DE112009000934T5

DE112009000934T5 - Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE112009000934T5
Application number: DE112009000934T
Authority: DE
Inventors: Xing Wang Conn. Deng; Yanfen Liu; Christophe Reuzeau
Original assignee: NAT INST FOR BIOLOG SCIENCES; NATIONAL INSTITUTE FOR BIOLOGICAL SCIENCES; BASF Plant Science GmbH
Current assignee: NAT INST FOR BIOLOG SCIENCES; NATIONAL INSTITUTE FOR BIOLOGICAL SCIENCES; BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-05-05
Filing date: 2009-05-04
Publication date: 2011-07-14
Also published as: WO2009135810A8; EP2274431A1; BRPI0912244A2; AU2009243552A1; AR071624A1; WO2009135810A1; CA2722806A1; US20110061134A1

Abstract

Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die für ein UBP-Polypeptid kodiert, moduliert wird, umfassend: (i) eine Cystein-Box (Cys-Box) und (ii) eine Histidin-Box (His-Box).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die eine UBiquitin-spezifische Protease (UBP) kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die eine UBP kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
Da die Weltbevölkerung ständig zunimmt und immer weniger Kulturfläche für die Landwirtschaft verfügbar ist, muss die Forschung gezwungenermaßen die Effizienz der Landwirtschaft verbessern. Herkömmliche Maßnahmen zur kulturpflanzen- und gartenbaulichen Verbesserung nutzen Selektionszüchtungstechniken, um Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften zu identifizieren. Diese Selektionszüchtungstechniken weisen jedoch mehrere Nachteile auf, nämlich, dass diese Techniken gewöhnlich arbeitsintensiv sind und Pflanzen ergeben, die häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, die nicht immer dazu führen, dass das wünschenswerte Merkmal von den Elternpflanzen weiter vererbt wird. Durch Fortschritte in der Molekularbiologie ist es der Menschheit nun möglich, das Protoplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die pflanzliche Gentechnik beinhaltet die Isolation und Manipulation von genetischem Material (gewöhnlich in Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einführung von diesem genetischen Material in eine Pflanze. Mit dieser Technologie kann man Kulturpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, agronomischen oder gartenbaulichen Merkmalen produzieren.
Ein Merkmal von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist erhöhter Ertrag. Ertrag wird normalerweise als messbares Kulturpflanzenprodukt mit wirtschaftlichem Wert definiert. Dies kann bezüglich Quantität und/oder Qualität definiert werden. Der Ertrag hängt direkt von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel die Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blattalterung und anderen. Weitere wichtige Faktoren, die den Ertrag bestimmen, sind Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität. Eine Optimierung der oben genannten Faktoren kann daher zur Erhöhung des Kulturpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist deshalb ein besonders wichtiges Merkmal, weil die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Kulturpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Canola-Raps und Sojabohne machen mehr als die Hälfte der Gesamtkalorienaufnahme des Menschen aus, und zwar entweder durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch den Verzehr von Fleischprodukten, die mit verarbeiteten Samen erzeugt wurden. Sie bilden weiterhin eine Quelle für Zucker, Öle und vielen Arte von Stoffwechselprodukten, die in industriellen Verfahren eingesetzt werden. Samen enthalten einen Embryo (den Ursprung für neue Sprosse und Wurzeln) und ein Endosperm (die Nährstoffquelle für das Embryowachstum während der Keimung und des frühen Wachstums der Keimlinge). An der Entwicklung eines Samens sind viele Gene beteiligt; sie erfordert den Transfer von Stoffwechselprodukten von den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Insbesondere das Endosperm assimiliert die Stoffwechselvorstufen von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert daraus Speichermakromoleküle, die das Korn ausfüllen.
Ein weiteres wichtiges Merkmal für viele Pflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist eine wichtige Aufgabe bei modernen Reiszüchtungsprogrammen bei gemäßigten sowie tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind für eine korrekte Verankerung in wassergesetztem Reis wichtig. Wird Reis direkt auf geflutete Felder gesät, und müssen die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen, sind längere Stängel mit Wüchsigkeit gepaart. Bei der Ausführung von Drill- bzw. Reihensaat sind längere Mesokotyle und Koleoptile wichtig für ein gutes Auflaufen des Keimlings. Die Fähigkeit zu gentechnischen Einbringung von Jungpflanzenvitalität in Pflanzen ist in der Landwirtschaft von großer Bedeutung. Eine schlechte Jungpflanzenvitalität war beispielsweise eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea mays L.)-Hybriden auf der Basis von dem im Maisgürtel vorherrschenden Protoplasmas im Europäischen Atlantik.
Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die verbesserte abiotische Stresstoleranz. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweite Ernteverluste und reduziert die durchschnittlichen Erträge bei den meisten Hauptkulturpflanzenarten um mehr als 50% (Wang et al., Planta (2003), 218: 1–14). Abiotischer Stress kann durch Dürre, Versalzung, Temperaturextrems, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit, die Pflanzentoleranz gegenüber abiotischen Stress zu verbessern, wäre weltweit von großem wirtschaftlichem Vorteil für die Landwirte und würde den Anbau von Kulturpflanzen unter ungünstigen Bedingungen und in Gebieten, wo ein Anbau von Kulturpflanzen sonst nicht möglich wäre, gestatten.
Der Kulturpflanzenertrag kann somit durch Optimierung von einem der vorstehend genannten Faktoren gesteigert werden.
Je nach dem Endgebrauch kann die Modifikation bestimmter Ertragsmerkmale gegenüber anderen bevorzugt sein. Für Anwendungen wie Viehfutter- oder Holzproduktion oder für den Rohstoff Biokraftstoff kann eine Steigerung der vegetativen Pflanzenteile gewünscht sein, und für Anwendungen, wie die Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann eine Steigerung der Samenparameter besonders gewünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können je nach der Anwendung einige anderen gegenüber bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Steigerung des Samenertrags beitragen, und zwar in der Form einer erhöhten Samengröße oder einer gesteigerten Samenanzahl.
Ein Ansatz zur Steigerung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann über die Modifikation interner Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie Zellzyklus oder verschiedene Signalwege, die an dem Pflanzenwachstum oder Verteidigungsmechanismen beteiligt sind.
Es wurde nun gefunden, dass verschiedene ertragsverbessernde Merkmale in Pflanzen dadurch verbessert werden können, dass man die Expression einer Nukleinsäure, die für eine UBP kodiert, in einer Pflanze moduliert.
Allgemeiner Stand der Technik
Hintergrund
Bei den Ubiquitin-spezifischen Proteasen (UBPs) handelt es sich um eine konservierte Proteinfamilie in Eukaryoten, die wichtige Rollen bei der Deubiquitinierung spielen. Die kovalente Modifikation von Proteinen durch Ubiquitin spielt eine zentrale Rolle bei verschiedenen zellulären Vorgängen, wie Durchlaufen des Zellzyklus, Signalübermittlung, Regulation der Transkription, DNA-Reparatur, Stressreaktionen, Endozytose und Apoptose (Hochstrasser, 1996; Varshavsky, 1997; Hershko und Ciechanover, 1998; Weissman, 2001; Pickart, 2004). Die Protein-Ubiquitinierung wird durch eine Kaskade aus drei Enzymen katalysiert. Zunächst wird Ubiquitin durch das Ubiquitin-aktivierende Enzym (E1) aktiviert, das eine Thiolesterbindung mit dem C-Terminus von Ubiquitin eingeht. Dann wird Ubiquitin auf das Ubiquitin-konjugierende Enzym (E2) überfragen. Zwar können einige E2-Enzyme eine Ligation des C-Terminus von Ubiquitin mit dem Lysinrest von Zielproteinen mithilfe von Ubiquitin-Ligasen (E3) katalysieren, aber andere E2-Enzyme übertragen ihr konjugiertes Ubiquitin auf E3-Enzyme, bevor es an Substrate dirigiert wird. Ziel-Substratproteine können durch aufeinander folgende Konjugation des C-Terminus von Ubiquitin an den Lysinrest der Ersteren über mehrere mögliche Bindungstypen mono-ubiquitiniert oder multi-ubiquitiniert werden. Das Schicksal ubiquitinierter Substratproteine hängt zum Teil von der Anzahl an konjugiertem bzw. konjugierten Ubiquitin(en) und von der Art der Bindung in der Ubiquitin-Kette ab. Die häufigste Ubiquitinierung ist eine über Lys48 verknüpfte Multi-Ubiquitin-Kette (Ubiquitin-Anzahl >= 4), die als Signal für den Proteinabbau durch das 26S-Proteasom dient.
Die Abspaltung von Ubiquitin von Proteinen durch Deubiquitinierungsenzyme (DUB) kann ebenfalls die Aktivität und das Schicksal des ubiquitinierten Substratproteins beeinflussen (Wilkinson, 1997; Amerik und Hochstrasser, 2004; Crosas et al., 2006; Hanna et al., 2006). Bei diesen DUB handelt es sich um Proteasen, die spezifisch die Peptidbindung zwischen Ubiquitinen oder zwischen dem C-Terminus von Ubiquitin und kovalent gebundenen Polypeptiden spalten. Die derzeit bekannten DUB führen zusammen vier Arten von wichtigen biochemischen Funktionen aus: zunächst erzeugen sie reife Ubiquitine aus Ubiquitin-Vorstufen (die an ribosomales Protein fusioniert sind) und aus Polyubiquitin-Genprodukten; zweitens retten sie Proteine, die unpassend ubiquitiniert wurden; drittens spalten sie Ubiquitin(-Ketten) von gebundenen Substratproteinen und viertens setzen sie freie Ubiquitinmonomere aus Multi-Ubiquitin-Ketten frei. Die drei letzteren Rollen gehen mit einer Spaltung der Isopeptidbindungen zwischen dem C-terminalen Gly von Ubiquitin und einem Lys-ε-Aminorest von einem Zielprotein einher.
Cysteinproteasen und Metalloproteasen sind die zwei großen Gruppen innerhalb der DUB-Superfamilie, wobei Cysteinproteasen in Eukaryoten am zahlreichsten sind (Nijman et al., 2005). Sämtliche bekannten Metalloproteasen weisen eine JAMM-Domäne für die katalytische Aktivität auf (Verma et al., 2002). Die Cysteinprotease-DUB kann man aufgrund der Organisation der Struktur des katalytischen Zentrums der Ubiquitin-Protease und der Organisation weiter in vier Familien unterteilen (Wilkinson, 1997; Amerik und Hochstrasser, 2004; Nijman et al., 2005). Ubiquitin-spezifische Proteasen (UBP oder USP, wie sie in Säugetieren bezeichnet werden) weisen katalytische Triadenreste in der hoch konservierten Cystein-Box und Histidin-Box auf (Hu et al., 2002). Ubiquitin-C-terminale Hydrolasen (UCH) mit ähnlichen katalytischen Triadenresten in zwei konservierten Cystein- und Histidin-Boxen (Johnston et al., 1997; Johnston et al., 1999) sind insgesamt kleinere Proteine mit einer strukturellen Behinderung über ihrer katalytischen Oberfläche, so dass sie nur kleine Amide und Ester am C-Terminus von Ubiquitin hydrolysieren können (Amerik und Hochstrasser, 2004). Ovar-Tumor-Proteasen (OTU) besitzen eine zu den beiden obigen Familien vergleichbare katalytische Triade in Cystein- und Histidin-Boxen, jedoch mit einem OTU-verwandten Motiv und werden als Teil der UBP-Familie angesehen (Balakirev et al., 2003; Nanao et al., 2004). Schließlich besitzen die Machado-Joseph-Disease-Protein-Domain-Proteasen (MJD) eine Domäne ähnlich einer Cystein- und Histidin-Box, aber ansonsten mit recht wenig Sequenzähnlichkeit zu den drei anderen Gruppen (Burnett et al., 2003; Scheel et al., 2003). Die UBP-Familie stellt den größeren Teil der Cysteinproteasen. Alle vier Typen der oben genannten biochemischen Funktionen von DUB findet man in der UBP-Familie, während die UCH ihre Funktionen nur an kleinen Proteinen und der Ubiquitin-Vorstufe ausüben.
In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zeigte eine In-silico-Analyse des vollständig sequenzierten Genoms insgesamt 27 UBP auf der Grundlage des Vorhandenseins der konservierten Cys- und His-Boxen; diese 27 UBP hat man in 14 Subfamilien weiter unterteilt (Yan et al., 2000). Frühere Untersuchungen zeigten, dass UBP3 und UBP4 eine Subfamilie bilden, in vitro eine UBP-Aktivität aufweisen und im Kern vorliegen (Chandler et al., 1997; Rao-Naik et al., 2000). Von einem weiteren Mitglied, UBP5, wurde ebenfalls gezeigt, dass es in vitro eine Deubiquitinierungsaktivität besitzt (Rao-Naik et al., 2000). Es wurde berichtet, dass eine genetische Analyse von UBP1 und UBP2, die Mitglieder einer anderen Subfamilie sind, für die Resistenz gegenüber dem Aminosäureanalogon Canavanin erforderlich sind (Yan et al., 2000). Weiterhin hat man gezeigt, dass eine Funktionsverlustmutation in UBP14 zu Letalität in der frühen Embryonalentwicklung führt (Doelling et al., 2001).
Zusammenfassung
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein UBP-Polypeptid kodiert, zu Pflanzen führt, die verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, das das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein UBP-Polypeptid in einer Pflanze kodiert, umfasst.
Definitionen
Polypeptid(e)/Protein(e)
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Aminosäuren in polymerer Form mit beliebiger Länge, welche über Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)” werden im vorliegenden Text austauschbar eingesetzt und beziehen sich auf Nukleotide, und zwar entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination davon, in einer polymeren unverzweigten Form mit einer beliebigen Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Wahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein Routinebestandteil eines Versuchsaufbaus und kann entsprechende Wildtyppflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das interessierende Gen beinhalten. Gewöhnlich gehört die Kontrollpflanze zur selben Pflanzenart oder sogar derselben Sorte wie die zu beurteilende Pflanze. Bei der Kontrollpflanze kann es sich auch um eine Nullizygote der zu beurteilenden Pflanze handeln. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze” steht im vorliegenden Zusammenhang nicht nur für ganze Pflanzen, sondern auch Pflanzenteile, darunter Samen und Samenteile.
Homolog/Homologe
”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu dem jeweiligen nichtmodifizierten Protein, sie weisen eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das nichtmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich auf einen oder mehrere Aminosäurereste, die in eine vorbestimmte Stelle in ein Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Insertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäuren in eine Sequenz hinein umfassen. Im Allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in einer Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide gehören die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie er im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet wird, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf den Austausch von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie ähnlicher Hydrophobie, Hydrophilie, Antigenität, Neigung zur Bildung oder zum Bruch von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche von einzelnen Resten, sie können jedoch je nach den funktionellen Zwängen, die dem Polypeptid auferlegt werden, in Form von Clustern vorliegen; Insertionen liegen üblicherweise in der Größenordnung von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten vor. Bei den Aminosäuresubstitutionen handelt es sich vorzugsweise um konservative Aminosäuresubstitutionen. Konservative Substitutionstabellen sind dem Fachmann bestens bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	konservative Substitutionen	Rest	konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen lassen sich leicht mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Peptidsynthese-Techniken, wie Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, herstellen. Verfahren für die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind im Stand der Technik bestens bekannt. So kennt der Fachmann zum Beispiel Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA; wozu M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder andere Protokolle für die ortsgerichtete Mutagenese gehören.
Derivate
”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die im Vergleich zu der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie das interessierende Protein, Substitutionen von Aminosäuren durch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste oder Additionen von nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten umfassen. ”Derivate” eines Proteins umfassen auch Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, die natürlich vorkommende veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte usw.) oder nicht natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann auch eine(n) oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der es abstammt, umfassen, zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, das bzw. der kovalent oder nichtkovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie ein Reportermolekül, das gebunden ist, damit es leichter nachgewiesen werden kann, und nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins. ”Derivate” umfassen darüber hinaus auch Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Überblick über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(a)/Paralog(a)
Orthologe und Paraloge umfassen Evolutionskonzepte, mit denen die Stammbeziehungen von Genen beschrieben werden. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Art, die durch Duplikation eines Urgens entstanden sind, und Orthologe sind Gene von unterschiedlichen Organismen, die durch Artbildung entstanden sind, und die auch von einem gemeinsamen Urgen abstammen.
Domäne
Der Begriff ”Domäne” steht für einen Satz von Aminosäuren, die an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen von evolutionsmäßig verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologe variieren können, zeigen Aminosäuren, die an spezifischen Positionen stark konserviert sind, Aminosäuren an, die wahrscheinlich für die Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins essentiell sind. Sie werden durch ihren hohen Konservierungsgrad in als Alignment dargestellten Sequenzen einer Familie von ProteinHomologe identifiziert und können als Identifikatoren verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Polypeptid zu einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie gehört.
Motiv/Konsensussequenz/Signatur
Der Begriff ”Motiv” oder ”Konsensussequenz” oder ”Signatur steht für eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionsmäßig verwandten Proteinen. Bei Motiven handelt es sich häufig um hochkonservierte Teile von Domänen, sie können jedoch auch nur einen Teil der Domäne beinhalten oder außerhalb einer konservierten Domäne lokalisiert sein (wenn alle Aminosäuren des Motivs außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff ”Hybridisierung” ist wie hier definiert ein Vorgang, bei dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen Basenpaarungen eingehen. Der Hybridisierungsvorgang kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Der Hybridisierungsvorgang kann auch stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren auf einer Matrix, wie magnetischen Perlen, Sepharose-Perlen oder einem anderen Harz immobilisiert ist. Der Hybridisierungsvorgang kann außerdem stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einen festen Träger, wie eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran, immobilisiert ist oder mittels z. B. Photolithographie auf z. B. einen Quarzglasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder ”micorarrays” oder Nukleinsäure-Chips bekannt ist). Die Nukleinsäuremoleküle werden im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen aufzuschmelzen und/oder um ”hairpins” oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen, so dass die Hybridisierung stattfinden kann.
Der Begriff ”Stringenz” steht für diejenigen Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch Bedingungen, wie Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und Zusammensetzung des Hybridisierungspuffers beeinflusst. Im Allgemeinen werden niedrige Stringenzbedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 30°C niedriger sind als die Schmelztemperatur (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Mittlere Stringenzbedingungen liegen dann vor, wenn die Temperatur 20°C unter T_m liegt, und hohe Stringenzbedingungen dann, wenn die Temperatur 10°C unter T_m liegt. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen werden gewöhnlich zur Isolation von hybridisierenden Sequenzen, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Zielnukleinsäuresequenz aufweisen, eingesetzt. Die Sequenzen der Nukleinsäuren können jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes voneinander abweichen, und dennoch kodieren die Nukleinsäuren ein im Wesentlichen identisches Polypeptid. Zum Identifizieren von solchen Nukleinsäuremolekülen können daher manchmal Hybridisierungsbedingungen mit mittlerer Stringenz erforderlich sein.
Bei dem T_m-Wert handelt es sich um diejenige Temperatur bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisiert. Der T_m-Wert hängt von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung und der Länge der Sonde ab. Längere Sequenzen hybridisieren zum Beispiel spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Hybridisierungsrate wird bei 16°C bis 32°C unter dem T_m-Wert erzielt. Das Vorliegen von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung reduziert die elektrostatische Abstoßung zwischen den beiden Nukleinsäuresträngen und fördert so die Hybridbildung; dieser Effekt wird für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M beobachtet (bei höheren Konzentrationen kann dieser Effekt außer Acht gelassen werden). Formamid verringert die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen mit 0,6 bis 0,7°C pro Prozent Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid ermöglicht eine Hybridisierung bei 30 bis 45°C, obwohl die Hybridisierungsrate gesenkt wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die Hitzestabilität der Doppelstränge. Durchschnittlich, und für lange Sonden sinkt der T_m-Wert um ungefähr 1°C pro Prozent Basen-Fehlpaarung. Der T_m Wert kann je nach der Art der Hybride mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6 × log₁₀[Na⁺]^a + 0,41 × %[G/C^b] – 500 × [L^c]^–1 – 0,61 × %Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58 (%G/C^b) + 11,8 (%G/C^b)² – 820/L^c
3) oligo-DNA- oder oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2 (l_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46 (l_n) ^a oder für ein anderes einwertiges Kation, jedoch nur im Bereich von 0,01–0,4 M genau. ^b nur für %GC im Bereich von 30% bis 75% genau. ^c L = Länge des Doppelstrangs in Basenpaaren. ^d oligo, Oligonukleotid; l_n, effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. G/C) + (Anz. A/T).

Eine unspezifische Bindung kann dadurch bekämpft werden, dass man eine von mehreren bekannten Techniken einsetzt, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusätze von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit RNase. Für nichthomologe Sonden können eine Reihe von Hybridisierungen durchgeführt werden, und zwar dadurch, dass man entweder (i) die Anlagerungstemperatur nach und nach senkt (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) dass man die Formamidkonzentration nach und nach senkt (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann ist mit verschiedenen Parametern vertraut, die während der Hybridisierung verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung gewöhnlich auch von der Funktion der Waschvorgänge nach der Hybridisierung ab. Um einen Hintergrund, der durch unspezifische Hybridisierung entsteht, zu entfernen, werden die Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu entscheidenden Faktoren solcher Waschvorgänge gehören die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung: Je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur ist, desto höher ist die Stringenz des Waschvorgangs. Die Waschbedingungen werden gewöhnlich bei oder unter Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, das mindestens zweimal so stark wie der Hintergrund ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäurehybridisierungs-Assays oder Genamplifizierungsnachweisverfahren wie oben dargestellt. Es können auch Bedingungen höherer oder niedrigerer Stringenz ausgewählt werden. Dem Fachmann sind die verschiedenen Parameter geläufig, die während des Waschens verändert werden können und die die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Übliche hochstringente Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen zum Beispiel die Hybridisierung bei 65°C in 1× SSC oder bei 42°C in 1× SSC und 50% Formamid, wonach Waschen bei 65°C in 0,3× SSC erfolgt. Beispiele für Hybridisierungsbedingungen mittlerer Stringenz für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4× SSC oder bei 40°C in 6× SSC und 50% Formamid, und anschließendes Waschen bei 50°C in 2× SSC. Die Länge des Hybrids ist die erwartete Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Werden Nukleinsäuren mit einer bekannten Sequenz hybridisiert, kann die Hybridlänge dadurch bestimmt werden, dass man mit den Sequenzen ein Alignment durchführt und die darin beschriebenen konservierten Regionen identifiziert. 1× SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und die Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA und 0,5% Natriumpyrophosphat beinhalten.
Zur Bestimmung des Stringenzausmaßes, kann Sambrook et al., (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Neufassungen) herangezogen werden.
Spleißvariante
Der Begriff ”Spleißvariante”, wie er hier verwendet wird, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in der ausgewählte Introns und/oder Exons ausgeschnitten, ersetzt, versetzt oder zugefügt wurden, oder in der Introns verkürzt oder verlängert wurden. Bei solchen Varianten bleibt die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten; dies lässt sich erzielen, indem man funktionelle Segmente des Proteins selektiv beibehält. Solche Spleißvarianten findet man in der Natur oder künstlich hergestellt. Verfahren zur Vorhersage und Isolation dieser Spleißvarianten sind im Stand der Technik bestens bekannt (siehe beispielsweise Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelvariante
Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines bestimmten Gens, die sich an der gleichen Chromosomenposition befinden. Allelvarianten umfassen Einzelnukleotid-Polymorphismus (Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)), sowie Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen (Small Insertion/Deletion Polymorphisms (INDELs)). Die Größe der INDELs ist gewöhnlich kleiner als 100 Bp. SNPs und INDELs bilden den größten Satz an Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Genshuffling/gerichtete Evolution
Genshuffling oder gerichtete Evolution besteht aus iterativem DNA-Shuffling und anschließendem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Teilen davon zu erzeugen, die Proteine mit modifizierter biologischer Aktivität kodieren (Castle et al., (2004), Science 304(5674): 1151–4; US-Patente 5,811,238 und 6,395,547 ).
Regulationselement/Kontrollsequenz/Promotor
Die Begriffe ”Regulationselement”, ”Kontrollsequenz” und ”Promotor” werden im vorliegenden Text jeweils austauschbar verwendet und sollen dahingehend breit interpretiert werden, dass sie regulatorische Nukleinsäuresequenzen bedeuten, die diejenigen Sequenzen, mit denen sie ligiert sind, exprimieren können. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich gewöhnlich auf eine Nukleinsäurekontrollsequenz, die sich stromaufwärts vom Transkriptionsstart eines Gens befindet und die an der Erkennung und an der Bindung der RNA-Polymerase und anderer Proteine beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verknüpften Nukleinsäure gesteuert wird. Die oben genannten Begriffe umfassen auch Transkriptionsregulationssequenzen, die sich von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen ableiten (darunter auch die TATA-Box, die für eine präzise Initiation der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz) sowie zusätzliche Regulationselemente (d. h. stromaufwärts aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression auf Umweltreize und/oder von außen wirkende Reize hin oder auf gewebespezifische Art und Weise verändern. Der Begriff beinhaltet auch eine Transkriptionsregulationssequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, der in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen beinhaltet. Der Begriff ”Regulationselement” umfasst auch ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, das die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ vermittelt, aktiviert oder verbessert.
Ein ”pflanzlicher Promotor” umfasst Regulationselemente, die die Expression eines kodierenden Sequenzabschnitts in pflanzlichen Zellen vermitteln. Ein pflanzlicher Promotor muss daher nicht pflanzlichen Ursprungs sein, sondern kann von Viren oder Mikroorganismen, zum Beispiel von Viren, die Pflanzenzellen angreifen, abstammen. Der ”pflanzliche Promotor” kann auch von einer Pflanzenzelle abstammen, z. B. von der Pflanze, die mit der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierenden und hier beschriebenen Nukleinsäuresequenz transformiert wird. Dies trifft auch auf andere ”pflanzliche” Regulationssignale, wie ”pflanzliche” Terminatoren zu. Die stromaufwärts der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten Nukleotidsequenzen gelegenen Promotor können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert werden, ohne dass die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Promotoren, des offenen Leserasters (ORF) oder der 3'-Regulationsregion wie Terminatoren oder anderen 3'-Regulationsregionen, die vom ORF beabstandet liegen, gestört wird. Weiterhin kann man auch die Aktivität der Promotoren durch Modifizieren ihrer Sequenz steigern oder sie vollständig durch aktivere Promotoren ersetzen, sogar durch Promotoren von heterologen Organismen. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder einen geeigneten Promotor umfassen, der das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Zur Identifikation funktionell äquivalenter Promotoren kann die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, indem man den Promotor funktionsfähig mit einem Reporter-Gen verknüpft und das Expressionsausmaß und/oder das Muster des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze untersucht. Geeignete bestens bekannte Reportergene umfassen beispielsweise Betaglucuronidase oder Betagalactosidase. Die Promotor-Aktivität wird untersucht, indem man die Enzymaktivität der Betaglucuronidase oder Betagalactosidase misst. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit der- bzw. demjenigen eines Referenz-Promotors verglichen werden (wie er beispielsweise in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren der mRNA-Spiegel oder durch Vergleich der mRNA-Spiegel der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Housekeeping-Genen, wie 18S rRNA, untersucht werden, wobei Verfahren des Standes der Technik, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse der Autoradiogramme, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR verwendet werden (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994). Ein ”schwacher Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor, der die Expression einer kodierenden Sequenz auf einem niedrigen Spiegel steuert. ”Niedrige Spiegel” sind Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis zu etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/500000 Transkripte pro Zelle. Ein ”starker Promotor” steuert die Expression einer kodierenden Sequenz dagegen auf hohem Spiegel, oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle.
Funktionsfähig verknüpft
Der Begriff ”funktionsfähig verknüpft” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine funktionelle Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem interessierenden Gen, so dass die Promotorsequenz die Transkription des interessierenden Gens einleiten kann.
Konstitutiver Promotor

Ein ”konstitutiver Promotor” steht für einen Promotor, der während der meisten, jedoch nicht unbedingt allen, Wachstums- und Entwicklungsphasen und unter den meisten Umweltbedingungen in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionell aktiv ist. Beispiele für konstitutive Promotoren finden sich in Tabelle 2a unten. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
Actin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGP	WO 2004/070039
CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais-H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Luzerne-H3-Histon	Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
Kleine Rubisco-Untereinheit	US 4,962,028
OCS	Leisner (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
Nos	Shaw et al., (1984),Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
V-ATPase	WO 01/14572
Superpromotor	WO 95/14098
G-Box-Proteine	WO 94/12015

Ubiquitärer Promotor
Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungsregulierter Promotor
Ein entwicklungsregulierter Promotor ist während gewisser Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, bei denen entwicklungsrelevante Veränderungen auftreten, aktiv.
Induzierbarer Promotor
Ein induzierbarer Promotor weist eine induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation auf einen chemischen Reiz (siehe Übersichtsartikel von Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen Umweltreiz oder einen physikalischen Reiz hin auf, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. dann aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt ist, oder ”pathogen induzierbar”, d. h. wird dann aktiviert, wenn eine Pflanze verschiedenen Pathogenen ausgesetzt ist.
Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein Promotor, der die Transkription bevorzugt in bestimmten Organen oder Geweben, wie den Blättern, Wurzeln, dem Samengewebe usw. initiieren kann. Ein ”wurzelspezifischer Promotor” ist beispielsweise ein Promotor, der in erster Linie in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.
Promotoren, die die Transkription nur in bestimmten Zellen initiieren können, werden im vorliegenden Text als ”zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele für wurzelspezifische Promotoren sind in Tabelle 2b unten angeführt: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
RCc3	Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27(2): 237–48
Arabidopsis-PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31:341)
Phosphattransporter aus Medicago	Xiao et al., 2006
Arabidopsis-Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
in Wurzeln exprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987
auxininduzierbares Gen des Tabaks	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991
β-Tubulin	Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988
wurzelspezifische Gene aus Tabak	Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990
G1-3b-Gen aus B. napus	United States Patent No. 5,401,836
SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993
LRX1	Baumberger et al., 2001, Genes & Dev. 15: 1128
BTG-26 aus Brassica napus	US 20050044585
LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Das LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
Klasse-I-Patatingen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991
KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
TobRB7-Gen	W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (Reis)	Wang et al., 2002, Plant Sci. 163: 273
ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
NRT2; 1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

Ein samenspezifischer Promotor ist in erster Linie in Samengewebe, jedoch nicht unbedingt ausschließlich in Samengewebe (bei ”leaky”-Expression) transkriptionell aktiv. Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann endosperm-/aleuron-/embryospezifisch sein. Beispiele für samenspezifische Promotoren (endosperm-/aleuron-/embryospezifisch) sind in den Tabellen 2c–f unten angegeben. Weitere Beispiele für samenspezifische Promotoren sind bei Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, und diese Offenbarung ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen als wäre sie hier vollständig beschrieben. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
Samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990
Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992
Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987
Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32, 1990
napA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996
LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen-SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
α-, β-, γ-Gliadine aus Weizen	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Itr1-Promotor aus Gerste	Diaz et al., (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
B1, C, D, Hordein aus Gerste	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
Gerste-DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998
Reis-Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
α-Globulin Glb-1 aus Reis	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis-OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
α-Globulin REB/OHP-1 aus Reis	Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais-ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
α-Kafirin aus Sorghumhirse	DeRose et al., Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis-Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblumen-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, mutmaßliches 40S-Ribosomenprotein aus Reis	WO 2004/070039
PRO0136, Reis-Alaninaminotransferase	unveröffentlicht
PRO0147, Trypsinhemmer ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
PRO0151, Reis-WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis-RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-artiges Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Tabelle 2d: Beispiele für endospermspezifische Promotoren

Herkunftsgen	Literaturangabe
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al., (1987), FEBS Letts. 221: 43–47
Zein	Matzke et al., (1990), Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
LMW- und HMW-Glutenin-1 aus Weizen	Colot et al., (1989), Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al., (1989), NAR 17: 461–2
Weizen-SPA	Albani et al., (1997), Plant Cell 9: 171–184
Weizen-Gliadine	Rafalski et al., (1984), EMBO 3: 1409–15
Itr1-Promotor aus der Gerste	Diaz et al., (1995), Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
B1, C, D, Hordein aus der Gerste	Cho et al., (1999), Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al., (1993), Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al., (1996), Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
Gersten-DOF	Mena et al., (1998), Plant J. 116(1): 53–62
blz2	Onate et. al., (1999), J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
Synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., (1998), Plant J. 13: 629–640
Reis-Prolamin NRP33	Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis-Globulin Glb-1	Wu et al., (1998), Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
Reis-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al., (1997), Plant Molec. Biol. 33: 513–522
Reis-ADP-Glukosepyrophosphorylase	Russell et al., (1997), Trans. Res. 6: 157–68
Mais-ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al., (1997), Plant J. 12: 235–46
Sorghumhirse-Kafirin	DeRose et al., (1996), Plant Mol. Biol. 32: 1029–35

Tabelle 2e: Beispiele für embryospezifische Promotoren:

Herkunftsgen	Literaturangabe
Reis-OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
PRO0151	WO 2004/070039
PRO0175	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039

Tabelle 2f: Beispiele für aleuronspezifische Promotoren:

Herkunftsgen	Literaturangabe
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin-β-artiges Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gersten-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor wie im vorliegenden Text definiert ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist.

Beispiele für Promotoren, die für das grüne Gewebe spezifisch sind und die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in Tabelle 2g unten dargestellt. Tabelle 2g: Beispiele für die Promotoren, die für das grüne Gewebe spezifisch sind

Gen	Expression	Literaturangabe
Orthophosphatdikinase aus Mais	Blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Mais	Blattspezifisch	Kausch et al., 2001
Phosphoenolpyruvatcarboxylase aus Reis	Blattspezifisch	Liu et al., 2003
Kleine Rubisco-Untereinheit aus Reis	Blattspezifisch	Nomura et al., 2000
Beta-Expansin EXBP9 aus Reis	Sprossspezifisch	WO 2004/070039
Kleine Rubisco-Untereinheit aus Straucherbse	Blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
RBCS3A aus Erbse	Blattspezifisch

Ein weiteres Beispiel für einen gewebespezifischen Promotor ist ein meristemspezifischer Promotor, der in erster Linie in Meristemgewebe transkriptionell aktiv ist, und zwar im Wesentlichen unter Ausschluss von jeglichen anderen Teilen einer Pflanze, obwohl trotzdem noch ”leaky”-Expression in diesen anderen Pflanzenteilen möglich ist. Beispiele für Promotoren, die für das grüne Meristem spezifisch sind und die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in Tabelle 2h unten dargestellt. Tabelle 2h: Beispiele für meristemspezfische Promotoren

Herkunftsgen	Expressionsmuster	Literaturangabe
Reis-OSH1	Sprossapikalmeristem, von globulärem Embryostadium bis zum Keimlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Reis-Metallothionein	Meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzelapikalmeristeme, sowie in sich ausbreitenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

Terminator
Der Begriff ”Terminator” umfasst eine Kontrollsequenz, bei der es sich um eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit handelt, die die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines primären Transkripts und die Transkriptionstermination signalisiert. Der Terminator kann von dem natürlichen Gen, von verschiedenen anderen pflanzlichen Genen oder von T-DNA abstammen. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel vom Nopalinsynthasegen oder vom Octopinsynthasegen oder auch von einem anderen pflanzlichen Gen oder, was weniger bevorzugt ist, von einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abstammen.
Modulation
Der Begriff ”Modulation” steht in Bezug auf die Expression oder Genexpression für ein Verfahren, bei dem das Expressionsausmaß durch die Genexpression im Vergleich zu der Kontrollpflanze dahingehend geändert ist, dass das Expressionsausmaß erhöht oder gesenkt ist. Die ursprüngliche unmodulierte Expression kann eine Art Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit nachfolgender Translation sein. Der Begriff ”Modulation der Aktivität” bedeutet eine Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder der kodierten Proteine, die einen erhöhten Ertrag und/oder ein gesteigertes Wachstum der Pflanzen ergibt.
Expression
Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht für die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” steht insbesondere für die Transkription eines Gens oder mehrerer Gene oder eines genetischen Konstrukts in strukturelle RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit oder ohne darauffolgende Translation des letzteren in ein Protein. Der Prozess beinhaltet die Transkription der DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie es hier verwendet wird steht für eine beliebige Form von Expression, die über den Spiegel des ursprünglichen Wildtyp-Spiegel hinaus geht.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Stand der Technik gut dokumentiert und beinhalten beispielsweise die Überexpression, die durch geeignete Promotoren getrieben wird, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, die als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (gewöhnlich stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, die das interessierende Polypeptid kodiert, aufwärtsreguliert wird. Endogene Promotoren können beispielsweise in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5,565,350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der korrekten Orientierung und im korrekten Abstand von einem erfindungsgemäßen Gen in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
Ist eine Polypeptidexpression gewünscht, wird wünschenswerterweise eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer Polynukleotid-kodierenden Region aufgenommen. Die Polyadenylierungsregion kann von dem natürlichen Gen, von einer Anzahl anderer Pflanzengene oder von T-DNA hergeleitet sein. Die hinzuzufügende 3'-Endsequenz kann beispielsweise hergeleitet sein von Nopalinsynthase- oder Octopinsynthase-Genen oder alternativ von einem anderen Pflanzengen oder weniger bevorzugt von einem anderen eukaryotischen Gen.
Eine Intronsequenz kann ebenfalls an der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz der partiellen kodierenden Sequenz zugegeben werden, um die Menge der reifen Botschaft zu steigern, die sich im Cytosol ansammelt. Die Aufnahme eines spleißbaren Introns in die Transkriptionseinheit in Pflanzen- und Tier-Expressionskonstrukten steigert Befunden zufolge die Genexpression auf mRNA- und Protein-Ebenen bis zu 1000fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183–1200). Eine solche Intron-Steigerung der Genexpression ist gewöhnlich am größten, wenn es sich nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit befindet. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6, das Bronze-1-Intron, sind im Stand der Technik bekannt. Für eine allgemeine Information siehe: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Hrsg., Springer, N. Y. (1994).
Endogenes Gen
Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ein ”endogenes” Gen betrifft nicht nur das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form gefunden wird (d. h. ohne dass ein menschlicher Eingriff vorliegt), sondern betrifft auch das gleiche Gen, (oder eine im Wesentlichen homologe Nukleinsäure bzw. Gen) in einer isolierten Form, das anschließend in eine Pflanze (wieder) eingebracht wird (ein Transgen). Eine transgene Pflanze, die ein solches Transgen enthält, kann eine wesentliche Reduktion der Transgenexpression und/oder eine wesentliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder von Menschenhand hergestellt werden, beispielsweise durch chemische Synthese.
Verringerte Expression
Eine Bezugnahme im vorliegenden Text auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” der Expression soll eine Abnahme der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptid-Spiegel und/oder Polypeptid-Aktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung ist in steigender Reihenfolge der Bevorzugung mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder noch mehr im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze ist eine hinreichende Länge der im Wesentlichen durchgehenden Nukleotide einer Nukleinsäuresequenz erforderlich. Zur Durchführung von Gensilencing können diese nur 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide betragen (u. a. mit der 5'- und/oder 3'-UTR, und zwar entweder teilweise oder ganz). Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann von der Nukleinsäure, die das interessierende Protein (Zielgen) kodiert, oder von einer Nukleinsäure hergeleitet werden, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann. Der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide kann Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Zielgen eingehen (und zwar entweder mit dem Sense- oder Antisense-Strang), stärker bevorzugt hat der Bereich der im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotide in steigender Reihenfolge der Bevorzugung 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zu dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäure, die ein (funktionelles) Polypeptid kodiert, ist keine Anforderung für die verschiedenen hier erörterten Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann mit Routine-Werkzeugen und -Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der endogenen Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren eines Genkonstruktes, in das die Nukleinsäure (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen abstammen, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einem der interessierenden Proteine kodieren kann) als inverted Repeat (teilweise oder ganz), getrennt durch einen Spacer (nicht-kodierende DNA) kloniert wird, in einer Pflanze.
In einem solchen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing mit einem inverted Repeat einer Nukleinsäure oder einem Teil davon (in diesem Fall einem Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann), der eine Hairpin-Struktur bilden kann. Der inverted repeat wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Kontrollsequenzen umfasst. Eine nichtkodierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Spacer, beispielsweise ein Fragment der Matrixbindungsregion (matrix attachment region fragment (MAR)), ein Intron, ein Polylinker, etc.) befindet sich zwischen den beiden invertierten Nukleinsäuren, die den inverted Repeat bilden. Nach der Transkription des inverted repeats wird eine chimäre RNA mit einer selbstkomplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als Hairpin-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird durch die Pflanze in siRNAs prozessiert, die in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex eingebracht sind (RISC). Der RISC spaltet zudem die mRNA-Transkripte, wodurch im Wesentlichen die Anzahl der mRNA-Transkripte in Polypeptide translatiert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten können beispielsweise Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ) herangezogen werden.
Die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren beruht nicht auf der Einbringung und Expression eines Genkonstrukts, in das die Nukleinsäure als inverted Repeat kloniert wurde, in eine bzw. einer Pflanze, aber eine oder mehrere einiger bekannter ”Gen-Silencing”-Verfahren kann zur Erzielung der gleichen Effekte verwendet werden.
Ein solches Verfahren zur Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing der Genexpression (Abwärtsregulation). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze durch eine doppelsträngige RNA-Sequenz (dsRNA) getriggert, die dem endogenen Zielgen im Wesentlichen ähnelt. Diese dsRNA wird weiter durch die Pflanze in etwa 20 bis etwa 26 Nukleotide prozessiert, die als kurze interferierende RNAs (short interfering RNAs (siRNAs)) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht, der das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl der zu einem Polypeptid zu translatierenden mRNA-Transkripte verringert wird. Die doppelsträngige RNA-Sequenz entspricht einem Zielgen.
Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Einbringung von Nukleinsäure-Sequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense Orientierung” betrifft eine DNA-Sequenz, die zu einem mRNA-Transkript davon homolog ist. In eine Pflanze wird daher mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz eingebracht. Die zusätzliche Nukleinsäure verringert die Expression des endogenen Gens, was ein Phänomen erzeugt, das als Co-Suppression bezeichnet wird. Die Reduktion der Genexpression wird ausgeprägter, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da es eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und dem Triggern der Co-Suppression gibt.
Ein weiteres Beispiel für ein RNA-Silencing-Verfahren beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotid-Sequenz, die zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein kodiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem zu silencenden endogenen Gen. Die Komplementarität kann sich in der ”kodierenden Region” und/oder in der ”nicht-kodierenden Region” eines Gens befinden. Der Begriff ”kodierende Region” betrifft eine Region der Nukleinsäuresequenz, die Codons umfasst, die zu Aminosäureresten translatiert werden. Der Begriff ”nicht kodierende Region” betrifft 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren, die transkribiert, aber nicht zu Aminosäuren translatiert werden (und die auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet werden).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß der Basenpaarungsregeln von Watson und Crick entwickelt werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann komplementär zur gesamten Nukleinsäuresequenz sein (in diesem Fall ein Bereich von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem interessierenden Gen hergeleitet sind, oder von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog des interessierenden Proteins kodieren kann), kann aber auch ein Oligonukleotid sein, das nur zu einem Teil der Nukleinsäuresequenz Antisense-Orientierung aufweist (wie auch mRNA 5' und 3' UTR). Die Antisense-Oligonukleotidsequenz kann beispielsweise komplementär zu der Region sein, die die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid kodiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotid-Sequenz ist im Stand der Technik bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuresequenz kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mit Verfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (beispielsweise eine Antisense-Oligonukleotid-Sequenz) kann beispielsweise chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukloeotide oder verschiedene modifizierte Nukleotide verwendet werden, die dazu ausgelegt sind, dass die biologische Stabilität der Moleküle oder die physikalische Stabilität des Doppelstrangs erhöht wird, der zwischen den Antisense- und den Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildet wird, beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die sich zur Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwenden lassen, sind im Stand der Technik bestens bekannt. Bekannte Nukleotid-Modifikationen umfassen, Methylierung, Cyclisierung und 'Caps' sowie die Substitution von einer oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, wie Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Stand der Technik bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch produziert werden mit einem Expressionsvektor, in den eine Nukleinsäuresequenz in Antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. RNA, die aus der eingefügten Nukleinsäure transkribiert wurde, ist zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure in Antisense-Orientierung). Die Produktion der Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch ein stabil integriertes Nukleinsäure-Konstrukt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verknüpftes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
Die Nukleinsäuremoleküle, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zum Silencen verwendet werden (unabhängig davon, ob sie in eine Pflanze eingebracht wurden, oder in situ erzeugt wurden), hybridisieren mit oder binden an mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, die ein Polypeptid kodiert, wodurch die Expression des Proteins gehemmt wird, beispielsweise durch Hemmen der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch konventionelle Nukleotid-Komplementarität erfolgen, so dass man einen stabilen Doppelstrang erhält, oder beispielsweise im Falle einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, die an DNA-Doppelstränge bindet, über spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer bestimmten Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Anzielen ausgewählter Zellen modifiziert werden und dann systemisch verabreicht werden. Zur systemischen Verabreichung können die Antisense-Nukleinsäuresequenzen derart modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, beispielsweise durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, die an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch auf Zellen übertragen werden, und zwar mit den hier beschriebenen Vektoren.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelständige Hybride mit komplementärer RNA, in der im Gegensatz zu den üblichen b-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon umfassen (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330).
Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression kann auch mit Ribozymen durchgeführt werden. Die Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz spalten können, wie eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen. Somit können Ribozyme (beispielsweise Hammerkopf-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) zur katalytischen Spaltung von mRNA-Transkripten verwendet werden, die in ein Polypeptid translatiert werden, wodurch die Anzahl der mRNA-Transkripte, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, erheblich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entwickelt werden (siehe beispielsweise: Cech et al. U.S. Patent No. 4,987,071 ; und Cech et al. U.S. Patent No. 5,116,742 ). Alternativ können mRNA-Transkripte, die einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, zur Auswahl einer katalytischen RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen ausgewählt werden (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen zum Gen-Silencing ist im Stand der Technik bekannt (beispielsweise Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
Das Gensilencing kann ebenfalls durch Insertionsmutagenese erzielt (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien, wie sie u. a. von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ), oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben wurden.
Das Gensilencing kann auch erfolgen, wenn eine Mutation an einem endogenem Gen und/oder eine Mutation an einem isolierten Gen bzw. einer isolierten Nukleinsäure vorliegt, die anschließend in eine Pflanze eingeführt wurde. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Das Polypeptid kann beispielsweise an verschiedene wechselwirkende Proteine binden; eine oder mehrere Mutationen und/oder Verkürzungen können daher ein Polypeptid bereitstellen, das noch an wechselwirkende Proteine binden kann (wie Rezeptorproteine), die aber ihre normale Funktion nicht ausüben können (beispielsweise als signalgebender Ligand).
Ein weiterer Ansatz zum Gensilencing ist durch Anzielen von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens komplementär sind (beispielsweise Promotor und/oder Enhancer), so dass dreifach helikale Strukturen erzeugt werden, die die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
Andere Verfahren, wie die Verwendung von Antikörpern gegen ein endogenes Polypeptid zur Hemmung seiner Funktion in Pflanzen oder die Interferenz in dem Signalweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, sind dem Fachmann bestens bekannt. Es kann insbesondere angestrebt werden, dass sich von Menschenhand gemachte Moleküle zur Hemmung der biologischen Funktion eines Ziel-Polypeptids oder zum Eingreifen in den Signalweg, an dem das Ziel-Polypeptid beteiligt ist, eignet.
Alternativ kann ein Screening-Programm aufgestellt werden, mit dem man in einer Pflanze die natürlichen Genvarianten identifiziert, wobei die Varianten Polypeptide mit reduzierter Aktivität kodieren. Solche natürlichen Varianten können auch beispielsweise zur Durchführung einer homologen Rekombination verwendet werden.
Künstliche und/oder natürliche mikroRNAs (mRNAs) können zum Knockout der Genexpression und/oder mRNA-Translation verwendet werden. Endogene miRNAs sind einzelsträngige kleine RNAs mit gewöhnlich 19 bis 24 Nukleotiden Länge. In erster Linie regulieren sie die Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten Pflanzen-mikroRNAs (miRNAs) haben eine perfekte oder nahezu perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen. Es gibt jedoch natürliche Ziele mit bis zu 5 Mismatches. Sie werden aus längeren nicht-kodierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch doppelstrangspezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Bei der Prozessierung werden sie durch Bindung an ihre Hauptkomponente, ein Argonaut-Protein, in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebracht. MiRNAs wirken als Spezifitäts-Komponenten von RISC), da sie mit Ziel-Nukleinsäuren, meist mRNAs im Cytoplasma Basenpaare eingehen. Nachfolgende Regulationsereignisse umfassen Ziel-mRNA-Spaltung und die Zerstörung und/oder translationale Hemmung. Die Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich somit oft in verringerten mRNA-Spiegeln der Zielgene wider.
Künstliche mikroRNAs (amiRNAs), die gewöhnlich 21 Nukleotide lang sind, können genetisch modifiziert werden, so dass sie die Genexpression einzelner oder multipler interessierender Gene negativ regulieren. Determinanten der Pflanzen-mikroRNA-Zielselektion sind im Stand der Technik bestens bekannt. Empirische Parameter zur Zielerkennung wurden definiert und können zur Unterstützung der Aufmachung spezifischer amiRNAs verwendet werden (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Herkömmliche Werkzeuge zur Aufmachung und Erzeugung von amiRNAs und ihrer Vorstufen sind ebenfalls öffentlich zugänglich (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
Für eine optimale Leistung erfordern die Gensilencing-Techniken, die zur Reduktion der Expression in einer Pflanze eines endogenen Gens verwendet werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen zur Transformation monokotyler Pflanzen und aus dikotylen Pflanzen zur Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer gegebenen Pflanzenart in die gleiche Pflanzenart eingebracht. Beispielsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Es ist jedoch kein absolutes Erfordernis, dass die einzubringende Nukleinsäuresequenz aus der gleichen Pflanzenart stammt wie die Pflanze, in die sie eingebracht wird. Es reicht, wenn eine wesentliche Homologie zwischen endogenem Zielgen und der einzubringenden Nukleinsäure vorliegt.
Vorstehend sind Beispiele für verschiedene Verfahren zur Verringerung oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze beschrieben. Ein Fachmann kann leicht die vorstehend genannten Verfahren zum Silencing so anpassen, dass die Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer vollständigen Pflanze oder in Teilen davon, zum Beispiel durch die Verwendung eines geeigneten Promotors erzielt wird.
Selektionsmarker(gen)/Reportergen
”Selektionsmarker”, ”Selektionsmarkergen” oder ”Reportergen” beinhaltet jegliches Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, um die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transfiziert sind oder transformiert sind, zu erleichtern, einen Phänotyp verleiht. Mit diesen Markergenen kann ein erfolgreicher Transfer der Nukleinsäuremoleküle mittels einer Reihe von unterschiedlichen Prinzipien identifiziert werden. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen, die ein neues Stoffwechselmerkmal einführen oder die eine visuelle Selektion gestatten. Zu Selektionsmarkergenen gehören zum Beispiel Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, die Resistenz gegen zum Beispiel Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin verleihen), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, die Resistenz gegen z. B. Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff verleihen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es Pflanzen ermöglicht, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, oder Xyloseisomerase für die Verwertung von Xylose, oder Antinährstoffmarker, wie Resistenz gegen 2-Desoxyglucose), vermitteln. Die Expression visueller Markergene führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit ihren gefärbten Substraten, zum Beispiel X-Gal), Lumineszenz (wie das Luziferin/Luziferase-System) oder Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP, und seine Derivate). Diese Aufzählung stellt nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern dar. Der Fachmann ist mit solchen Markern vertraut. Je nach dem Organismus und dem Selektionsverfahren werden unterschiedliche Marker bevorzugt.
Bei stabiler oder transienter Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nimmt bekanntlich nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA auf, und integriert sie wenn gewünscht je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik in ihr Genom. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker kodiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind) in die Wirtszelle zusammen mit dem interessierenden Gen eingesetzt. Diese Marker können beispielsweise in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene nicht funktionell sind, beispielsweise durch Deletion durch herkömmliche Verfahren. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen Selektionsmarker kodieren, in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, der die Sequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert, oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, oder ansonsten in einem gesonderten Vektor. Zellen, die stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert wurden, können beispielsweise durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise Zellen, die den Selektionsmarker integriert haben, überleben, wohingegen andere Zellen sterben).
Da die Markergene, insbesondere Gene für die Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich sind oder ungewünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, setzt das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren erfolgreich Techniken ein, die die Entfernung oder Abspaltung dieser Markergene ermöglichen. Ein solches Verfahren wird als Cotransformation bezeichnet. Die Cotransformation setzt 2 Vektoren ein, die simultan zur Transformation eingesetzt werden, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und der zweite das oder die Markergene trägt. Ein großer Anteil der Transformanten erhält, oder umfasst bei Pflanzen (bis zu 40% oder mehr Transformanten) beide Vektoren. Bei der Transformation mit Agrobakterien, erhalten die Transformanten gewöhnlich nur einen Teil des Vektors, d. h. die Sequenz, die von der T-DNA flankiert wird, die gewöhnlich die Expressions-Kassette veranschaulicht. Die Markergene können anschließend aus der transformierten Pflanze durch Kreuzungen entfernt werden. Bei einem anderen Verfahren werden die in ein Transposon integrierten Markergene zur Transformation zusammen mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (was als Ac/Ds-Technologie bekannt ist). Die Transformanten können mit einer Quelle für Transposase gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäure-Konstrukt transformiert, das die transiente oder stabile Expression einer Transposase vermittelt. In einigen Fällen (etwa 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat und verloren geht. Bei einer weiteren Anzahl von Fällen, springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen mit Hilfe von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, die den Nachweis solcher Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen, deren Vorteil ist, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieser Art ist als Cre/lox-System bekannt. Cre1 ist eine Rekombinase, die die zwischen den loxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Ist der Marker zwischen den loxP-Sequenzen integriert, wird er entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, durch Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können stellenspezifisch in das Pflanzengenom integriert werden. Natürlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen angewendet werden, wie Hefe, Pilze oder Bakterien.
Transgen/transgen/rekombinant
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant” eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus, der mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren transformiert ist, wobei alle diese Konstrukte mittels rekombinanter Verfahren entstehen, in denen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, die Proteine kodieren, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, oder
(b) genetische Kontrollsequenz(en) in funktionsfähiger Verknüpfung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, zum Beispiel einem Promotor, oder
(c) a) und b)

US 5,565,350

WO00/15815

Unter einen transgenen Pflanze versteht man für erfindungsgemäße Zwecke wie oben, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Locus im Genom dieser Pflanze vorliegen, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Wie erwähnt bedeutet transgen jedoch auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die Nukleinsäuren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, zwar in ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz jedoch in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Transgen bedeutet vorzugsweise die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an einem unnatürlichen Locus in dem Genom, d. h. dass eine homologe, oder vorzugsweise, heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen werden im vorliegenden Text erwähnt.
Transformation
Der Begriff ”Einführung” oder ”Transformation” umfasst im vorliegenden Zusammenhang den Transfer eines Fremdpolynukleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von dem für den Transfer eingesetzten Verfahren. Pflanzengewebe, das entweder durch Organogenese oder Embryogenese zu einer anschließenden klonalen Vermehrung befähigt ist, kann mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert werden, und daraus kann eine ganze Pflanze regeneriert werden. Das jeweils ausgewählte Gewebe hängt von den jeweiligen klonalen Vermehrungssytemen ab, die für die jeweilige zu transformierende Art verfügbar und am besten geeignet sind. Zu Zielgeweben gehören zum Beispiel Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes Meristemgewebe (z. B. Apikalmeristem, Achelknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Wirtszelle transient oder stabil eingeführt werden und kann in nichtintegrierter Form, zum Beispiel als Plasmid, aufrechterhalten werden. Es kann jedoch auch in das Wirtsgenom integriert werden. Mit den erhaltenen transformierten Pflanzenzellen kann man dann eine transformierte Pflanze auf dem Fachmann bekannte Art und Weise regenerieren.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenarten ist eine Technik, die heutzutage relativ routinemäßig erfolgt. Um das interessierende Gen in eine geeignete Vorfahrenzelle einzuführen, kann vorteilhafterweise irgendeine von verschiedenen Transformationsmethoden eingesetzt werden. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Methoden können für die transiente oder für die stabile Transformation eingesetzt werden. Zu Transformationsmethoden gehören die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, die die freie DNA-Aufnahme verstärken, die Injektion der DNA direkt in die Pflanze, der Teilchenkanonenbeschuss, die Transformation mit Viren oder Pollen und die Mikroprojektion. Die Verfahren können aus den folgenden ausgewählt werden: Calcium/Polyethylenglycol-Methode für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982), Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al., (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al., (1985), Bio/Technol. 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A et al., (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Partikeln (Klein TM et al., (1987), Nature 327: 70), Infektion mit (nichtintegrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, darunter auch transgene Kulturpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation erzeugt. Eine vorteilhafte Transformationsmethode ist die Transformation in die Pflanze. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Agrobakterien auf Pflanzensamen einwirken lassen oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien beimpfen. Erfindungsgemäß hat sich besonders günstig erwiesen, eine Suspension von transformierten Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest die Blütenprimordien einwirken zu lassen. Die Pflanze wird anschließend weiter herangezogen, bis man die Samen der behandelten Pflanze erhält (Clough und Bent, Plant J. (1998), 16, 735–743). Zu den Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation des Reises gehören gut bekannte Verfahren für die Reistransformation, wie diejenigen, die in einer der folgenden Schriften beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al., (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al., (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Bei der Transformation von Mais ist das bevorzugte Verfahren entweder wie bei Ishida et al., (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder bei Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind. Diese Verfahren sind weiterhin zum Beispiel bei B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. das zu exprimierende Konstrukt werden/wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der sich für die Transformation von Agrobacterium tumefaciens eignet, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobakterien, die mit solch einem Vektor transformiert wurden, können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden, wie Pflanzen, die als Modell verwendet werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung nicht als Kulturpflanze angesehen), oder Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, und zwar zum Beispiel dadurch, dass man verletzte Blätter oder zerkleinerte Blätter in eine Agrobakterienlösung taucht und sie dann in geeigneten Medien kultiviert. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens wird zum Beispiel bei Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988), 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 bekannt.
Zusätzlich zu der Transformation von somatischen Zellen, die dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, kann man auch Zellen von pflanzlichen Meristemen transformieren, insbesondere solche Zellen, die sich zu Gameten entwickeln. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung und ergeben transgene Pflanze. So werden zum Beispiel Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und man erhält von den sich entwickelnden Pflanzen, von denen ein gewisser Teil transformiert und daher transgen ist, Samen [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua und J Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren beruhen auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und Inkubation der Exzisionsstelle in der Mitte der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch ebenfalls später transformierte Samen erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders wirksames Verfahren ist jedoch die Vakuuminfiltrationsmethode mit ihren Modifikationen, wie der ”floral dip”-Methode. Bei der Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], während bei der ”floral dip”-Methode das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer mit Tensid behandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ und Bent AF (1998), The Plant J. 16, 735–743]. Ein gewisser Anteil transgener Samen wird in beiden Fällen geerntet, und diese Samen lassen sich von nichttransgenen Samen dadurch unterscheiden, dass man sie unter den oben beschriebenen Selektionsbedingungen heranzieht. Außerdem ist die stabile Transformation von Plastiden vorteilhaft, da Plastide bei den meisten Kulturpflanzen mütterlich vererbt werden, wodurch die Gefahr des Transgenflusses durch Pollen reduziert oder eliminiert wird. Die Transformation des Chloroplastengenoms erfolgt im Allgemeinen durch ein Verfahren, das schematisch bei Klaus et al., 2004, [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] gezeigt wurde. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen gemeinsam mit einem Selektionsmarkergen zwischen flankierende Sequenzen, die zu dem Chloroplastengenom homolog sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen steuern die ortsgerichtete Integration in das Plastom. Die Plastidentransformation ist für viele unterschiedliche Pflanzenarten beschrieben worden, und eine Übersicht findet sich bei Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J. Mol. Biol. 2001 Sept. 21; 312 (3): 425–38 oder Maliga, P (2003), Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Über einen weiteren Fortschritt in der Biotechnologie wurde in jüngster Zeit in Form von markerfreien Plastidentransformanten, die durch ein transientes cointegriertes Markergen erzeugt werden können, berichtet (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungstagging
T-DNA-Aktivierungstagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Einführung von T-DNA, die gewöhnlich einen Promotor enthält (es kann auch ein Translations-Enhancer oder ein Intron sein) in der genomischen Region des interessierenden Gens von bis zu 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der kodierenden Region eines Gens in einer Konfiguration, so dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Die Regulation der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor wird gewöhnlich unterbrochen und das Gen gerät unter die Kontrolle des neu eingeführten Promotors. Der Promotor ist gewöhnlich in eine T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom eingeführt, beispielsweise durch Agrobacterium Infektion und führt zu modifizierter Expression der Gene nahe der eingeführten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression der Gene nahe dem eingeführten Promotor.
TILLING
Der Begriff TILLING ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und steht für eine Mutagenesetechnologie, die sich dazu eignet, Nukleinsäuren, die Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität kodieren, zu erzeugen und/oder zu identifizieren. TILLING ermöglicht auch die Selektion von Pflanzen, die solche Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufweisen, und zwar entweder bezüglich der Stärke oder der Lokalisierung oder des Zeitpunkts (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufweisen als diejenige des Gens in seiner natürlichen Form. Beim TILLING wird Mutagenese in hoher Dichte mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz kombiniert. Die Schritte, die beim TILLING gewöhnlich erfolgen, sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992), In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg. Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg., Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998), In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods on Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Herstellung und Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer interessierenden Region; (d) Denaturieren und Annealing, um die Bildung von Heteroduplices zu ermöglichen; (e) DHPLC, wo das Vorhandensein eines Heteroduplex in einem Pool als zusätzlicher Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifizieren des mutierten Individuums; und (g) Sequenzieren des PCR-Produkts der Mutante. TILLING-Methoden sind im Stand der Technik bestens bekannt (McCallum et al., (2000), Nat. Biotechnol. 18: 455–457; in einem Übersichtsartikel von Stemple (2004), Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50) erwähnt.
Homologe Rekombination
Homologe Rekombination ermöglicht die Einführung einer ausgewählten Nukleinsäure in ein Genom, an einer definierten ausgewählten Position. Die homologe Rekombination ist eine Standard-Technik, die routinemäßig in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen verwendet wird, wie Hefe und das Moos Physcomitrella. Verfahren zur Durchführung der homologen Rekombination in Pflanzen wurden nicht nur für Pflanzenmodelle beschrieben (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077–84) sondern auch für Kulturpflanzen, wie beispielsweise Reis (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132–8), und es gibt Ansätze, die gewöhnlich anwendbar sind, ungeachtet des Zielorganismus (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertrag
Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen ein messbares Produkt von wirtschaftlichem Wert, das gewöhnlich mit einer bezeichneten Kulturpflanze, einem Ort und einem Zeitraum einher geht. Die einzelnen Pflanzenteile tragen direkt aufgrund ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts zum Ertrag bei, oder der tatsächliche Ertrag ist derjenige Ertrag pro m² für eine Kulturpflanze und ein Jahr, der dadurch bestimmt wird, dass man die Gesamtproduktion (was sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion beinhaltet) durch die bewirtschafteten m² dividiert. Der Begriff ”Ertrag” einer Pflanze kann die vegetative Biomasse (Wurzel und/oder Spross-Biomasse), Fortpflanzungsorgane und/oder Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze betreffen.
Jungpflanzenvitalität
”Jungpflanzenvitalität” steht für das aktive gesunde gut balancierte Wachstum, insbesondere während früher Stadien des Pflanzenwachstums, und kann sich aus einer gesteigerten Pflanzen-Fitness ergeben, beispielsweise wenn die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. durch Optimierung der Verwendung von Energiequellen und der Verteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit eine Jungpflanzenvitalität zeigen auch ein gesteigertes Überleben des Keimlings und eine bessere Entwicklung der Kulturpflanze, was häufig zu sehr einheitlichen Feldern (wobei die Kulturpflanze einheitlich wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen erreicht im Wesentlichen gleichzeitig verschiedene Entwicklungsstadien) und oft einem besseren und höheren Ertrag führt. Daher kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren bestimmt werden, wie Tausendkorngewicht, Prozent Keimung, Prozent Auflaufen, Wachstum des Keimlings, Höhe des Keimlings, Wurzellänge, Biomasse von Wurzel und Spross und vielen anderen.
Erhöhen/Verbessern/Fördern
Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind untereinander austauschbar und sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, stärker bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen wie im vorliegenden Text definiert bedeuten.
Samenertrag
Ein erhöhter Samenertrag kann sich als eine oder mehrere der folgenden Erscheinungen äußern: a) Erhöhung der Samenbiomasse (Samengesamtgewicht), entweder auf Grundlage der einzelnen Samen und/oder pro Pflanze und/oder oder pro m²; b) erhöhte Anzahl Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl (gefüllter) Samen; d) erhöhte Samenfüllungsrate (die als Verhältnis zwischen der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als Verhältnis des Ertrags von Erntegut wie Samen dividiert durch die Gesamtbiomasse ausgedrückt wird; sowie f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKG), das aufgrund der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihres Gesamtgewichts extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKG kann das Ergebnis einer erhöhten Samengröße und/oder eines erhöhten Samengewichts sein und kann auch das Ergebnis einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße sein.
Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Erhöhung der Samengröße und/oder des Samenvolumens äußern. Eine Erhöhung des Samenertrags kann sich auch als Vergrößerung der Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder des Samenumfangs äußern. Ein erhöhter Ertrag kann auch zu einer modifizierten Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur vorliegen.
Greenness Index
Der ”Greenness Index”, wie hier verwendet, wird aus digitalen Bildern von Pflanzen berechnet. Für jeden zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehörigen Pixel wird das Verhältnis des Grünwertes gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell für Farbkodierung) berechnet. Der Greenness Index wird ausgedrückt als Prozent der Pixel, für die das Grün:Rot-Verhältnis eine bestimmte Schwelle überschreitet. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen, und unter den Wachstumsbedingungen einer reduzierten Nährstoffverfügbarkeit wird der Greenness Index der Pflanzen bei der letzten Bildnahme vor dem Blühen gemessen. Unter Trockenstress-Wachstumsbedingungen, wird der Greenness Index der Pflanzen in der erste Bildnahme nach dem Trockenstress gemessen.
Pflanze
Der Begriff ”Pflanze” umfasst im vorliegenden Zusammenhang ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachfahren der Pflanzen und Pflanzenteile, wozu Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe gehören, wobei jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst. Der Begriff ”Pflanze” umfasst auch Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der genannten Objekte das interessierende Gen bzw. die interessierende Nukleinsäure umfasst.
Zu Pflanzen, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders eignen, gehören all diejenigen Pflanzen, die zu der Überfamilie Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, darunter Futterleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelpflanzen, Bäume oder Sträucher aus der Liste, die unter Anderem die folgenden Pflanzen umfasst: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (bspw. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (bspw. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola-Raps, normaler Raps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (bspw. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (bspw. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (bspw. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (bspw. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (bspw. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (bspw. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phasenlus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (bspw. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (bspw. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Zjziphus spp.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Ertragsmerkmale in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression der Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, besteht darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein UBP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einbringt und exprimiert.
Wird im folgenden Text auf ein ”Protein, das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll darunter ein UBP-Polypeptid, wie im vorliegenden Text definiert, verstanden werden. Wird im folgenden Text auf eine ”Nukleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist” Bezug genommen, soll dies eine Nukleinsäure bedeuten, die ein solches UBP-Polypeptid kodieren kann. Die Nukleinsäure, die in eine Pflanze eingeführt werden soll (und daher zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist), ist jede Nukleinsäure, die für den Typ Protein kodiert, der im Folgenden beschrieben wird, und wird im Folgenden auch als ”UBP-Nukleinsäure” oder ”UBP-Gen” bezeichnet.
Ein ”UBP-Polypeptid”, wie hier definiert, betrifft jedes Polypeptid, das Ubiquitin spalten kann, das über Peptid-(α-Amino) und/oder Isopeptid-(ε-Amino)-Bindungen an andere Proteine gebunden ist. Zudem umfasst das UBP-Polypeptid Folgendes:

(i) eine Cystein-Box (Cys-Box) und
(ii) eine Histidin-Box (His-Box).

Die Cys- und die His-Box sind zwei gut konservierte Motive, die sich in einer konservierten katalytischen Domäne befinden, die man als UBP-Domäne bezeichnet. Die Cys-Box und die His-Box umfassen die katalytischen Triadenreste (Cys in der Cys-Box, His und Asp/Asn in der His-Box) (Amerik und Hochstrasser, 2004). Die Länge der UBP-Domänen variiert von 300 bis 900 Aminosäuren und, obwohl die Sequenz manchmal insgesamt wenig konserviert ist, weisen sie üblicherweise eine konservierte dreidimensionale Struktur auf. Innerhalb der UBP-Domänen spielt das Cystein in der Cys-Box eine wesentliche Rolle bei der katalytischen Aktivität, und eine spezifische Mutation des Cysteins kann die Deubiquitinierungsaktivität der UBP beseitigen (Papa und Hochstrasser, 1993; Chandler et al., 1997; Rao-Naik et al., 2000; Yan et al., 2000; Baek et al., 2001; Doelling et al., 2001; Hanna et al., 2006).
Das UBP-Polypeptid kann auch eine Q-Box und/oder eine G-Box und/oder eine L-Box und/oder eine F-Box umfassen. Diese Boxen sind konservierte Motive, die sich in UBP befinden. Q, G, L und F stehen für das Vorhandensein von einem oder mehreren dieser Aminosäuren in ihren entsprechenden Domänen.
UBP-Polypeptide können gewöhnlich auch zusätzliche Sequenzmotive umfassen, wie Zinkfingerdomänen, Zinkfinger-MYND-Domänen, DUF1055-Domänen, DUSP-Domänen, MATH-Domänen, Ubiquitin-ähnliche Domänen und Ubiquitin-assoziierte Domänen.

Die Tabelle 3 veranschaulicht die Domänen, die in einer Auswahl von UBP vorhanden sind. Tabelle 3: In UBP vorhandene Domänen

Nukleinsäure SEQ ID NO	Polypeptid SEQ ID NO	UBP Klasse	MIPS-Zugang	Domäne 1
19	20	UBP10	At4g10590	DUSP (39-137)
21	22	UBP5	At2g40930	DUSP (34-147)
23	24	UBP9	At4g10570	DUSP (38-137)
25	26	UBP11	At1g32850	DUSP (37-135)
27	28	UBP8	At5g22030	DUSP (39-206)
13	14	UBP26	At3g49600	peptidase_C19_L (107-440)
33	34	UBP12	At5g06600	MATH (54-178)
35	36	UBP13	At3g11910	MATH (54-178)
43	44	UBP4	At2g22310	peptidase_C19_G (24-360)
41	42	UBP3	At4g39910	peptidase_C19_G (24-365)
87	88	UBP24	At4g30890	peptidase_C19_E (196-548)
31	32	UBP25	At3g14400	peptidase_C19_E (23-333)
75	76	UBP15	At1g17110	Zf-MYND (130-164)
83	84	UBP19	At2g24640	Zf-MYND (64-101)
81	82	UBP18	At4g31670	Zf-MYND (61-98)
79	80	UBP17	At5g65450	Zf-MYND (57-94)
77	78	UBP16	At4g24560	Zf-MYND (74-111)
53	54	UBP6	At1g51710	Peptidase_C19A (66-301)
55	56	UBP7	At3g21280	UBQ (57-128)
11	12	UBP14	At3g20630	Zf-UBP (180-257)
61	62	UBP20	At4g17895	peptidase_C19_E (175-474)
63	64	UBP21	At5g46740	peptidase_C19_E (162-467)
47	48	UBP1	At2g32780	zf-UBP (89-154)
49	50	UBP2	At1g04860	zf-UBP (109-170)
3	4	UBP23	At5g57990	Peptidase_C19E (106-408)
7	8	UBP27	At4g39370	Peptidase_C19F (75-199)
5	6	UBP22	At5g10790	Peptidase_C19D (177-528)

UBP-Klasse	Domäne 2	Domäne 3
UBP10	DUF1055 (97-228)	peptidase_C19_E (307-490)
UBP5	DUF1055 (107-247)	peptidase_C19_E (326-493)
UBP9	DUF1055 (97-228)	peptidase_C19_E (308-491)
UBP11	DUF1055 (95-233)	peptidase_C19_E (302-473)
UBP8	DUF1055 (448-618)	peptidase_C19_E
UBP26	DUSP (522-597)	UBL (960-1027)
UBP12	peptidase_C19_C (196-525)
UBP13	peptidase_C19_C (196-524)
UBP4
UBP3
UBP24
UBP25
UBP15	Peptidase_C19E (437-742)
UBP19	Peptidase_C19E (173-478)	MDN1 (489-670)
UBP18	Peptidase_C19E (167-472)
UBP17	Peptidase_C19E (328-631)
UBP16	Peptidase_C19E (541-845)
UBP6	Peptidase_C19A (370-437)
UBP7	Peptidase_C19A (160-394)	Peptidase_C19A (459-526)
UBP14	Peptidase_C19B (309-571)	UBA (615-653)
UBP20
UBP21
UBP1	Peptidase_C19K (203-362)	Peptidase_C19K (791-837)
UBP2	Peptidase_C19K (232-383)	Peptidase_C19K (708-747)
UBP23
UBP27	Peptidase_C19F (209-297)
UBP22

UBP-Klasse	Domäne 4	Domäne 5	Domäne 6
UBP10	peptidase_C19_R (739-892)
UBP5	peptidase_C19_R
UBP9	peptidase_C19_R (740-893)
UBP11	peptidase_C19_R (722-878)
UBP8	peptidase_C19_R
UBP26
UBP12
UBP13
UBP4
UBP3
UBP24
UBP25
UBP15
UBP19
UBP18
UBP17
UBP16
UBP6
UBP7
UBP14	GFP loop (626-628; 683-685)	UBA (672-709)	Peptidase_C19B (737-794)
UBP20
UBP21
UBP1	Peptidase_C19K (954-1081)
UBP2	Peptidase_C19K (832-955)
UBP23
UBP27
UBP22

Zusätzlich oder alternativ hat das Homolog eines UBP-Proteins in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamt-Sequenzidentität zu einer der in Tabelle A aufgeführten Aminosäuresequenzen. Die Gesamtsequenzidentität wird bestimmt mit einem allgemeinen Alignment-Algorithmus, wie dem Algorithmus von Needleman Wunsch in dem Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Default-Parametern. Verglichen mit der Gesamt-Sequenzidentität ist die Sequenzidentität im Allgemeinen höher, wenn nur konservierte Domänen oder Motive berücksichtigt werden.
Zusätzlich oder alternativ hat das Homolog eines UBP-Proteins in steigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer oder mehreren der in Tabelle 3 aufgeführten Domänen.
Zusätzlich oder alternativ bildet eine UBP-Polypeptidsequenz, wenn sie für die Konstruktion eines Stammbaums verwendet wird, mit anderen UBP-Polypeptiden Cluster.
Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im vorliegenden Text in dem Abschnitt ”Definitionen” definiert. Für die Identifikation von Domänen gibt es Spezialdatenbanken, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al., (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315–318), Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Ein Satz Werkzeuge für die In-silico-Analyse von Proteinsequenzen findet sich auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)). Domänen oder Motive können auch unter Verwendung von Routinetechniken, wie Sequenz-Alignment, identifiziert werden.
Verfahren für das Alignment von Sequenzen für Vergleichszwecke sind in der Fachwelt gut bekannt, dazu zählen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA. Bei GAP wird der Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453) verwendet, um das globale Alignment (d. h. das Alignment, das sich über die vollständigen Sequenzen erstreckt) von zwei Sequenzen, das die Anzahl der ”matches” maximiert und die Anzahl der ”gaps” minimiert. Beim BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–10) wird die Sequenzidentität in Prozent berechnet, und es wird eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen durchgeführt. Die Software für die Durchführung einer BLAST-Analyse ist der Öffentlichkeit über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) zugänglich. Homologe können leicht unter Verwendung von zum Beispiel dem multiplen Sequenz-Alignment-Algorithmus ClustalW (Version 1.83) identifiziert werden, und zwar mit den Default-Parametern für paarweises Alignment und einer Scoring-Methode in Prozent. Die Gesamtprozentsätze der Ähnlichkeit und der Identität können auch unter Verwendung von einer der in dem MatGAT-Softwwre-Paket verfügbaren Methoden bestimmt werden (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003, Juli 10; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.). Für eine Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven können, wie es dem Fachmann ersichtlich wird, kleine manuelle Veränderungen vorgenommen werden. Darüber hinaus können statt Volllängensequenzen für die Identifikation von Homologe auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können mit den oben erwähnten Programmen unter Einstellung der Default-Parameter über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) bestimmt werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders geeignet (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195–7).
Weiterhin weisen die UBP-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise eine UBP-Aktivität auf. Hilfsmittel und Techniken zum Messen der UBP-Aktivität sind in der Fachwelt gut bekannt. Yan et al., 2000 (Plant Physiol. Bd. 124) geben Einzelheiten zu UBP-Aktivitätsassays.
Zusätzlich führen die UBP-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie sie im Beispiele-Abschnitt hier beschrieben sind, in Reis exprimiert werden, zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der Transformation von Pflanzen mit einer der in Tabelle B des Beispiels 7 hierin erwähnten Sequenzen, die die ebenfalls in Tabelle B erwähnten entsprechenden Polypeptidsequenzen kodieren, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die erfindungsgemäßen Verfahren können vorteilhafterweise durch Verwendung einer/eines beliebigen UBP-kodierenden Nukleinsäure oder UBP-Polypeptids, wie hier definiert durchgeführt werden.
Beispiele für Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptide kodieren, sind in der Tabelle A von Beispiel 1 hierin beschrieben. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen umfassen Orthologe und Paraloge verschiedener in Tabelle B des Beispiels 7 aufgeführter Polypeptide, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” die hier definierte Bedeutung haben. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Durchführen einer so genannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Dies beinhaltet typischerweise einen ersten BLAST, bei der mit einer Abfragesequenz (zum Beispiel eine der in Tabelle A von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) ein ”BLASTing” gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie die öffentlich zugängliche NCBI-Datenbank, durchgeführt wird. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung von Standard-Default-Werten) werden im Allgemeinen dann verwendet, wenn man von einer Nukleotidsequenz ausgeht, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung von Standard-Default-Werten), wenn man von einer Proteinsequenz ausgeht. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Mit den Volllängen-Sequenzen der gefilterten oder ungefilterten Ergebnisse wird anschließend ein Rück-BLASTing (zweiter BLAST) gegen Sequenzen des Organismus, von dem die Abfragesequenz stammt, durchgeführt (ist die Abfragesequenz eine der in Tabelle B aufgeführten Sequenzen, dann wäre das zweite BLASTing daher gegen Reis-Sequenzen). Die Ergebnisse des ersten und des zweiten BLASTing werden dann verglichen. Ein Paralog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit von dem ersten BLASTing von der gleichen Art ist, von der die Abfragesequenz stammt, in diesem Fall führt ein Rück-BLASTing idealerweise zu der Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits; ein Ortholog wird dann identifiziert, wenn ein hochrangiger Hit in dem ersten BLASTing nicht von der gleichen Art wie derjenigen, von der die Abfragesequenz stammt, ist, und führt vorzugsweise beim Rück-BLASTing dazu, dass die Abfragesequenz unter den höchstrangigen Hits ist.
Hochrangige Hits sind solche mit niedrigem E-Wert. Je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der ”Score” (anders ausgedrückt, desto niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Hit durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist Stand der Technik. Das ”Scoring” der Vergleiche erfolgt nicht nur mittels E-Werten, sondern auch mit dem Prozentsatz der Identität. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl der identischen Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den beiden verglichenen Nukleinsäure-(oder Polypeptid-)Sequenzen über eine bestimmte Länge. Bei großen Familien kann man ClustalW und anschließend einen Neighbour-Joining-Tree verwenden, um die Cluster der verwandten Gene leichter sichtbar zu machen und um Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren können sich auch Nukleinsäurevarianten eignen. Beispiele für solche Varianten umfassen die Nukleinsäuresequenzen, die Homologe und Derivate von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 hier angegebenen Polypeptid-Sequenzen kodieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” die hier definierte Bedeutung haben. Für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich auch Nukleinsäuren, die Homologe und Derivate von Orthologe oder Paraloge von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 hier angegebenen Aminosäuresequenzen kodieren. Homologe und Derivate, die sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, weisen im Wesentlichen dieselbe biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, von dem sie abstammen, auf.
Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, gehören Abschnitte von Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptide kodieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptide kodieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptide kodieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptide kodieren, die durch ”Gene-Shuffling” erhalten wurden, kodieren. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleißvariante, Allelvariante und ”Gene-Shuffling” sind wie im vorliegenden Text definiert.
Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptide kodieren, müssen nicht unbedingt Volllängennukleinsäuren sein, da die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf die Verwendung von Volllängen-Nukleinsäuresequenzen angewiesen ist. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze einen Abschnitt von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einen Abschnitt von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel dadurch hergestellt werden, dass man eine oder mehrere Deletionen bei der Nukleinsäure durchführt. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder können mit anderen kodierenden (oder nichtkodierenden) Sequenzen fusioniert werden, um zum Beispiel ein Protein herzustellen, bei dem mehrere Aktivitäten kombiniert sind. Bei der Fusion mit anderen kodierenden Sequenzen kann das bei der Translation hergestellte Polypeptid größer sein, als für den Proteinabschnitt vorhergesagt wurde.
Abschnitte, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind kodieren, für ein UBP-Polypeptid, wie hier definiert, und weisen im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuren oder um einen Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt mindestens 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 3900 aufeinander folgende Nukleotide oder mehr lang, wobei es sich bei den aufeinander folgenden Nukleotiden um eine der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen oder um eine Nukleinsäure handelt, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1. Vorzugsweise kodiert der Abschnitt ein Fragment von einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums verwendet wird, mit UBP-Polypeptiden Cluster bildet.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen einer verringerten Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, wie hier definiert, oder mit einem Abschnitt, wie hier definiert, hybridisieren kann.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren hybridisieren kann, einführt und exprimiert, oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Hybridisierende Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, kodieren ein UBP-Polypeptid, wie hier definiert, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise kann die hybridisierende Sequenz mit einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt von einer dieser Sequenzen hybridisieren, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, hybridisieren kann. Am stärksten bevorzugt kann die hybridisierende Sequenz mit einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 oder einem Abschnitt davon hybridisieren.
Die hybridisierende Sequenz kodiert vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, vorzugsweise in voller Länge, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums verwendet wird, mit UBP-Polypeptiden Cluster bildet.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Spleißvariante, die ein UBP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Spleißvariante von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Spleißvariante von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer in Tabelle B aufgeführten Nukleinsäure oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog einer der in Tabelle B aufgeführten Aminosäuresequenzen kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums verwendet wird, mit UBP-Polypeptiden Cluster.
Eine andere Nukleinsäurevariante, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid, wie hier vorstehend definiert, kodiert, wobei eine Allelvariante wie hier definiert ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Allelvariante von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 genannten Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert.
Die Polypeptide, die von Allelvarianten kodiert werden, die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie eines der in Tabelle A von Beispiel 1 dargestellten UBP-Polypeptide. Allelvarianten kommen in der Natur vor und von den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Verwendung dieser natürlichen Allele mit umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der Allelvariante um eine Allelvariante einer der in Tabelle B aufgeführten Nukleinsäuren oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog einer der in Tabelle B aufgeführten Nukleinsäuren kodiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Allelvariante kodiert wird, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums verwendet wird, mit UBP-Polypeptiden Cluster.
Man kann auch ”Gene shuffling” oder gerichtete Evolution dazu verwenden, Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, die UBP-Polypeptide, wie oben definiert, kodieren, wobei der Begriff ”gene shuffling” wie hier definiert ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Verbesserung von Ertragsmerkmalen bei Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen einführt und exprimiert oder bei dem man in eine(r) Pflanze eine Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, einführt und exprimiert, wobei die Nukleinsäurevariante mittels ”gene shuffling” erhalten wird.
Die Aminosäuresequenz, die von der durch gene shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante kodiert wird, bildet, wenn sie zur Konstruktion eines Stammbaums verwendet wird, vorzugsweise mit UBP-Polypeptiden Cluster.
Nukleinsäurevarianten können weiterhin auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Zur Erzielung einer ortsgerichteten Mutagenese sind verschiedene Verfahren verfügbar, von denen die häufigsten Verfahren auf PCR-Basis sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Hrsg.).
Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptide kodieren, können von einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle stammen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form in ihrer Zusammensetzung und/oder genomischen Umgebung durch gezielte Manipulation durch den Menschen modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die Nukleinsäure, die das UBP-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer einkeimblättrigen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Poaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit verstärkten Ertragsmerkmalen. Insbesondere führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” werden hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
Werden hier verbesserte Ertragsmerkmale erwähnt, so soll dies eine Erhöhung der Biomasse (des Gewichts) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, was oberirdische (erntbare) Teile und/oder unterirdische (erntbare) Teile beinhalten kann. Insbesondere sind solche oberirdischen erntbaren Teile Samen, und die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren führt zu Pflanzen mit höherem Samenertrag im Vergleich zu dem Samenertrag von Kontrollpflanzen.
Wählt man Mais als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als eines oder mehrere der folgenden Merkmale äußern: Unter anderem erhöhte Anzahl an Pflanzen, die pro Quadratmeter wachsen, eine Erhöhung der Anzahl an Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Reihen, der Anzahl an Körnern pro Reihe, des Korngewichts, Tausendkorngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, eine Erhöhung der Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl der Samen und multipliziert mit 100). Wählt man Reis als Beispiel, kann sich eine Ertragserhöhung als Erhöhung bezüglich eines oder mehrerer der folgenden Merkmale ausdrücken: Unter anderem Anzahl der Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl der Rispen pro Pflanze, Anzahl der Ährchen pro Rispe, Anzahl der Blüten (Einzelblüten) pro Rispe (ausgedrückt als Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen zu der Anzahl an Primärrispen), erhöhte Samenfüllungsrate (d. h. der Anzahl gefüllter Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100), erhöhtes Tausendkorngewicht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, verglichen mit Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
Weil die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen (zumindest während eines Teils ihres Lebenszyklus) eine höhere Wachstumsrate aufweisen als Kontrollpflanzen in einem entsprechenden Stadium ihres Lebenszyklus.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (darunter Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen in der ganzen Pflanze stattfinden. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Unter dem Lebenszyklus einer Pflanze kann man diejenige Zeit verstehen, die die Pflanze benötigt, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in dem die Pflanze trockene reife Samen ähnlich dem Ausgangsmaterial produziert hat. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, ”Greenness Index”, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann in einem Stadium oder in mehreren Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Lebenszyklus der Pflanze erfolgen. Eine erhöhte Wachstumsrate während der Frühstadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann verbesserte Vitalität widerspiegeln. Die erhöhte Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, so dass die Pflanzen später gesät werden können und/oder früher geerntet werden können als dies sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt lässt sich mit einer früheren Blütezeit erzielen). Ist die Wachstumsrate ausreichend erhöht, kann dies weiteres Aussäen von Samen derselben Pflanzenart ermöglichen (zum Beispiel Aussäen und Ernten von Reispflanzen und anschließendes Aussäen und Ernten von weiteren Reispflanzen sogar innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann dies ebenso das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenarten ermöglichen (zum Beispiel das Aussäen und Ernten von Maispflanzen und anschließend zum Beispiel Aussäen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer anderen geeigneten Pflanze). Auch mehrmalige zusätzliche Ernten von demselben Wurzelstock können bei einigen Kulturpflanzen möglich sein. Eine Veränderung des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (weil man eine bestimmte Pflanze öfter (z. B. pro Jahr) heranziehen und ernten kann). Eine erhöhte Wachstumsrate kann auch den Anbau transgener Pflanzen in einem breiteren geographischen Bereich als ihre Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen, da die räumlichen Beschränkungen für den Anbau einer Kultur häufig von ungünstigen Umweltbedingungen entweder während der Pflanzzeit (früh in der Saison) oder während der Erntezeit (spät in der Saison) bestimmt werden. Solche ungünstigen Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt ist. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven bestimmt werden, wobei die Parameter u. a. folgende sein können: T-Mid (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (Zeitdauer, die die Pflanzen benötigen, um 90% ihrer Maximalgröße zu erreichen).
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung führt die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zu Pflanzen mit einer im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Wachstumsrate. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid, wie hier definiert, kodiert, in einer Pflanze umfasst.
Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt unabhängig davon auf, ob die Pflanze unter Nichtstressbedingungen steht oder ob die Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterworfen wird. Typischerweise reagieren Pflanzen auf Stress dadurch, dass sie langsamer wachsen. Unter starken Stressbedingungen kann die Pflanze sogar ihr Wachstum völlig einstellen. Leichter Stress ist dagegen hier als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist und der nicht dazu führt, dass die Pflanze völlig aufhört zu wachsen, ohne dass sie die Fähigkeit besitzt, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Leichter Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, stärker bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger im Vergleich zu der Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Aufgrund von Fortschritten bei den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerung, Düngung, Pestizidbehandlungen) findet man bei angebauten Kulturpflanzen nicht oft starke Stressbedingungen. Daher ist das durch leichten Stress induzierte geschwächte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal in der Landwirtschaft. Leichte Stressbedingungen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (Umwelt-)Stressbedingungen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotischer Stress kann durch Dürre oder Wasserüberschuss, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Gefriertemperaturen verursacht werden. Bei dem abiotischen Stress kann es sich um einen osmotischen Stress handeln, der durch Wasserstress (insbesondere aufgrund von Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder ionenbedingten Stress verursacht wird. Unter biotischem Stress versteht man gewöhnlich Stressbedingungen, die durch Pathogene, wie Bakterien, Viren, Pilze, Nematoden und Insekten, verursacht werden.
Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Dürrebedingungen durchgeführt werden, wobei man Pflanzen mit einem im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhten Ertrag erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003), 218: 1–14) beschrieben, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenproduktivität negativ beeinflussen. Es ist bekannt, dass Dürre, Salinität, extreme Temperaturen und oxidativer Stress miteinander in Verbindung stehen und über ähnliche Mechanismen Wachstums- und Zellschäden induzieren können. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003), 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an gegenseitiger Beeinflussung (”Cross-Talk”) von Dürrestress und durch hohe Salinität verursachtem Stress. Zum Beispiel äußern sich Dürre und/oder Versalzung in erster Linie als osmotischer Stress, was zur Störung der Homöostase und der Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, der häufig hohe oder niedrige Temperatur, Salinität oder Dürrestress begleitet, kann zur Denaturierung funktioneller und struktureller Proteine führen. Infolgedessen aktivieren diese verschiedenen Umweltstressbedingungen häufig ähnliche Zellsignalwege und Zellreaktionen, wie die Produktion von Stressproteinen, die Hinaufregulation von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und ein Einstellen des Wachstums. Der Begriff ”Nichtstress”-Bedingungen, wie hier verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann ist mit normalen Bodenbedingungen und Klimabedingungen für einen bestimmten Standort vertraut.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Dürrebedingungen wachsen, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags von Pflanzen, die unter Nichtstressbedingungen oder unter leichten Dürrebedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verleiht Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden. Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, die unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogen werden, bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren die Expression einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, in einer Pflanze moduliert. Ein Nährstoffmangel kann durch ein Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphate und andere phosphorhaltige Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, hervorgerufen werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das ein UBP-Polypeptid kodiert, wie oben definiert.
Die Erfindung stellt auch Genkonstrukte und Vektoren bereit, um die Einführung und/oder Expression von Nukleinsäuren, die für UBP-Polypeptide kodieren, in Pflanzen zu erleichtern. Die Genkonstrukte können in Vektoren eingefügt werden, die im Handel erhältlich sein können und die für die Transformation des interessierenden Gens in Pflanzen und für die Expression des interessierenden Gens in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hier definiert, bei den erfindungsgemäßen Verfahren bereit.
Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, das Folgendes umfasst:

(a) eine Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, wie oben definiert;
(b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz unter (a) vorantreiben können, und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, wie vorstehend definiert. Die Begriffe ”Kontrollsequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hier definiert.
Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann kennt die genetischen Elemente, die in einem Vektor vorhanden sein müssen, damit Wirtszellen erfolgreich transformiert, Wirtszellen, die die interessierende Sequenz enthalten, erfolgreich selektiert und vermehrt werden können. Die interessierende Sequenz ist mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen (mindestens mit einem Promotor) funktionsfähig verbunden.
Jede Art von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, kann vorteilhaft für das Vorantreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Ein konstitutiver Promotor ist für die Verfahren besonders geeignet. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor außerdem ein ubiquitärer Promotor mittlerer Stärke. Die Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe hier im Abschnitt ”Definitionen”.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die in Tabelle A oder Tabelle B hierin aufgeführten, ein UBP-Polypeptid kodierenden Nukleinsäuren noch auf die Expression einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, wenn sie von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, beschränkt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise handelt es sich bei dem Promotor um einen GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen der SEQ ID NO: 89 gleicht, am stärksten bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch die SEQ ID NO: 89 dargestellt. Weitere Beispiele für konstitutive Promotoren siehe Tabelle 2a im Abschnitt ”Definitionen”.
Gegebenenfalls kann/können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, das in eine Pflanze eingeführt wird, verwendet werden. Das Konstrukt umfasst vorzugsweise eine Expressionskassette, die eine Nukleinsäure enthält, die im Wesentlichen einer der in Tabelle B aufgeführten Aminosäuresequenzen ähnlich oder damit identisch ist, und den GOS2-Promotor und die T-Zein- + T-Rubisco-Transkriptionsterminatorsequenz umfasst.
Zu weiteren Regulationselementen können Transkriptionsenhancer sowie Translationsenhancer gehören. Der Fachmann ist mit Terminator- und Enhancersequenzen vertraut, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Es kann auch eine Intronsequenz zu der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge an reifer Botschaft, die im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt Definitionen beschrieben ist. Weitere Kontrollsequenzen (neben Promotor-, Enhancer-, Silencer-, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können weiterhin eine Replikationsursprungssequenz beinhalten, die für die Aufrechterhaltung und/oder die Replikation in einem bestimmten Zelltyp erforderlich ist. Ein Beispiel ist, wenn ein Genkonstrukt in einer Bakterienzelle als episomales genetisches Element (z. B. als Plasmid- oder Cosmidmolekül) aufrechterhalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge sind u. a. der f1-ori und colE1, sie sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Für den Nachweis eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie sie bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und/oder für die Selektion von transgenen Pflanzen, die diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Daher kann das Genkonstrukt gegebenenfalls ein Selektionsmarkergen umfassen. Selektionsmarker sind hier im Abschnitt ”Definitionen” eingehender beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder ausgeschnitten werden, wenn sie nicht mehr gebraucht werden. Techniken zur Entfernung von Markern sind im Stand der Technik bekannt, geeignete Techniken sind vorstehend im Abschnitt Definitionen beschrieben.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid, wie oben definiert, kodiert, in eine(r) Pflanze umfasst.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten verbesserten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem Ertrag oder erhöhtem Samenertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze oder Pflanzenzelle und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung fördern.

Bei der Nukleinsäure gemäß (i) kann es sich um eine der Nukleinsäuren handeln, die ein UBP-Polypeptid, wie hier definiert, kodieren können.
Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingeführt werden (was das Einführen in ein Gewebe, Organ oder irgendeinen anderen Teil einer Pflanze beinhaltet). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise mittels Transformation in eine Pflanze eingeführt. Der Begriff ”Transformation” ist hier im Abschnitt ”Definitionen” genauer beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren finden sich in den oben genannten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer.
Im Allgemeinen werden nach der Transformation die Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen hinsichtlich des Vorhandenseins von einem oder mehreren Markern selektiert, die von in Pflanzen exprimierbaren Genen kodiert werden, die mit dem interessierenden Gen co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Für die Selektion von transformierten Pflanzen wird das bei der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel derartigen Selektionsbedingungen unterworfen, dass man transformierte Pflanzen von untransformierten Pflanzen unterscheiden kann. So können zum Beispiel Samen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten wurden, ausgepflanzt werden und nach einer anfänglichen Wachstumsphase einer geeigneten Selektion durch Spritzen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass man die Samen, gegebenenfalls nach Sterilisieren, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels heranzieht, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen auf das Vorhandensein eines Selektionsmarkers, wie die oben beschriebenen, gescreent.
Nach DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen auch zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Analyse auf das Vorhandensein des interessierenden Gens, die Kopienzahl und/oder die Genomorganisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Expressionsniveaus der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse verfolgt werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie durch klonale Vermehrung oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (T1-Pflanze) geselbstet werden, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (T2-Pflanzen) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann mit Hilfe von klassischen Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten transformierten Organismen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. So kann es sich zum Beispiel um Chimären von transformierten Zellen und untransformierten Zellen, klonale Transformanten (bei denen z. B. alle Zellen so transformiert wurden, dass sie die Expressionskassette enthalten), Pfropfmaterial von transformiertem und untransformiertem Gewebe (z. B. bei Pflanzen ein transformierter Wurzelstock, der auf ein untransformiertes Edelreis gepfropft wurde) handeln.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf jede Pflanzenzelle oder Pflanze, die durch eines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und auf alle Pflanzenteile und sämtliches Vermehrungsmaterial davon. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Nachkommenschaft eine(r/s) primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, die/das nach einem der oben genannten Verfahren hergestellt wurde, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass die Nachkommenschaft dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufweist, wie es/sie der Elter bei den erfindungsgemäßen Verfahren aufweist.
Die Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, die ein UBP-Polypeptid wie hier vorstehend definiert, kodiert. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip vorteilhafterweise alle Pflanzen, welche die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide synthetisieren können.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorteilhaft auf jede beliebige Pflanze anwenden. Zu den Pflanzen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, gehören alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Futter- oder Weidepflanzenleguminosen, Zierpflanzen, Nahrungsmittelkulturen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Pflanze um eine Kulturpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen sind zum Beispiel u. a. Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Luzerne, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak.
Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine monokotyle Pflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen beinhalten Zuckerrohr. Stärker bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um ein Getreide. Beispiele für Getreide sind u. a. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntbare Teile einer Pflanze, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft weiterhin Produkte, die, vorzugsweise direkt, von einem erntbaren Teil einer solchen Pflanze stammen, wie trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung handelt es sich bei der modulierten Expression um erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind in der Fachwelt gut bekannt und Beispiele werden im Abschnitt Definitionen gegeben.
Wie vorstehend erwähnt, besteht ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren der Expression eines UBP-Polypeptids darin, dass man eine Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert; die Wirkungen der Durchführung des Verfahrens, d. h. das Erhöhen der Ertragsmerkmale, können jedoch auch unter Verwendung anderer bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-DNA-Activation-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken findet sich im Abschnitt Definitionen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptide, wie hier beschrieben, kodieren, und die Verwendung dieser UBP-Polypeptide zur Verbesserung eines der oben genannten Ertragsmerkmale in Pflanzen.
Hier beschriebene Nukleinsäuren, die ein UBP-Polypeptid kodieren, oder die UBP-Polypeptide selbst können Verwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der mit einem Gen, das ein UBP-Polpeptid kodiert, genetisch verknüpft sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die UBP-Polypeptide selbst können dazu verwendet werden, einen molekularen Marker zu bestimmen. Dieser DNA- oder Protein-Marker kann dann in Züchtungsprogrammen zur Selektion von Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen verwendet werden, wie hier vorstehend in den erfindungsgemäßen Verfahren definiert.
Allelvarianten einer Nukleinsäure/eines Gens, die/das ein UBP-Polypeptid kodiert, können auch Verwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Bei solchen Züchtungsprogrammen ist manchmal das Einführen von allelischer Variation durch Mutagenbehandlung der Pflanzen erforderlich, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese verwendet wird; alternativ kann das Programm von einer Sammlung von Allelvarianten so genannten ”natürlichen” Ursprungs ausgehen, die nicht mit Absicht hervorgerufen wurden. Dann erfolgt die Identifikation allelischer Varianten, zum Beispiel mittels PCR. Darauf folgt ein Schritt zur Selektion besserer allelischer Varianten der in Frage kommenden Sequenz, die bessere Erträge liefern. Die Selektion wird gewöhnlich durchgeführt, indem man die Wachstumsleistung von Pflanzen verfolgt, die verschiedene Allelvarianten der in Frage kommenden Sequenz enthalten. Die Wachstumsleistung kann im Gewächshaus oder auf dem Feld verfolgt werden. Weitere Schritte beinhalten gegebenenfalls das Kreuzen der Pflanzen, in denen die bessere Allelvariante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies kann zum Beispiel zur Herstellung einer Kombination interessanter phänotypischer Merkmale verwendet werden.
Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptide kodieren, können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, und als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Diese Information kann für die Pflanzenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine solche Verwendung von Nukleinsäuren, die ein UBP-Polypeptid kodieren, erfordert nur eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden. Die Nukleinsäuren, die ein UBP-Polypeptid kodieren, können als Marker für Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsgespaltener genomischer Pflanzen-DNA können mit den Nukleinsäuren, die UBP-Polypeptid kodieren, sondiert werden. Die erhaltenen Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181), unterworfen werden, wodurch eine Genkarte erstellt wird. Außerdem können die Nukleinsäuren zum Sondieren von Southern-Blots verwendet werden, die Restriktionsendonuklease-behandelte genomische DNAs von einem Satz von Individuen enthalten, die den Elter und die Nachkommen einer bestimmten genetischen Kreuzung wiedergeben. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird festgestellt und zur Berechnung der Position der Nukleinsäure, die das UBP-Polypeptid kodiert, in der zuvor unter Verwendung dieser Population erhaltenen Genkarte verwendet (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Verwendung von Sonden, die von Pflanzengenen stammen, für die Verwendung bei der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer cDNA-Klone, wobei die vorstehend erläuterte Methodik oder Varianten davon verwendet werden. Für die Kartierung können zum Beispiel F2-Inzuchtpopulationen, Rückkreuzungspopulationen, zufallsgemäß gepaarte Populationen, nahezu isogene Linien und andere Sätze von Individuen verwendet werden. Diese Methodik ist dem Fachmann bekannt.
Die Nukleinsäuresonden können auch zur physikalischen Kartierung (d. h. zum Anordnen von Sequenzen in physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346 und darin genannte Bezugsstellen) verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden zur Kartierung mittels direkter Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154) verwendet werden. Zwar bevorzugen derzeitige FISH-Kartierungsverfahren die Verwendung großer Klone (mehrere kb bis mehrere Hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), aber durch Verbesserungen in der Empfindlichkeit kann die FISH-Kartierung auch unter Verwendung kürzerer Sonden durchgeführt werden.
Eine Reihe von Verfahren auf Basis von Nukleinsäureamplifikation für die genetische und physikalische Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Beispiele sind u. a. die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy-Kartierung (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Bei diesen Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure dazu verwendet, Primer-Paare zu gestalten und herzustellen, die in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen verwendet werden. Die Gestaltung dieser Primer ist dem Fachmann bekannt. Bei Verfahren, die eine genetische Kartierung auf PCR-Basis einsetzen, kann es notwendig sein, dass man DNA-Sequenz-Unterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in dem Bereich identifiziert, welcher der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch für Kartierungsverfahren nicht allgemein erforderlich.
Die erfindungsgemäßen Verfahren führen zu Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen, wie hier vorstehend beschrieben. Diese Merkmale können auch mit anderen ökonomisch vorteilhaften Merkmalen kombiniert werden, wie weiteren Ertragsmerkmalen, Toleranz gegenüber anderen abiotischen und biotischen Stressbedingungen, Merkmalen, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren veranschaulicht. Es zeigt:
1 den binären Vektor für eine gesteigerte Expression in Oryza sativa einer Nukleinsäure, die UBP kodiert, unter der Kontrolle eines GOS2-Promotors (pGOS2) aus Reis. Die Nukleinsäure, die UBP kodiert, kann ist eine der in Tabelle B aufgeführten Nukleinsäuren.
2 genaue Beispiele für Sequenzen, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die lediglich beispielhaft sind. Die folgenden Beispiele sollen den Schutzbereich der Erfindung keinesfalls vollständig definieren oder ansonsten einschränken.
Die DNA-Manipulation: wenn nicht anders angegeben werden DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standard-Protokollen durchgeführt, beschrieben in Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder in Bd. 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standard-Materialien und Verfahren zur molekularen Arbeit an der Pflanze sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) beschrieben.
Beispiel 1. Identifikation von UBP-Sequenzen
Unter den Sequenzen in der Entrez Nucleotides Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurden unter Verwendung von Datenbanksequenzabfragewerkzeugen, wie dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402), (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomische) UBP-Sequenzen identifiziert. Das Programm wird zum Auffinden von Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen verwendet, und zwar durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptid-Sequenzen mit Sequenz-Datenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz der Matches. Das durch die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure kodierte Polypeptid wurde beispielsweise für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar unter Ausschaltung der Default-Einstellungen und des Filters für die Nichtmiteinbeziehung von Sequenzen mit niedriger Komplexität. Der Output der Analyse wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeits-Wertung (E-Wert) gereiht, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Alignment statistisch vorkommt, widerspiegelt (je niedriger der E-Wert, desto signifikanter der Hit). Zusätzlich zu den E-Werten wurden die Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität gewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Anzahl identischer Nukleotide (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Aminosäure(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In manchen Fällen werden die Default-Parameter so eingestellt, dass die Stringenz der Suche modifiziert wird. So wird zum Beispiel der E-Wert erhöht, so dass weniger stringente Matches gezeigt werden, so dass kurze beinahe exakte Matches identifiziert werden.

Die Tabelle A stellt eine Liste von UBP-Nukleinsäuresequenzen bereit, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können. Tabelle A: Beispiele für UBP-Polypeptide und Nukleinsäuresequenzen

Name		Organismus	Nukleinsäure SEQ ID NO:	Polypeptid SEQ ID NO:
UBP23-ähnlich	X7608	Oryza sativa	1	2
UBP23	UBP23	Arabidopsis thaliana	3	4
UBP22	UBP22	Arabidopsis thaliana	5	6
UBP27	UBP27	Arabidopsis thaliana	7	8
UBP14-ähnlich	X7011	Oryza sativa	9	10
UBP14	UBP14	Arabidopsis thaliana	11	12
UBP26	UBP26	Arabidopsis thaliana	13	14
UBP10-ähnlich	X7009	Oryza sativa	15	16
UBP10-ähnlich	X7578	Oryza sativa	17	18
UBP10	UBP10	Arabidopsis thaliana	19	20
UBP5	UBP5	Arabidopsis thaliana	21	22
UBP9	UBP9	Arabidopsis thaliana	23	24
UBP11	UBP11	Arabidopsis thaliana	25	26
UBP8	UBP8	Arabidopsis thaliana	27	28
UBP25-ähnlich	X7014	Oryza sativa	29	30
UBP25	UBP25	Arabidopsis thaliana	31	32
UBP12	UBP12	Arabidopsis thaliana	33	34
UBP13	UBP13	Arabidopsis thaliana	35	36
UBP3-ähnlich	X7010	Oryza sativa	37	38
UBP3-ähnlich	X7580	Oryza sativa	39	40
UBP3	UBP3	Arabidopsis thaliana	41	42
UBP4	UBP4	Arabidopsis thaliana	43	44
UBP1-ähnlich	X7012	Oryza sativa	45	46
UBP1	UBP1	Arabidopsis thaliana	47	48
UBP2	UBP2	Arabidopsis thaliana	49	50
UBP6-ähnlich	X7610	Oryza sativa	51	52
UBP6	UBP6	Arabidopsis thaliana	53	54
UBP7	UBP7	Arabidopsis thaliana	55	56
UBP20-ähnlich	X7609	Oryza sativa	57	58
UBP20-ähnlich	X7013	Oryza sativa	59	60
UBP20	UBP20	Arabidopsis thaliana	61	62
UBP21	UBP21	Arabidopsis thaliana	63	64
UBP15-ähnlich	X7612	Oryza sativa	65	66
UBP15-ähnlich	X7611	Oryza sativa	67	68
UBP15-ähnlich	X7023	Oryza sativa	69	70
UBP15-ähnlich	X6368	Oryza sativa	71	72
UBP15-ähnlich	X6367	Oryza sativa	73	74
UBP15	UBP15	Arabidopsis thaliana	75	76
UBP16	UBP16	Arabidopsis thaliana	77	78
UBP17	UBP17	Arabidopsis thaliana	79	80
UBP18	UBP18	Arabidopsis thaliana	81	82
UBP19	UBP19	Arabidopsis thaliana	83	84
UBP24	UBP24	Oryza sativa	85	86
UBP24	UBP24	Arabidopsis thaliana	87	88

In manchen Fällen wurden die verwandten Sequenzen von Forschungsinstituten, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), versuchsweise assembliert und der Öffentlichkeit bekannt gemacht. Mit der The Eukaryotic Gene Orthologs(EGO)-Datenbank kann man solche Sequenzen identifizieren, und zwar entweder durch eine Schlüsselwortsuche oder unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der interessierenden Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz.
Beispiel 2: Alignment von UBP-Polypeptidsequenzen
Das Alignment von Polypeptid-Sequenzen erfolgt mit dem AlignX Programm von Vector NTI (Invitrogen), das auf dem bekannten Clustal W-Algorithmus des progressiven Alignments beruht (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497–3500). Die Default-Werte lauten: gap open penalty 10, gap extension penalty 0,1, und die gewählte ”weight matrix” ist Blosum 62 (wenn Polypeptide in Alignment sind). Um das Alignment weiter zu optimieren, werden kleinere Veränderungen von Hand durchgeführt.
Mit einem ”Neighbour-joining”-Clustering-Algorithmus, wie er von dem AlignX-Programm von Vektor NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird, wird ein Stammbaum der UBP-Polypeptide konstruiert.
Beispiel 3: Berechnung des Gesamtidentitätsprozentsatzes zwischen UBP-Polypeptidsequenzen
Die Gesamtprozentsätze für Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängenpolypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, werden unter Verwendung von einer der in der Fachwelt verfügbaren Techniken, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; von Ledion Bitincka gehostete software) bestimmt. Die MatGAT-Software wird verwendet, um Ähnlichkeits-/Identitätsmatrizes für DNA- oder Proteinsequenzen zu erzeugen, ohne dass ein vorheriges Alignment der Daten erforderlich ist. Das Programm führt eine Reihe von paarweisen Alignments unter Verwendung des globalen Alignment-Algorithmus von Myers und Miller durch (gap opening Penalty 12, gap extension Penalty 2), berechnet die Ähnlichkeit und Identität unter Verwendung von z. B. Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert dann die Ergebnisse in einer Abstandsmatrix.
Bei den in dem Vergleich eingesetzten Parametern handelt es sich um:
Scoring matrix: Blosumo2
First Gap: 12
Extending gap: 2
Eine MATGAT-Tabelle für lokales Alignment einer spezifischen Domäne oder Daten zu % Identität/Ähnlichkeit zwischen spezifischen Domänen wird ebenfalls bestimmt.
Beispiel 4: Identifikation von Domänen in UBP-Polypeptidsequenzen
Bei der Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites-(InterPro-)Datenbank handelt es sich um eine integrierte Plattform für die häufig verwendeten Signatur-Datenbanken für Suchen auf Text- und Sequenzbasis. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, in denen unterschiedliche Methodiken und verschiedene Mengen an biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu den angeschlossenen Datenbanken zählen SWISSPROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung multipler Sequenzalignments und versteckter Markov-Modelle, die viele häufige Proteindomänen und Familien abdeckt. Pfam wird auf dem Server des Sanger Institute im Vereinigten Königreich gehostet. InterPro wird vom European Bioinformatics Institute im Vereinigten Königreich gehostet.
Beispiel 5: Topologie-Vorhersage für UBP-Polypeptidsequenzen
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung eukaryotischer Proteine voraus. Die Zuordnung der Lokalisierung beruht auf der vorhergesagten Anwesenheit von einer der folgenden N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Signalpeptid (SP) für den sekretorischen Weg. Die Bewertungen (Scores), auf denen die endgültige Vorhersage beruht, sind keine echten Wahrscheinlichkeiten, und sie tragen auch nicht notwendigerweise zu einer bei. Die Lokalisierung mit dem höchsten Score ist jedoch gemäß TargetP am wahrscheinlichsten und das Verhältnis zwischen den Scores (die Verlässlichkeitsklasse) kann ein Anzeichen dafür sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Verlässlichkeitsklasse (Reliability Class, RC) reicht von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage angibt. TargetP wird auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehalten.
Für die Sequenzen, die den Vorhersagen zufolge eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann auch eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
Es wird eine Anzahl Parameter ausgewählt, wie Organismusgruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Sätze von Ausschlussgrenzen (keine, vordefinierte Sätze von Ausschlussgrenzen oder nutzerspezifische Sätze von Ausschlussgrenzen) und die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).
Zur Durchführung solcher Analysen können viele andere Algorithmen verwendet werden, wie u. a.:

• ChloroP 1.1, das auf dem Server der Technischen Univerität Dänemark gehostet wird;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, das auf dem Server des Instituts für Molekulare Biowissenschaft, Universität Queensland, Brisbane, Australien, gehostet wird;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, das auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada, gehostet wird;
• TMHMM, das auf dem Server der Technischen Universität Dänemark gehostet wird

Beispiel 6: Funktionalitätsassays für UBP-Polypeptide
Hilfsmittel und Techniken zum Messen der UBP-Aktivität sind in der Fachwelt gut bekannt. Yan et al., 2000 (Plant Physiol. Bd. 124) geben Einzelheiten zu UBP-Aktivitätsassays.
Beispiel 7: Klonierung der UBP-Nukleinsauresequenzen

Tabelle B: UBP-Nukleinsäuren für die Klonierung

Name		Organismus	Nukleinsäure SEQ ID NO:	Polypeptid SEQ ID NO:
UBP23-ähnlich	X7608	Oryza sativa	1	2
UBP14-ähnlich	X7011	Oryza sativa	9	10
UBP10-ähnlich	X7009	Oryza sativa	15	16
UBP10-ähnlich	X7578	Oryza sativa	17	18
UBP25-ähnlich	X7014	Oryza sativa	29	30
UBP3-ähnlich	X7010	Oryza sativa	37	38
UBP3-ähnlich	X7580	Oryza sativa	39	40
UBP1-ähnlich	X7012	Oryza sativa	45	46
UBP6-ähnlich	X7610	Oryza sativa	51	52
UBP20-ähnlich	X7609	Oryza sativa	57	58
UBP20-ähnlich	X7013	Oryza sativa	59	60
UBP15-ähnlich	X7612	Oryza sativa	65	66
UBP15-ähnlich	X7611	Oryza sativa	67	68
UBP15-ähnlich	X7023	Oryza sativa	69	70
UBP15-ähnlich	X6368	Oryza sativa	71	72
UBP15-ähnlich	X6367	Oryza sativa	73	74

Eine der in Tabelle B aufgeführten UBP-Nukleinsäuresequenzen wird mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Vereinigtes Königreich) verwendet wird. Die PCR wird unter Verwendung von Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Das amplifizierte PCR-Fragment wird unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt. Anschließend wird der erste Schritt des Gateway-Verfahrens, die BP-Reaktion, durchgeführt, bei der das PCR-Fragment in vivo mit dem Plasmid pDONR201 unter Bildung eines – gemäß der Gateway-Terminologie – ”entry clone”, pUBP, rekombiniert. Das Plasmid pDONR201 wird von Invitrogen als Bestandteil der Gateway^®-Technologie erworben.
Der ”entry clone”, der die UBP enthält, wird anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor, der für die Transformation von Oryza sativa verwendet wird, verwendet. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Grenzen Folgendes: Einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette und eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein GOS2-Promotor aus reis (SEQ ID NO: 89) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wird der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::UBP (1) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
Beispiel 8: Pflanzentransformation
Reistransformation
Agrobacterium, das den Expressionsvektor enthält, wird zur Transformation von Oryza-sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen der japonica-Reissorte Nipponbare werden entspelzt. Die Sterilisation erfolgt durch einminütiges Inkubieren in 70%igem Ethanol und anschließend 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, wonach 6 Mal je 15 Minuten mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wird. Anschließend werden die sterilen Samen auf einem Medium, das 2,4-D enthielt, (Kallusinduktionsmedium) zur Keimung gebracht. Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln werden embryogene, vom Scutellum stammende Kalli herauspräpariert und mittels Subkultur auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen werden die Kalli mittels Subkultur auf dem gleichen Medium für weitere 2 Wochen vervielfacht oder vermehrt. Stückchen der embryogenen Kalli werden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (um die Zellteilungsaktivität zu fördern).
Für die Cokultivierung verwendet man den Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den Expressionsvektor enthält. Agrobacterium wird auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft und für 3 Tage bei 28°C kultiviert. Anschließend werden die Bakterien gewonnen und bis zum Erreichen einer Dichte (OD₆₀₀) von ungefähr 1 in flüssigem Cokultivierungsmedium suspendiert. Anschließend wird die Suspension in eine Petrischale überführt und die Kalli werden 15 Minuten in der Suspension eingetaucht. Dann werden die Kallusgewebe auf einem Papierfilter trocken getupft, auf ein verfestigtes Cokultivierungsmedium umgesetzt und für 3 Tage im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Die cokultivierten Kalli werden 4 Wochen im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels auf 2,4-D-haltigem Medium herangezogen. Während dieses Zeitraums entwickeln sich rasch wachsende resistente Kallusinseln. Nach dem Umsetzen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation im Hellen wird das embryogene Potential freigesetzt und in den nächsten 4 bis 5 Wochen entwickeln sich Sprosse. Die Sprosse werden aus den Kalli herauspräpariert und 2 bis 3 Wochen lang auf auxinhaltigem Medium inkubiert, von dem sie in Erde umgesetzt werden. Abgehärtete Sprosse werden im Gewächshaus unter hoher Feuchtigkeit und im Kurztag herangezogen.
Pro Konstrukt werden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten werden von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Überprüfung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts werden für die Ernte von T1-Samen nur transgene Ein-Kopien-Pflanzen zurückbehalten, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel zeigen. Die Samen werden dann 3 bis 5 Monate nach der Transplantation geerntet. (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
Maistransformation
Die Transformation von Mais (Zea mays) erfolgt durch eine Modifikation des von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50 beschriebenen Verfahrens. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig und nur spezifische Genotypen sind für eine Transformation und Regeneration zugänglich. Die Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elter sind gute Quellen für Donormaterial für die Transformation, aber es können auch andere Genotypen erfolgreich verwendet werden. Die Ähren werden von Maispflanzen etwa 11 Tage nach der Bestäubung (days after pollination, DAP) geerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos etwa 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Herauspräparierte Embryonen werden auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Mais-Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Weizentransformation
Die Transformation von Weizen erfolgt mit dem von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50 beschriebenen Verfahren. Die Sorte Bobwhite (von CIMMYT, Mexico, erhältlich) wird üblicherweise zur Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens cokultiviert, das den Expressionsvektor enthält, und transgene Pflanzen werden mittels Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallusinduktionsmedium, dann auf Regenerationsmedium, das das Selektionsmittel (zum Beispiel Imidazolinon, aber es können verschiedene Selektionsmarker verwendet werden) enthält, herangezogen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C für 2–3 Wochen oder, bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Wurzelmedium überführt und bei 25°C für 2–3 Wochen inkubiert, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden dann auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Sojabohnentransformation
Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens, das im Texas A&M-Patent US 5,164,310 beschrieben ist, transformiert. Es sind mehrere im Handel erhältliche Sojanbohnen-Sorten für die Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Die (von der Illinois Seed Foundation erhältliche) Sorte Jack wird üblicherweise für die Transformation verwendet. Sojabohnensamen wird für die In-vitro-Aussaat sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Keimblatt werden von jungen, 7 Tage alten Keimlingen präpariert. Das Epikotyl und das verbleibende Keimblatt werden weiter gezüchtet, damit sich Achselknoten entwickeln. Diese Achselknoten werden herauspräpariert und mit Agrobacterium tumefaciens, das den Expressionsvektor enthält, inkubiert. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien umgesetzt. Regenerierte Sprosse werden herauspräpariert und auf Sprossverlängerungsmedium umgesetzt. Sprosse mit nicht mehr als 1 cm Länge werden auf Wurzelmedium umgesetzt, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Raps-/Canolatransformation
Keimblattpetiolen und -hypokotyle von 5–6 Tage alten jungen Keimlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Die im Handel erhältliche Sorte Westar (Agriculture Canada) ist die für die Transformation eingesetzte Standardsorte, aber es können auch andere Sorten verwendet werden. Canolasamen werden für die In-vitro-Aussaat oberflächensterilisiert. Die Kotyledonenpetiolenexplantate mit dem daran befindlichen Keimblatt werden aus den In-vitro-Keimlingen herauspräpariert und mit Agrobacterium (das den Expressionsvektor enthält) beimpft, indem das abgeschnittene Ende des Petiolenexplantats in die Bakterienlösung getaucht wird. Die Explantate werden dann für 2 Tage auf MSBAP-3-Medium, das 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar enthält, bei 23°C, 16 Std. Licht gezüchtet. Nach zweitägiger Cokultur mit Agrobacterium werden die Petiolenexplantate für 7 Tage auf MSBAP-3-Medium umgesetzt, das 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) enthält, und dann auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration gezüchtet. Wenn die Sprosse eine Länge von 5–10 mm haben, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0,5 mit 0,5 mg/l BAP) umgesetzt. Sprosse mit einer Länge von etwa 2 cm werden für die Wurzelinduktion auf Wurzelmedium (MSO) umgesetzt. Die bewurzelten Sprosse werden auf Boden im Gewächshaus umgesetzt. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Alfalfatransformation
Ein regenerierender Alfalfa-(Medicago sativa)Klon wird unter Verwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig und daher wird eine regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zur Gewinnung regenerierender Pflanzen sind beschrieben. Diese können zum Beispiel von der Sorte Rangelander (Agriculture Canada) oder jeder anderen im Handel erhältlichen Alfalfa-Sorte wie von Brown DCW und A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben erhalten werden. Alternativ hat man die Sorte RA3 (University of Wisconsin) für die Verwendung bei der Gewebekultur ausgewählt (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654–659). Petiolenexplantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839–847) oder LBA4404, die den Expressionsvektor enthalten, cokultiviert. Die Explantate werden für 3 Tage im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium, das 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält, gezüchtet. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) der halben Stärke gewaschen und auf demselben SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon, aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum für die Hemmung des Agrobacterium-Wachstums herangezogen. Nach mehreren Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium umgesetzt, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika und 50 g/l Saccharose enthält. Die somatischen Embryonen lässt man anschließend auf Murashige-Skoog-Medium der halben Stärke keimen. Bewurzelte Keimlinge werden in Töpfe umgesetzt und im Gewächshaus herangezogen. T1-Samen werden von Pflanzen gewonnen, die eine Toleranz gegen das Selektionsmittel aufweisen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Baumwolltransformation
Die Transformation von Baumwolle erfolgt unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens nach dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren. Baumwollsamen werden in einer dreiprozentigen Natriumhypochloritlösung 20 Minuten lang oberflächensterilisiert und mit destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden anschließend zur Keimung auf SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl umgesetzt. Die Hypokotyle von 4–6 Tage alten Keimlingen werden entfernt, in 0,5 cm große Stücke geschnitten und auf 0,8%igen Agar gelegt. Für die Inokulation der Hypokotylexplantate verwendet man eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 10⁸ Zellen pro ml, verdünnt von einer mit dem interessierenden Gen und geeigneten Selektionsmarkern transformierten Übernachtkultur). Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung werden die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl₂ sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten von noch vorhandenen Bakterien umgesetzt. Einzelne Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten isoliert (wobei alle 4 bis 6 Wochen subkultiviert wird) und werden auf Selektionsmedium für die Gewebevermehrung weiter herangezogen (30°C, 16-h-Fotoperiode). Die transformierten Gewebe werden anschließend 2 bis 3 Monate auf Nicht-Selektionsmedium weiter herangezogen, wodurch man zu somatischen Embryonen gelangt. Gesund aussehende Embryonen mit einer Mindestlänge von 4 mm werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit mit einem Zusatz von 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6 Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure umgesetzt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Fotoperiode von 16 h herangezogen, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blatt-Stadium werden in Töpfe mit Vermiculit und Nährstoffen umgesetzt. Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend in das Gewächshaus umgesetzt, wo sie weiter herangezogen werden.
Beispiel 9: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
9.1 Aufbau der Auswertung
Es werden ungefähr 35 unabhängige T0-Reistransformanten erzeugt. Die Primärtransformanten werden für das Heranziehen und Ernten von T1-Samen von einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus umgesetzt. Es werden sechs Ereignisse zurückbehalten, von denen die T1-Nachkommenschaft für Vorliegen/Abwesenheit des Transgens im Verhältnis 3:1 aufspaltete. Für jedes dieser Ereignisse werden ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, die das Transgen enthalten (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimpflanzen, denen das Transgen fehlt (Nullizygoten), durch Beobachten der sichtbaren Markerexpression selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten werden nebeneinander in zufälliger Anordnung herangezogen. Die Gewächshausbedingungen sind Kurztage (12 Stunden Licht), 28°C im Hellen und 22°C im Dunkeln und eine relative Feuchtigkeit von 70%.
Vier T1-Ereignisse werden in der T2-Generation nach dem gleichen Untersuchungsverfahren wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter untersucht. Vom Sästadium bis zum Reifestadium werden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen.
Screening unter Dürrebedingungen
Pflanzen aus T2-Samen werden unter Normalbedingungen in Blumenerde bis zum Stadium des Rispenschiebens herangezogen. Anschließend werden sie in ein ”trockenes” Areal gestellt, wo keine Bewässerung erfolgt. Um den Bodenwassergehalt (BWG) zu verfolgen, werden Feuchtigkeitssonden in statistisch ausgewählte Töpfe eingeführt. Sinkt der BWG unter gewisse Schwellenwerte, werden die Pflanzen automatisch ständig erneut gegossen, bis wieder ein Normalgehalt erreicht wurde. Dann werden die Pflanzen in Normalbedingungen gestellt. Die übrige Anzucht (Pflanzenreife, Samenernte) erfolgt wie bei den nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogenen Pflanzen. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen beschrieben.
Screening auf Effizienz der Stickstoffnutzung
Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumenerde und mit Ausnahme der Nährlösung unter normalen Bedingungen gezüchtet. Die Töpfe werden von der Transplantierung bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährlösung gewässert, die einen reduzierten Stickstoff-(N-)Gehalt, und zwar gewöhnlich 7 bis 8 Mal niedriger, aufweist. Die übrige Anzucht (Pflanzenreifung, Samenernte) entspricht derjenigen von Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress gezüchtet werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden wie für das Wachstum unter normalen Bedingungen beschrieben ausgewertet.
Salzstress-Screening
Die Pflanzen werden auf einem Substrat aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) herangezogen. Während der ersten zwei Wochen nach dem Umsetzen der Pflänzchen in das Gewächshaus wird eine normale Nährlösung verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wird die Nährlösung mit 25 mM Salz (NaCl) versetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Anschließend werden Samenparameter gemessen.
9.2 Statistische Analyse: F-Test
Als statistisches Modell für die Gesamtauswertung der phänotypischen Eigenschaften der Pflanze wird eine zweifaktorielle ANOVA (Varianzanalyse) verwendet. Mit allen Parametern, die bei allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem erfindungsgemäßen Gen transformiert werden, bestimmt werden, wird ein F-Test durchgeführt. Der F-Test erfolgt zur Überprüfung im Hinblick auf einen Effekt des Gens über alle Transformationsereignisse und zur Feststellung eines Gesamteffekts des Gens, was auch als globaler Geneffekt bezeichnet wird. Die Signifikanzschwelle für einen echten globalen Geneffekt wird bei dem F-Test auf dem 5%-Wahrscheinlichkeitsniveau festgelegt. Ein signifikanter F-Test-Wert weist auf einen Geneffekt hin, was bedeutet, dass mehr als nur das einfache Vorhandensein oder die Lage des Gens die Unterschiede im Phänotyp verursacht.
Da zwei Versuche mit überlappenden Ereignissen durchgeführt werden, wird eine kombinierte Analyse durchgeführt. Dies ist dazu geeignet, die Übereinstimmung der Effekte über die beiden Versuche zu überprüfen, und wenn dies der Fall ist, Befunde von beiden Versuchen zu vereinigen, um die Verlässlichkeit der Schlussfolgerung zu erhöhen. Bei dem verwendeten Verfahren handelt es sich um einen ”Mixed-Modell”-Ansatz, der die mehrschichtige Struktur der Daten (d. h. Versuch – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. Die p-Werte werden dadurch erhalten, dass der Wahrscheinlichkeits-Quotienten-Test mit Chi-Quadrat-Verteilungen verglichen wird.
9.3 Messparameter
Biomasseparameter-Messung
Vom Sästadium bis zum Reifestadium werden die Pflanzen mehrmals in eine Digital-Imaging-Kammer gestellt. Zu jedem Zeitpunkt werden von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder Blattbiomasse) wird dadurch bestimmt, dass man die Gesamtanzahl der Pixel auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen zählt, die sich vom Hintergrund unterscheiden. Dieser Wert wird über die zu demselben Zeitpunkt aus unterscheidlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Versuche zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist diejenige Fläche, die zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, an dem die Pflanzen ihre maximale Blattbiomasse erreicht hatten. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Fläche der Pflanze (des Keimlings) drei Wochen nach der Keimung. Eine Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Anstieg der Gesamtwurzelbiomasse (die als maximale Biomasse der Wurzeln, die während der Lebenszeit einer Pflanze beobachtet werden, gemessen wird) oder als ein Anstieg des Wurzel/Spross-Index (der als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse im aktiven Wachstumszeitraum von Wurzel und Spross gemessen wird) ausgedrückt.
Die Jungpflanzenvitalität wird bestimmt, indem die Gesamtzahl der Pixel von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterschieden, gezählt wurde. Dieser Wert wird über die zu demselben Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommenen Bilder gemittelt und mittels Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert, ausgedrückt in Quadratmillimeter, umgewandelt. Die Jungpflanzenvitalität wird drei Wochen nach der Keimung gemessen.
Samenparameter-Messungen
Die reifen Primärrispen werden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode versehen und dann drei Tage bei 37°C in einem Ofen getrocknet. Dann werden die Rispen gedroschen und alle Samen werden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Spelzen werden von den leeren Spelzen mittels einer Luftblaseeinrichtung getrennt. Die leeren Spelzen werden verworfen und die restliche Fraktion wird nochmals gezählt. Die gefüllten Spelzen werden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl gefüllter Samen wird dadurch bestimmt, dass man die Anzahl der gefüllten Spelzen, die nach dem Abtrennungsschritt verbleiben, auszählt. Der Gesamtsamenertrag wird dadurch gemessen, dass man alle von einer Pflanze geernteten gefüllten Spelzen wiegt. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wird dadurch gemessen, dass man die von einer Pflanze geerntete Anzahl Spelzen auszählt. Das Tausendkorngewicht (TKG) wird aus der Anzahl der gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶, definiert. Die Gesamtanzahl an Blüten pro Rispe ist bei der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl an Samen und der Anzahl an reifen Primärrispen definiert. Die Samenfüllungsrate ist bei der vorliegenden Erfindung als der Anteil (ausgedrückt als %) der Anzahl gefüllter Samen zu der Gesamtzahl Samen (oder Blüten) definiert.
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Zusammenfassung
Pflanzen mit verbesserten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und befasst sich mit einem Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die eine Ubiquitin-spezifische Protease (UBP) kodiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die eine UBP kodiert, wobei die Pflanzen verbesserte Ertragsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die für ein UBP-Polypeptid kodiert, moduliert wird, umfassend: (i) eine Cystein-Box (Cys-Box) und (ii) eine Histidin-Box (His-Box).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das UBP-Polypeptid eine oder mehrere der folgenden Domänen umfasst: Zinkfinger-, Zinkfinger-MYND-, DUF1055-, DUSP-MATH-, Ubiquitin-ähnliche, Ubiquitin-assoziierte Domäne, oder worin das UBP-Polypeptid eine oder mehrere der in Tabelle 3 aufgeführten Domänen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, in eine(r) Pflanze herbeigeführt wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, eines der in Tabelle A aufgeführten Proteine kodiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure, die mit einer solchen Nukleinsäure hybridisieren kann.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A angegebenen Proteine kodiert.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale einen gesteigerten Ertrag, vorzugsweise gesteigerte Biomasse und/oder gesteigerten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die verbesserten Ertragsmerkmale unter Dürrestress-, Salzstress- oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2 Promotor aus Reis, verknüpft ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, aus einer Pflanze, vorzugsweise aus einer monokotylen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa, stammt.
Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch erhältlich sind, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein UBP-Polypeptid kodiert.
Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid nach den Ansprüchen 1 oder 2 kodiert; (ii) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) steuern können; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
Konstrukt nach Anspruch 12, wobei eine der Kontrollsequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt nach Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.
Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, in eine(r) Pflanze; und (ii) Züchten der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze fördern.
Transgene Pflanze mit gesteigertem Ertrag, vorzugsweise gesteigerter Biomasse und/oder gesteigertem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der sich aus einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, ergibt, oder eine Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 11, 15 oder 17, oder eine daraus stammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Zwerghirse, Mohrenhirse and Hafer ist.
Erntbare Teile einer Pflanze nach Anspruch 18, wobei die erntbaren Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
Produkte, die aus einer Pflanze nach Anspruch 18 und/oder aus erntbaren Teilen einer Pflanze nach Anspruch 19 stammen.
Verwendung einer Nukleinsäure, die ein UBP-Polypeptid kodiert, bei der Steigerung des Ertrags, insbesondere bei der Steigerung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.