DE1118403B - Verfahren zur Gewinnung von antitumorwirksamen Sporen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung von antitumorwirksamen Sporen Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von antitumorwirksamen Sporen eines apathogenen, obligat anaeroben Bakterienstammes, Stamm 55, ATCC Nr. 13 732, aus der Gruppe Clostridium butyricum.
• Es sind schon vor langer Zeit Versuche gemacht worden, Tumoren durch bakterielle Infektion und durch Behandlung mit Bakterienprodukten zu heilen (vgl. R. C. Parker und Mitarbeiter, Proc. Soc. exper.
• Biol. und Med., 66, S.461 [1947]; Reilly, Canc.
• Res., 13, S. 821 [1953]) oder Kulturen von Mikroorganismen zur Anwendung bei Tumoren herzustellen (vgl. deutsche Patentschriften 510 490 und 941 151). Es ist auch schon versucht worden, Tiertumoren durch Infektion von Tieren mit Sporen von Clostridium histolyticum zu beeinflussen (vgl. Parker und Mitarbeiter, a. a. O.). Da es sich hierbei um einen pathogenen, Toxin bildenden Mikroorganismus handelt, mußten die Tiere durch gleichzeitige Gabe von Antitoxin oder von Antibiotika vor einem Überhandnehmen der Infektion geschützt werden.
• Alle diese Versuche haben bisher noch nicht zu einer praktischen Anwendung geführt.
• Es wurde ferner beobachtet, daß gesunde Tiere, die mit Tetanussporen infiziert wurden, nicht erkrankten, daß aber tumortragende Tiere nach kurzer Zeit an Tetanusinfektion eingingen und daß die Tetanussporen hierbei im Tumorgewebe, aber nicht im normalen Gewebe auskeimten (vgl. R. R. Malmgren, C.C.Flanigan, Canc. Res., S.473 [1955]; J. R.
• Möse, G. Löse, Zeitschrift für Krebsforschung, 63, s. 63 bis 74 [1959]).
• Sowohl bei Clostridium histolyticum als auch bei Tetanus handelt es sich um anaerobe Sporenbildner, deren Anwendung zu einer Tumorbehandlung wegen ihrer großen Pathogenität nicht möglich ist. Daß für eine solche Tumorbehandlung apathogene Bakterien in Betracht kommen, war nicht zu erwarten, da diese biologisch indifferent sind. Hieraus geht hervor, daß es als überraschend angesehen werden muß, wenn nicht toxische (apathogene) Sporen bzw. Sporen von apathogenen Bakterien Tumoren günstig zu beeinflussen vermögen. Eine derartige spezielle Wirksamkeit gegenüber lebendem Gewebe wird von der Fachwelt in der Regel nicht bei Anwendung von apathogenen Substanzen erwartet. Von diesen war eher anzu nehmen, daß sie dem Gewebe gegenüber indifferent bleiben.
• Es wurde nun ein Verfahren zur Gewinnung von antitumorwirksamen Sporen gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Sporen eines apathogenen, obligat anaeroben Bakterienstammes, Stamm 55, ATCC Nr. 13 732, aus der Gruppe Clostridium butyricum, vorzugsweise aus Eisennagelbouillonkulturen des genannten Bakteriums, isoliert, mit physiologischer Kochsalzlösung wäscht und in wäßrige Suspension überführt, abfüllt und gegebenenfalls gefriertrocknet.
• Der Stamm 55 wurde aus Humusboden isoliert und erwies sich als besonders geeignet zur Tumorbehandlung (vgl. J. R. Möse, G. Möse, a.a.O.). Bei der Suche nach wirksamen Bakterien kamen nur solche in Frage, die bei entsprechender Kultivierung unter guter Ausbeute möglichst zahlreich versporen und deren Sporen selbst bei hochdosierter mehrmaliger Verabfolgung am gesunden Tier apathogen sind.
• Der Stamm 55 zeigt folgende Merkmale: Obligat anaerobe, bewegliche Stäbchen 0,7 5 M (Länge in älteren Kulturen zum Teil etwas größer).
• Sporen oval, subterminal gelegen, die Stäbchen clostridienartig auftreibend. Grampositiv (ältere Kulturen gramlabil). Gutes Wachstum bei 37°C.
• Gelatine wird nicht verflüssigt. In Leber- und Eisennagelbouillon gutes Wachstum und starkes Schäumen. Indolnegativ. Verhalten gegen Zucker (+ Säurebildung vorhanden, keine keine Säurebildung): Glukose +, Galaktose +, Laevulose +, Saccharose +, Laktose +, Maltose +, Stärke +, Inosit -, Sorbit -, Arabinose -, Xylose +, Dulcit -, Rhamnose -, Salicin +, Mannitol + schwach, Amygdalin -, Cellulose -, Glycerin -.
• Aus diesen und anderen Merkmalen läßt sich der Stamm 55 in die Gruppe des Clostridium butyricum einordnen (s. Berge: Manual of deter- minative bacteriology, 6. Auflage, London, 1948, mit Anhang der bisher beschriebenen Arten).
• Nach Topley und Wilson: Principles of bacteriology and immunology, London, 1947, sind die entsprechenden Synonyma Clost. pasteurianum, Bac. amylobacter, Granulobacter saccharobutyrium.
• Der Stamm 55 wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Nummer ATCC 13732.
• Die Züchtung des genannten Stammes und die Herstellung einer gebrauchsfertigen Sporensuspension erfolgt nach üblichen Methoden entweder über Blutagarplatten oder aus einer Eisennagelbouillonkultur. Die in der Suspension neben den Sporen vorhandenen Bakterien werden durch Erhitzen auf 73"C abgetötet. Die Suspension wird dann durch Auszählung und entsprechende Verdünnung auf die gewünschte Sporenzahl pro Milliliter gebracht und in Röhrchen oder in Ampullen abgefüllt; diese werden bei -25- C eingefroren und aufbewahrt. Man kann auch durch Gefriertrocknen ein Trockenpräparat herstellen.
• Jede Sporensuspensioncharge wird auf ihre pyrogene Wirkung am Kaninchen geprüft. Während die aus der Blutagarplatte gewonnenen Präparate häufig eine kurzdauernde Temperaturerhöhung um 1 bis 1,4"C bewirken, sind die aus der Eisennagelbouillon gewonnenen meist pyrogenfrei. Im folgenden wird die Wirkung der Sporensuspension vom Stamm 55 im Tierversuch geschildert (vgl. J. R. Möse, G. Möse, a.a.O.).
• 1. Ehrlich-Ascites-Tumor Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von etwa 20g werden 30 mol frischer Ascitestumor intraperitoneal injiziert. Am 4. Tage des Versuchs wurden 0,2 ml einer Sporensuspension, entsprechend 18000000 Sporen, injiziert. In anderen Versuchen wurde mehrmals intravenös mit wechselnden Sporenmengen von 250 000 bis 18 000 000 behandelt. In den Kontrollen zeigte sich bei allen Tieren nach der Injektion ein sofortiges Stehenbleiben oder Absinken der durch das Tumorwachstum bedingten Gewichtszunahme. Am Ausstrichpräparat ließen sich schon 24 Stunden nach der Sporeninjektion wenige, später mehr ausgekeimte Stäbchen in der Ascitesfiüssigkeit nachweisen, aber nicht in so reichlicher Menge wie bei der unten beschriebenen Behandlung von Solidtumoren. Eine wesentliche Erhöhung der Überlebenszeit gegenüber den Kontrollen wurde in diesen Versuchen nicht erzielt.
• Am günstigsten erwies sich die Wirkung einer einmaligen Sporeninjektion, wenn sie zeitlich mit dem beginnenden Wachstumsimpetus des Tumors (nach der anfänglichen Latenzperiode) zusammenfällt; dies ist etwa am 3. Tag der Fall. Hierbei konnten zum Teil noch beträchtliche Überlebenszeiten beobachtet werden.
• Sporeninjektionen knapp nach der Tumoreninjektion sind von geringer Wirkung, ebenso zu einem späteren Zeitpunkt während der massiven Gewichtszunahme durch das Tumorwachstum.
• 2. Ehrlich Tumor in Solidform Der im folgenden kurz als )>Solidtumor« bezeichnete Tumor wurde ursprünglich so erhalten, daß eine geringe Menge frischen Ascitestumors subcutan in die lin'.e Schultergegend der Tiere injiziert wurde. Nach einiger Zeit entwickelte sich an dieser Stelle ein nur langsam an Größe zunehmender, solider Tumor von etwa hartgummiartiger Konsistenz. Für die weiteren Passagen wurde dann jeweils ein solcher, ziemlich gut abgegrenzter Tumor unter sterilen Kautelen herausgenommen, mit der Schere so weit als möglich zerkleinert und anschließend unter Zusatz von etwas physiologischer Kochsalzlösung kurz in einer Reibschale zerrieben. Die immer noch aus gröberen Teilen bestehende Suspension wurde dann mit einer dicken Kanüle in Tuberkulinspritzen aufgezogen und zu je 0,05 ml den Tieren subcutan durch den linken Vorderfuß in die linke Schultergegend injiziert.
• Das Wachstum der Tumoren wurde durch Messungen der Tumorgröße verfolgt. Normalerweise war etwa 10 Tage nach der Injektion bereits ein deutliches Tumorknötchen tastbar, das sich später bis zu beträchtlichen Größen weiterentwickelte. Nach 3 bis 4 Wochen betrugen die Tumorgrößen der Kontrolltiere bis zu 25 28 mm (= Höhe mal Breite), in einzelnen Fällen auch etwas darüber. Die Kontrolltiere erlagen dem Tumor im Zeitraum von etwa 30 bis 40 Tagen. Der Solidtumor neigte nicht zur Metastasierung und ist auch in seinen großen Formen meist nur fest mit der darüberliegenden Haut verbunden.
• Er läßt sich relativ leicht von dem übrigen Gewebe trennen. Makroskopisch erkennbare Nekrosen innerhalb der Kontrolltumoren ließen sich nicht feststellen.
• Bei den ersten Versuchsserien wurde die intravenöse Injektion von Sporen des Stammes 55 (in einer Menge von rund 18 Millionen Sporen) erst zu einem ziemlich späten Zeitpunkt der Tumorentwicklung vorgenommen.
• Die Tumorgrößen betrugen 20 - 20 mm. Es zeigte sich übereinstimmend, daß bereits nach kurzer Zeit (1 bis 2 Tagen) nach der einmaligen Sporeninjektion der Tumor deutlich erweichte, kurz später fluktuierend wurde und sich anschließend durch eine zunächst kleine, später breiter werdende Öffnung nach außen entleerte. Die ausrinnenden Massen sind nicht blutig und von dünn eitriger Konsistenz. Ihr Buttersäuregeruch ist intensiv gleich dem Geruch des Stammes in der Kultur. Im Ausstrichpräparat finden sich ausschließlich die injiziertem Keime in großer Menge vor.
• Durch die Behandlung wird der Tumor in seiner vollen Größe nekrotisiert, ohne daß diese Vorgänge auf das anschließende Gewebe übergreifen. Später bildet sich über diesen, je nach Mächtigkeit des ursprünglichen Tumors auch entsprechend großen Gewebsdefekt eine ziemlich harte Kruste aus, die leicht abhebbar ist. Vom Rande her beginnen zum Teil wulstige Regenerationsvorgänge. Je größer allerdings der ursprüngliche Tumor, je größer also der entstehende Gewebsdefekt, um so weniger vermag das Tier, diesen im Vergleich zur Körpergröße der Tiere oft außerordentlich großen Defekt auszuheilen. Die Tiere gehen dann einige Zeit später zugrunde. Wird aber die Versuchsanordnung insofern geändert, als nicht erst im späteren Tumorstadium die Sporeninjektion durchgeführt wird, sondern bereits bei Vorhandensein eines kleinen bis höchstens mittelgroßen Tumors, dann kann ein hoher Prozentsatz der Tiere diesen Gewebsdefekt ausheilen und überleben.
• Bei kleinen Tumoren sind die Verhältnisse gegen die ja an sich schon zerfallsbereiteren großen Tumoren insofern anders, als hier der Tumorzerfall nach einmaliger oder auch mehrmaliger Sporeninjektion nicht mit solcher Sicherheit bereits nach 1 bis 2 Tagen beginnt. Es dauert hier meist mehrere Tage bis zum Zerfall. Bei Behandlung ganz kleiner Tumoren, die gerade erst als kleines derbes Knötchen tastbar sind und sich bei den Kontrolltieren stets weiter ntwickelten, kann ein Zerfall auch ohne Durchbruch nach außen eintreten. Die Ausheilung erfolgt in diesen Fällen ohne äußerlich erkennbare Veränderungen.
• In anderen Versuchen wurde der Verlauf des Tumorzerfalls auch histologisch verfolgt. Bereits 24 Stunden nach der Sporeninjektion waren vegetative Formen der Keime in geringer bis reichlicher Menge im Tumor nachweisbar. Histologisch sind zu diesem Zeitpunkt bereits massive Nekrosen sichtbar.
• Im Klatschpräparat von Niere, Leber, Milz und Herzblut waren keine vegetativen Formen nachzuweisen.
• 48 Stunden nach der Sporeninjektion zeigte sich bereits mikroskopisch die Mehrzahl der Tumoren in deutlicher Lyse, zum Teil mit kleinem Durchbruch nach außen. Histologisch sah man ausgedehnte Nekrosen in der Art von Koagulationsnekrosen mit kleinen Tumorzellinseln, die ebenfalls bereits geschädigt aussahen. Nach 72 Stunden waren alle Tumoren auch makroskopisch sichtbar in Lyse mit feinem oder breiterem Durchbruch nach außen. Die histologischen Bilder entsprechen diesem Befund.
• Auch nach dieser Zeit waren in den Organen keine vegetativen Formen nachweisbar.
• In der Kultur können die Keime bis zu 14 Tagen nach der Injektion aus den Organen wieder herausgezüchtet werden, später nicht mehr. Diese Befunde zeigen, daß nach der intravenösen Verabreichung die Sporen sich zwar im ganzen Organismus verteilen, daß aber ein Auskeimen nur im Tumorgewebe stattfindet. Dies spricht dafür, daß es die besonderen anaeroben Verhältnisse im Tumorgewebe sind, die den Sporen ein Auskeimen und Aktivwerden ermöglichen.
• Bei der gleichen Versuchsanordnung, aber mit kleineren Tumoren wurde ebenfalls eine rasche Ansiedlung der Keime im Tumor beobachtet. Die Nekrose trat erheblich langsamer ein als bei den großen Tumoren. Nach Abheilen des entstandenen Defektes überlebten aber die Tiere in hohem Prozentsatz. Zum Vergleich mit dem anaeroben Stamm 55 wurden Tiere mit Ehrlich-Ascites- und Ehrlich-Solidtumoren auch mit Sporensuspensionen von aeroben Sporenbildnern, nämlich Bac. subtili und Bac. mesentercum, behandelt. Die Tumoren wurden hierdurch nicht beeinflußt. Im Tumorabstrich waren keine vegetativen Formen nachweisbar.
• 3. Versuche mit anderen Tumoren In weiteren Versuchsreihen wurden auch Tiere mit Walker-Tumoren, Yoshida-Sarkom- und Oberling-Tumoren mit Sporensuspensionen des Stammes 55 behandelt. Auch hier wurde einige Tage nach der Sporeninjektion eine Erweichung und Nekrose der Tumoren beobachtet, wobei im Tumor massenhaft Stäbchen des Stammes 55 nachweisbar waren. Die starke Nekrose mit den sich dabei bildenden toxischen Zerfallsprodukten und die Sekundärinfektionen hatten in den meisten Fällen zur Folge, daß keine deutliche Erhöhung der Überlebenszeit festgestellt wurde. Bei der Behandlung von Melanomen an der Maus zeigten sich ähnliche Verhältnisse. Die Tumormasse verflüssigte sich mit der Zeit ebenfalls, jedoch trocknete dann das Melanom ein und fiel ab. Es wurden hierbei echte Heilungen beobachtet.
• Es hat sich gezeigt, daß in manchen Fällen, besonders im Anfangsstadium des Tumorwachstums, die Sporen im Tumorgewebe nur schlecht auskeimen. Man kann das Auskeimen erheblich beschleunigen, wenn man vor der Verabreichung der Sporen oder gleichzeitig hiermit ein Bakterienpyrogen verabreicht. Diese Maßnahme führt zur Bildung von Nekroseherden in den Tumoren (vgl. M. J. Shear und Mitarbeiter, J. Nat.
• Cancer Inst., 4, S. 81, 99, 107, 123 [1943]; 5, S. 159 [1949]; Approaches to Tumor Chemotherapy, 1947, S. 236). In solchen nekrotischen Stellen finden die erfindungsgemäßen Bakteriensporen offenbar ein besonders günstiges Milieu zur Auskeimung vor und können dann den Tumor zur Einschmelzung und Abheilung bringen.
• Wie schon erwähnt, enthalten die aus der Blutagarplattenkultur gewonnenen Sporenpräparate häufig kleine Mengen an pyrogenen Substanzen, die somit die Auskeimung der Sporen begünstigen. Die aus Eisennagelbouillon gewonnenen Sporensuspensionen sind bei sorgfältiger Herstellung pyrogenfrei. Falls eine kombinierte Behandlung mit Pyrogen erwünscht ist, kann man bei Anwendung der pyrogenfreien Sporensuspensionen zunächst mit einem Bakterien-Endotoxin vorbehandeln oder es gleichzeitig gegebenenfalls in Mischung mit der Sporensuspension verabreichen. Diese Art der Pyrogenvorbehandlung hat gegenüber der Anwendung der pyrogenhaltigen Sporensuspension aus der Blutagarkultur den Vorteil, daß man das Pyrogen genau dosieren kann und daß man ebenso die Dosis der Sporensuspension beliebig groß wählen kann. Als Bakterien-Endotoxine können z. B. solche von gramnegativen Bakterien wie E. coli, Salmonellen, Shigellen, Pasteurellen, Serratia usw. in Frage kommen. An Stelle von reinen Endotoxinen kann man auch Kulturfiltrate oder abgetötete Bakterien verwenden.
• 4. - Klinische Versuche Die bisher durchgeführten klinischen Versuche bestätigen die im Tierversuch gewonnenen Ergebnisse.
• Bei einem Patienten (MOK 3) mit einer derb-harten, in die Tiefe ziehenden Metastase (nach Plattenepithelcarcinom des Larynx) von der Größe eines kleinen Apfels an der rechten oberen Halsseite und weicherer, etwa pflaumengroßer Metastase an der gleichen Seite oberhalb des Schlüsselbeins (Clavicula) unter dem M. sternocleidomastoideus wurde mit 0,5ml einer Sporensuspension aus einer Eisennagelbouillonkultur des Stammes 55 die obere, harte Metastase behandelt, wobei die Injektion lokal in die Metastase erfolgte.
• Nach 2 Tagen bildete sich ein Ödem aus, das später bis über den Kieferwinkel ging. Am 4. Tag nach der Sporeninjektion war die Metastase fluktuierend weich und punktierbar. Im reichlichen Punktat befanden sich nekrotische Massen mit typischen Stäbchen. Das Punktat hatte einen typischen Geruch wie der verwendete Stamm 55 in der Kultur. Im Ausstrich fanden sich Leukozyten, zerstörte Tumorzellen, Detritus und Stäbchen. Bis zum 18. Tag wurde noch viermal punktiert. Spätere Punktionen ließen die Stäbchen schon in hohem Grad versport erkennen. Bei der letzten Punktion am 18. Tag waren Stäbchen nur noch durch Kultur nachweisbar. Am 5. Tag nach der Sporeninjektion in die obere Metastase begann auch die untere Metastase fluktuierend zu werden. Auch aus dieser ließen sich mehrmals nekrotische Massen punktieren. Stäbchen waren darin reichlich nachweisbar. Nach 4 Wochen waren die Metastasen palpatorisch und optisch völlig verschwunden. Der Patient, der vorher über starke Schmerzen und erhebliche Bewegungseinschränkungen geklagt hatte, fühlte sich ausgezeichnet und nahm an Gewicht zu. Bei Beginn der Tumorlyse war eine leicht erhöhte Körpertemperatur über 4 Tage aufgetreten, deren Maximum bei 37,4"C lag.
• Bei weiteren drei Patienten wurden die Sporen im Tumor zum Angehen gebracht durch gleichzeitige Verabreichung von 20 bis 40 y eines Endotoxins, das aus E. coli in der Form eines als Pyrogen wirkenden Lipopolysaccharids gewonnen war.
• In allen diesen Fällen kam es zu einer raschen Lyse des Tumors, beginnend nach etwa 2 bis 3 Tagen. Über der Tumorstelle trat ebenfalls ein Ödem auf, das bei Beendigung des Prozesses wieder verschwand. Es handelte sich um einen Patienten mit einer harten, gut pflaumengroßen, in die Tiefe strahlenden Metastase nach Kehlkopf-Carcinom an der rechten Halsseite; einen Patienten mit einem Plattenepithel-Carcinom, oval, kleinapfelgroß, hart, in die Tiefe ausstrahlend, am rechten Hals-Kieferwinkel; einen weiteren Patienten mit Plattenepithel-Carcinom, flächig, derb, vom Nacken zur rechten Halsseite ziehend, mit derben Knoten.
• In den Punktaten waren reichlich Stäbchen des Stammes 55 nachweisbar und auch der typische Buttersäuregeruch wurde festgestellt.
• Bei Entlassung waren die Tumoren bis auf Reste von narbigem Gewebe abgeheilt, die Patienten fühlten sich wohl, und die Schmerzen waren verschwunden.
• Während der ersten Tage der Tumorlyse traten, wie beim ersten Patienten, nur unbedeutende Temperatursteigerungen auf.
• Die beschriebenen Versuche eröffnen eine neue Behandlungsmöglichkeit von Tumoren durch eine gezielte Therapie mit Sporen eines anaeroben, apathogenen Keimes. Nach Injektion verteilen sich die Sporen mit dem Blutstrom im Organismus. Sie keimen normalerweise nicht aus bzw. nur in so geringem Maße, daß sofort eine Vernichtung von vegetativen Formen durch Phagozytose erfolgt. Normalerweise sind nach etwa 14 Tagen keine Sporen mehr nachweisbar. Beim Vorhandensein von Tumoren finden die Sporen dagegen in dem hier herrschenden anaeroben Milieu günstige Bedingungen zur Auskeimung und Vermehrung vor, als deren Wirkung dann eine Einschmelzung des Tumorgewebes erfolgt. Durch die intravenöse Injektion ist es z. B. möglich, auch Tumoren zu erfassen, die nicht äußerlich zu erkennen oder zu diagnostizieren sind.
• Der für die Versuche verwendete apathogene Stamm 55 erzeugt keinerlei Nebenerscheinungen.
• Normale Kaninchen, denen 3 ml der reinen unverdünnten Sporensuspension (etwa 1000 000 000 Sporen) intravenös injiziert wurden, zeigten außer einer kurzdauernden Temperaturerhöhung bei Verwendung von aus Blutagarplattenkulturen hergestellten Sporensuspensionen keinerlei Reaktion. Sie wurden einige Wochen auf eventuell eintretende Schäden beobachtet und anschließend getötet und seziert. Es konnten in keinem Falle pathologische Erscheinungen gefunden werden.
• Sporensuspensionen des Stammes 55 können wie folgt hergestellt werden. a) Sporensuspension von Blutagarplattenkulturen Je 2 Tropfen einer flüssigen Anaerobenkultur (24stündig) werden auf Blutagarplatten aufgetropft und gleichmäßig verspatelt. In die Deckel dieser Petrischalen ist Nähragar eingegossen, auf dem eine dichte Kultur von Bact. Prodigiosum verspatelt wird. Dann wird die Blutplatte auf den prodigiosusbeimpften Agar aufgesetzt, und die Ränder mit einer heißen Vaselin-Paraffin-Mischung dicht vergossen. Anschließend Bebrütung bei 37"C über 4 Tage. Das Öffnen der Platten erfolgt wegen des ziemlich intensiven, unangenehmen Geruches nach Buttersäure am besten in einem isolierten Raum. Nun wird mittels Färbepräparaten die Versporung (und orientierend auch die Reinheit) der Kultur festgestellt. Jede Blutagarplatte wird sodann mit 2 bis 3 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemmt und gemeinsam in entsprechende Röhrchen übertragen. Anschließend wird dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen (je 10 Minuten auf vollen Touren einer normalen, größeren Laborzentrifuge). Vor dem Aufgießen neuer physiologischer Kochsalzlösung wird dabei der Bodensatz immer wieder mittels sterilen Glasstabes gut suspendiert. Nach dem letzten Zentrifugieren wird bis zur ungefähren Erreichung der gewünschten Keimzahl abermals sterile physiologische Kochsalzlösung zugesetzt und anschließend diese Suspension durch sterile Papierfilter filtriert. Die nun gleichmäßig suspendierte Zubereitung kommt über 25 Minuten in ein Wasserbad von 73°C. Anschließend wird die genaue Keimzahl bestimmt, im Färbepräparat der Prozentsatz an Sporen festgelegt (und danach die Sporenzahl pro Millimeter Suspension berechnet). Zur Kontrolle werden anaerobe und gewöhnliche (aerobe) Bouillonröhrchen mit der Suspension beimpft. Letztere müssen bei der Bebrütung steril bleiben. Die Suspension wird dann in entsprechende Röhrchen verteilt oder zum Teil auch in Ampullen abgefüllt (jeweils in kleineren Mengen von 0,5 bis 1,0 ml) und bis zum Gebrauch bei -25"C eingefroren. Beim späteren Auftauen müssen die Suspensionen gut durchgeschüttelt werden. b) Sporensuspensionen aus Eisennagelbouillon Eisennagelbouillon (K. Berger, Wiener. Med.
• Wochenschrift, 97, S. 381 [1947]) wird beimpft und bis zur möglichst optimalen Versporung bei 37° C bebrütet (8 bis 10 Tage). Dann wird die Bouillonkultur filtriert, einmal mit physiologischer Kochsalzlösung (wie oben) gewaschen, abermals filtriert (Papierfilter) und nun noch zweimal gewaschen. Nach entsprechend dosierter Aufschüttung neuer physiologischer Kochsalzlösung und guter Suspendierung der Keime mittels Glasstabes wird die Suspension über Nacht im normalen Eisschrank stehengelassen. Am anderen Tag wird unter Verwerfung eines eventuell noch entstandenen geringen Bodensatzes der Überstand mittels Spritze aufgezogen und in einer gemeinsamen, einzigen Eprouvette gemischt. In dieser Eprouvette wird dann die Suspension über 25 Minuten einer Temperatur von 730 C im Wasserbad ausgesetzt. Keimzählung, Reinheitskontrollen und Abfüllung in kleinere Portionen in Röhrchen und Ampullen beenden die Herstellung der gebrauchsfertigen Suspension. Auch die so hergestellten Sporensuspensionen werden bei -25"C bis zum Gebrauch eingefroren. Die Herstellung in der Eisennagelbouillon hat vor allem den Vorteil der besseren Versporungsergebnisse.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH.

   Verfahren zur Gewinnung von antitumorwirksamen Sporen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sporen eines apathogenen, obligat anaeroben Bakterienstammes, Stamm 55, ATCC Nr. 13732, aus der Gruppe Clostridium butyricum vorzugsweise aus Eisennageibouillonkulturen des genannten Bakteriums isoliert, mit physiologischer Kochsalzlösung wäscht und in wäßrige Suspension überführt, abfüllt und gegebenenfalls gefriertrocknet.