DE10339996A1

DE10339996A1 - Analyseverfahren, Analysevorrichtung und Analysechip zur Analyse von Reagenzien

Info

Publication number: DE10339996A1
Application number: DE2003139996
Authority: DE
Inventors: Christoph Dr. Gauer
Original assignee: Advalytix AG
Current assignee: Advalytix AG
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2005-04-07

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Analyseverfahren, bei dem eine Oberfläche mit zumindest zwei Spots bereitgestellt wird, an denen unterschiedliche Reagenzien unspezifisch gebunden sind. Auf diese Oberfläche wird Probenlösung derart aufgebracht, daß sich jeweils einzelne Probenlösungstropfen auf den Spots befinden. Die unspezifisch gebundenen ersten Reagenzien werden in dem Probenlösungstropfen zur Flüssigphasenreaktion der ersten und zweiten Reagenzien aufgelöst. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Analysechip zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, eine Analysevorrichtung zur Verwendung mit einem erfindungsgemäßen Analysechip und Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens, des erfindungsgemäßen Analysechips und der erfindungsgemäßen Analysevorrichtung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Analyseverfahren zur Analyse von Reagenzien, einen Analysechip zur Durchführung des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens und eine Analysevorrichtung zur Verwendung mit einem erfindungsgemäßen Analysechip.
Bei der Analyse von Reagenzien, im speziellen bei biologischen Analysen werden die Reagenzien in Gefäßen, z. B. den Kavitäten einer Mikro-Titerplatte zur Reaktion gebracht. Dazu werden die einzelnen Reagenzien z. B. in die Kavitäten pipettiert. In die ggf. unterschiedlich gefüllten Kavitäten der Mikro-Titerplatte wird Probenlösung gegeben und nach Ablauf einer typischen Reaktionszeit untersucht, in welchen der Kavitäten eine spezifische Reaktion stattgefunden hat.
Die PCR (Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion) ist ein bekanntes Verfahren zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen. Sogenannte Primer definieren einen DNA-Abschnitt, der in dieser Reaktion vervielfältigt wird. Häufig möchte man aus einer Probe jedoch nicht nur einen, sondern mehrere DNA-Abschnitte vervielfältigen. Dies kann z. B. in der Diagnostik sinnvoll sein. Eine Anwendung aus diesem Gebiet ist die Amplifikation von DNA-Sequenzen, die für verschiedene Bakterien spezifisch sind. Bei einem positiven Ergebnis der PCR, d.h. bei einer stattgefundenen Vervielfältigung, läßt sich so bestimmen, welche Bakterien in der Probe vorhanden waren. Bei der sogenannten Multiplex-PCR werden der Probe verschiedene Primer zugesetzt, so daß gleichzeitig mehrere DNA-Abschnitte amplifiziert werden.
Eine Möglichkeit, um aus einer Probe unterschiedliche DNA-Sequenzen zu amplifizieren, besteht darin, der Probe in einer Reaktion unterschiedliche Primer zuzusetzen und dann das notwendige PCR-Temperaturprotokoll zu durchlaufen. Da sich die Primer jedoch gegenseitig beeinflussen, ist bei dieser Methode ein erheblicher Optimierungsaufwand notwendig. So ist nicht sichergestellt, daß zwei Primer, die in separaten Reaktionen zu einer spezifischen Amplifikation führen, dies auch in einer gemeinsamen Reaktion tun. Zusätzlich ist bei diesem Ansatz eine Unterscheidung der Amplifikate z. B. durch Trennung auf einem Gel oder durch Hybridisierung notwendig, um angeben zu können, welche Gensequenz vervielfältigt worden ist.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Probe zu trennen und dann die einzelnen PCR-Reaktionen in unterschiedlichen Reaktionskammern wie z. B. den Kavitäten einer Mikro-Titerplatte ablaufen zu lassen, wie es oben allgemein beschrieben ist. Bei dieser Methode ist großer Laboraufwand für die einzelnen Pipettierschritte notwendig.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Technologie zur Analyse anzugeben, die einfach durchzuführen ist und mit einem verringerten Laboraufwand durchführbar ist.

Diese Aufgabe wird mit einem Analyseverfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1, einem Analysechip mit den Merkmalen des Anspruches 30 bzw. einer Analysevorrichtung mit den Merkmalen des Anspruches 42 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche. Die Ansprüche 50 und 51 sind auf vorteilhafte Verwendungen gerichtet.

Bei dem erfindungsgemäßen Analyseverfahren für Reagenzien wird eine Festkörperoberfläche bereitgestellt, z. B. die Oberfläche eines Festkörperchips. Auf dieser Festkörperoberfläche sind zumindest zwei Spots vorgesehen, an denen unterschiedliche erste Reagenzien unspezifisch gebunden sind. Die ersten Reagenzien, die an den Spots unspezifisch gebunden sind, können z. B. biologische Makromoleküle, wie Antigene, Antikörper oder DNA-Sequenzen, insbesondere Primer für die PCR umfassen. Der Begriff „unspezifische Bindung" soll eine Bindung beschreiben, deren Bindungsstärke gering ist, insbesondere eine Bindung, die durch van-der-Waals-Kräfte vermittelt wird.

Die Zahl der Spots kann bis zu einigen Tausend auf einem Chip von z. B. einigen mm² bis einigen cm² betragen, wobei der Abstand solcher Spots z. B. einige 100 μm bis einige mm sein kann. Vorteilhafterweise sind die Spots in der Form eines ein- oder zweidimensionalen Arrays angeordnet, wodurch die automatisierte Behandlung vereinfacht wird.

Auf die so präparierte Festkörperoberfläche wird erfindungsgemäß eine Probenlösung mit zweiten Reagenzien derart aufgebracht, daß sich auf den Spots jeweils einzelne Probenlösungstropfen bilden, vorzugsweise derart, daß jeweils ein Probenlösungstropfen auf jeweils einem Spot gebildet wird. Es können jedoch auch einige wenige Spots mit einem gemeinsamen Probenlösungstropfen in Kontakt gebracht werden. Die Probenlösung wird dabei alleine durch ihre Oberflächenspannung in Form eines Tropfens zusammengehalten. Bei einem Tropfendurchmesser von einigen 100 μm bis einigen mm ergeben sich typische Tropfenvolumina von einigen nl bis einigen 100 μl.

Die Probenlösungstropfen auf den Spots bilden separierte und einzelne Reaktionsvolumina.

Die unspezifisch gebundenen ersten Reagenzien werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in den Probenlösungstropfen aufgelöst, so daß eine Reaktion zwischen den ersten und den zweiten Reagenzien stattfinden kann. Dieser Auflösungsprozeß ermöglicht das Stattfinden der Reaktion in der Flüssigphase. Im Gegensatz zu einer flüssig-fest-Reaktion ist dies speziell bei der Untersuchung der Hybridisierung biologischer Makromoleküle, einer Antigen-Antikörper-Reaktion oder Durchführung einer PCR von Vorteil, da die Verteilung der einzelnen Edukte und die Dynamik gegenüber einer fest-flüssig-Reaktion besser ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind nur sehr kleine Reaktionsvolumina notwendig. Mehrere Untersuchungen und Amplifikationen können parallel auf einer sehr kleinen Fläche, z. B. einem Festkörperchip mit nur wenigen Zentimetern Ausmaß durchgeführt werden. Die Anzahl der flüssigen und daher schwieriger zu handhabenden Reagenzien ist verringert, da die ersten Reagenzien auf dem Chip unspezifisch gebunden bereitgestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet getrennte Reaktionsvolumina in Form der getrennten Probenlösungstropfen auf kleinstem Raum, wobei dennoch nur eine Flüssigkeit zugegeben werden muß und insofern aufwendige Pipettierschritte entfallen. Das zu verwendende Device hat eine sehr geringe Baugröße und insofern auch eine geringe thermische Masse, was insbesondere bei ggf. notwendigen Temperaturzyklen, z. B. bei PCR-Zyklen, vorteilhaft ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft bei Reaktionen, die die Vervielfältigung bestimmter Probenmoleküle, insbesondere PCR (Polymerase-Kettenreaktion) umfassen.

Während der Reaktionszeit, während der die Reaktion der ersten und zweiten Reagenzien auf dem Chip stattfindet, kann ein Temperaturprofil durchgefahren werden. Derartige Temperaturzyklen sind z. B. bei typischen PCR-Zyklen notwendig, um die gewünschte Amplifizierung einzelner DNA-Sequenzen auszulösen. Temperaturprofile lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgrund der geringen Baugröße des zu verwendenden Devices besonders gut durchführen, da aufgrund der geringen thermischen Masse des Devices eine schnelle Reaktion auf die Heizleistung gewährleistet ist. Aufgrund der geringen thermischen Masse kann eine Kühlung ggf. rein passiv erfolgen.

Die unspezifische Bindung an den Spots, die insbesondere durch van-der-Waals-Kräfte vermittelt wird, läßt sich auf einfache Weise durch Eintrocknen der Reagenzien an den Spots erzeugen.

Sind die einzelnen Spots in Form eines eindimensionalen oder zweidimensionalen Arrays angeordnet, so ist eine Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens leicht durchzuführen. Im speziellen, wenn eine optische Auslesung an den Spots stattfinden soll, ob eine spezifische Reaktion stattgefunden hat oder nicht, ist eine Anordnung in einem Array vorteilhaft.

Bei einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens wird nach Ablauf einer typischen Reaktionszeit oder während der Reaktion eine ortsaufgelöste Untersuchung durchgeführt, ob und/oder an welchen Spots eine spezifische Reaktion innerhalb des Probenlösungstropfens stattgefunden hat. Dazu sind z. B. an den Spots erste Reagenzien eingetrocknet, die mit den zweiten Reagenzien in der Probenlösung eine spezifische Reaktion eingehen können. Zum Beispiel im Fall von biologischen Makromolekülen als erste und zweite Reagenzien kann die Hybridisierung der ersten und zweiten Reagenzien nachgewiesen werden.

Bei einer Weiterbildung enthalten die Spots als erste Reagenzien zum einen Primer zur Amplifikation von DNA-Sequenzen in der Probenlösung und zum anderen biologische Makromoleküle, die mit den Amplifikaten hybridisieren können. Diese biologischen Makromoleküle können z. B. farbstoffmarkiert sein, so daß in an sich bekannter Weise die Hybridisierung nachgewiesen werden kann.

Bei einer anderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Spots verwendet, in denen Primer zur Amplifikation von DNA-Sequenzen unspezifisch gebunden sind. Nachdem die Probenlösung mit zu amplifizierenden DNA- Sequenzen mit den Spots in Verbindung gebracht worden ist und eine Amplifikation in den einzelnen Probenlösungstropfen stattgefunden hat, werden die Probenlösungstropfen mit den amplifizierten DNA-Sequenzen auf dem Festkörperchip weiter zu einem Analysebereich transportiert, in dem in an sich bekannter Weise die Hybridisierung der amplifizierten DNA-Sequenzen in der Probenlösung mit weiteren biologischen Makromolekülen untersucht werden kann.

Der Analysebereich kann z. B. einen oder mehrere Analysepunkte umfassen, an denen unterschiedliche biologische Makromoleküle immobil gebunden sind, so daß an unterschiedlichen Punkten des Analysebereiches unterschiedliche Makromoleküle zur Hybridisierung bereitstehen. Die biologischen Makromoleküle an den Analysepunkten werden im folgenden auch als Sondenmoleküle bezeichnet. Es wird eine ortsaufgelöste Messung des Analysebereiches vorgenommen, so daß festgestellt werden kann, an welchen Analysepunkten eine spezifische Reaktion der amplifizierten DNA-Sequenzen mit den biologischen Makromolekülen der Analysepunkte stattgefunden hat. Allgemein ist die Untersuchung von Hybridisierungen biologischer Makromoleküle mit Hilfe eines als Microarray ausgestalteten Analysebereiches ist aus DE 101 36 008 A1 bekannt.

Ebenso ist es jedoch möglich, daß der Analysebereich Spots umfaßt, die unspezifisch gebundene Makromoleküle aufweisen, so daß auch im Analysebereich das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann.

Umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe von Primern, die an den Spots gebunden sind, so ist durch das erfindungsgemäße Verfahren sichergestellt, daß die einzelnen Reaktionen mit unterschiedlichen Primern sich nicht beeinflussen. Es ist also eine Multiplex-PCR möglich, bei der mehrere DNA-Abschnitte amplifiziert werden, ohne daß eine gegenseitige Beeinflussung das Ergebnis beeinflussen würde.

Im Falle der Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion kann die Probenlösung die zur PCR notwendige Polymerase enthalten. Besonders vorteilhafterweise kann die Polymerase jedoch zusätzlich zu den Primern, die an den Spots unspezifisch gebunden sind, an den Spots selbst vorhanden sein.

Die Auslesung, die entweder direkt an den Spots oder in einem separaten Analysebereich erfolgt, kann z. B. optisch durch Untersuchung einer möglichen Farbreaktion, Anlagerung spezifischer Oligonukleotidsequenzen oder UV-Absorption erfolgen. Derartige optische Meßverfahren sind einfach durchzuführen und speziell bei regelmäßigen Anordnungen leicht zu automatisieren.

Sowohl die ersten als auch die zweiten Reagenzien können biologische Makromoleküle sein, deren spezifische Reaktion miteinander untersucht werden soll. Zum Beispiel können Antigen-Antikörper-Reaktionen untersucht werden.

Die Auflösung der unspezifisch gebundenen ersten Reagenzien in den Probenlösungstropfen kann z. B. durch Applikation mechanischer Energie an den Chip erreicht werden. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Ultraschall, der z. B. mit Hilfe von piezoelektrischen Volumenschwingern in an sich bekannter Weise erzeugt werden kann. Die piezoelektrischen Volumenschwinger werden dazu unterhalb des Chips z. B. in Form eines Arrays ggf. unter Einsatz einer Koppelflüssigkeit angeordnet. So können die einzelnen Spots durch einzelne piezoelektrische Volumenschwinger angesprochen werden und eine lokale Auswahl der einzelnen Spots zur Durchmischung ist möglich. Auf die gleiche Weise können auch Interdigitaltransducer anstelle der piezoelektrischen Volumenschwinger eingesetzt werden.

Besonders einfach und vorteilhaft ist die Verwendung von Oberflächenschallwellen, die auf der Festkörperoberfläche erzeugt werden, wobei durch geeignete Auswahl des Schallpfades auch hier einzelne Spots ausgewählt werden können. Die Oberflächenschallwelle überträgt ihren Impuls auf die Flüssigkeit des Probenlösungstropfens, die dadurch in Bewegung versetzt wird. Diese Bewegung fördert das Auflösen der unspezifisch gebundenen ersten Reagenzien der Spots. Zusätzlich wird eine Durchmischung des Probenlösungstropfens erreicht, wodurch die optimale Verteilung und Dynamik der Reaktion gewährleistet ist. Allgemein ist die Manipulation kleiner Flüssigkeitsmengen mit Oberflächenschallwellen und deren Erzeugung z. B. mit Interdigitaltransducern in DE-A-100 55 318 beschrieben.

Ebenso kann eine Oberflächenschallwelle auf einer separaten piezoelektrischen Oberfläche mit Hilfe eines oder mehrerer Interdigitaltransducer erzeugt werden und das piezoelektrische Material entweder direkt oder über eine entsprechende Koppelflüssigkeit mit der Festkörperoberfläche in Kontakt gebracht werden, auf der die ersten Reagenzien unspezifisch gebunden sind. Bei einer solchen Ausgestaltung kann als Festkörperoberfläche z. B. ein Glaschip verwendet werden.

Bei einer vorteilhaften Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Festkörperoberfläche verwendet, die hydrophile Ankerbereiche an den Stellen der Spots oder in direkter Nachbarschaft dazu aufweist. Durch solche im Vergleich zu ihrer Umgebung hydrophilen Bereiche ist die Lokalisierung der Probenlösungstropfen an den Spots sichergestellt. Eine Probenlösung, die sich z. B. frei über die Festkörperoberfläche bewegt, wird durch die hydrophilen Ankerpunkte auf den Spots gehalten. Durch die hydrophilen Eigenschaften ist der Benetzungswinkel an den Spots gegenüber der Umgebung unterschiedlich, so daß die Oberflächenspannung des Tropfens die Lokalisierung fördert. Besonders sicher und einfach ist eine Ausgestaltung, bei der um die Spots ringförmige, im Vergleich zu ihrer Umgebung und somit auch im Vergleich zu den umschlossenen Spots hydrophile Bereiche vorgesehen sind. Die ringförmigen Bereiche halten einen Tropfen, der sich auf dem Spot befindet, an seinem Rand und ermöglichen ein größeres Tropfenvolumen bei gleichen Außenmaßen.

Im Vergleich zu ihrer Umgebung hydrophile Bereiche lassen sich z. B. durch Silanisierung der umgebenden Oberfläche erhalten, die dadurch hydrophob wird.

Die Probenlösungstropfen lassen sich auf verschiedene Weise zu den Spots bewegen. Zum Beispiel kann der Impulsübertrag von Oberflächenschallwellen eingesetzt werden, um die Probenlösungstropfen an die gewünschten Spots zu bringen bzw. auf der Oberfläche zu verteilen.

Bei einer besonders einfachen und sicheren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt eine Festkörperoberfläche zum Einsatz, die hydrophile Bereiche an den bzw. in der unmittelbaren Nachbarschaft der Spots aufweist, z. B. ringförmige Bereiche. Ein Probenlösungsvolumen wird auf den Chip aufgebracht und unter Ausnutzung der Schwerkraft, z. B. durch einfaches Schrägstellen des Chips über die Festkörperoberfläche bewegt. An den hydrophilen Ankern bleiben einzelne Probenlösungstropfen zurück. Durch die definierte Größe der hydrophilen Bereiche ist die Größe der einzelnen Probenlösungstropfen im wesentlichen vorbestimmt. Mit diesem Aufbringungsschritt ist sehr einfach eine optimale Verteilung der Probenlösung in einzelnen separierten Probenlösungstropfen an den Spots zu erreichen.

Bei einer anderen Ausgestaltung wird ein Probenlösungsvolumen mit Hilfe einer Pipette oder Spritze durch Anwendung von hydrostatischem Druck, der damit erzeugt wird, über die Probenoberfläche bewegt. Wie im Falle der Ausgestaltung, bei der der Chip schräg gestellt wird, bleiben an den hydrophilen Ankern einzelne Probenlösungstropfen zurück.

Ein größeres Probenvolumen kann auch durch Impulsübertrag von Oberflächeschallwellen über eine Probenoberfläche mit hydrophilen Ankerbereichen bewegt werden, an denen dann wie beschrieben einzelne Probenlösungstropfen zurückbleiben.

Eine weitere Möglichkeit zur Aufbringung der Probenlösungstropfen sieht vor, daß ein größeres Probenlösungsvolumen auf den Chip aufgebracht wird und durch Applikation von entsprechend gerichteten Oberflächenschallwellen aufgeteilt wird, um einzelne Probenlösungstropfen zu bilden, die an den Spots lokalisiert sind.

Der ggf. stattfindende Transport der Probenlösungstropfen mit den Produkten der Reaktion zwischen ersten und zweiten Reagenzien zu dem Analysebereich kann ebenfalls durch Impulsübetrag von Oberflächenschallwellen bewirkt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf einer freien Oberfläche mit entsprechenden Spots durchgeführt werden. Eine besondere Ausgestaltung umfaßt jedoch die zusätzliche Bereitstellung eines Deckels oberhalb der Festkörperoberfläche in einem vorbestimmten Abstand und das Einbringen der Probenlösung zwischen die Festkörperoberfläche mit den Spots und den Deckel. Durch den zusätzlichen Deckel ist ein Schutz des Systems während der Untersuchung und Reaktion gewährleistet.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn der Abstand zwischen Festkörperoberfläche mit den Spots und dem Deckel derart gering gewählt wird, daß ein an einem Spot lokalisierter Flüssigkeitstropfen auch den Deckel berührt. Bei einem Tropfendurchmesser von z. B. 100 μm bis einigen mm beträgt die Höhe des Tropfens einige 10 μm bis einige mm, wodurch der Abstand des Deckels von der Festkörperoberfläche für diese besondere Ausgestaltung festgelegt wird. Der optimale Abstand kann z. B. in einfachen Vorversuchen ermittelt werden.

Bei einer besonders günstigen Verfahrensführung wird ein Deckel eingesetzt, der derartige Benetzungseigenschaften aufweist, daß zumindest die Bereiche, die registergerecht den Spots auf der Festkörperoberfläche gegenüberliegen, hydrophil im Vergleich zu ihrer Umgebung sind. So ist eine zusätzliche Lokalisierung der Probenlösungstropfen an den Spots gewährleistet.

Bei Verwendung eines Deckels gegenüberliegend zu der Festkörperoberfläche kann bei einer einfachen Verfahrensführung vorgesehen sein, daß dieser Deckel Öffnungen aufweist, die registergerecht gegenüber den Spots auf der Festkörperoberfläche angeordnet sind. Die Probenlösung kann dann durch diese Öffnungen einfach und präzise auf die Spots appliziert werden. Dazu muß z. B. nur auf die der Festkörperoberfläche mit den Spots abgewandte Oberfläche des Deckels ein Probenlösungsvolumen aufgebracht werden, das dann durch die Öffnungen z. B. durch Ausnutzung der Kapillarkräfte hindurch fließt und direkt an den Spots landet. Vorteilhafterweise wird eine derartige Probenvolumenmenge gewählt, daß nach dieser Befülloperation keine Probenlösung mehr auf der der Festkörperoberfläche mit den Spots abgewandten Seite des Deckels verbleibt.

Ein Deckel kann auch so funktionalisiert werden, daß mit ihm die Reaktionsprodukte analysiert werden können. Zum Beispiel können auch am Deckel Spots aufgebracht sein, die Bestandteile enthalten, die komplementär zu dem erwarteten Reaktionsprodukt zwischen ersten und zweiten Reagenzien sind und somit zur Bindung und Analyse der Reaktionsprodukte verwendet werden, wie es oben für den analogen Fall eines separaten Analysebereiches auf der Festkörperoberfläche beschrieben ist.

Um die Gefahr des Verdampfens des Probenlösungstropfens auf dem Spot zu verringern oder zu beseitigen, werden bei einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Probenlösungstropfen mit Öl bedeckt. Auf diese Weise ist durch das Öl auf dem Probenlösungstropfen ein abgeschlossenes Reaktionsvolumen in dem Probenlösungstropfen gebildet, wodurch die Reaktion nicht durch das Verdampfen des Probenlösungstropfenvolumens verfälscht wird. Durch die Beschichtung mit Öl wird weiterhin sichergestellt, daß sich die einzelnen Probenlösungstropfen nicht vermischen können. Bei Verwendung eines zusätzlichen Deckels mit Öffnungen gegenüber der Spots kann das Öl zusätzlich zum Verschluß der Öffnungen eingesetzt werden.

Bei einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung eines Deckels kann dieser Deckel auf der der Festkörperoberfläche mit den Spots zugewandten Seite lipophil ausgestaltet sein, so daß eine optimale Befüllung des Raumes zwischen Festkörperoberfläche mit den Spots und dem Deckel mit dem die Verdampfung verhindernden Öl gewährleistet ist. Je nach Ausgestaltung ist dabei die entsprechende Oberfläche des Deckels vollständig lipophil ausgestaltet oder nur in Bereichen um die Probenlösungstropfen lokalisierende hydrophile Bereiche herum.

Bei allen beschriebenen Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, daß zusätzlich einzelne Spots und/oder Analysepunkte mit Bestandteilen versehen sind, deren Reaktionsverhalten mit den zu untersuchenden Materialien bekannt ist. Auf diese Weise kann eine Positiv- und/oder Negativkontrolle des Reaktionsverhaltens durchgeführt werden.

Ein erfindungsgemäßer Analysechip zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Analyseverfahrens weist eine Festkörperoberfläche auf, auf der sich zumindest zwei Spots mit unterschiedlichen Reagenzien befinden, die unspezifisch an der Festkörperoberfläche gebunden sind. Die Festkörperoberfläche weist derart modulierte Benetzungseigenschaften auf, daß an den Spots ein anderer Benetzungswinkel vorliegt als in ihrer Umgebung. Weiterhin weist der erfindungsgemäße Analysechip eine Einrichtung zur Auflösung der unspezifisch gebundenen Reagenzien auf.

Ein erfindungsgemäßer Analysechip kann einige mm² bis einige cm² groß sein und z. B. aus piezoelektrischem Material oder Glas bestehen. Die Anzahl der Spots kann bis zu einige 1000 betragen, wobei der Abstand z. B. einige 100 μm bis einige mm sein kann.

Die Modulation der Benetzungseigenschaften kann vorteilhafterweise wie oben bereits für das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben durch hydrophile ringförmige Bereiche erzeugt werden. Zum Auflösen der unspezifisch gebundenen Reagenzien kann z. B. eine Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtung eingesetzt werden, die Oberflächenschallwellen in der oben für das erfindungsgemäße Verfahren bereits beschriebenen Weise nutzt. Diese Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtung kann z. B. einen oder mehrere Interdigitaltransducer auf der Festkörperoberfläche umfassen.

Um ggf. ein gewünschtes Temperaturprofil während der spezifischen Reaktion durchfahren zu können, wie es z. B. bei PCR-Reaktionen notwendig ist, kann auf dem Analysechip eine Heizeinrichtung, z. B. ein Widerstandsheizer vorgesehen sein. Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist diese Heizeinrichtung derart ausgestaltet, daß ein lokales Erhitzen einzelner Spots auf dem Analysechip möglich ist. Dazu können z. B. entsprechend lokalisierte Heizeinrichtungen, z. B. Widerstände, unterhalb der Spots an der Unterseite des Analysechips vorgesehen sein.

Zur Messung der Temperatur kann ein Temperatursensor an dem Analysechip vorgesehen sein, z. B. ein Platinthermometer.

Die unspezifisch gebundenen Reagenzien in den Spots des Analysechips können biologische Makromoleküle umfassen. Die Spots können in Form eines ein- oder zweidimensionalen Arrays angeordnet sein und/oder die unspezifisch gebundenen Reagenzien in den Spots eingetrocknet sein.

Bei einer Ausführungsform des Analysechips zum Einsatz bei Polymerase-Kettenreaktionen umfassen die unspezifisch gebundenen Reagenzien der Spots Primer zur Durchführung der PCR. Gegebenenfalls können die Spots auch Polymerase zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion umfassen.

Gegebenenfalls können einzelne Spots auf dem Analysechip vorgesehen sein, die Bestandteile enthalten, deren Reaktionsverhalten wohlbekannt ist, so daß sie als Positiv- und/oder Negativkontrolle des Reaktionsverhaltens eingesetzt werden können.

Bei einer Ausgestaltung des Analysechips, der mit einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden soll, bei dem ein externer Analysebereich eingesetzt wird, weist der Analysechip zusätzlich zu den Spots mit den unspezifisch gebundenen ersten Reagenzien einen Analysebereich auf, der z. B. in Form eines Microarrays angeordnet sein kann und einzelne Analysepunkte umfaßt, die mit unterschiedli chen immobil gebundenen Bestandteilen funktionalisiert sind, deren Reaktionsverhalten mit den Produkten der Reaktion zwischen den Materialien in den Probenlösungstropfen und den Spots mit den ersten Reagenzien untersucht werden kann.

Ebenso kann der Analysebereich des Analysechips Spots mit unspezifisch gebundenen ersten Reagenzien umfassen, so daß auch im Analysebereich das erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden kann.

Diese geschilderten vorteilhaften Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Analysechips bieten die oben bereits bei der Beschreibung der entsprechenden Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens beschriebenen Vorteile.

Eine erfindungsgemäße Analysevorrichtung zur Verwendung mit einem erfindungsgemäßen Analysechip weist einen Chiphalter für den Analysechip, einen Deckel in einem vorbestimmten Abstand zu dem Analysechip und zumindest eine Befüllöffnung zur Befüllung des Raumes zwischen einem in dem Chiphalter gehaltenen Analysechip und dem Deckel auf.

Mit einer solchen Analysevorrichtung läßt sich das erfindungsgemäße Analyseverfahren auf einfache Weise durchführen. Der Analysechip wird in den Chiphalter eingesetzt und das System mit dem Deckel in vorbestimmtem Abstand abgeschlossen. Eine Befüllung mit Probenflüssigkeit und/oder Öl kann durch die Befüllöffnungen geschehen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Analysevorrichtung weist der Deckel Öffnungen auf, die registergerecht den Spots auf einem eingelegten Analysechip gegenüberliegen, vorzugsweise in der Anordnung eines zweidimensionalen Arrays.

Der Deckel kann eine dem Chiphalter gegenüberliegende Oberfläche aufweisen, die derart benetzungsmoduliert ist, daß sich gegenüber den Spots auf einem eingelegten Analysechip hydrophile Bereiche befinden. Bei einer anderen Ausführungs form kann der Deckel auf der dem Chiphalter zugewandten Oberfläche lipophile Bereiche aufweisen oder vollständig lipophil ausgestaltet sein. Der vorbestimmte Abstand der Analysevorrichtung kann bei einer bevorzugten Ausführungsform derart ausgewählt sein, daß ein Probenlösungstropfen, der auf einem Spot auf einem eingelegten Analysechip lokalisiert ist, sowohl den Deckel als auch den Analysechip berührt.

Um die beschriebene Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens unter Applikation von Ultraschall zur Auflösung der unspezifisch gebundenen ersten Reagenzien zu ermöglichen, kann die erfindungsgemäße Analysevorrichtung zumindest eine Ultraschallwellenerzeugungseinrichtung, vorzugsweise einen Interdigitaltransducer, aufweisen, die derart angeordnet ist, daß sie bei eingelegtem Analysechip unterhalb des Analysechips zu liegen kommt. Bei einer anderen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Analysevorrichtung ist eine Kontaktierungseinrichtung vorgesehen, mit deren Hilfe die elektrische Kontaktierung einer Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtung, vorzugsweise eines Interdigitaltransducers, auf einem eingelegten Analysechip ermöglicht wird, um die beschriebene Auflösung der unspezifisch gebundenen Reagenzien und/oder die Bewegung oder Teilung der Probenlösungstropfen zu ermöglichen.

Bei diesen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Analysevorrichtung können die oben bereits mit Bezug zu den entsprechenden Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens geschilderten Vorteile erreicht werden.

Besonders vorteilhaft lassen sich die erfindungsgemäßen Verfahren, der erfindungsgemäße Analysechip bzw. die erfindungsgemäße Analysevorrichtung zur Analyse der Hybridisierung von biologischen Makromolekülen oder Antigen-Antikörper-Reaktionen einsetzen. Speziell bei diesen Reaktionen ist es vorteilhaft, daß die Reaktion der ersten und zweiten Reagenzien in der flüssigen Phase geschieht.

Eine andere besonders vorteilhafte Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, des erfindungsgemäßen Analysechips bzw. der erfindungsgemäßen Analysevorrichtung umfaßt die PCR (Polymerase-Kettenreaktionen). Bei dieser Anwendung macht sich besonders vorteilhaft bemerkbar, daß in Form der Probenlösungstropfen getrennte Reaktionsvolumina auf kleinstem Raum vorliegen, aber dennoch nur eine Probenflüssigkeit appliziert werden muß, so daß keine aufwendigen Pipettierschritte notwendig sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren, der erfindungsgemäße Analysechip und die erfindungsgemäße Analysevorrichtung werden anhand der beiliegenden Figuren im Detail erläutert. Die Figuren zeigen in schematischer Darstellung und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu entsprechende Ausführungsformen. Dabei zeigt:
1: eine seitliche Querschnittsansicht durch einen erfindungsgemäßen Analysechip während der Durchführung eines erfindungsgemäßen Analyseverfahrens,
2: eine seitliche Querschnittsansicht durch eine Analysevorrichtung während der Durchführung einer anderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens,
3: eine Draufsicht auf einen Schnitt gemäß III-III in 2,
4: eine schematische Darstellung einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens beim Aufbringen der Probenlösungstropfen,
5a: eine seitliche Querschnittsansicht auf eine erfindungsgemäße Analysevorrichtung bei der Durchführung einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
5b: eine seitliche Querschnittsansicht auf eine erfindungsgemäße Analysevorrichtung bei der Durchführung einer Weiterbildung dieser Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens,
5c: eine Draufsicht auf eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Analysevorrichtung,
5d: eine Teilschnittansicht durch die Analysevorrichtung der 5c gemäß Vd-Vd bei der Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
6: eine Schnittansicht durch eine weitere Analysevorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und
7: die Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Analysechips.
Die folgende Schilderung besonderer Ausführungsformen und Ausgestaltungen beschreibt den Einsatz bei PCR-Reaktionen.
1 zeigt einen erfindungsgemäßen Analysechip mit darauf befindlichen Spots 2. Diese Spots enthalten bei dem Beispiel von PCR-Reaktionen unterschiedliche PCR-Primer, die an den Orten der Spots 2 eingetrocknet sind. Die einzelnen Spots können z. B. in einem schachbrettartigen Muster angeordnet sein. Gleichzeitig können auch die für die PCR erforderlichen Nukleotide und die Polymerase auf dem Analysechip 1 an den selben Spots wie die Primer eingetrocknet sein.
In 1 nicht erkennbar sind um die Spots 2 hydrophile ringförmige Bereiche auf der Oberfläche des Analysechips 1 vorgesehen, die als Anker für die Probenlösung 3 dienen. 3 zeigt solche hydrophilen Bereiche einer anderen Ausführungsform in Draufsicht. Durch die hydrophilen Anker wird eine Lokalisierung der Probenflüssigkeit 3 in Tropfenform oberhalb der Spots 2 erreicht.
Typische Volumina für die Probenlösungstropfen 3 liegen von einigen nl bis zu einigen 100 μl. Oberhalb der Probenlösungstropfen 3 ist Öl in Form eines Filmes 4 gezeigt, das die Verdampfung der Probenlösungstropfen 3 verhindert.
Bei der Ausführungsform der 1 besteht der Analysechip 1 aus piezoelektrischem Material und weist einen oder mehrere an sich bekannte Interdigitaltransducer 5 auf, wie er zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen aus der Oberflächenwellenfilterotechnologie bekannt ist und hier daher nur schematisch dargestellt ist. Der Interdigitaltransducer umfaßt ineinander greifende metallische Fingerelektroden. Anlegen eines elektrischen Hochfrequenzfeldes an diese Fingerelektroden bewirkt in an sich bekannter Weise die Erzeugung einer Oberflächenschallwelle in dem piezoelektrischen Material 1 mit einer Ausbreitungsrichtung senkrecht zu den Fingerelektroden. Der bzw. die Interdigitaltransducer ist/sind so angeordnet, daß von ihm bzw. ihnen abgestrahlte Oberflächenschallwellen in Richtung der Spots 2 gerichtet sind.
Die Ausführungsform der 1 kann wie folgt eingesetzt werden.
Die PCR-Primer sind in Spots 2, die in einem schachbrettartigen Muster angeordnet sind, ggf. zusammen mit den für die PCR erforderlichen Nukleotiden und der erforderlichen Polymerase eingetrocknet. Probenlösung für die PCR wird auf den Chip gegeben und verteilt sich derart, daß sie in Form von Tröpfchen auf den durch die getrockneten Primer bezeichneten Spots 2 vorliegt. Dazu dienen die hydrophilen Anker 7, die ringförmig um die Spots 2 angeordnet sind. Die Probenlösung kann z. B. mit Hilfe eines Pipettierroboters an die Orte der Spots 2 gebracht werden. Mit dem Device der 1 ist das Aufbringen der Probe auch unter Ausnutzung akustischer Oberflächenschallwellen möglich. Ein größeres Probenvolumen wird auf den Analysechip gebracht und mit Hilfe einer durch den Interdigitaltransducer 5 erzeugten Oberflächenschallwelle durch deren Impulsübertrag über die Oberfläche des Analysechips 1 bewegt. Die hydrophilen Anker bewirken, daß von dem über sie bewegten Probenlösungsvolumen Probenlösungstropfen 3 zurückbleiben. Ebenso kann durch Verwendung des Impulsübertrages einer entsprechend gerichteten Oberflächenschallwelle eine Bewegung einzelner Probenlösungstropfen 3 an gewünschte Spots 2 oder eine Teilung eines größeren Probenlösungsvolumens in einzelne kleinere Probenvolumina 3 erfolgen.
Nachdem die Probenlösungstropfen 3 an den gewünschten Orten der Spots 2 appliziert worden sind, werden in einem nächsten Schritt die in den Spots 2 eingetrockneten Reagenzien in den Probenlösungstropfen 3 aufgelöst. Dazu werden bei der gezeigten Ausführungsform akustische Oberflächenschallwellen eingesetzt, die z. B. mit dem zumindest einen Interdigitaltransducer 5 erzeugt werden können. Durch die auf diese Weise in den Probenlösungstropfen 3 erzeugte Bewegung wird die Auflösung der in den Spots 2 eingetrockneten Reagenzien bewirkt. So ist sichergestellt, daß die Reaktion zwischen den Reagenzien der Probenlösungstropfen 3 und der Spots 2 in der flüssigen Phase stattfindet.
Alternativ zu dem auf dem Analysechip 1 vorgesehenen Interdigitaltransducer 5 können die Wellen auch über ein Kopplungsmedium von externen Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtungen auf den Analysechip 1 übertragen werden.
Anschließend werden die Probentropfen 3 wie in 1 sichtbar mit Öl 4 überdeckt, ohne daß sie von den hydrophilen Ankern wegbewegt werden würden. So ist das Verdampfen der Probenlösungstropfen 3 während der nachfolgenden PCR-Reaktion wirksam verhindert. Bei der in 1 gezeigten Ausgestaltung werden die Tropfen einzeln mit Öl überdeckt. Das Öl kann in analoger Weise wie die Probenlösungstropfen 3 aufgebracht werden.
Mit Hilfe einer in den Figuren nicht gezeigten Analysechipheizung, z. B. einem resistiven Heizer, und einer Temperaturmessung, z. B. mit Hilfe eines Platinthermometers (Pt 100), oder mit einer externen Heizung und Temperaturmessung wird im Anschluß das für eine PCR-Reaktion notwendige Temperaturprofil durchgefahren, um die spezifische Reaktion zwischen den jetzt in der Probenlösung 3 gelösten Reagenzien der Spots 2 und den bereits in der Probenlösung vorhandenen Reagenzien in der gewünschten Form zu ermöglichen. Gegebenenfalls wird an un terschiedlichen Spots eine unterschiedliche Temperatur erzeugt, indem z. B. ein entsprechender Temperaturgradient eingestellt wird, so daß die Zyklustemperaturen für unterschiedliche Spots 2 verschieden sind. Durch die geringe thermische Masse des Analysechips 1 ist eine schnelle Temperaturreaktion auf Applikation von Heizleistung gewährleistet.
Nach der spezifischen Reaktion in dem Probenlösungstropfen 3 wird z. B. durch entsprechende optische Messungen in an sich bekannter Weise untersucht, ob eine spezifische Reaktion stattgefunden hat oder nicht. Auf diese Weise kann z. B. festgestellt werden, an welchem Spot 2 und insofern bei welchen Reagenzien eine PCR-Amplifikation und spezifische Reaktion mit den in der Probenlösung 3 ursächlich vorhandenen Reagenzien stattgefunden hat.
2 zeigt eine andere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Oberhalb des Analysechips 1, der ebenfalls einen Interdigitaltransducer 5 auf seiner Oberfläche umfassen kann, der in 2 nicht gesondert gezeigt ist, befindet sich ein Deckel 6, der z. B. eine lipophil funktionalisierte Oberfläche 60 gegenüber dem Analysechip 1 aufweist.
Nachdem die Probenlösungstropfen in der bereits beschriebenen Weise auf den Analysechip 1 bzw. die darauf befindlichen Spots 2 aufgebracht worden sind, wird Öl 4 in den Zwischenraum zwischen Deckel 6 und Analysechip 1 eingebracht. Durch die lipophile Funktionalisierung der Oberfläche 60 ist eine günstige Verteilung des Öls in dem Zwischenraum gewährleistet. Bei einem Tropfendurchmesser von typischerweise einigen 100 μm bis einigen mm beträgt die Höhe eines Tropfens einige 10 μm bis einige mm und der Abstand zwischen Deckel und Chip wird größer oder etwa gleich der Höhe eines Tropfens 3 gewählt.
Dieser Abstand kann auch derart gering gewählt sein, daß die Probenlösungstropfen 3 den Deckel 6 berühren, der dann nicht vollständig lipophil ausgestaltet ist. Ein solcher Deckel kann z. B. eine Fluidik enthalten, die die Probenlösung durch Berei che bevorzugter Benetzung an bevorzugten Orten hält bzw. deren Bewegung nur entlang bestimmter Bahnen ermöglicht.
3 zeigt eine Draufsicht auf einen Schnitt gemäß III-III der 2, in der auch die hydrophilen Anker 7 um die Spots 2 herum sichtbar sind, wobei die Probenlösungstropfen 3 in der 3 nicht gezeigt sind. Die hydrophilen Bereiche 7 entstehen z. B. durch Silanisierung der umgebenden Bereiche, die dadurch hydrophob werden.
Durch die hydrophile Strukturierung der Oberfläche 60 kann sehr einfach der ganze Spalt mit Öl gefüllt werden, um die Verdampfung der Probenlösungstropfen 3 wirksam zu verhindern.
Die mit der Ausführungsform der 2 und 3 durchzuführenden folgenden Schritte entsprechen in analoger Weise dem mit Bezug zu 1 geschilderten Verfahren und werden hier nicht noch einmal aufgeführt.
4 zeigt eine alternative einfache Möglichkeit zur Beladung der einzelnen hydrophilen Anker 7 mit den darin befindlichen Spots 2. Ein großer Probenlösungstropfen 8 wird z. B. durch Schrägstellen des Analysechips 1 über die Festkörperoberfläche bewegt. Kleine Probenlösungstropfen 3 bleiben an den hydrophilen Ankern 7 hängen.
Bei der in 4 gezeigten Ausführungsform sind die hydrophilen Anker 7 beispielhaft derart ausgestaltet, daß sie jeweils zwei Spots 2 umfangen und sich somit zwei Spots innerhalb eines Probenlösungstropfens 3 befinden, um eine Reaktion der Reagenzien mehrerer Spots mit den Reagenzien des Probenlösungstropfens zu ermöglichen.
5a zeigt eine Ausgestaltung, bei der ein strukturierter Deckel 9 zur Beladung eingesetzt wird. Der Deckel 9 weist Öffnungen 10 auf, die registergerecht über den Spots 2 des Analysechips 1 angeordnet sind. Probenlösung 11 wird auf den struk turierten Deckel 9, der ggf. Ränder 19 aufweist, gegeben. Die Probenlösung zieht sich durch Kapillarkraft in die Kanäle 10 und bildet einen Tropfen 3 an der Deckelunterseite, der den Analysechip 1 berührt und so auf die Oberfläche des Chips gezogen wird. Die Tropfengröße läßt sich durch geeignete Wahl der Benetzungseigenschaften sowohl des Deckels 9 als auch des Analysechips 1 einstellen. Idealerweise wird nur so viel Probenlösung 11 hinzugegeben, daß es zu keinem Überstand der Probenlösung auf dem Deckel 9 kommt, wenn die Probenlösung durch die Kanäle 10 hindurch getreten ist.
5b zeigt denselben Querschnitt mit Öl 4 gefüllt. Das Öl 4 dient der Verhinderung der Verdampfung der Probenlösungstropfen 3 während der PCR-Zyklen. Das Öl 4 kann in den Raum zwischen Deckel 9 und Analysechip 1 entweder seitlich oder durch eine separate Öffnung im Deckel gelangen. Bei der gezeigten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich Öl 14 auf dem Deckel 9 verwendet, um die Kanäle 10 abzudecken.
5c zeigt eine Draufsicht auf einen entsprechend ausgestalteten und strukturierten Deckel 9. Sichtbar sind die Öffnungen 10 zur Befüllung des Probenraumes zwischen Deckel 9 und Analysechip 1 mit Probenflüssigkeit. Weiterhin sind in der Ansicht der 5c die Befüllöffnungen bzw. Entlüftungsöffnungen 12 und 13 erkennbar, durch die das Öl 4 in den Probenraum eingebracht werden kann.
5d zeigt die Anordnung der 5c im Querschnitt gemäß Vd-Vd. Dabei ist in der Teilansicht der 5d nur der strukturierte Deckel 9 ohne den darunter befindlichen Analysechip 1 und die darauf befindlichen Probenlösungstropfen 3 gezeigt. Bei der dargestellten Ausführungsform weist der Deckel 9 eine zusätzliche Stufe 15 auf, die den Bereich der Öffnungen 10 umfaßt. Mit dieser Ausführungsform kann der Bereich, der von der Stufe 15 umfaßt wird, leicht mit Probenlösung gefüllt werden, die dann durch die Kanäle 10 in beschriebener Weise auf den Analysechip geleitet wird. Durch die zusätzliche Stufe ist gewährleistet, daß keine Probenlösung durch die Befüllöffnungen 12 und 13 in unkontrollierter Weise zu dem Analysechip gelangt. Nachdem die Probenlösung durch die Kanäle 10 zum Analysechip gelangt ist, wird in beschriebener Weise Öl 4 auf den Deckel 9 aufgebracht.
6 zeigt in seitlicher Querschnittsansicht den generellen Aufbau einer erfindungsgemäßen Analysevorrichtung. Erkennbar ist der Analysechip 1, dessen Komponenten in 6 der Übersichtlichkeit halber nicht im Detail dargestellt sind. Der Analysechip entspricht z. B. einer Ausführungsform, wie sie mit Bezug zu 1 erläutert ist.
Nur schematisch dargestellt sind Probenlösungstropfen 3 auf der Oberfläche des Analysechips 1. Der zumindest eine Interdigitaltransducer, der auf dem Analysechip zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen vorgesehen ist, wird mit Hilfe des Kontaktfederstiftes 30 kontaktiert, der durch den Deckel 6 hindurch reicht. An dem Kontaktfederstift 30 wird über die Zuleitungen 38 das entsprechende Hochfrequenzsignal zur Anregung der Oberflächenschallwellen mit dem Interdigitaltransducer eingeleitet. Oberhalb des Analysechips 1 befindet sich der Deckel 6 mit einer Öffnung 10 zur Befüllung des Spaltes zwischen Analysechip 1 und Deckel 6 mit Probenlösung. Die gesamte Anordnung wird in einem Gehäuse 36 gehalten. Unterhalb des Analysechips 1 sind bei der dargestellten Ausführungsform ein Infrarotthermometer 32 zur Feststellung der aktuellen Temperatur und eine optische Detektionseinrichtung 34 zur optischen Detektion von Reaktionsereignissen geeigneter z. B. fluoreszenzmarkierter Bestandteile vorgesehen.
Die optische Detektionseinrichtung kann z. B. eine Fotodiode oder eine Glasfaser umfassen, die zu einem entsprechenden optischen Detektionsgerät führt.
7 zeigt eine weitere Ausgestaltung eines Analysechips 1. In der schematischen Draufsicht ist ein Interdigitaltransducer 5 mit den ineinander greifenden Fingerelektroden 50 erkennbar, wie er aus der Oberflächenwellenfiltertechnologie bekannt ist. Der Übersichtlichkeit halber ist nur eine geringe Anzahl von ineinander greifenden Fingern als Schema dargestellt. Mit 2 sind einzelne Spots bezeichnet, die in beschriebener Weise eingetrocknete PCR-Primer enthalten. Das Hybridisie rungsfeld 40 besteht aus einer Anordnung von Analysepunkten 42, die in Art eines Microarrays angeordnet sind und immobilisierte Sondenmoleküle umfassen. Diese können für unterschiedliche Analysepunkte 42 unterschiedlich sein.
Eine solche Ausführungsform, wie sie den 6 und 7 entspricht, erlaubt die folgende Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Sowohl PCR als auch Hybridisierung finden auf dem Analysechip 1 statt, der z. B. 20 mm × 20 mm groß ist. In dem Analysechip 1 ist ein Heizwiderstand integriert, der mit den Methoden der Halbleitertechnologie kostengünstig aufgebracht werden kann. Ein oder mehrere Interdigitaltransducer 5 befinden sich auf dem Analysechip 1 zur Auflösung von Reagenzien, die auf dem Analysechip getrocknet vorgelegt sind, sowie zur Bewegung von Reagenzien und zum Mischen während der Hybridisierung. Der Analysechip 1 ist ein Einwegprodukt um Kontamination auszuschließen und befindet sich in einem Gehäuse 36, wobei die Zuführung und Aufreinigung der Probenlösung im Gehäuse integriert sein können. Die Analysevorrichtung enthält einen Infrarotsensor 32 zur Temperaturmessung sowie einen Sensor 34 zur optischen Auslesung der in dem Hybridisierungsfeld ggf. stattfindenden Reaktionen, z. B. durch Auslesung eines entsprechenden Fluoreszenzsignales in an sich bekannter Weise. Ein Hochfrequenzgenerator zur Anregung der akustischen Oberflächenwellen ist über die schematisch dargestellte Zuleitung 38 mit dem Kontaktfederstift 30 verbunden, der die Hochfrequenz zu dem Interdigitaltransducer 5 leitet. Der Analysechip 1 kann einfach ausgewechselt werden, da die Kontaktierung nur über einen Kontaktfederstift 30 erfolgt.
Im ersten Schritt wird z. B. medizinisches Probenmaterial durch den Kanal 10 in das Gehäuse 36 pipettiert und dort aufgereinigt. Die so gereinigte Ziel-DNA erreicht durch Kapillarkraft den Analysechip 1, wo sie mittels akustischer Oberflächenwellen geeignet angeordneter Interdigitaltransducer in mehrere Probentropfen 3 aufgeteilt wird. Die Probentropfen werden ebenfalls mittels entsprechend angeordneter Interdigitaltransducer zu verschiedenen Spots 2 bewegt, auf denen unterschiedliche PCR-Primer und Polymerase unspezifisch gebunden sind. Akustische Oberflächenwellen, die mit dem Interdigitaltransducer 5 erzeugt werden, lösen PCR-Primer und Polymerase der Spots in dem medizinischen Probenmaterial auf und erzeugen so die PCR-Lösung. Anschießend wird die PCR-Lösung mit Öl überschichtet, um eine Verdampfung während der Reaktion zu verhindern. Nun wird das PCR-Protokoll zur spezifischen Vervielfältigung der DNA durchgeführt. Ist für den diagnostischen Test nur die Gegenwart eines bestimmten DNA-Stranges nachzuweisen, so wird nach jedem PCR-Zyklus das entsprechende Signal gemessen. Eine Positivkontrolle kann z. B. erfolgen, indem ein Primerpaar zugegeben wird, das humane DNA amplifiziert, die in der medizinischen Probe immer vorhanden ist.
Ist eine weitere Spezifizierung des Amplifikats durch Hybridisierung erforderlich, so wird die mit Öl überdeckte PCR-Lösung wiederum durch Impulsübertrag von Oberflächenschallwellen zu dem Hybridisierungsfeld 40 bewegt, wo sie mit Sondenmolekülen der Analysepunkte 42 hybridisieren kann. Das Hybridisierungssignal wird mit der optischen Detektionsvorrichtung 34 ausgelesen.
Das erfindungsgemäße Verfahren, der erfindungsgemäße Analysechip und die erfindungsgemäße Analysevorrichtung ermöglichen eine Multiplex-PCR, die miniaturisiert abläuft, sich zum Einsatz im Bereich des Point-Off-Care eignet und gleichzeitig mit einer minimalen Anzahl von Pipettierschritten auskommt. Die geringe thermische Masse des Chips bzw. der Analysevorrichtung ermöglicht schnelle PCR-Zyklen. Es wird nur eine geringe Anzahl flüssiger Reagenzien benötigt, da verschiedene Primer an verschiedenen Spots auf dem Chip eingetrocknet sein können, die in Trockenform eine lange Lebensdauer haben und nicht gekühlt aufbewahrt werden müssen. Die Auslesung kann z. B. optisch (Farbreaktion, Anlagerung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, UV-Absorption) für jeden Spot einzeln erfolgen. Auch ein Auslesen nach jedem PCR-Zyklus ist möglich.

Claims

Analyseverfahren für Reagenzien mit folgenden Schritten: a) Bereitstellen einer Festkörperoberfläche, z. B. einer Chipoberfläche, mit mindestens zwei Spots (2), an denen unterschiedliche erste Reagenzien unspezifisch gebunden sind, b) Aufbringen einer Probenlösung mit zweiten Reagenzien derart auf die Festkörperoberfläche, daß sich jeweils einzelne Probenlösungstropfen (3) auf den Spots (2) bilden, vorzugsweise jeweils ein Probenlösungstropfen (3) auf jeweils einem Spot (2), c) Auflösen der unspezifisch gebundenen ersten Reagenzien in den Probenlösungstropfen (3) zur Reaktion der ersten mit den zweiten Reagenzien in der Flüssigphase.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Reaktion zwischen den ersten und zweiten Reagenzien die Vervielfältigung bestimmter Probenmoleküle, insbesondere eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die ersten an den Spots (2) unspezifisch gebundenen Reagenzien Primer zur Polymerase-Kettenreaktion umfassen.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die ersten an den Spots (2) unspezifisch gebundenen Reagenzien zusätzlich Polymerase zur Polymerase-Kettenreaktion umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dem während der Reaktion zwischen den ersten und zweiten Reagenzien ein Temperaturprofil durchfahren wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei dem die unspezifische Bindung an den Spots durch Eintrocknen erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei dem die Spots (2) in Form eines ein- oder zweidimensionalen Arrays angeordnet sind.
Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit folgendem zusätzlichen Schritt: d1) nach Ablauf einer typischen Reaktionszeit oder während der Reaktion ortsaufgelöste Untersuchung, ob und/oder an welchen Spots (2) eine spezifische Reaktion innerhalb des Probenlösungstropfens (3) zwischen den ersten und zweiten Reagenzien stattgefunden hat.
Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, mit folgenden zusätzlichen Schritten: d2) Transport der einzelnen Probenlösungstropfen (3) zu einem Analysebereich (40) mit zumindest einem, vorzugsweise mehreren in einem Array angeordneten Analysepunkten (42), der bzw. die Sondenmoleküle umfassen, e2) nach Ablauf einer typischen Reaktionszeit oder während der Reaktion Untersuchung, ob an dem Analysepunkt bzw. an welchen Analysepunkten (42) eine spezifische Reaktion der Sondenmoleküle mit den in den Probenlösungstropfen (3) enthaltenen Produkten einer spezifischen Reaktion zwischen den ersten und zweiten Reagenzien stattgefunden hat.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Sondenmoleküle biologische Makromoleküle umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei dem die Untersuchung, ob eine spezifische Reaktion stattgefunden hat, eine optische Messung umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei dem die spezifische Reaktion eine Hybridisierung biologischer Makromoleküle oder eine Antigen-Antikörper-Reaktion umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem in Schritt c) zum Auflösen der unspezifisch gebundenen Reagenzien eine Oberflächenschallwelle appliziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem in Schritt b) die Probenlösung (3) durch Applikation von Oberflächenschallwellen in Richtung der Spots (2) bewegt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem in Schritt b) die Probenlösung (3) durch Applikation von Oberflächenschallwellen aufgeteilt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem in Schritt a) eine Festkörperoberfläche bereitgestellt wird, die hydrophile Ankerbereiche (7) für die Probenlösungstropfen (3) an den Stellen der oder direkt benachbart zu den Spots (2) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die hydrophilen Ankerbereiche durch im Vergleich zu ihrer Umgebung hydrophile Ringe (7) um die Spots (2) gebildet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, bei dem in Schritt b) die Probenlösung (3, 8) unter Ausnutzung der Schwerkraft über die Festkörperoberfläche bewegt wird, so daß an den hydrophilen Ankern (7) einzelne Probenlösungstropfen (3) haften bleiben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, bei dem in Schritt b) die Probenlösung (3) durch Applikation von hydrostatischem Druck über die Festkörperoberfläche bewegt wird, so daß an den hydrophilen Ankern (7) einzelne Probenlösungstropfen (3) haften bleiben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, das das Bereitstellen eines Deckels (6, 9) oberhalb der Festkörperoberfläche in einem vorbestimmten Abstand und in Schritt b) das Einbringen der Probenlösung (3) zwischen die Festkörperoberfläche und den Deckel (6, 9) umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 20, bei dem der vorbestimmte Abstand derart gewählt wird, daß ein Probenlösungstropfen (3) auf einem Spot (2) sowohl die Festkörperoberfläche als auch den Deckel (9) berührt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 21, bei dem ein Deckel (6) verwendet wird, der derartige Benetzungseigenschaften aufweist, daß zumindest die Bereiche, die registergerecht den Spots (2) auf der Festkörperoberfläche gegenüberliegen, hydrophil im Vergleich zu ihrer Umgebung sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, bei dem ein Deckel (6) mit einer zur Analyse funktionalisierten Oberfläche verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, bei dem ein Deckel (9) zum Einsatz kommt, der registergerecht gegenüber den Spots (2) auf der Festkörperoberfläche Öffnungen (10) aufweist und die Probenlösung (3) durch die Öffnungen (10) auf die Festkörperoberfläche aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, bei dem die Probenlösungstropfen (3) auf der Festkörperoberfläche zur Verringerung der Verdampfung mit Öl (4) bedeckt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 24 und 25, bei dem Öl (4) zum Verschluß der Öffnungen (10) eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 oder 26, insoweit sie direkt oder indirekt von Anspruch 20 abhängig sind, bei dem ein Deckel (6) zum Einsatz kommt, der auf der der Festkörperoberfläche mit den Spots (2) zugewandten Seite (60) lipophile Bereiche aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, bei dem die unspezifisch gebundenen ersten Reagenzien biologische Makromoleküle umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, bei dem die zweiten Reagenzien biologische Makromoleküle umfassen.
Analysechip zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29 mit – einer Festkörperoberfläche, auf der sich zumindest zwei Spots (2) mit unterschiedlichen Reagenzien befinden, die unspezifisch an der Festkörperoberfläche gebunden sind, – wobei die Festkörperoberfläche derart modulierte Benetzungseigenschaften aufweist, daß an den Spots (2) ein anderer Benetzungswinkel vorliegt als in ihrer Umgebung, und – einer Einrichtung (5) zum Auflösen der unspezifisch gebundenen Reagenzien.
Analysechip nach Anspruch 30, bei dem die unspezifisch gebundenen Reagenzien an den Spots (2) Primer zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) umfassen.
Analysechip nach Anspruch 31, bei dem die unspezifisch gebundenen Reagenzien an den Spots (2) zusätzlich Polymerase zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) umfassen.
Analysechip nach einem der Ansprüche 30 bis 32, bei dem die unspezifisch gebundenen Reagenzien biologische Makromoleküle umfassen.
Analysechip nach einem der Ansprüche 30 bis 33, bei dem um die Spots (2) ringförmige Bereiche (7) vorgesehen sind, die im Vergleich zu ihrer Umgebung hydrophil sind.
Analysechip nach einem der Ansprüche 30 bis 34, bei dem die Einrichtung zum Auflösen der unspezifisch gebundenen Reagenzien zumindest eine Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtung (5) umfaßt.
Analysechip nach Anspruch 35, bei dem die Festkörperoberfläche piezoelektrische Eigenschaften aufweist und die Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtung einen Interdigitaltransducer (5) umfaßt.
Analysechip nach einem der Ansprüche 30 bis 36 mit zumindest einer Heizeinrichtung.
Analysechip nach Anspruch 37, bei dem die Heizeinrichtung bzw. die Heizeinrichtungen derart ausgestaltet sind, daß ein lokales Erhitzen einzelner Spots (2) auf dem Analysechip (1) möglich ist.
Analysechip nach einem der Ansprüche 30 bis 38 mit zumindest einem Temperatursensor.
Analysechip nach einem der Ansprüche 30 bis 39, bei dem die unspezifisch gebundenen Reagenzien eingetrocknet sind.
Analysechip nach einem der Ansprüche 30 bis 40, bei dem die Spots (2) in Form eines ein- oder zweidimensionalen Arrays angeordnet sind.
Analysevorrichtung zur Verwendung mit einem Analysechip gemäß einem der Ansprüche 30 bis 41 mit – einem Chiphalter für den Analysechip (1), – einem Deckel (6, 9) in einem vorbestimmten Abstand zu dem Analysechip (1), und – zumindest einer Befüllöffnung (12, 13) zur Befüllung des Raumes zwischen einem in dem Chiphalter gehaltenen Analysechip (1) und dem Deckel (6, 9).
Analysevorrichtung nach Anspruch 42 mit einer Anordnung von Öffnungen (10) in dem Deckel (9), die registergerecht den Spots (2) auf einem eingelegten Analysechip (1) gegenüberliegen.
Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 42 oder 43, bei der der Deckel (6, 9) eine dem Chiphalter gegenüberliegende Oberfläche (60) aufweist, die derart benetzungsmoduliert ist, daß sich zumindest gegenüber den Spots (2) eines eingelegten Analysechips (1) hydrophile Bereiche befinden.
Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 44, bei der die dem Chiphalter zugewandte Oberfläche (60) des Deckels (6, 9) lipophile Bereiche aufweist.
Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 45, bei der der vorbestimmte Abstand derart ausgewählt ist, daß ein Probenlösungstropfen (3) auf einem Spot (2) auf einem eingelegten Analysechip (1) sowohl den Deckel (9) als auch den Analysechip (1) berührt.
Analysevorrichtung nach Anspruch 46, bei der der Deckel (6, 9) zur Analyse funktionalisiert ist.
Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 47 mit einer Kontakteinrichtung zur elektrischen Kontaktierung des zumindest einen Interdigitaltransducers (5) auf einem eingelegten Analysechip (1).
Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 47 mit zumindest einer Ultraschallerzeugungseinrichtung, vorzugsweise einer Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtung, die derart angeordnet ist, daß sie bei eingelegtem Analysechip unterhalb des Analysechips (1) liegt.
Analysevorrichtung nach Anspruch 49, bei der die Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtung einen Interdigitaltransducer umfaßt.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 29, eines Analysechips nach einem der Ansprüche 30 bis 41 oder einer Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 50 zur Untersuchung der Hybridisierung von biologischen Makromolekülen oder Antigen-Antikörper-Reaktionen.
Verwendung eines Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, eines Analysechips nach einem der Ansprüche 30 bis 41 oder einer Analysevorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 50 für Polymerase-Kettenreaktionen.