein, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann. Die Abfolge der im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotide kann Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Zielgen eingehen (und zwar entweder mit dem Sense- oder dem Antisense-Strang), stärker bevorzugt hat die Abfolge der im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotide, in steigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität mit dem Zielgen (entweder mit dem Sense- oder dem Antisense-Strang). Eine Nukleinsäure, die ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen hier erörterten Verfahren zur Verringerung oder im Wesentlichen zur Ausschaltung der Expression eines endogenen Gens.
  • Diese Verringerung oder im Wesentlichen Ausschaltung der Expression kann unter Verwendung von Routine-Werkzeugen und -Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verringerung oder im Wesentlichen Ausschaltung der endogenen Genexpression erfolgt durch RNA-vermitteltes Silencing mit einem Inverted Repeat einer Nukleinsäure oder einem Teil davon (in diesem Fall einer Abfolge von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure hergeleitet sind, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann), der vorzugsweise eine Hairpin-Struktur bilden kann. Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Einbringung von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Abfolge von im Wesentlichen aufeinander folgenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen oder von einer beliebigen Nukleinsäure hergeleitet sind, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Gensilencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie u. a. von Angell and Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ), oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden. Andere Verfahren, wie die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zur Hemmung seiner Funktion in Pflanzen oder ein Eingriff in den Signalweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, sind dem Fachmann bekannt. Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (mRNAs) können zum Knockout der Genexpression und/oder der mRNA-Translation verwendet werden. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs, die gewöhnlich 19 bis 24 Nukleotide lang sind. Künstliche mikroRNAs (amiRNAs), die gewöhnlich 21 Nukleotide lang sind, können derart spezifisch gentechnisch verändert werden, dass sie die Genexpression einzelner oder mehrerer interessierender Gene negativ regulieren. Determinanten für die Auswahl von Pflanzen-mikroRNA-Zielen sind im Stand der Technik bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können bei der Gestaltung spezifischer amiRNAs helfen (Schwab et al., (2005) Dev Cell 8(4): 517–527). Herkömmliche Werkzeuge für die Gestaltung und Erzeugung von amiRNAs und ihrer Vorstufen sind ebenfalls öffentlich zugänglich (Schwab et al., (2006) Plant Cell 18(5): 1121–33).
  • Für eine optimale Leistung der Gensilencing-Techniken, die zur Verringerung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze verwendet werden, müssen Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen für die Transformation monokotyler Pflanzen und aus dikotylen Pflanzen für die Transformation dikotyler Pflanzen verwendet werden. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer gegebenen Pflanzenart in die gleiche Pflanzenart eingebracht. Beispielsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Es ist jedoch nicht absolut erforderlich, dass die einzubringende Nukleinsäuresequenz von der gleichen Pflanzenart stammt wie die Pflanze, in die sie eingebracht wird. Es reicht, wenn eine erhebliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzubringenden Nukleinsäuresequenz vorliegt.
  • Vorstehend sind Beispiele für verschiedene Verfahren zur Verringerung oder im Wesentlichen zur Ausschaltung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Der Fachmann kann leicht die vorstehend genannten Verfahren für das Silencing anpassen, zum Beispiel durch die Verwendung eines geeigneten Promotors, so dass eine Verringerung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erzielt wird.
  • Selektionsmarker(gen)/Reportergen
  • ”Selektionsmarker”, ”Selektionsmarkergen” oder ”Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, einen Phänotyp verleiht, so dass die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert oder transformiert sind, erleichtert wird. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle über eine Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Beispiele für Selektionsmarkergene sind u. a. Gene, die Resistenz gegen Antibiotika verleihen (wie nptlI, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die beispielsweise eine Resistenz gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, die eine Resistenz gegen beispielsweise Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder Anti-Nährstoffmarker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression sichtbarer Markergene führt. zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Markern vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
  • Bei stabiler oder transienter Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nimmt bekanntlich je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur ein kleinerer Teil der Zellen die fremde DNA auf und integriert sie, wenn gewünscht, in ihr Genom. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen Selektionsmarker kodiert (wie die vorstehend beschriebenen), zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszelle eingeführt. Diese Marker können beispielsweise in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise durch Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionell sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die Polypeptide, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, kodiert, oder auch in einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert wurden, können beispielsweise durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, wohingegen andere Zellen sterben).
  • Da die Markergene, insbesondere Gene für die Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich sind oder ungewünscht sind, sobald die Nukleinsäuresequenzen erfolgreich eingebracht worden sind, setzt das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuresequenzen vorteilhafterweise Techniken ein, die die Entfernung oder Abspaltung dieser Markergene ermöglichen. Ein solches Verfahren wird als Cotransformation bezeichnet. Die Cotransformation setzt zur Transformation zwei Vektoren gleichzeitig ein, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und der zweite das oder die Markergen(e) trägt. Dabei erhält, oder umfasst im Fall von Pflanzen, ein großer Anteil der Transformanten (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien erhalten die Transformanten gewöhnlich nur einen Teil des Vektors, d. h. die Sequenz, die von der T-DNA flankiert wird, die gewöhnlich die Expressions-Kassette darstellt. Die Markergene können anschließend aus der transformierten Pflanze durch Kreuzungen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden die in ein Transposon integrierten Markergene zur Transformation zusammen mit der gewünschten Nukleinsäuresequenz verwendet (was als Ac/Ds-Technologie bekannt ist). Die Transformanten können mit einer Quelle für Transposase gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt transformiert, das die transiente oder stabile Expression einer Transposase vermittelt. In einigen Fällen (etwa 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. Bei einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen mit Hilfe von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf so genannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil ist, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieser Art ist als Cre/Iox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die zwischen den loxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Ist das Markergen zwischen den loxP-Sequenzen integriert, wird es, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase entfernt. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können ortsspezifisch in das Pflanzengenom integriert werden. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen angewendet werden, wie Hefe, Pilze oder Bakterien.
  • Transgen/transgen/rekombinant
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant” beispielsweise in Bezug auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz, oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, alle Konstrukte, die mittels rekombinanter Verfahren hergestellt wurden, in denen entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenzen, die Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, oder
    • (b) genetische Kontrollsequenz(en) in funktionsfähiger Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
    • (c) a) und b)
    sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch Rekombinationsverfahren modifiziert worden sind, wobei es sich bei der Modifikation zum Beispiel um eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten handeln kann. Unter der natürlichen genetischen Umgebung versteht man den natürlichen genomischen oder chromosomalen Locus in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bank. Bei einer genomischen Bank wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz auf zumindest einer Seite und weist eine Sequenzlänge von mindestens 50 Bp, vorzugsweise mindestens 500 Bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 Bp, am stärksten bevorzugt mindestens 5000 Bp auf. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch nicht natürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel mutagene Behandlung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5,565,350 oder WO 00/15815 beschrieben.
  • Unter einen transgenen Pflanze versteht man für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt, bedeutet transgen jedoch auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder die Nukleinsäuresequenzen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, zwar in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz jedoch in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen an einem nicht natürlichen Locus im Genom, d. h. dass eine homologe oder vorzugsweise heterologe Expression der Nukleinsäuresequenzen stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen werden im vorliegenden Text erwähnt.
  • Transformation
  • Der Begriff ”Einführung” oder ”Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das entweder durch Organogenese oder Embryogenese zu einer anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden, und daraus kann eine ganze Pflanze regeneriert werden. Das jeweils ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen klonalen Vermehrungssytemen ab, die für die jeweilige transformierte Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben gehören zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achelknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit der erhaltenen transformierten Pflanzenzelle kann man dann eine transformierte Pflanze auf dem Fachmann bekannte Art und Weise regenerieren.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenarten ist eine Technik, die heutzutage relativ routinemäßig erfolgt. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann jedes von verschiedenen Transformationsverfahren vorteilhaft eingesetzt werden. Die für die Transformation und die Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsverfahren gehören die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die Aufnahme von freier DNA verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Teilchenkanonenbeschuss, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Verfahren können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglycol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F.A. et al., (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al., (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R.D. et al., (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Partikeln (Klein TM et al., (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in die Pflanze. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien beimpfen. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis gehören gut bekannte Verfahren für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Plants 199: 612–617, 1996); Chan et al., (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al., (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Bei der Transformation von Mais ist das bevorzugte Verfahren entweder wie bei Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Diese Verfahren sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit einem solchen Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze angesehen), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in eine Agrobakterienlösung taucht und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
  • Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen und insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln, transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben transgene Pflanzen. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt und man erhält Samen von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert worden und daher transgen ist [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch später ebenfalls transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders wirksames Verfahren ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der ”floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der ”floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastiden bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wird. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen steuern die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001, 21. Sept.; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie wurde in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
  • T-DNA-Aktivierungstagging
  • Das T-DNA-Aktivierungstagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Einführung von T-DNA, die gewöhnlich einen Promotor enthält (es kann auch ein Translations-Enhancer oder ein Intron sein), in der genomischen Region des interessierenden Gens oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der kodierenden Region eines Gens in einer Konfiguration, so dass der Promotor die Expression des angesteuerten Gens steuert. Die Regulation der Expression des angesteuerten Gens durch seinen natürlichen Promotor wird gewöhnlich unterbrochen und das Gen gerät unter die Kontrolle des neu eingeführten Promotors. Der Promotor ist gewöhnlich in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom eingeführt, beispielsweise durch Agrobacterium-Infektion, und führt zu einer modifizierten Expression der Gene nahe der eingeführten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression der Gene nahe dem eingeführten Promotor.
  • TILLING
  • Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und steht für eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuresequenzen, die Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als das Gen in seiner natürlichen Form. Beim TILLING wird eine Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING gewöhnlich erfolgen, sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg., Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods an Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Bilden von Pools von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplices zu ermöglichen; (e) DHPLC, wobei das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren des mutierten Individuums; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind im Stand der Technik bekannt (McCallum et al., (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50) erwähnt.
  • Homologe Rekombination
  • Homologe Rekombination ermöglicht die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäure in ein Genom an einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standard-Technik, die routinemäßig in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe und das Moos Physcomitrella, verwendet wird. Verfahren zur Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen wurden nicht nur für Pflanzenmodelle beschrieben (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077–84), sondern auch für Kulturpflanzen, wie beispielsweise Reis (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030–4; Iida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132–8) Terada et al (2007) Plant Physiol.
  • Ertrag
  • Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das gewöhnlich mit einer bestimmten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum einhergeht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen aufgrund ihrer Anzahl, ihrer Größe und/oder ihres Gewichts direkt zum Ertrag bei oder der tatsächliche Ertrag ist derjenige Ertrag pro Acre für eine Kulturpflanze und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl die geerntete als auch die geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bewirtschafteten Acres dividiert. Der Begriff ”Ertrag” einer Pflanze kann sich auf die vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf Fortpflanzungsorgane und/oder Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
  • Jungpflanzenvitalität
  • ”Jungpflanzenvitalität” steht für das aktive, gesunde, gut ausgewogene Wachstum, insbesondere während früher Stadien des Pflanzenwachstums, und kann von einer gesteigerten Pflanzen-Fitness herrühren, weil die Pflanzen beispielsweise besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. durch Optimierung der Verwendung von Energiequellen und der Verteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Jungpflanzenvitalität zeigen auch ein gesteigertes Überleben des Keimlings und einen besseren Bewuchs durch die Kulturpflanze, was häufig zu sehr einheitlichen Feldern (wobei die Kulturpflanze gleichmäßig wächst, d. h. der größere Teil der Pflanzen im Wesentlichen gleichzeitig verschiedene Entwicklungsstadien erreicht) und oft zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Daher kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren bestimmt werden, wie Tausendkorngewicht, Prozent Keimung, Prozent Auflaufen, Wachstum des Keimlings, Höhe des Keimlings, Wurzellänge, Biomasse von Wurzel und Spross und viele andere.
  • Erhöhen/Verbessern/Steigern
  • Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie im vorliegenden Text definiert, bedeuten.
  • Samenertrag
  • Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder bezogen auf die einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder oder pro Hektar oder Acre; b) erhöhte Anzahl an Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtanzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als das Verhältnis des Ertrags von Erntegut, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird; sowie f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
  • Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Vergrößerung der Samenfläche und/oder der Samenlänge und/oder der Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
  • Greenness Index
  • Der ”Greenness Index”, wie hier verwendet, wird aus digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jeden zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehörigen Pixel wird das Verhältnis des Grünwertes gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell für Farbkodierung) berechnet. Der Greenness Index wird ausgedrückt als Prozent der Pixel, für die das Grün:Rot-Verhältnis eine bestimmte Schwelle überschreitet. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter den Wachstumsbedingungen einer reduzierten Nährstoffverfügbarkeit wird der Greenness Index der Pflanzen bei der letzten Bildaufnahme vor dem Blühen gemessen. Unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen wird der Greenness Index der Pflanzen bei der ersten Bildaufnahme nach dem Trockenstress gemessen.
  • Pflanze
  • Der Begriff ”Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, wozu Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe gehören, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäuresequenz umfasst. Der Begriff ”Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäuresequenz umfasst.
  • Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, gehören all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die unter anderem die folgenden Pflanzen umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticale (Triticum secale), Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • 1. 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX)
  • Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation, vorzugsweise die Erhöhung, der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, in den Wurzeln einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, in den Wurzeln einer Pflanze moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren, vorzugsweise Erhöhen, der Expression einer Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäuresequenz, die für ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, in die Wurzeln einer Pflanze einbringt und darin exprimiert.
  • Wird im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Wird im folgenden Text auf eine ”Nukleinsäuresequenz, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll dies eine Nukleinsäuresequenz bedeuten, die ein solches 2-Cys-PRX-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäuresequenz, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäuresequenz, die für den Typ des Polypeptids kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”2-Cys-PRX-Nukleinsäuresequenz” oder ”2-Cys-PRX-Gen” bezeichnet.
  • Ein ”2-Cys-PRX-Polypeptid”, wie hier definiert, betrifft jedes Polypeptid, das vom N- Terminus zum C-Terminus Folgendes umfasst: (1) ein Plastiden-Transitpeptid und (2) eine konservierte 2-Cys-PRX-Domäne.
  • Weiterhin umfasst ein ”2-Cys-PRX-Polypeptid” vorzugsweise eines der oder beide folgende(n) Motive: (i) Motiv 1, wie in SEQ ID NO: 77 dargestellt, oder ein Motiv mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität mit der SEQ ID NO: 77; oder (ii) Motiv 2, wie in SEQ ID NO: 78 dargestellt, oder ein Motiv mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität mit der SEQ ID NO: 78.
  • Alternativ oder zusätzlich betrifft ein ”2-Cys-PRX-Polypeptid”, wie hier definiert, jede Polypeptidsequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher mit dem 2-Cys-PRX-Stamm von Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NO: 2 dargestellte Polypeptidsequenz umfassen, als mit jedem anderen PRX-Stamm Cluster bildet.
  • Alternativ oder zusätzlich betrifft ein ”2-Cys-PRX-Polypeptid”, wie hier definiert, jedes Polypeptid, das, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit dem durch SEQ ID NO: 2 dargestellten 2-Cys-PRX-Polypeptid oder mit jedem der hier in Tabelle A1 angegebenen Polypeptidsequenzen hat.
  • Der Begriff ”Domäne” und ”Motiv” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASY-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden. Eine Analyse der Polypeptidsequenz der SEQ ID NO: 2 ist nachstehend in den Beispielen 2 und 4 dargestellt.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der im MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann klar ist. Weiterhin können anstelle von Volllängensequenzen auch spezifische Domänen für die Identifikation von Homologen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte, die nachstehend im Beispiel 3 als Prozent angegeben sind, wurden über die gesamte Nukleinsäuresequenz bzw. Polypeptidsequenz bestimmt (siehe Tabelle A2 im vorliegenden Text), können aber auch über ausgewählte Domänen oder (ein) konservierte(s) Motiv(e) (wie das Motiv 1 gemäß SEQ ID NO: 77 und wie das Motiv 2 gemäß SEQ ID NO: 78, in SEQ ID NO: 2 sind sowohl Motiv 1 als auch Motiv 2 enthalten) mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter bestimmt werden.
  • Die Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Kennt man die Lokalisierung eines Proteins, trägt dies zur Aufklärung seiner Funktion bei. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zur Markierung (Tagging) von Proteinen mit dem Green Fluoreszent Protein (GFP). Solche Verfahren sind genau, obwohl sie verglichen mit Computerverfahren arbeitsintensiv sind. Vor kurzem wurden große Fortschritte bei der computergestützten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den Algorithmen, die dem Fachmann bekannt sind, sind unter den ExPASy Proteomics Tools, die am Swiss Institute for Bioinformatics gehosted werden, unter anderem zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale verfügbar. Die Identifikation der subzellulären Lokalisierung des erfindungsgemäßen Polypeptids ist im Beispiel 5 dargestellt. Dabei wird insbesondere die erfindungsgemäße SEQ ID NO: 2 dem plastidären (Chloroplasten-)Kompartiment von photosynthetischen (autotrophen) Zellen zugeordnet.
  • Verfahren zur Zielsteuerung von Proteinen zu Plastiden sind im Stand der Technik bekannt und sie beinhalten die Verwendung von Transitpeptiden. Die folgende Tabelle 3 zeigt Beispiele für Transitpeptide, die zur Zielsteuerung jedes beliebigen 2-Cys-PRX-Polypeptids zu einer Plastide verwendet werden können, wobei das 2-Cys-PRX-Polypeptid in seiner natürlichen Form nicht aufgrund eines anderen Transitpeptids (zum Beispiel seines natürlichen Transitpeptids) zu einer Plastide geleitet wird. Zum Beispiel kann auch eine Nukleinsäuresequenz, die ein cyanobakterielles 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sein, solange das 2-Cys-PRX-Polypeptid zu einer Plastide, vorzugsweise zu einem Chloroplasten, gesteuert wird. Tabelle 3: Beispiele für Transitpeptid-Sequenzen, die sich für die Zielsteuerung von Polypeptiden zu Plastiden eignen
    Figure 00380001
  • Ein 2-Cys-PRX-Polypeptid wird zu der Plastide gesteuert und ist in dieser aktiv, d. h. das 2-Cys-PRX-Polypeptid kann (zumindest in seiner nativen Form) die Entfernung von H2O2 im Chloroplasten katalysieren. Assays zum Testen dieser Aktivität sind im Stand der Technik bekannt. Weitere Einzelheiten sind Beispiel 6 zu entnehmen.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder beliebigen Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX kodiert, oder jeder 2-Cys-PRX-Polypeptidsequenz, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegeben. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen sind beispielhafte Sequenzen von Orthologen und Paralogen des 2- Cys-PRX-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 2, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht mittels Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet üblicherweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 aufgelisteten Sequenzen). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein zweites BLASTing gegen Sequenzen des Organismus, aus dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Brassica). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, und führt vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren (siehe 3).
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Zu solchen Varianten zählen beispielsweise Nukleinsäuresequenzen, die für Homologe und Derivate von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuresequenzen geeignet, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die für 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuresequenzen, die mit Nukleinsäuresequenzen, die für 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuresequenzen, die für 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die für 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier definiert.
  • Nukleinsäuresequenzen, die 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuresequenzen sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in die Wurzeln einer Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und darin exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäuresequenz durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie hier definiert, und haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle A1 von Beispiel genannten Nukleinsäuresequenzen oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäuresequenz handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt eine Polypeptidsequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der 2-Cys-PRX-Polypeptide, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in die Wurzeln einer Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer der in Tabelle A1 von Beispiel angegebenen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann, einführt und darin exprimiert oder bei dem man in die Wurzeln einer Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und darin exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz kann mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisieren, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz eine Polypeptidsequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der 2-Cys-PRX-Polypeptide, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in die Wurzeln einer Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und darin exprimiert.
  • Bei bevorzugten Spleißvarianten handelt es sich um Spleißvarianten einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der 2-Cys-PRX-Polypeptide, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in die Wurzeln einer Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und darin exprimiert oder bei dem man in die Wurzeln einer Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 genannten Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und darin exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das 2-Cys-PRX-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 und irgendeine der in Tabelle A1 von Beispiel 1 dargestellten Polypeptidsequenzen. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 2 kodiert. Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der 2-Cys-PRX-Polypeptide, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster.
  • ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution kann ebenfalls dazu verwendet werden, Varianten von Nukleinsäuresequenzen herzustellen, die 2-Cys-PRX-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in die Wurzeln einer Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und darin exprimiert oder bei dem man in die Wurzeln einer Pflanze eine Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen kodiert, einführt und darin exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der 2-Cys-PRX-Domäne-Polypeptide, welche die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe Cluster.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese stehen mehrere Verfahren zur Verfügung, von denen die üblichsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuresequenzen, die 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, können aus einer natürlichen Quelle stammen, beispielsweise aus Eubakterien und Eukaryoten (Pilzen, Pflanzen oder Tieren). Die Nukleinsäuresequenz, die aus einer künstlichen Quelle stammt, oder kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiterhin bevorzugt aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Brassica napa.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile Samen und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit erhöhter Samenausbeute im Vergleich zu der Samenausbeute von Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung eines oder mehrerer der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. erhöhte Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man bei dem Verfahren in den Eurzeln einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine erhöhte Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige weitere Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch dazu führen, dass man transgene Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke anbauen kann, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in den Wurzeln einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Üblicherweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Infolgedessen ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten, verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen angezogen werden, erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al., (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, erhöhte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren für verbesserte Ertragsmerkmale bei Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren in den Wurzeln einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen herangezogen werden, mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen werden. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperaturen, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Weil verschiedene Umweltstressbedingungen die gleichen Wege aktivieren, sollte die beispielhafte Darstellung der vorliegenden Erfindung anhand von Trockenheitsstress nicht als eine Beschränkung auf Trockenheitsstress aufgefasst werden, sondern eher als ein Filter, um die Beteiligung von 2-Cys-PRX-Polypeptiden, wie vorstehend definiert, an der Verbesserung von Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen werden, unter abiotischen Stressbedingungen im Allgemeinen darzustellen.
  • Über ein besonders hohes Ausmaß an ”Cross-Talk” zwischen Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress wird berichtet (Rabbani et al. (2003) Plant Physiol 133: 1755–1767). Daher sollte man annehmen, dass 2-Cys-PRX-Polypeptide zusammen mit ihrem Nutzen zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter Trockenheitsstressbedingungen herangezogen wurden, auch für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter verschiedenen anderen abiotischen Stressbedingungen herangezogen wurden, Anwendung finden.
  • Der Begriff ”abiotischer Stress”, wie im vorliegenden Text definiert, soll einen oder mehrere der folgenden Stressfaktoren bedeuten: Wasserstress (aufgrund von Trockenheit oder Wasserüberschuss), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (aufgrund von Hitze, Kälte oder Gefriertemperaturen), chemischer Toxizitätsstress und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionenbedingtem Stress. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wasserstress um Trockenheitsstress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern es kann sich dabei um einen Stress handeln, der durch u. a. eines oder mehrere der folgenden Salze verursacht wird: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2.
  • Die verbesserten Ertragsmerkmale bei Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen (vorzugsweise unter Trockenheitsstressbedingungen) herangezogen wurden, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen herangezogen wurden, können eines oder mehrere der folgenden Merkmale umfassen: (i) verbesserte Jungpflanzenvitalität, (ii) erhöhte oberirdische Biomasse, (iii) erhöhte Biomasse der (dünnen und dicken) Wurzeln, (iv) erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, (v) erhöhte Samenfüllungsrate, (vi) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (vii) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen, (viii) erhöhter Harvest Index oder (ix) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG).
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen unter abiotischen Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen gewachsen sind. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale in Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen herangezogen wurden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, in den Wurzeln einer Pflanze moduliert, vorzugsweise erhöht. Unter einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus einem oder mehreren der Folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionenbedingter Stress. Der Wasserstress ist vorzugsweise Trockenheitsstress.
  • Ein weiteres Beispiel für einen abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, die von der Pflanze für ihr Wachstum und ihre Entwicklung assimiliert werden müssen. Aufgrund des starken Einflusses, den die Nährstoffverwertungseffizienz auf den Ertrag und die Produktqualität von Pflanzen ausübt, wird eine enorm hohe Menge Dünger auf die Felder gestreut, um das Pflanzenwachstum und die Pflanzenqualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird üblicherweise von den drei Hauptnährstoffen Phosphor, Kalium und Stickstoff begrenzt, wobei der Letztgenannte von diesen drei Nährstoffen üblicherweise das limitierende Element für das Pflanzenwachstum ist. Das wichtigste Nährstoffelement, das für das Pflanzenwachstum erforderlich ist, ist daher Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, die man in lebenden Zellen findet, wie u. a. von Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Chlorophyll. 1,5% bis 2% der pflanzlichen Trockenmasse ist Stickstoff und ungefähr 16% des gesamten pflanzlichen Proteins. Die Verfügbarkeit von Stickstoff ist daher ein wesentlicher limitierender Faktor für das Kulturpflanzenwachstum und die Kulturpflanzenproduktion (Frink et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und hat auch eine wichtige Auswirkung auf die Proteinakkumulation und auf die Aminosäurezusammensetzung. Kulturpflanzen mit einem erhöhten Ertrag bei Wachstum unter Stickstoffmangelbedingungen sind daher von großem Interesse.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ergibt Pflanzen, die bei Wachstum unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen aufweisen. Daher wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen bereitgestellt, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogenwurden, wobei man bei dem Verfahren in den Wurzeln einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, moduliert, vorzugsweise steigert. Nährstoffmangel kann sich unter anderem aus einem Fehlen oder einem Überschuss von Nährstoffen, wie Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, ergeben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert, das funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor verbunden ist.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuresequenzen, die 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und für die Transformation in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das Folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, wie oben definiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Bei einer Ausführungsform ist eine der Kontrollsequenzen eines Konstrukts ein organspezifischer Promotor, vorzugsweise ein Promotor für die Expression in den Wurzeln einer Pflanze. Ein Beispiel für einen wurzelspezifischen Promotor ist ein Rcc3-Promotor, zum Beispiel ein Rcc3-Promotor aus Reis, wie er durch die SEQ ID NO: 80 dargestellt wird.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich transformiert, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor verbunden. Der wurzelspezifische Promotor ist vorzugsweise ein RCc3-Promotor (Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48), stärker bevorzugt stammt der RCc3-Promotor aus Reis, weiterhin bevorzugt wird der RCc3-Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen gleich der SEQ ID NO: 80 ist, am stärksten bevorzugt ist der Promotor wie in SEQ ID NO: 80 dargestellt. Beispiele für andere wurzelspezifische Promotoren, die ebenfalls zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in Tabelle 2b im vorstehenden Abschnitt ”Definitionen” dargestellt.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 noch auf die Expression einer ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, wenn sie von einem wurzelspezifischen Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Andere organspezifische Promotoren, zum Beispiel für eine bevorzugte Expression in Blättern, Stängeln, Knollen, Meristemen, Samen (im Embryo und/oder im Endosperm) eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenz(en) in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. ein Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion transgener Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben.
  • Bekanntlich nimmt je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nach der stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur ein kleinerer Teil der Zellen die Fremd-DNA auf und integriert sie in ihr Genom, falls dies gewünscht ist. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen) kodiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, zum Beispiel durch Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionell sind. Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die Polypeptide, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, kodiert, oder auch auf einem separaten Vektor eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäuresequenz stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, während die anderen Zellen absterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr gebraucht werden. Techniken zur Entfernung von Markergenen sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in die Wurzeln einer Pflanze eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert, einführt und darin exprimiert.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze, eine(n/m) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäuresequenz unter (i) kann es sich um irgendeine der Nukleinsäuresequenzen handeln, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäuresequenz kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, ein Organ oder einen irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von Genen kodiert werden, die in Pflanzen exprimierbar sind und die mit dem interessierenden Gen co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, gescreent.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des interessierenden Gens, der Kopienzahl und/oder der Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden und die T2-Pflanzen können dann unter Verwendung klassischer Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (z. B. dass alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das durch eines der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuresequenzen oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuresequenzen oder Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren, vorzugsweise Erhöhen, der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, in die/den Wurzeln einer Pflanze; die Wirkungen der Durchführung des Verfahren, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die 2-Cys-PRX-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser 2-Cys-PRX-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuresequenzen, die 2-Cys-PRX-Polypeptid kodieren, oder die 2-Cys-PRX-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein 2-Cys-PRX-Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen oder die 2-Cys-PRX-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend bei den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten eines Gens/einer Nukleinsäure, das/die für ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, können ebenfalls Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten SO genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die Ertragsmerkmale verbessern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte sind gegebenenfalls u. a. das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination von interessanten phänotypischen Merkmalen verwendet werden.
  • Nukleinsäuresequenzen, die 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die 2-Cys-PRX-Polypeptide kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuresequenzen, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den 2-Cys-PRX-kodierenden Nukleinsäuresequenzen sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuresequenzen zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die restriktionsendonukelasebehandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung darstellen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird ermittelt und dazu verwendet, die Position der Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte zu berechnen (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann vertraut.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die bei der Amplifikationsreaktion oder bei Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren im Allgemeinen nicht erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschalftlich vorteilhaften Merkmalen, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemisch und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
  • 2. Annexin-ähnlich (ANN)
  • Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein annexinähnliches Polypeptid (im Folgenden als ANN-Polypeptid bezeichnet) kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei man die Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in eine Pflanze einbringt und in dieser exprimiert.
  • Wird im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein ANN-Polypeptid, wie hier definiert, verstanden werden. Wird hier im Folgenden auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, bedeutet dies eine Nukleinsäure, die ein solches ANN-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und die daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede beliebige Nukleinsäure, welche den Typ Protein, der im Folgenden beschrieben wird, kodiert und wird im Folgenden auch als ”ANN-Nukleinsäure” oder ”ANN-Gen” bezeichnet.
  • Ein ”ANN-Polypeptid”, wie hier definiert, betrifft ein Polypeptid, das in seiner nativen Form (d. h. das Protein, wie es im Genom kodiert wird) mindestens eine, vorzugsweise zwei oder mehr der folgenden konservierten Signatursequenzen umfasst:
  • Signatursequenz 1 (SEQ ID NO: 87)
    • (A/L/V)(M/V/L/I)(L/V/M/I/C)X(W/F)(I/V/M/T/A)(L/P/Y/M/F)(D/E/S/H)(P/A)X(G/S/E/A)RDA
    • wobei X an Position 4 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine aus L, S, I, V, Q oder M; und X an Position 10 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine aus A, V, P, G, S, T oder W.
  • Vorzugsweise ist die Signatursequenz 1
    • (A/L/V)(V/L/I)(L/V/M/I)X(W/F)(V/T/A)(L/Y/M/F)(D/E/S/H)PX(E/A)RDA
  • Signatursequenz 2 (SEQ ID NO: 88):
    • A(F/I/V/C/G)XG(F/R/W/M)G(C/T/V)(D/N)(S/A/T/E)X(T/A/V/L/M)(V/I/L)(I/T)X(I/V/T)L(T/A/G)(H/Q/K)(R/S)
    • wobei X an Position 3 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine aus K, R, Q, S, E, A oder M; X an Position 10 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine aus T, S, K, N, G, D, A, E, Q oder R; X an Position 14 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine aus N, A, R, E, D, S, Q,
  • Vorzugsweise ist die Signatursequenz 2
    • A(F/I/V/C/G)XG(W/M)G(T/V)(D/N)EX(A/L/M)(I/L)(I/T)X(I/V/T)L(A/G)(H/Q/K)(R/S)
  • Signatursequenz 3 (SEQ ID NO: 89):
    • (T/S)(D/N/E/T)(D/E/K)XXL(I/T/S/N)R(V/I/A/G)(V/I/F)(V/T/C/S/A)(T/S)R(T/A)(E/D)(I/V/F/L/K/H)(D/S)
    • wobei X an Position 4 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine aus S, T, D, E, G, W, N, K; X an Position 5 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine aus T, A, S, M, H, D, G, W.
  • Vorzugsweise ist die Signatursequenz 3
    • (T/S)(D/E/T)(D/E/K)XXL(T/S/N)R(V/I/A/G)(V/I/F)(V/T/C/S/A)(T/S)R(T/A)(E/D)(I/V/F/L/K/H)(D/S)
  • Signatursequenz 4 (SEQ ID NO: 90):
    • (Y/H)(F/Y)(A/E/V/S)(K/E/D)(V/A/L/I)(L/V/I)(R/H/D)X(S/A)(M/I/L)
    • wobei X an Position 8 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine aus K, E, D, T, L, S, Q, R, N oder A.
  • Vorzugsweise ist die Signatursequenz 4
    • (Y/H)(F/Y)(A/E/V/S)(K/E/D)(V/L/I)(L/V/I)(R/D)X(S/A)(I/L)
  • Signatursequenz 5 (SEQ ID NO: 91):
    • (Y/G/K/S)(L/I/M)E(H/E)(D/H)(I/V/L)(G/A/E)
  • Vorzugsweise ist die Signatursequenz 5
    • S(L/I/M)EE(D/H)(I/V/L)A
  • Signatursequenz 6 (SEQ ID NO: 92):
    • (F/L/V/I/T)(I/L/V)(R/Q/Y)(I/V)(F/L/V/I)(T/S/G/A)(E/D/T)RS
  • Vorzugsweise ist die Signatursequenz 6
    • (F/L/V/I/T)(I/L/V)(R/Y)(I/V)(L/V/I)(T/S/G/A)TRS
  • Signatursequenz 7 (SEQ ID NO: 93):
    • Y(R/K/M/E/Q)X(F/T/L/M/I)(L/I)(L/I/V)(S/T/V/A)L(V/I/L/A/M)(G/S)
    • wobei X an Position 3 eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise eine aus T, D, N, K, S, R, A
  • Weil das ANN-Polypeptid mit Annexinen verwandt ist, weist das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete ANN-Polypeptid vorzugsweise auch eine oder mehrere Annexin-Domänen auf (Pfam-Eintrag PF00191, SMART-Eintrag SM00335, InterPro IPR001464, siehe auch 7A und 7B).
  • Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten (aus Cantero et al., Plant Physiol. Biochem. 44, 13–24, 2006 entnommen), verwendet wird, eher mit der Gruppe der ANN-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 84 und SEQ ID NO: 135 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Der Begriff ”Domäne”, ”Motiv” und ”Signatur” wird hier im Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244, InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318, Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motives and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Ein Satz von Werkzeugen für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server verfügbar (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788 (2003)). Domänen können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) dazu verwendet, das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen zu finden, das die Anzahl der Übereinstimmungen (”Matches”) maximiert und die Anzahl der Lücken (”Gaps”) minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich zugänglich. Homologe können zum Beispiel unter Verwendung des multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) leicht identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität können auch unter Verwendung eines der in dem MatGAT-Software-Paket verfügbaren Verfahren bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. Juli 2003, 10; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können kleinere Änderungen per Hand vorgenommen werden, wie dem Fachmann bekannt ist. Weiterhin können für die Identifikation von Homologen auch spezifische Domänen anstelle von Volllängensequenzen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Verwendung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder ein konservierte(s) Motiv(e) bestimmt werden.
  • Außerdem haben ANN-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) in der Regel Calciumbindungsaktivität und die Fähigkeit, an Membranen zu binden. Werkzeuge und Techniken zur Messung der Membranbindungsaktivität sind im Stand der Technik bekannt und dazu gehören die Messung von Wirkungen auf die Hydrophobie der Membranoberfläche, Vesikeldurchlässigkeit (vesicle leakage) oder Vesikelaggregation. Außerdem können ANN-Polypeptide Enzymaktivität aufweisen; zum Beispiel wird für Annexin 1 aus Arabidopsis thaliana berichtet, dass es Peroxidase-Aktivität besitzt (Gorecka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 336, 868–875, 2005). Weitere Einzelheiten werden in Beispiel 19 genannt.
  • Die vorliegende Erfindung wird dadurch veranschaulicht, dass man Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 83, welche jeweils die Polypeptidsequenzen gemäß SEQ ID NO: 84 kodiert, transformiert. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhaft unter Verwendung jeder ANN-kodierenden Nukleinsäuresequenz oder jedes ANN-Polypeptids, wie hier definiert, durchgeführt werden.
  • Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die ANN-Polypeptide kodieren, sind hier in Tabelle B1 von Beispiel 14 angegeben. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle B1 von Beispiel 14 angegebenen Aminosäuresequenzen sind beispielhafte Sequenzen von Orthologen und Paralogen des ANN-Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 84, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht identifiziert werden, indem man eine so genannte reziproke Blast-Suche durchführt. Dies beinhaltet üblicherweise eine erste BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird (zum Beispiel unter Verwendung von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 aufgelisteten Sequenzen). BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweites BLASTing) gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz die SEQ ID NO: 83 oder SEQ ID NO: 84, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Sequenzen aus Arabidopsis thaliana). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing aus derselben Art stammt wie die Abfragesequenz, in diesem Fall führt ein zweites BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von derselben Art stammt wie die Abfragesequenz und vorzugsweise beim zweiten BLASTing dazu führt, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
  • Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist in der Fachwelt gut bekannt. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch anhand der Prozent Identität. Prozent Identität bezieht sich auf die Anzahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Bildung von Clustern verwandter Gene leichter sichtbar zu machen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können auch Nukleinsäurevarianten geeignet sein. Zu solchen Varianten zählen beispielsweise Nukleinsäuren, die für Homologe und Derivate von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Für die erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Nukleinsäuresequenzen geeignet, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Aminosäuresequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität auf wie das unmodifizierte Protein, von dem sie stammen.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die ANN-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die ANN-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die ANN-Polypeptide kodieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die ANN-Polypeptide kodieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die ANN-Polypeptide kodieren, die mittels ”gene shuffling” erhalten wurden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, allelische Variante und ”gene shuffling” sind wie hier beschrieben.
  • Nukleinsäuren, die ANN-Polypeptide kodieren, müssen keine Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt einer beliebigen der in Tabelle B1 von Beisipiel 14 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen an der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können an andere kodierende (oder nichtkodierende) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, das mehrere Aktivitäten in sich vereinigt. Wenn es an andere kodierende Sequenzen fusioniert ist, kann das so erhaltene, nach der Translation hergestellte Polypeptid größer sein als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
  • Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein ANN-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle B1 von Beispiel 14 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 aufeinander folgende Nukleotide lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 83. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der ANN-Gruppe, welche die in SEQ ID NO: 84 und SEQ ID NO: 135 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, wie hier definiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein ANN-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren kann. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 83 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
  • Vorzugsweise kodiert die hybridisierende Sequenz eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der ANN-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 84 und SEQ ID NO: 135 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein ANN-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 83 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 84 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der ANN-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 84 und SEQ ID NO: 135 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine allelische Variante wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 genannten Aminosäuresequenz en kodiert, einführt und exprimiert.
  • Die allelischen Varianten, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das ANN-Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 84 und jede der in Tabelle B1 von Beispiel 14 dargestellten Aminosäuren. Allelische Varianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der allelischen Variante um eine allelische Variante gemäß SEQ ID NO: 83 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog der SEQ ID NO: 84 kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der allelischen Variante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der ANN-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 84 und SEQ ID NO: 135 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Man kann auch ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution dazu verwenden, Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, die ANN-Polypeptide, wie vorstehend definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle B1 von Beispiel 14 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
  • Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 8 dargestellten, verwendet wird, eher mit der Gruppe der ANN-Polypeptide, welche die in SEQ ID NO: 84 und SEQ ID NO: 135 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, als mit jeder anderen Gruppe Cluster.
  • Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
  • Nukleinsäuren, die ANN-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die das ANN-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer zweikeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verstärkten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” werden hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit höherem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Hektar oder Acre wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Hektar oder Acre, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, verglichen mit Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression, vorzugsweise die Erhöhung der Expression, einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine höhere Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige zusätzliche Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau transgener Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate Kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation, vorzugsweise die Erhöhung, der Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Trockenheit oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Trockenheit), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze und Insekten, verursacht werden.
  • Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen erhält, deren Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht ist. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Trockenheit, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreiben ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Trockenheitsstress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Trockenheit und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperatur, Salinität oder Trockenheitsstress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen bei Wachstum unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Trockenheitsbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze erhöht. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphate und andere phosphorhaltige Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, hervorgerufen werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein ANN-Polypeptid kodiert, wie oben definiert.
  • Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuresequenzen, die ANN-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation des interessierenden Gens in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das folgendes umfasst:
    • (a) eine Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, wie oben definiert;
    • (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, welche die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen erfolgreich transformiert, Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promoter) funktionsfähig verbunden.
  • Jede Art von Promoter, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promoter ist für die Verfahren besonders geeignet. Die Definitionen der verschiedenen Promotertypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”. Für die erfindungsgemäßen Verfahren ist auch ein für grüne Gewebe spezifischer Promotor geeignet.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die durch SEQ ID NO: 83 dargestellte, ein ANN-Poylpeptid kodierende Nukleinsäuresequenz noch auf die Expression einer ein ANN-Polypeptid kodierenden Nukleinsäure, wenn sie von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird oder wenn sie von einem für grüne Gewebe spezifischen Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen gleich der SEQ ID NO: 94 ist, am stärksten bevorzugt wird der Protomotor durch die SEQ ID NO: 94 dargestellt. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe hier in Tabelle 2a im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung ist die Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, mit einem für grüne Gewebe spezifischen Promotor verknüpft. Der für grüne Gewebe spezifische Promotor ist vorzugsweise ein Expansin-Promotor, weiterhin bevorzugt ein Expansin-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der für grüne Gewebe spezifische Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 95 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der für grüne Gewebe spezifische Promotor durch die SEQ ID NO: 95 dargestellt. Weitere Beispiele für Promotoren, die für grüne Gewebe spezifisch sind, siehe hier in Tabelle 2g im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Weitere Regulationselemente können u. a. Transkriptionsenhancer und Translationsenhancer sein. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. als Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
  • Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion von transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben.
  • Bekanntlich nimmt abhängig von dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nach einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur ein kleinerer Teil der Zellen die Fremd-DNA auf und integriert sie in ihr Genom, falls dies gewünscht ist. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das einen Selektionsmarker (wie die oben beschriebenen) kodiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingeführt. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, zum Beispiel durch Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionell sind. Weiterhin können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die Polypeptide, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, kodiert, oder auch auf einen separaten Vektor eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nukleinsäuresequenz stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (zum Beispiel überleben Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, während die anderen Zellen absterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr gebraucht werden.
  • Techniken zur Entfernung von Markergenen sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert, einführt und exprimiert.
  • Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem Samenertrag, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.
  • Bei der Nukleinsäuresequenz gemäß (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein ANN-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
  • Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, die mit dem interessierenden Gen co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, gescreent.
  • Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
  • Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (bei denen z. B. alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren erzeugt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren aufweist.
  • Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäuresequenz enthalten, die ein ANN-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuresequenzen oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind zum Beispiel u. a. Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind zum Beispiel u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuresequenzen oder Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
  • Wie vorstehend erwähnt, besteht ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, darin, dass man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, einführt und exprimiert; die Wirkungen der Durchführung des Verfahren, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die ANN-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser ANN-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
  • Hier beschriebene Nukleinsäuresequenzen, die ANN-Polypeptide kodieren, oder die ANN-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem ein ANN-Polpeptid kodierenden Gen genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die ANN-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend unter den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
  • Allelische Varianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein ANN-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von allelischen Varianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht absichtlich hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene allelische Varianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte beinhalten gegebenenfalls das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
  • Nukleinsäuresequenzen, die ANN-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die ANN-Polypeptide kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein ANN-Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den ANN-kodierenden Nukleinsäuresequenzen sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuresequenzen zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease-behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung wiedergeben. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der Nukleinsäure, die das ANN-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäuresequenz dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren im Allgemeinen nicht erforderlich.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • Punkte
    • 1. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in den Wurzeln einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX) kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht, wobei dass 2-Cys-PRX-Polypeptid vom N-Terminus zum C-Terminus Folgendes umfasst: (1) ein Plastiden-Transitpeptid und (2) eine 2-Cys-PRX-Domäne, und gegebenenfalls Pflanzen mit erhöhtem Ertrag selektiert.
    • 2. Verfahren nach Punkt 1, wobei das 2-Cys-PRX-Polypeptid außerdem eines der oder beide folgende(n) Motive umfasst: (i) Motiv 1, wie in SEQ ID NO: 77 dargestellt, oder ein Motiv mit mindestens 50%, 55%. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität mit der SEQ ID NO: 77; oder (ii) Motiv 2, wie in SEQ ID NO: 78 dargestellt, oder ein Motiv mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität mit der SEQ ID NO: 78.
    • 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, wobei das 2-Cys-PRX-Polypeptid, wenn es zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher mit dem 2-Cys-PRX-Stamm von Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NO: 2 dargestellte Polypeptidsequenz umfassen, als mit jedem anderen PRX-Stamm Cluster bildet.
    • 4. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei das 2-Cys-PRX-Polypeptid ein Polypeptid ist, das, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit dem durch SEQ ID NO: 2 dargestellten 2-Cys-PRX-Polypeptid oder mit einer der hier in Tabelle A1 angegebenen Polypeptidsequenzen hat.
    • 5. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, durch eine der in Tabelle A1 aufgeführten Nukleinsäuresequenzen dargestellt wird oder ein Teil einer solchen Nukleinsäuresequenz ist oder eine Sequenz ist, die mit einer der in Tabelle A1 aufgeführten Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann.
    • 6. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 angegebenen Polypeptide kodiert.
    • 7. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die modulierte, vorzugsweise erhöhte, Expression durch ein oder mehrere der folgenden Verfahren erzielt wird: T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING oder homologe Rekombination.
    • 8. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die modulierte, vorzugsweise erhöhte, Expression erzielt wird, indem man in die Wurzeln einer Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, einbringt und darin exprimiert.
    • 9. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei es sich bei den verbesserten Ertragsmerkmalen um eines oder mehrere der Folgenden handelt: (i) verbesserte Jungpflanzenvitalität, (ii) erhöhte oberirdische Biomasse, (iii) erhöhte Wurzelbiomasse, (iv) erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, (v) erhöhte Samenfüllungsrate, (vi) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (vii) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen, (viii) erhöhter Harvest Index oder (ix) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG).
    • 10. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter abiotischem Stress erhalten werden.
    • 11. Verfahren nach Punkt 10, wobei der abiotische Stress osmotischer Stress ist, ausgewählt aus einer oder mehreren der folgenden Stressbedingungen: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionenbedingter Stress; wobei der Wasserstress vorzugsweise Trockenheitsstress und/oder verringerte Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise verringerte Stickstoffverfügbarkeit, ist.
    • 12. Verfahren nach Punkt 10 oder 11, wobei sich die Toleranz gegenüber abiotischem Stress als verbessertes Ertragsmerkmal äußert, das aus einem oder mehreren der Folgenden ausgewählt ist: (i) verbesserte Jungpflanzenvitalität, (ii) erhöhte oberirdische Biomasse, (iii) erhöhte Biomasse der (dünnen und dicken) Wurzeln, (iv) erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, (v) erhöhte Samenfüllungsrate, (vi) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (vii) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen, (viii) erhöhter Harvest Index oder (ix) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), jeweils im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 13. Verfahren nach einem der Punkte 8 bis 12, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor, vorzugsweise einem RCc3-Promotor, weiterhin bevorzugt mit einem RCc3-Promotor, der im Wesentlichen gleich der SEQ ID NO: 80 ist, am stärksten bevorzugt mit einem Promotor, der durch die SEQ ID NO: 80 dargestellt wird, verknüpft ist.
    • 14. Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt aus Brassica napa stammt.
    • 15. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Punkt erhältlich ist/sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine Nukleinsäuretransgen umfasst, das ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert und das funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor verknüpft ist.
    • 16. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid nach einem der Punkte 1 bis 6 kodiert; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) steuern können; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen ein wurzelspezifischer Promotor, vorzugsweise ein RCc3-Promotor, ist.
    • 17. Verwendung eines Konstrukts nach Punkt 16 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale vorzugsweise eines oder mehrere der Folgenden sind: (i) verbesserte Jungpflanzenvitalität, (ii) erhöhte oberirdische Biomasse, (iii) erhöhte Biomasse der (dünnen und dicken) Wurzeln, (iv) erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, (v) erhöhte Samenfüllungsrate, (vi) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (vii) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen, (viii) erhöhter Harvest Index oder (ix) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG) im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 18. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach Punkt 16 transformiert ist.
    • 19. Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX- Polypeptid nach einem der Punkte 1 bis 5 kodiert, in eine(r) Pflanze, eine(n/m) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors; und (ii) Heranziehen der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • 20. Verfahren nach Punkt 19, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter erhöhtem abiotischem Stress auftreten.
    • 21. Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die sich aus einer modulierten, vorzugsweise erhöhten, Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid nach einem der Punkte 1 bis 6 kodiert, in den Wurzeln ergibt, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, die von der transgenen Pflanze stammen.
    • 22. Transgene Pflanze nach Punkt 15, 18 oder 21, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, die von der transgenen Pflanze stammen.
    • 23. Erntbare Teile einer Pflanze nach Punkt 22, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Samen sind.
    • 24. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 22 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Punkt 23 stammen.
    • 25. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, nach einem der Punkte 1 bis 6 zur Steigerung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, vorzugsweise zur Steigerung von einem oder mehreren der folgenden Ertragsmerkmale: (i) erhöhte Samenfüllungsrate, (ii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (iii) erhöhte Anzahl an gefüllten Samen, (iv) erhöhte Gesamtanzahl der Samen, (v) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG) oder (vi) erhöhter Harvest Index im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 26. Verwendung nach Punkt 25, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter abiotischem Stress auftreten.
    • 27. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das ANN-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Signatursequenz 1 (SEQ ID NO: 87), (ii) Signatursequenz 2 (SEQ ID NO: 88), (iii) Signatursequenz 3 (SEQ ID NO: 89), (iv) Signatursequenz 4 (SEQ ID NO: 90), (v) Signatursequenz 5 (SEQ ID NO: 91), (vi) Signatursequenz 6 (SEQ ID NO: 92), (vii) Signatursequenz 7 (SEQ ID NO: 93).
    • 28. Verfahren nach Punkt 27, wobei das ANN-Polypeptid mindestens eine Annexin-Domäne umfasst.
    • 29. Verfahren nach Punkt 27 oder 28, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
    • 30. Verfahren nach einem der Punkte 27 bis 29, wobei die Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle B1 aufgeführten Proteine kodiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
    • 31. Verfahren nach einem der Punkte 27 bis 30, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle B1 angegebenen Proteine kodiert.
    • 32. Verfahren nach einem der Punkte 27 bis 31, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise einen gesteigerten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 33. Verfahren nach einem der Punkte 27 bis 32, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nicht-Stressbedingungen erhalten werden.
    • 34. Verfahren nach einem der Punkte 27 bis 33, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Trockenheitsbedingungen erhalten werden.
    • 35. Verfahren nach einem der Punkte 29 bis 34, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis, verknüpft ist.
    • 36. Verfahren nach einem der Punkte 29 bis 34, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem für grüne Gewebe spezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem Expansin-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem Expansin-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
    • 37. Verfahren nach einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
    • 38. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Punkte erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein ANN-Polypeptid kodiert.
    • 39. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid nach den Punkten 27 oder 28 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (i) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • 40. Konstrukt nach Punkt 39, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • 41. Konstrukt nach Punkt 39, wobei eine der Kontrollsequenzen ein für grüne Gewebe spezifischer Promotor, vorzugsweise ein Expansin-Promotor, am stärksten bevorzugt ein Expansin-Promotor aus Reis, ist.
    • 42. Verwendung eines Konstrukts nach einem der Punkte 39 bis 41 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 43. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach einem der Punkte 39 bis 41 transformiert sind.
    • 44. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid nach Punkt 27 oder 28 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
    • 45. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus der gesteigerten Expression einer Nukleinsäure ergibt, die ein ANN-Polypeptid nach Punkt 27 oder 28 kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze stammt.
    • 46. Transgene Pflanze nach Punkt 38, 43 oder 45 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist.
    • 47. Erntbare Teile einer Pflanze nach Punkt 46, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Samen sind.
    • 48. Produkte, die aus einer Pflanze nach Punkt 46 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Punkt 47 stammen.
    • 49. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, zur Steigerung des Ertrags, insbesondere zur Steigerung des Samenertrags, bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Beschreibung der Figuren
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren veranschaulicht. Es zeigt:
  • 1 den katalytischen sowie den Inaktivierungs-/Reaktivierungszyklus von 2-Cys-PRX-Enzymen gemäß Rhee et al., (2005) Free radical Biology and Medicine 38: 1543–1552
  • 2 das Ergebnis einer Suche (unter Verwendung von Default-Werten) in der Conserved Domains-Datenbank (CDD) am NCBI, wobei ein 2-Cys PRX gemäß SEQ ID NO: 2 verwendet wurden. Der oberste Hit ist der Eintrag CD3015, PRX_Typ2cys.
  • 3 einen Stammbaum, der mithilfe des Neighbour Joining Clustering-Verfahrens erstellt wurde, nach einem mehrfachen Sequenz-Alignment von 2-Cys-PRX aus Eubakterien, pflanzlichen Algen, Tieren und 1-Cys-PRX aus Pflanzen mithilfe von ClustalW (1.83). Die 2-Cys-PRX-Klasse ist durch eine Hervorhebung gekennzeichnet. Das 2-Cys-PRX gemäß SEQ ID NO: 2 steht in einem Kasten.
  • 4 ein mehrfaches Sequenz-Alignment mithilfe von CLUSTAL W (1.83) von 2-Cys-PRX aus Eubakterien, pflanzlichen Algen, Tieren und 1-Cys-PRX aus Pflanzen unter Verwendung von Default-Werten. Mitov 1 gemäß SEQ ID NO: 77 und Motiv 2 gemäß SEQ ID NO: 78 stehen jeweils in einem Kasten.
  • 5 den binären Vektor für die gesteigerte Expression in Oryza sativa einer 2-Cys-PRX-kodierenden Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle eines GOS2-Promotors (pGOS2; SEQ ID NO: 79) aus Reis oder eines Rcc3-Promotors (pRcc3; SEQ ID NO: 80) aus Reis in Oryza sativa.
  • 6 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • 7A die SEQ ID NO: 84, wobei die Annexin-Domänen, wie sie durch SMART vorhergesagt werden, fettgedruckt und unterstrichen sind; 7B zeigt die (durch SMART vorhergesagten) Annexin-Domänen in ANNEXIN 4 von Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 135).
  • 8 einen Stammbaum (Cantero et al., Plant Physiol. Biochem. 44, 13–24, 2006) pflanzlicher Annexin-Proteine, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen. Die Pfeile zeigen auf Annexin 1 (SEQ ID NO: 84) und Annexin 4 (SEQ ID NO: 135), die beiden aus Arabidopsis thaliana stammen.
  • 9 ein multiples Alignment verschiedener pflanzlicher Annexin-Proteine. Die Identifikatoren geben die Datenbank-Zugangsnummern an; NP_174810 entspricht der SEQ ID NO: 84. Konservierte Reste sind durch Doppelpunkte oder Punkte angegeben.
  • 10 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression einer ANN-kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines GOS2-Promotors aus Reis (pGOS2) in Oryza sativa.
  • 11 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die lediglich beispielhaft sind. Die folgenden Beispiele sollen den Schutzbereich der Erfindung keinesfalls vollständig definieren oder ansonsten einschränken.
  • DNA-Manipulation: wenn nicht anders angegeben, werden DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standard-Protokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols beschrieben sind. Standard-Materialien und -Verfahren zur molekularen Arbeit an der Pflanze sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK), beschrieben.
  • Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische), die mit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), identifiziert. Das Programm wird zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Matches. Das durch die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz kodierte Polypeptid wurde beispielsweise für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) in eine Reihenfolge gebracht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein bestimmtes Alignment statistisch vorkommt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch anhand der Prozent Identität gewertet. Die Prozent Identität beziehen sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann der E-Wert erhöht werden, so dass auch weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.
  • Tabelle A1 stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Tabelle A1: Beispiele für 2-Cys-PRX-Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen:
    Art NCBI-Zugangsnummer der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO NCBI-Zugangsnummer der Polypeptidsequenz SEQ ID NO
    Brassica sp. SEQ ID NO: 1 1 SEQ ID NO: 2 2
    Brassica rapa AF052202.1 3 AAF00001.1 4
    Arabidopsis thaliana AY086974.1 5 AAM64537.1 6
    Brassica napus AF311863.1 7 AAG30570.1 8
    Arabidopsis thaliana NM_120712.2 9 AAM62760.1 10
    Spinacia oleracea X94219.1 11 O24364 12
    Nicotiana tabacum AJ309009.2 13 CAC84143.2 14
    Phaseolus vulgaris AJ288895.1 15 CAC17803.1 16
    Pisum sativum AJ315851.1| 17 CAC48323.1 18
    Oryza sativa NM_001053585.1 19 NP_001047050.1 Os02g0537700 20
    Secale cereale AF076920.1 21 AAC78473.1 22
    Riccia fluitans AJ005006.1 23 CAB82860.1 24
    Chlamydomonas incerta DQ122920.1 25 ABA01151.1 26
    Nostoc gi|17227497: 5544705-5545316 27 NP_488681.1 28
    Synechococcus sp gi|86607503:2357237-2357845 29 YP_478458.1 30
    Nodularia spumigena gi|119509627:35267-35878 31 ZP_01628800.1 32
    Thermosynechococcus elongatus gi|22297544:1516844-1517437 33 NP_682244.1 34
    Ostreococcus tauri gi|118721427:14610-14671, 14874-14913, 15068-15658 35 CAL55168.1 36
    Synechococcus gi|86604733:552727-553335 37 YP_474017.1 38
    Synechococcus gi|33864539:1204065-1204667 39 NP_897306.1 40
    Synechococcus elongatus gi|81298811:2377107-2377703 41 YP_401326.1 42
    Prochlorococcus marinus gi|84517401:555567-556163 43 ZP_01005378.1 44
    Porphyra purpurea gi|11465652:76976-77575 45 NP_053882.1 46
    Gracilaria tenuistipitata gi|51209843:100291-100971 47 YP_063623.1 48
    Mus musculus X82067.1 49 Q61171 50
    Rattus norvegicus NM_017169.1 51 NP_058865.1 52
  • In einigen Fällen wurden verwandte Sequenzen vorläufig zusammengebaut und öffentlich durch Forschungsinstitutionen offenbart, wie The Institute for Genomic Research (TIGR). Die Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank kann zur Identifikation solcher verwandten Sequenzen verwendet werden, und zwar entweder über die Schlüsselwort-Suche oder durch den BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenz.
  • Beispiel 2: Alignment von 2-Cys-PRX-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment von 2-Cys-PRO: Polypeptidsequenzen aus Eubakterien, pflanzlichen Algen, Tieren und von 1-Cys-PRX-Polypeptidsequenzen aus Pflanzen (als Ausreißer) erfolgte mit dem Clustal W-Algorithmus (1.83) des progressiven Alignments unter Verwendung von Default-Werten (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Um das Alignment weiter zu optimieren, wurden kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt. Das Alignment der 2-Cys-PRX-Polypeptide ist in 4 gezeigt. Motiv 1 gemäß SEQ ID NO: 77 und Motiv 2 gemäß SEQ ID NO: 78 stehen jeweils in einem Kasten.
  • Unter Verwendung eines ”Neighbour-joining”-Clustering-Algorithmus, wie er im Stand der Technik bekannt ist, (3) wurde ein Stammbaum der 2-Cys-PRX-Polypeptidsequenzen aus Eubakterien, pflanzlichen Algen, Tieren und der 1-Cys-PRX-Polypeptidsequenzen aus Pflanzen (als Ausreißer) konstruiert. Die 2-Cys-PRX-Klasse ist durch Hervorhebung gekannzeichnet. Das 2-Cys-PRX gemäß SEQ ID NO: 2 steht in einem Kasten.
  • Beispiel 3: Berechnung der Gesamtprozent an Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einem der im Stand der Technik verfügbaren Verfahren, nämlich der MatGAT-(Matrix Global Alignment Tool-)Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und die Identität unter Verwendung von zum Beispiel Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring-Matrix: Blosum62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle A2 für die Gesamt-Ähnlichkeit und -Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt. Die Prozent Identität sind über der Diagonale fettgedruckt dargestellt und die Prozent Ähnlichkeit unter der Diagonalen (in normaler Schrift).
  • Die Prozent Identität zwischen den 2-Cys-PRX-Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann nur 35% Aminosäure-Identität im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 betragen.
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001
  • Beispiel 4: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Der Conserved Domain Search-Service (CD-Search) ist ein Internet-Werkzeug für die Ermittlung struktureller und funktioneller Domänen in Proteinsequenzen, das am NCBI gehostet wird. Bei CD-Search wird BLAST(R) dazu verwendet, eine umfassende Sammlung von Modelldomänen zu durchsuchen. Die Ergebnisse der Suche werden angezeigt als Zeichnung der Domänenarchitektur sowie paarweise Alignments zwischen der Abfragesequenz und der Konsensussequenz der Modelldomäne (Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004), "CD-Search: protein domain annotations an the fly", Nucleic Acids Res. 32 (W)327–331). Eine Suche (unter Verwendung von Default-Werten) mit einem 2-Cys PRX gemäß SEQ ID NO: 2 liefert als obersten Hit den Eintrag CD3015, PRX_Typ2cys (2, Tabelle A3). Table A3: CDD mit der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsbezeichnung Beschreibung
    CDD CD3015 PRX_Typ2cys Peroxiredoxin-(PRX-) Familie, üblich 2-Cys-PRX-Subfamilie; PRX sind thiolspezifische Antioxidans-(TSA-) Proteine, die in Zellen aufgrund ihrer Peroxidase-Aktivität eine Schutzfunktion ausüben, indem sie Wasserstoffperoxid, Peroxynitrit und organische Hydroperoxide reduzieren.
  • Beispiel 5: Vorhersage der subzellulären Lokalisierung für die Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine voraus. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) für den sekretorischen Weg. Die Bewertungen (Scores), auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Score ist jedoch gemäß TargetP am wahrscheinlichsten und das Verhältnis zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (Reliability Class, RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Für die Sequenzen, die den Vorhersagen zufolge eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurde eine Anzahl Parameter ausgewählt, wie Organismusgruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Sätze von Ausschlussgrenzen (keine, vordefinierte Sätze von Ausschlussgrenzen oder nutzerspezifische Sätze von Ausschlussgrenzen) und die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 2 veranschaulicht wird, sind in Tabelle A4 dargestellt. Es wurde die Organismusgruppe ”Pflanze” gewählt, keine Ausschlussgrenzen definiert und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids abgefragt. Die vorhergesagte subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 ist das Plastidenkompartiment. Tabelle A4: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 2
    Länge (AA) 268
    Chloroplasten-Transitpeptid 0,987
    Mitochondriales Transitpeptid 0,014
    Signalpeptid des sekretorischen Wegs 0,023
    Anderes subzelluläres Ziel 0,018
    Vorhergesagte Lokalisierung Chloro
    Verlässlichkeitsklasse 1
    Vorhergesagte Länge des Transitpeptids 58
  • Die vorhergesagte Länge gemäß TargetP1.1 beträgt 58 Aminosäuren (beginnend am N-Terminus), dies lässt sich jedoch nur experimentell durch Sequenzieren des reifen Proteins bestätigen. Cheong et al (1999) sagen ein 65 Aminosäuren lange Transitpeptid für das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 voraus (Plant Molec Biol 40: 825–834).
  • Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:
    • • ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Univerität Dänemark gehostet wird;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada, gehostet wird;
    • • TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird
  • Beispiel 6: Funktioneller Assay für ein 2-Cys-PRX-Polypeptid
  • 2-Cys PRX-Polypeptide zeigen zum Beispiel an Wasserstoffperoxid eine Peroxidase-Aktivität. Enzymassays für 2-Cys PRX-Proteine sind in der Literatur ausgiebig beschrieben und dem Fachmann bekannt. Huang et al. (2007; Appl Microbiol Biotechnol 74(1): 84–92), Bernier-Villamor et al. (2004; J Exp Bot 55(406): 2191–9) und Caporaletti et al. (2007; Biochem Biophys Res Commun 355(3): 722–7) sind neuere Veröffentlichungen, die den Enzymtest von 2-Cys PRX-Proteinen beschreiben.
  • Beispiel 7: Klonierung der Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird
  • Die Nukleinsäuresequenz, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize ein 2-Cys-PRX-Klon aus Brassica rapa verwendet wurde, wie in Cheong et al., (1999; Plant Molec Biol) beschrieben. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm08756 (SEQ ID NO: 81; sense, Startcodon fettgedruckt):
    5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgt ctgttgcttctt-3'
    und prm08757 (SEQ ID NO: 82; revers, komplementär):
    5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcgagctaaatagctgagaagag-3',
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone”, p2-Cys-PRX, rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der ”entry clone”, der die SEQ ID NO: 1 enthielt, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit zwei Zielvektoren, die für die Transformation von Oryza sativa verwendet werden, verwendet. Diese Vektoren enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Der erste Zielvektor umfasste stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette den GOS2-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 79) für eine starke konstitutive Expression, der zweite Zielvektor umfasste den Rcc3-Promotor aus Reis für die wurzelspezifische Expression (SEQ ID NO: 80).
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die erhaltenen Expressionsvektoren pGOS2::2-Cys-PRX und pRcc3::2-Cys-PRX (5) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 8: Pflanzentransformation
  • Reistransformation
  • Die beiden Agrobacterium-Stämme, die jeweils einen der Expressionsvektoren, wie im Beispiel 7 beschrieben, enthielten, wurden zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisation erfolgte durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl2, wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Anschließend wurden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli mittels Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Stückchen der embryogenen Kalli wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
  • Für die Cokultivierung verwendete man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthielt. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und für 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien gewonnen und bis zu einer Dichte (OD600) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wurde die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli wurden 15 Minuten in die Suspension eingetaucht. Dann wurden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft, auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und für 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli wurden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickelten sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wurde das embryogene Potenzial freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickelten sich Sprosse. Die Sprosse wurden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt wurden. Abgehärtete Sprosse wurden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
  • Pro Konstrukt wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden für die Ernte von T1-Samen nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen zurückbehalten, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel zeigten. Die Samen wurden dann 3 bis 5 Monate nach der Transplantation geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten mit einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Beispiel 9: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 9.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygoten), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation weiter untersucht, wobei dasselbe Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, aber mehr Individuen pro Ereignis eingesetzt wurden. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen aus T2-Samen von 4 Ereignissen wurden unter Normalbedingungen in Blumenerde herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch erneut gegossen, bis wiederum ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Ansonsten wurde wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen kultiviert (Pflanzenreife, Samenernte). Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • 9.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden waren, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Aussagen von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch-Ereignis-Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass man den Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen vergleicht.
  • 9.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln 2-Cys-PRXnt-Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (Keimpflanze) drei Wochen nach der Keimung. Die Jungpflanzenvitalität wurde bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von überirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, die zum gleichen Zeitpunkt aus verschiedenen Winkeln aufgenommen wurden, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse stammen von Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten.
  • Zur Messung der Wurzelparameter wurden die Pflanzen in speziellen Töpfen mit transparentem Boden herangezogen, so dass die Wurzeln sichtbar waren. Während des Pflanzenwachstums wurden durch den Topfboden mit einer Digitalkamera Bilder aufgenommen. Aus dem Bild wurden unter Verwendung einer entsprechenden Software die Wurzelmerkmale extrapoliert, wie beispielsweise die herausragende Gesamtfläche (die mit dem Gesamt-Wurzelvolumen korreliert werden kann), der mittlere Durchmesser und die mittlere Länge der Wurzeln oberhalb einer bestimmten Dickegrenze (Länge der dicken Wurzeln oder ”thick root length”). Eine Steigerung der Wurzelbiomasse drückt sich aus als Erhöhung der Gesamt-Wurzelbiomasse (die als maximale Biomasse der Wurzeln, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet werden, gemessen wird) oder als Erhöhung des Wurzel/Spross-Index (der als Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im aktiven Wachstumszeitraum von Wurzel und Spross gemessen wird).
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag pro Pflanze und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen an der Gesamtanzahl an Samen (oder Einzelblüten) definiert.
  • Beispiel 10: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen, die unter Normalbedingungen herangezogen wurden
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die eine Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors exprimierten und unter normalen Wachstumsbedingungen herangezogen wurden, sind nachstehend dargestellt. Es wurden eine bessere Jungpflanzenvitalität sowie eine erhöhte Samenfüllungsrate, ein erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, eine erhöhte Anzahl gefüllter Samen, ein erhöhter Harvest Index und ein erhöhtes Tausendkorngewicht beobachtet. Tabelle A5: Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors exprimierten und unter normalen Wachstumsbedingungen herangezogen wurden.
    Merkmal % Erhöhung für die drei besten Ereignisse in der T1-Generation % Erhöhung für die drei besten Ereignisse in der T2-Generation
    Jungpflanzenvitalität (Keimlinge) 7% 5%
    Samenfüllungsrate 1% 10%
    Gesamt-Samenertrag pro Pflanze 8% 10%
    Gesamtanzahl gefüllter Samen 6% 8%
    Harvest Index 7% 9%
    Tausendkorngewicht 3% 3%
  • Transgene Reispflanzen, die eine Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors (eines GOS2-Promotors aus Reis) exprimierten und unter normalen Wachstumsbedingungen herangezogen wurden, zeigten keinen Unterschied hinsichtlich eines der phänotypisch untersuchten Merkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren normalen Wachstumsbedingungen herangezogen wurden (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 11: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen, die unter Stresswachstumsbedingungen herangezogen wurden
  • Die Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die eine Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors exprimierten und unter Trockenheitsstress-Wachstumsbedingungen herangezogen wurden, sind nachstehend dargestellt. Es wurden eine bessere Jungpflanzenvitalität sowie eine erhöhte oberirdische Biomasse, eine erhöhte Wurzelbiomasse, eine erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, eine erhöhte Samenfüllungsrate, ein erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, eine erhöhte Anzahl an Samen, eine erhöhte Anzahl gefüllter Samen und ein erhöhter Harvest Index beobachtet. Tabelle A6: Ergebnisse der Untersuchung transgener Reispflanzen, die die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors exprimierten und unter Trockenheitsstress-Wachstumsbedingungen herangezogen wurden.
    Merkmal % Erhöhung in T2-Generation (alle Ereignisse)
    Jungpflanzenvitalität (Keimlinge) 31%
    oberirdische Biomasse 11%
    Wurzelbiomasse 6%
    Blüten pro Rispe 8%
    Samenfüllungsrate 8%
    Gesamt-Samenertrag pro Pflanze 18%
    Gesamtanzahl an Samen 10%
    Gesamtanzahl gefüllter Samen 17%
    Harvest Index 8%
  • Beispiel 12: Beispiele für die Transformation anderer Kulturpflanzen
  • Maistransformation
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days alter pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizentransformation
  • Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexiko, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Sojabohnentransformation
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A&M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojanbohnen-Sorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojabohnensamen wird für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Raps-/Canolatransformation
  • Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Ausssat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakteriensuspension getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MS0) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Luzernetransformation
  • Ein regenerierender Luzerne-(Medicago sativa-)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Luzerne-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige and Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums herangezogen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Baumwolltransformation
  • Die Transformation von Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) erfolgt unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens an Hypokotylenexplantaten. Die handelsüblichen Sorten, wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sind für die Transformation verwendete Standardsorten, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln gekeimt. Hypokotylenexplantate von den gekeimten Keimlingen werden auf eine Länge von etwa 1–1,5 Zentimeter geschnitten. Das Hypokotylenexplantat wird in dem Agrobacterium tumefaciens-Impfgut, das den Expressionsvektor enthält, für 5 Minuten eingetaucht und dann für etwa 48 Stunden auf MS + 1,8 mg/l KNO3 + 2% Glucose bei 24°C im Dunkeln cokultiviert. Die Explantate werden in das gleiche Medium, das geeignete bakterielle und pflanzliche Selektionsmarker enthält (und mehrmals erneuert wird) umgesetzt, bis embryogene Kalli beobachtet werden. Die Kalli werden dann getrennt und subkultiviert, bis somatische Embryonen auftreten. Pflänzchen, die von den somatischen Embryonen stammen, lässt man auf Wurzelmedium reifen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Blumenerde im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Beispiel 13: Beispiele für andere Screening-Bedingungen
  • Salzstress-Screening
  • Die Pflanzen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden.
  • Screening unter verringerter Nährstoff-(Stickstoff-)Verfügbarkeit
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde unter Normalbedingungen mit Ausnahme der Nährlösung herangezogen. Die Töpfe werden vom Umsetzen bis zur Reife mit einer spezifischen Nährlösung mit verringertem N-Stickstoff-(N-)Gehalt, üblicherweise zwischen 7 bis 8 Mal weniger, gegossen. Ansonsten erfolgt die Kultivierung (Pflanzenreife, Samenernte) wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter Normalbedingungen aufgezeichnet.
  • Beispiel 14: Identifikation von Sequenzen, die mit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische), die mit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), identifiziert. Das Programm wird zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Matches. Das durch die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz kodierte Polypeptid wurde beispielsweise für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) in eine Reihenfolge gebracht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein bestimmtes Alignment statistisch vorkommt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch anhand der Prozent Identität gewertet. Die Prozent Identität beziehen sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann der E-Wert erhöht werden, so dass auch weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.
  • Tabelle B1 stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit der für die erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Nukleinsäuresequenz verwandt sind. Tabelle B1: Beispiele für ANN-Polypeptide:
    Ursprungspflanze Nukleinsäure-SEQ ID NO: Protein-SEQ ID NO:
    Arabidopsis thaliana ANNAT1 83 84
    Gossypium hirsutum Faser-Annexin 96 97
    Lavatera thuringiaca Annexin 98 99
    Brassica rapa subsp. Pekinensis 80C09_22 100 101
    Gossypium hirsutum Annexin 102 103
    Capsicum annuum Annexin 24 104 105
    Nicotiana tabacum VCaB42 106 107
    Gossypium hirsutum Anx1 108 109
    Nicotiana tabacum Annexin 110 111
    Solanum tuberosum Annexin p34 112 113
    Lycopersicon esculentum Annexin p34 114 115
    Lycopersicon esculentum Annexin p35 116 117
    Arabidopsis thaliana ANNAT2 118 119
    Nicotiana tabacum Annexin 120 121
    Solanum tuberosum Annexin p34-ähnlich 122 123
    Arabidopsis thaliana ANN7 124 125
    Medicago sativa Annexin 126 127
    Brassica rapa subsp. pekinensis 80A08_20 128 129
    Arabidopsis thaliana ANNAT3 130 131
    Arabidopsis thaliana annexin 5 132 133
    Arabidopsis thaliana ANNAT4 134 135
    Arabidopsis thaliana ANN6 136 137
    Arabidopsis thaliana ANN8 At5g12380 138 139
    Oryza sativa (Sortengruppe japonica) Os09g0394900 140 141
    Oryza sativa (Sortengruppe japonica) Os02g0753800 142 143
    Oryza sativa (Sortengruppe japonica) Os08g0425700 144 145
    Oryza sativa (Sortengruppe japonica) Os06g0221200 146 147
    Oryza sativa (Sortengruppe japonica) Os09g0453300 148 149
    Oryza sativa (Sortengruppe japonica) Os05g0382900 150 151
    Oryza sativa (Sortengruppe japonica) Os08g0372900 152 153
    Oryza sativa (Sortengruppe japonica) Os03g0819300 154 155
  • In einigen Fällen sind verwandte Sequenzen vorläufig zusammengebaut und durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), öffentlich offenbart worden. Die Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) Datenbank kann zur Identifikation solcher verwandten Sequenzen verwendet werden, und zwar entweder über die Schlüsselwort-Suche oder unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz.
  • Beispiel 15: Alignment von ANN-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment von Polypeptidsequenzen erfolgte mit dem AlignX-Programm aus dem Vector NTI-Paket (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1 und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (wenn Polypeptide einem Alignment unterworfen werden). Um das Alignment weiter zu optimieren, können kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt werden. Sequenzkonservierung zwischen den ANN-Polypeptiden kommt in der gesamten Sequenz vor. In 9 ist das Alignment der ANN-Polypeptide dargestellt.
  • Ein Stammbaum von ANN-Polypeptiden (wie er in 8 dargestellt ist) kann unter Verwendung eines Neighbour-Joining-Cluster-Algorithmus konstruiert werden, der in dem AlignX Programm von Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird.
  • Beispiel 16: Berechnung der Gesamtprozent an Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Die Gesamtprozent an Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wurden unter Verwendung von einem der im Stand der Technik verfügbaren Verfahren, nämlich der MatGAT-(Matrix Global Alignment Tool-)Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete Software), bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening penalty 12, gap extension penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und die Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix. Die Sequenzähnlichkeit ist in der unteren Hälfte der Trennlinie und die Sequenzidentität in der oberen Hälfte der diagonalen Trennlinie dargestellt.
  • Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelte es sich um:
    Scoring Matrix: Blosum62
    First Gap: 12
    Extending gap: 2
  • Die Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B2 für die Gesamt-Ähnlichkeit und -Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen dargestellt. Die Prozent Identität sind fettgedruckt über der Diagonalen und die Prozent Ähnlichkeit sind (in normaler Schrift) unter der Diagonalen angegeben.
  • Die Prozent Identität zwischen den ANN-Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kann nur 30% Aminosäure-Identität im Vergleich zu SEQ ID NO: 84 (NP_174810) betragen. Tabelle B2: MatGAT-Ergebnisse für Gesamt-Ähnlichkeit und -Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
    1. NP_174810 72,6 71,0 29,9 68,6 65,2 67,5 67,8 65,6 66,2 65,9
    2. AAC33305 84,5 89,9 32,1 71,6 71,6 68,0 72,8 72,8 72,8 73,4
    3. AAB71830 84,5 94,3 30,6 68,8 67,0 64,2 68,7 69,0 68,7 69,0
    4. AAZ41833 36,4 37,4 36,8 32,6 29,4 33,4 33,9 29,6 30,0 30,2
    5. AAB67994 82,3 84,5 83,2 38,7 63,1 72,2 85,5 63,4 63,1 63,1
    6. 1DK5 83,9 83,9 81,7 37,7 79,2 63,6 64,5 91,0 91,9 91,6
    7. AAD24540 81,1 82,6 81,0 38,7 83,9 77,6 74,4 63,9 64,2 64,9
    8. AAR13288 81,7 84,5 82,6 39,3 92,7 78,6 84,8 65,2 65,2 66,5
    9. CAA75213 84,2 85,1 83,2 37,4 81,0 95,7 79,1 80,4 92,4 92,7
    10. CAB92956 83,9 85,4 83,5 37,6 80,6 95,3 79,1 80,4 97,8 98,4
    11. AAC97494 83,9 85,4 83,5 37,6 80,6 95,3 79,1 80,4 97,8 100,0
    12. AAC97493 80,8 80,4 79,4 37,8 82,9 77,6 92,1 85,8 79,4 79,4 79,4
    13. NP_201307 79,8 81,4 80,1 44,5 85,5 79,2 83,9 84,5 80,1 80,4 80,4
    14. CAA75214 83,6 84,2 82,3 37,1 80,0 94,7 78,2 79,7 98,4 97,5 97,5
    15. ABB55363 83,3 84,8 82,9 37,3 79,7 94,7 78,5 79,7 96,5 98,7 98,7
    16. NP_196585 80,4 80,4 79,1 41,2 84,2 78,9 82,0 82,6 80,4 81,0 81,0
    17. CAA52903 80,8 82,0 81,6 38,6 83,8 79,2 82,3 83,2 81,5 81,5 81,5
    18. AAZ67605 79,2 79,1 79,1 41,1 82,6 78,0 81,6 82,0 79,4 79,7 79,7
    19. NP_181410 59,2 58,6 58,6 27,8 61,4 58,4 61,7 63,2 58,6 58,9 58,9
    20. ABE65753 58,4 56,3 54,7 27,0 58,5 54,0 56,6 59,5 54,7 55,1 55,1
    21. NP_181409 56,4 55,2 53,6 25,3 53,9 54,7 54,5 54,2 55,8 55,8 55,8
    22. NP_196584 77,4 78,9 78,6 41,2 81,8 78,0 81,1 81,8 78,3 79,2 78,9
    23. NP_568271 69,4 67,1 67,7 30,9 68,4 66,5 66,8 69,0 66,8 68,0 67,7
    24. NP_001063096 55,8 55,7 53,8 27,4 59,0 54,7 57,0 58,5 54,9 54,6 54,6
    25. NP_001048149 76,0 78,5 77,5 35,2 79,4 74,5 75,3 79,1 77,1 77,1 77,1
    26. NP_001061839 55,1 54,5 52,6 27,1 57,6 53,7 57,0 56,1 55,1 53,9 53,9
    27. NP_001057176 78,2 79,8 80,1 35,2 79,5 75,8 77,0 79,5 76,7 77,0 77,0
    28. NP_001063343 53,0 53,6 52,4 26,1 53,6 50,3 52,0 52,0 50,8 51,1 51,1
    29. NP_001055408 54,3 52,7 53,0 30,2 53,8 55,1 53,8 54,3 53,0 53,2 53,2
    30. NP_001061661 27,8 27,6 27,3 24,9 26,8 24,2 28,4 26,8 28,1 27,3 27,3
    31. NP_001051711 17,7 16,8 17,1 10,2 16,5 17,4 14,2 16,8 17,2 17,5 17,8
    12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
    1. NP_174810 65,9 64,0 65,6 64,9 63,1 65,0 62,8 38,5 34,3 32,3 60,8
    2. AAC33305 65,5 67,5 71,8 71,4 66,5 69,3 64,9 41,0 35,6 34,2 63,8
    3. AAB71830 63,3 64,4 68,0 67,3 63,3 68,4 62,3 39,8 34,1 33,0 61,3
    4. AAZ41833 32,4 41,8 29,3 29,5 35,9 33,1 35,3 19,9 17,5 16,8 34,8
    5. AAB67994 70,3 70,1 63,1 62,1 68,1 70,5 67,5 39,6 34,9 35,1 64,9
    6. 1DK5 62,0 61,8 90,7 90,4 62,0 63,6 61,1 40,0 33,5 34,2 59,8
    7. AAD24540 87,0 70,3 63,6 62,9 69,3 69,6 69,3 42,5 36,9 33,7 67,6
    8. AAR13288 73,7 71,0 65,2 63,8 70,3 69,3 68,7 43,5 36,6 35,3 67,3
    9. CAA75213 62,0 64,4 97,1 90,8 64,6 64,2 62,7 41,9 35,6 35,0 61,9
    10. CAB92956 63,6 64,4 92,4 98,4 63,9 65,2 62,7 41,3 35,3 34,1 61,6
    11. AAC97494 64,2 64,4 92,7 96,8 64,9 65,8 63,6 42,2 35,0 34,7 62,3
    12. AAC97493 68,1 62,7 62,3 68,0 66,5 67,4 40,4 36,0 33,4 65,4
    13. NP_201307 81,4 63,1 63,0 79,2 69,7 78,9 42,2 37,4 34,9 74,9
    14. CAA75214 79,0 79,5 90,8 63,9 63,0 62,3 41,0 35,0 34,7 61,6
    15. ABB55363 78,8 79,8 96,2 62,6 63,8 61,3 40,4 34,5 34,1 60,3
    16. NP_196585 80,7 89,9 79,7 80,4 69,0 89,9 41,9 38,2 34,7 82,4
    17. CAA52903 80,3 83,3 80,9 80,4 81,0 68,4 40,8 35,1 33,8 67,0
    18. AAZ67605 80,1 89,9 78,8 79,1 95,6 81,3 40,4 36,0 33,8 82,4
    19. NP_181410 60,1 57,6 58,3 58,9 59,5 58,3 58,3 31,9 33,6 41,4
    20. ABE65753 55,4 58,0 55,7 55,1 58,9 54,7 58,5 51,7 27,4 36,1
    21. NP_181409 54,9 53,9 55,8 55,8 53,0 51,4 52,0 54,2 47,6 32,6
    22. NP_196584 80,2 88,4 77,4 78,6 91,2 80,8 91,5 58,6 58,5 51,7
    23. NP_568271 66,5 66,9 66,8 68,0 67,7 68,0 68,4 63,2 56,6 55,8 66,0
    24. NP_001063096 57,5 59,0 55,2 54,4 59,2 57,1 58,9 55,1 72,2 46,1 59,1
    25. NP_001048149 74,9 76,0 76,1 75,9 76,6 77,1 75,9 60,1 57,9 51,1 74,2
    26. NP_001061839 56,1 58,3 54,8 53,6 57,9 55,5 57,0 54,5 69,2 46,4 58,6
    27. NP_001057176 74,8 76,3 75,7 76,7 74,8 76,3 74,4 60,4 56,8 48,6 74,2
    28. NP_001063343 51,4 52,4 50,8 50,8 53,0 48,3 52,0 48,6 48,9 50,2 52,4
    29. NP_001055408 53,5 53,8 53,2 53,2 53,8 52,4 53,5 60,2 44,9 47,3 53,0
    30. NP_001061661 29,1 29,4 28,1 29,4 28,1 25,8 27,3 26,3 26,0 28,9 27,3
    31. NP_001051711 16,8 16,4 16,2 17,1 15,2 19,2 16,8 16,8 17,1 17,2 16,7
    23 24 25 26 27 28 29 30 31
    1. NP_174810 49,4 35,5 59,6 36,8 60,2 28,4 37,2 12,4 11,3
    2. AAC33305 51,1 37,4 63,3 38,8 64,5 30,2 38,9 14,1 10,1
    3. AAB71830 49,2 35,3 59,8 36,0 61,9 29,1 37,8 15,1 9,2
    4. AAZ41833 22,7 19,2 29,0 19,0 28,9 14,6 21,5 14,4 8,0
    5. AAB67994 51,3 36,8 63,1 39,0 61,8 30,6 39,0 12,5 10,1
    6. 1DK5 48,6 35,2 60,8 33,9 59,5 29,0 41,3 12,2 10,5
    7. AAD24540 51,4 37,2 61,1 40,7 62,6 28,3 39,4 14,9 9,5
    8. AAR13288 51,7 37,5 63,6 38,8 63,5 30,2 40,8 14,3 7,9
    9. CAA75213 48,6 36,5 62,0 35,6 60,7 30,5 39,1 13,0 10,5
    10. CAB92956 49,2 35,5 62,0 34,8 61,0 29,5 39,1 12,5 9,9
    11. AAC97494 49,5 35,5 63,0 34,8 61,9 29,5 39,7 12,5 8,6
    12. AAC97493 49,8 36,9 59,5 39,8 59,4 28,0 38,3 13,7 11,6
    13. NP_201307 48,1 40,4 59,6 39,6 60,8 27,9 40,1 12,9 10,7
    14. CAA75214 48,9 35,3 60,8 35,3 59,4 29,8 38,9 13,0 9,9
    15. ABB55363 48,3 35,3 61,0 34,0 60,6 29,2 38,4 13,2 10,2
    16. NP_196585 50,5 38,7 61,4 38,8 58,2 28,3 39,4 12,9 11,4
    17. CAA52903 49,1 36,3 60,3 36,0 59,6 27,5 37,6 13,0 9,4
    18. AAZ67605 50,2 37,5 60,1 37,9 56,6 28,3 37,5 12,8 11,1
    19. NP_181410 45,5 33,4 41,1 30,3 42,4 25,5 41,4 15,0 11,1
    20. ABE65753 34,3 53,2 37,0 50,2 35,5 27,0 28,8 14,7 12,3
    21. NP_181409 34,7 30,1 33,0 28,2 31,0 25,4 30,2 14,1 10,3
    22. NP_196584 49,5 37,9 59,1 37,5 58,1 29,0 37,6 12,8 11,3
    23. NP_568271 36,5 51,1 35,9 52,4 29,2 38,5 13,3 12,3
    24. NP_001063096 58,9 37,8 68,5 38,6 30,4 29,3 14,0 12,1
    25. NP_001048149 67,1 59,7 37,7 83,9 29,8 37,4 14,6 10,8
    26. NP_001061839 57,3 84,4 57,3 38,4 31,8 30,9 16,8 15,5
    27. NP_001057176 69,1 57,4 90,2 58,3 28,1 39,8 15,4 11,4
    28. NP_001063343 50,2 50,2 49,8 49,2 49,2 19,8 14,6 10,9
    29. NP_001055408 55,6 46,5 51,6 46,5 54,8 38,4 15,5 12,1
    30. NP_001061661 27,6 26,5 29,4 27,6 27,3 28,6 29,1 13,4
    31. NP_001051711 19,0 19,0 17,8 20,6 17,7 19,4 16,4 19,6
  • Beispiel 17: Identifikation von Domänen in Polypeptidsequenzen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind
  • Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites-(InterPro-)Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele häufige Proteindomänen und Familien abdeckt. Pfam wird auf dem Server des Sanger Institut im Vereinigten Königreich gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
  • Die Ergebnisse aus dem InterPro-Scan der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 84 sind in Tabelle B3 dargestellt. Tabelle B3: InterPro-Scan-Ergebnisse (Hauptzugangsnummern) für die Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 84
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsname Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NO 84
    PRODOM PD000143 Annexin [16–78]T – [88–153]T – [172–239]T - [246–313]T
    PRINTS PR00196 ANNEXIN [25–47]T – [65–81]T – [92–113]T – [255–275]T – [299–312]T
    GENE3D G3DSA:1.10.220.10 Annexin [13–82]T – [83–161]T – [166–238]T - [243–317]T
    PANTHER PTHR10502 Annexin [9–312]T
    PFAM PF00191 Annexin [15–80]T – [87–152]T – [170–236]T - [246–311]T
    SMART SM00335 ANX [28–80]T – [100–152]T – [183–232]T – [259–311]T
    PROFILE PS00223 ANNEXIN [259–311]T
    SUPERFAMILY SSF47874 Annexin [1–316]T
    PRINTS PR01814 ANNEXINPLANT [119–133]T – [161–181]T – [227–245]T
    PANTHER PTHR10502:SF10 Annexin_like [9–312]T
  • Beispiel 18: Topologievorhersage für Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine voraus. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) für den sekretorischen Weg. Die Scores, auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten, und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Score ist jedoch gemäß TargetP am wahrscheinlichsten und das Verhältnis zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
  • Für die Sequenzen, die den Vorhersagen zufolge eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurde eine Anzahl an Parametern ausgewählt, wie Organismusgruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Sätze von Ausschlussgrenzen (keine, vordefinierte Sätze von Ausschlussgrenzen oder nutzerspezifische Sätze von Ausschlussgrenzen) und die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie durch SEQ ID NO: 84 dargestellt ist, sind in Tabelle B4 veranschaulicht. Es wurde die Organismusgruppe ”Pflanze” gewählt, es wurden keine Ausschlussgrenzen definiert und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde abgefragt. Die subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 84 kann das Cytoplasma oder der Kern sein, es wurde kein Transitpeptid vorhergesagt. Diese Vorhersage stimmt mit früheren Berichten überein, die darauf hindeuten, dass Annexin-Proteine mit der Plasmamembran, der Vakuole oder der Kernperipherie assoziiert sind (Clark & Roux, Plant Physiol. 109, 1133–1139, 1995). Tabelle B4: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NO: 84
    Länge (AA) 317
    Chloroplasten-Transitpeptid 0,102
    Mitochondriales Transitpeptid 0,126
    Signalpeptid des sekretorischen Wegs 0,045
    Anderes subzelluläres Ziel 0,905
    Vorhergesagte Lokalisierung /
    Verlässlichkeitsklasse 2
    Vorhergesagte Länge des Transitpeptids /
  • Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:
    • • ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada, gehostet wird;
    • • TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird
  • Beispiel 19: Funktioneller Assay für das ANN-Polypeptid
  • Assay für Annexin-Membranwechselwirkungen (Dabitz et al. Biochemistry 44, 16292–16300, 2005):
  • Membranbindungsassay (Cosedimentationsassay)
  • Phospholipidvesikel werden gemäß dem Protokoll von Reeves und Dowben (J. Cell. Physiol. 73, 49–60, 1969) hergestellt. Zur Untersuchung des Membranbindungsverhaltens pflanzlicher Annexine wird ein Cosedimentationsassay durchgeführt (Hofmann und Huber, Methods Enzymol. 372, 186–216, 2003). Es werden insgesamt 0,2 μmol Phospholipide für jede einzelne Probe (500 μl), die aus 0,5 nmol Protein in Liposomenpuffer besteht, und verschiedene Mengen an Calcium verwendet. Eine Probe aus 0,1 nmol Protein in 100 μl 10% SDS wird auf dieser Stufe als Kontrolle hergestellt. Alle Proben werden zentrifugiert (23 000 U/min bei 4°C für 45 min) und die Sedimente werden mit 50 μl 10% SDS resuspendiert und anschließend einer SDS-PAGE unterzogen. Die Gele werden mit Coomassie angefärbt und unter Verwendung von ImageJ (Rasband, W. ImageJ, Version 1.30, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 2005) densitometrisch analysiert. Jede Calciumkonzentration wird dreimal unabhängig voneinander untersucht. Die Kurvenanpassung erfolgt mittels SigmaPlot unter Verwendung einer Standard-Bindungsgleichung.
  • Herstellung von Phospholipidvesikeln.
  • Bei Experimenten zur Untersuchung der Membranoberflächenhydrophobie und der Liposomen-Leckage werden die folgenden Protokolle verwendet. Gehirn-Phosphatidylserin (PS), Ei-Phosphatidylcholin (PC), Ei-Phosphatidylethanolamin (PE), Nitrobenzoxadiazolphosphatidylethanolamin (NBD-PE) und Lissamin-Rhodamin B-Sulfonylphosphatidylethanolamin (Rh-PE) werden von einem kommerziellen Zulieferer bezogen. Multilamellare Phospholipidvesikel (MLV) werden gemäß dem Verfahren von Bangham et al. (Preparation and use of liposomes as models of biological membranes, in Methods in Membrane Biology (Korn, E. D., Hrsg.) S. 1–68, Plenum Press, New York, 1974) hergestellt. Die MLV werden durch fünf Gefrier-Auftau-Zyklen und anschließende Extrusion (fünf Mal) durch 0,1 μm-Nucleopore-Filtermembranen unter Verwendung eines Extruders (Lipex Biomembranes, Vancouver, BC) bei 30°C in große unilamellare Vesikel (LUV) umgewandelt. Die Phosphat-Bestimmung erfolgt gemäß dem Verfahren von Chen et al. (Anal. Chem. 28, 1756–1758, 1956).
  • Membranoberflächenhydrophobie.
  • Zu einer Zunahme der Membranoberflächenhydrophobie kommt es aufgrund von Dehydratisierung der Phospholipid-Kopfgruppe, entweder indem Protein an die Membranoberfläche bindet oder zwischen zwei Vesikeln wasserfreie Zwischenräume erzeugt werden, was zum Beispiel bei der Aggregation auftritt. Eine Veränderung der Membranoberflächenhydrophobie kann beobachtet werden, wenn man die Vesikel mit N-[5-(Dimethylamino)-naphthalin-2-sulfonyl)-1,2-dioleoylyl-sn-glycero-3-PE (Dansyl-PE) markiert, dessen Emissionswellenlänge proportional zur Dielektrizitätskonstanten der Sondenumgebung ist. Dazu werden reine PS-, PS/PE(3:1)- und PS/PC(1:1)-LUV, die 1 mol % Dansyl-PE enthalten, hergestellt und zu 900 μl Pufferlösung hinzugefügt (Phospholipid-Endkonzentration von 45 μM). Die Wirkung von Annexin auf diese Vesikel wird bei unterschiedlichen pH-Werten beobachtet, indem 200 nM (0,18 nmol) Protein in die calciumfreie Probe injiziert werden. Die Proben werden bei 340 nm angeregt und die Fluoreszenzemission wird bei 400 bis 600 nm aufgezeichnet (23). Zuerst wird die Wirkung des Proteins allein und danach das calciumabhängige Verhalten der Oberflächenhydrophobie untersucht.
  • Liposomen-Leakage-Assay.
  • Annexin-Phospholipid-Wechselwirkungen können zu einer Destabilisierung von Phospholipidvesikeln führen, wodurch das Innere der Vesikel ausläuft. Die Vesikel-Leakage wird anhand des Quenching der Fluoreszenz von 8-Aminonaphthalin-1,3,6-trisulfonsäure (ANTS) in Gegenwart von p-Xylen-bis-pyridiniumbromid (DPX) untersucht. Der wasserlösliche Fluorophor ANIS und sein Quencher DPX werden zu der Pufferlösung während der Herstellung der Vesikel zugegeben. Überschüssige ANIS/DPX-Pufferlösung wird mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex G-50-Säule entfernt. In den unbeeinflussten Vesikeln sind der Fluorophor und der Quencher räumlich benachbart, so dass DPX zu einem Quenching der Fluoreszenz von ANIS führt. Mit zunehmender Vesikel-Leakage werden ANIS und DPX in die äußere Pufferlösung hinein verdünnt, was zu einer Zunahme der ANTS-Fluoreszenz führt (Ellens et al., Biochemistry 24, 3099–3106, 1985).
  • Assay der Peroxidase-Aktivität von Annexin 1 (Gorecka et al. 2005).
  • Die Peroxidase-Aktivität rekombinanter Annexin1-Proteine, die in eukaryotischen oder prokaryotischen Systemen exprimiert werden, kann mithilfe von zwei Verfahren getestet werden. Das erste Verfahren beruht auf der Chemilumineszenz von oxidiertem Luminal. Proben mit den zu analysierenden Proteinen, die mittels nicht-denaturierender Elektrophorese aufgetrennt wurden, werden gemäß dem Protokoll des Herstellers auf eine Nitrocellulosemembran überführt, mit der Entwicklungslösung (ECL-Kit, Amersham), die Luminol enthält, bedeckt und für 1 Std. mit medizinischem Röntgenfilm exponiert. Alternativ wird die Peroxidase-Aktivität rekombinanter Annexinl-Proteine unter Verwendung eines fluorimetrischen Verfahren mit Amplex Red-Reagenz (Molecular Probes) an einem Fluorolog 3-Spektralfluorimeter (Jobin Yvon Spex, Edison, NJ) mit 1-nm Schlitzen für Anregung und Emission bestimmt. Das Assaymedium (100 μl Gesamtvolumen) enthält 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4, 2 mM H2O2, Amplex Red-Reagenz in einer Endkonzentration von 100 μM. Die Messungen werden in Quarzküvetten mit einer optischen Weglänge von 10 mm (0,1 ml Volumen) durchgeführt. Die Fluoreszenzemission des Oxidationsprodukts des Amplex Red-Reagenzes, Resorufin, wird bei λem 590 nm aufgezeichnet (λexc 560 nm). Zur Bestimmung der Wirkung einer Proteinphosphorylierung auf die Peroxidase-Aktivität wird AnnAt1 vor den Messungen bei 36°C für 10 min in einem Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4, mit alkalischer Phosphatase (Sigma, 15 U/ml) inkubiert. Eine Probe ohne AnnAt1 dient als Kontrolle.
  • Beispiel 20: Klonierung der bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenz
  • Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm08727 (SEQ ID NO: 85; sense, Startcodon fettgedruckt):
    5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgactcttaaggtttct-3'
    und prm09025 (SEQ ID NO: 86; revers, komplementär):
    5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaagcatcatcttcaccgag-3'
    die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination enthalten. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardmethoden aufgereinigt. Anschließend wurde der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Teminologie – ”entry clone” rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Bestandteil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NO: 83 enthaltende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Expansin-Promotor aus Reis (SEQ ID NO: 95) für die spezifische Expression in grünem Gewebe befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • In einer alternativen Ausführungsform wurde ein Zielvektor verwendet, der den GOS2-Promotor (SEQ ID NO: 94) enthielt, so dass der Expressionsvektor pGOS2::ANN erhalten wurde.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pEXP::ANN (10) oder pGOS2::ANN nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 21: Pflanzentransformation
  • Die Transformation von Reispflanzen wurde gemäß dem hier in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
  • Beispiel 22: Verfahren bei der phänotypischen Auswertung
  • 22.1 Aufbau der Auswertung
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten wurden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es wurden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthielten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlte, (Nullizygoten) durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen waren Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
  • Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation nach dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter untersucht. Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Screening unter Trockenheitsbedingungen
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden in Blumenerde unter Normalbedingungen herangezogen, bis sie das Stadium des Rispenschiebens erreichten. Anschließend wurden sie in ein ”trockenes” Areal umgestellt, wo keine Bewässerung erfolgte. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, wurden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sank der BWG unter gewisse Schwellenwerte, wurden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann wurden die Pflanzen wiederum in Normalbedingungen umgestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgte wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
  • Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten N-Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht ansonsten derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
  • 22.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wurde eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert wurden, bestimmt wurden, wurde ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgte zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wurde bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
  • Da zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Befunde von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch-Ereignis-Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte wurden dadurch erhalten, dass der Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglichen wurde.
  • 22.3 Messparameter
  • Biomasseparameter-Messung
  • Vom Sästadium bis zum Reifestadium wurden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wurde dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählte, die sich vom Hintergrund unterschieden. Dieser Wert wurde über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten.
  • Samenparameter-Messungen
  • Die reifen Primärrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann wurden die Rispen gedroschen und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen wurden verworfen und die restliche Fraktion wurde nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wurde dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verblieben, auszählte. Der Gesamtsamenertrag wurde dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wog. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählte. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Einzelblüten) definiert.
  • Beispiel 23: Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der transgenen Pflanzen
  • Die Untersuchung von transgenen Reispflanzen, die eine ANN-Nukleinsäure in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem konstitutiven Promotors exprimierten und unter Nicht-Stressbedingungen herangezogen wurden, zeigte einen Anstieg von mehr als 5% beim Gesamtsamenertrag, der Anzahl gefüllter Samen, der Füllungsrate, beim Harvest Index und von mehr als 3% für das TKG. Unter Trockenheitsstressbedingungen wurde eine Steigerung bei Gesamtsamenertrag, der Anzahl gefüllter Samen und der Füllungsrate beobachtet.
  • Pflanzen, die eine ANN-Nukleinsäure in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem für grüne Gewebe spezifischen Promotor exprimierten, zeigten ebenfalls einen erhöhten Ertrag, insbesondere ein erhöhtes TKG.
  • Beispiel 24: Transformation anderer Kulturpflanzen
  • Die Transformation anderer Kulturpflanzen erfolgt wie hier vorstehend im Beispiel 12 beschrieben.
  • Zusammenfassung Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer
  • Herstellung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, indem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX) kodiert, in den Wurzeln einer Pflanze moduliert, vorzugsweise erhöht, oder indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer modulierten, vorzugsweise erhöhten, Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX kodiert, in den Wurzeln oder mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (49)

  1. Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in den Wurzeln einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die 2-Cystein-Peroxiredoxin (2-Cys-PRX) kodiert, moduliert, vorzugsweise erhöht, wobei das 2-Cys-PRX-Polypeptid vom N-Terminus zum C-Terminus Folgendes umfasst: (1) ein Plastiden-Transitpeptid und (2) eine 2-Cys-PRX-Domäne, und gegebenenfalls Pflanzen mit erhöhtem Ertrag selektiert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das 2-Cys-PRX-Polypeptid außerdem eines der oder beide folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 1, wie in SEQ ID NO: 77 dargestellt, oder ein Motiv mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität mit der SEQ ID NO: 77; oder (ii) Motiv 2, wie in SEQ ID NO: 78 dargestellt, oder ein Motiv mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität mit der SEQ ID NO: 78.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das 2-Cys-PRX-Polypeptid, wenn es zur Konstruktion eines Stammbaums, wie dem in 3 dargestellten, verwendet wird, eher mit dem 2-Cys-PRX-Stamm von Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NO: 2 dargestellte Polypeptidsequenz umfassen, als mit jedem anderen PRX-Stamm Cluster bildet.
  4. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das 2-Cys-PRX-Polypeptid ein Polypeptid ist, das, in steigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit dem durch SEQ ID NO: 2 dargestellten 2-Cys-PRX-Polypeptid oder mit einer der hier in Tabelle A1 angegebenen Polypeptidsequenzen hat.
  5. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, durch eine der in Tabelle A1 aufgeführten Nukleinsäuresequenzen dargestellt wird oder ein Teil einer solchen Nukleinsäuresequenz ist oder eine Sequenz ist, die mit einer der in Tabelle A1 aufgeführten Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann.
  6. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A1 angegebenen Polypeptide kodiert.
  7. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die modulierte, vorzugsweise erhöhte, Expression durch eines oder mehrere der folgenden Verfahren erzielt wird: T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING oder homologe Rekombination.
  8. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die modulierte, vorzugsweise erhöhte, Expression erzielt wird, indem man in die Wurzeln einer Pflanze eine Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, einbringt und darin exprimiert.
  9. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei es sich bei den verbesserten Ertragsmerkmalen um eines oder mehrere der Folgenden handelt: (i) verbesserte Jungpflanzenvitalität, (ii) erhöhte oberirdische Biomasse, (iii) erhöhte Wurzelbiomasse, (iv) erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, (v) erhöhte Samenfüllungsrate, (vi) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (vii) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen, (viii) erhöhter Harvest Index oder (ix) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG).
  10. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter abiotischem Stress erhalten werden.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der abiotische Stress osmotischer Stress ist, ausgewählt aus einer oder mehreren der folgenden Stressbedingungen: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionenbedingter Stress; wobei der Wasserstress vorzugsweise Trockenheitsstress und/oder verringerte Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise verringerte Stickstoffverfügbarkeit, ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei sich die Toleranz gegenüber abiotischem Stress als verbessertes Ertragsmerkmal äußert, das aus einem oder mehreren der Folgenden ausgewählt ist: (i) verbesserte Jungpflanzenvitalität, (ii) erhöhte oberirdische Biomasse, (iii) erhöhte Biomasse der (dünnen und dicken) Wurzeln, (iv) erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, (v) erhöht: Samenfüllungsrate, (vi) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (vii) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen, (viii) erhöhter Harvest Index oder (ix) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), jeweils im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor, vorzugsweise einem RCc3-Promotor, weiterhin bevorzugt mit einem RCc3-Promotor, der im Wesentlichen gleich der SEQ ID NO: 80 ist, am stärksten bevorzugt mit einem Promotor, der durch die SEQ ID NO: 80 dargestellt wird, verknüpft ist.
  14. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt aus Brassica napa stammt.
  15. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch erhältlich ist/sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine Nukleinsäuretransgen umfasst, das ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert und das funktionsfähig mit einem wurzelspezifischen Promotor verknüpft ist.
  16. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäure, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert; (b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) steuern können; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen ein wurzelspezifischer Promotor, vorzugsweise ein RCc3-Promotor, ist.
  17. Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 16 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale vorzugsweise eines oder mehrere der Folgenden sind: (i) verbesserte Jungpflanzenvitalität, (ii) erhöhte oberirdische Biomasse, (iii) erhöhte Biomasse der (dünnen und dicken) Wurzeln, (iv) erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispe, (v) erhöhte Samenfüllungsrate, (vi) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (vii) erhöhte Anzahl an (gefüllten) Samen, (viii) erhöhter Harvest Index oder (ix) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG) im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  18. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach Anspruch 16 transformiert ist.
  19. Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert, in eine(r) Pflanze, eine(n/m) Pflanzenteil oder eine(r) Pflanzenzelle unter der Kontrolle eines wurzelspezifischen Promotors; und (ii) Heranziehen der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter erhöhtem abiotischem Stress auftreten.
  21. Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die sich aus einer modulierten, vorzugsweise erhöhten, Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert, in den Wurzeln ergibt, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, die von der transgenen Pflanze stammen.
  22. Transgene Pflanze nach Anspruch 15, 18 oder 21, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, die von der transgenen Pflanze stammen.
  23. Erntbare Teile einer Pflanze nach Anspruch 22, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Samen sind.
  24. Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 22 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Anspruch 23 stammen.
  25. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein 2-Cys-PRX-Polypeptid kodiert, nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Steigerung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen, vorzugsweise zur Steigerung von einem oder mehreren der folgenden Ertragsmerkmale: (i) erhöhte Samenfüllungsrate, (ii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, (iii) erhöhte Anzahl an gefüllten Samen, (iv) erhöhte Gesamtanzahl der Samen, (v) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG) oder (vi) erhöhter Harvest Index im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter abiotischem Stress auftreten.
  27. Verfahren zur Verbesserung der Ertragsmerkmale bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, moduliert, wobei das ANN-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Signatursequenz 1 (SEQ ID NO: 87), (ii) Signatursequenz 2 (SEQ ID NO: 88), (iii) Signatursequenz 3 (SEQ ID NO: 89), (iv) Signatursequenz 4 (SEQ ID NO: 90), (v) Signatursequenz 5 (SEQ ID NO: 91), (vi) Signatursequenz 6 (SEQ ID NO: 92), (vii) Signatursequenz 7 (SEQ ID NO: 93).
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei das ANN-Polypeptid mindestens eine Annexin-Domäne umfasst.
  29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei die Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle B1 aufgeführten Proteine kodiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle B1 angegebenen Proteine kodiert.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise einen gesteigerten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nicht-Stressbedingungen erhalten werden.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Trockenheitsbedingungen erhalten werden.
  35. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 34, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promoter aus Reis, verknüpft ist.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 34, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem für grüne Gewebe spezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem Expansin-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem Expansin-Promotor aus Reis, verknüpft ist.
  37. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
  38. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche erhältlich sind, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein ANN-Polypeptid kodiert.
  39. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid nach den Ansprüchen 27 oder 28 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (i) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  40. Konstrukt nach Anspruch 39, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
  41. Konstrukt nach Anspruch 39, wobei eine der Kontrollsequenzen ein für grüne Gewebe spezifischer Promotor, vorzugsweise ein Expansin-Promotor, am stärksten bevorzugt ein Expansin-Promotor aus Reis, ist.
  42. Verwendung eines Konstrukts nach einem der Ansprüche 39 bis 41 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  43. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt nach einem der Ansprüche 39 bis 41 transformiert sind.
  44. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid nach Anspruch 27 oder 28 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
  45. Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, insbesondere gesteigertem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus der gesteigerten Expression einer Nukleinsäure ergibt, die ein ANN-Polypeptid nach Anspruch 27 oder 28 kodiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze stammt.
  46. Transgene Pflanze nach Anspruch 38, 43 oder 45 oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist.
  47. Erntbare Teile einer Pflanze nach Anspruch 46, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Samen sind.
  48. Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 46 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Anspruch 47 stammen.
  49. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein ANN-Polypeptid kodiert, zur Steigerung des Ertrags, insbesondere zur Steigerung des Samenertrags, bei Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
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