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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Substrat zum Durchführen von
chemischen und biologischen Reaktionen und eine Vorrichtung zum
Durchführen
von entsprechenden Reaktionen auf einem solchen Substrat.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere ein Substrat aus Kunststoff, das
vorbereitete Probenpunkte zum Aufnehmen von Flüssigkeitströpfchen aufweist, in welchen
anhand thermischer Einwirkung chemische und biologische Reaktionen
ausgeführt
werden, insbesondere bilden die Flüssigkeitstropfen einen PCR-Ansatz
zum Ausführen
eines PCR-Verfahrens. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung
zum kontaminationsfreien Ausführen
von chemischen und biologischen Reaktionen in Flüssigkeitströpfchen unter thermischer Einwirkung.
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Ein
biegsames Substrat aus Kunststoff für DNA-Arrays ist aus der US
2004/0086871 A1 bekannt, bei welchem Oligonukleotide mittels Linker-Molekülen an die
Oberfläche des
Substrates an vorbestimmten Punkten gebunden sind. Die Substrate
können
mit den darin angebundenen Molekülen
in einem Inkubator einer thermischen Behandlung unterzogen werden.
Vorzugsweise sind die Substrate als sogenannte Composite-Folien
ausgebildet, die aus mehreren Lagen unterschiedlicher Folien zusammengesetzt
sind.
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Aus
der US 2005/0032061 A1 geht ein Verfahren zum Speichern von Oligomeren
und/oder Polymeren hervor, bei welchem zumindest ein Oligomer und/oder
Polymer auf einem biegsamen Substrat gespeichert wird. Das Substrat
ist ein dünner
Bogen, der vorzugsweise mit Chitin und/oder Chitosan beschichtet
ist. Zum Ausführen
von chemischen und/oder biologischen Reaktionen mit den auf dem Substrat
vorgesehenen Oligomeren und Polymeren werden diese vom Substrat
gelöst
und in ein geeignetes Reaktionsgefäß überführt.
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Die
Firmen Advalytix AG und Alopex GmbH vertreiben unter dem Handelsnamen
AmpliGridTM ein Glassubstrat mit einer chemisch
speziell behandelten Oberfläche,
die hydrophile Punkte aufweist und von einer hydrophoben Oberfläche umgeben
ist. Die hydrophilen Punkte sind jeweils von einem schmalen hydrophilen
Ring umgeben, der konzentrisch zu dem jeweiligen Punkt angeordnet
ist. Die hydrophilen Punkte innerhalb der hydrophoben Oberfläche sind vorgesehen,
um zu verhindern, dass hieran aufgetragene Flüssigkeitströpfchen auf der Oberfläche des Substrates
verlaufen. Sie bilden somit einen Tropfen in der Form etwa eines
Kugelsegmentes, dessen Grundfläche
den hydrophilen Punkten entspricht. Diese Tröpfchen werden mit jeweils einer Ölschicht abgedeckt.
Durch das Vorsehen der hydrophilen Ringe wird verhindert, dass die Ölschicht
aus dem Ring heraus über
die Oberfläche
des Substrates verläuft. Dieses
Substrat hat sich in der Praxis sehr bewährt. Es ist jedoch in der Herstellung
aufgrund der aufwendigen chemischen Beschichtung der Glasoberfläche zur
Erzeugung der hydrophilen und hydrophoben Bereiche sehr teuer. Mit
diesem Substrat können
chemische und biologische Reaktionen in den darauf örtlich festgelegten
Flüssigkeitströpfchen ausgeführt werden,
da ein Verdampfen der Flüssigkeitströpfchen durch
die Ölschicht
sicher vermieden wird. Dieses Substrat eignet sich daher zum Durchführen einer Vielzahl
von chemischen und biologischen Reaktionen unter Temperatureinwirkung.
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Das
Vorsehen des Ölfilmes
ist jedoch arbeitsaufwändig.
Bei PCR-Verfahren, bei welchen PCR-Ansätze mit größeren Volumen verwendet werden,
hat sich in der Praxis durchgesetzt, geschlossene Reaktionsgefäße zu verwenden,
so dass die Abdeckung des PCR-Ansatzes mit einem Ölfilm nicht mehr
notwendig ist. Für
derart kleine Probenvolumen, wie sie auf dem Substrat des AmpliGridTM verwendet werden, ist das Vorsehen von
separaten, verschließbaren
Probengefäßen aufwändiger als
das Abdecken mit Öl.
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Aus
der
DE 103 39 996
A1 geht ein Analyseverfahren hervor, bei welchem auf einem
Analysechip Probelösungstropfen
mittels einer Ölschicht abgedeckt
werden, um ein Verdampfen der Probenlösung zu verhindern. Hierin
sind auch relativ komplexe Mittel zum Aufbringen der Ölschicht
beschrieben.
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Weiterhin
hat die Firma PlasmaTreat GmbH diverse Vorrichtungen und Verfahren
zur Plasmabehandlung von Oberflächen
entwickelt (
EP 0 986
939 B1 ;
DE
296 24 481 U1 ,
DE
102 23 865 A1 ,
EP
0 761 415 B1 ). Diese Plasmabehandlung von Oberflächen können hydrophob-wasserabweisende
oder hydrophil-benetzende Kunststoff-Oberflächen erzeugen.
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Bei
diesen Verfahren ist man bestrebt, die Oberfläche einer Kunststofffolie möglichst
großflächig zu
behandeln, damit man wirtschaftlich sinnvoll größere Folien entsprechend veredeln
kann. Prinzipbedingt ist es jedoch einfacher, dünne Plasmastrahlen mit derartigen
Düsen zu
erzeugen, mit welchen sehr präzise
kleinste Flächen
individuell plasmabehandelt werden können.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Substrat zum Durchführen von
chemischen und biologischen Reaktionen zu schaffen, mit welchen Flüssigkeitstropfen örtlich festlegbar
sind und das kostengünstig
herstellbar ist. Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde,
eine Vorrichtung zu schaffen, mit welcher chemische und biologische
Reaktionen mittels Temperatureinwirkung auf einem solchen Substrat
sicher, zuverlässig
und kontaminationsfrei und möglichst
ohne Verwendung einer Ölschicht
durchführbar
sind.
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Die
Erfindung wird durch ein Substrat mit den Merkmalen des Anspruchs
1 gelöst.
Die Erfindung wird weiterhin durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen
des Anspruchs 9, 10 oder 11 gelöst.
Vorteilhafte Ausführungen
der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben.
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Das
erfindungsgemäße Substrat
zum Durchführen
von chemischen und biologischen Reaktionen ist aus Kunststoff ausgebildet.
Es weist eine ebenflächige
Oberfläche
auf, auf der Reaktionspunkte vorgesehen sind, die durch einen kreisscheibenförmigen bzw.
kreisringförmigen
hydrophilen Bereich ausgebildet sind.
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Derartige
aus Kunststoff ausgebildete Substrate können kostengünstig hergestellt
werden. Sie sind in der Handhabung sehr einfach, insbesondere wenn
das Substrat aus einer dünnwandigen
Folie ausgebildet ist. Das Substrat kann entsprechend dem Bedarf
an Reaktionspunkten zugeschnitten werden.
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Das
Substrat kann mit einer Schutzfolie zum Schutz der Reaktionspunkte
versehen sein.
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Nach
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Substrat an der Unterseite mit einer Klebeschicht versehen.
Mit dieser Klebeschicht kann das Substrat unmittelbar auf eine Heiz-/Kühlplatte
aufgeklebt werden, wodurch ein hervorragender Wärmeübergang erzielt wird. Es ist
jedoch auch möglich,
das Substrat auf einen weiteren Träger, wie z.B. eine Glas- oder Keramikplatte
aufzukleben.
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Die
Vorrichtung nach Anspruch 9 zeichnet sich dadurch aus, dass in der
Heiz-/Kühlplatte
Saugöffnungen
vorgesehen sind, mit welchen ein Unterdruck zum Fixieren des Substrates
an die Heiz-/Kühlplatte
erzeugt werden kann. Hierdurch wird das Substrat mit einem guten
Wärmekontakt
an der Heiz-/Kühlplatte
fixiert.
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Die
Vorrichtung nach Anspruch 10 weist ein Deckelmodul auf, das gegen
ein auf einer Heiz-/Kühlplatte
aufliegendes Substrat gedrückt
werden kann, um über
den Substrat Reaktionskammern zu begrenzen. Das Deckelmodul ist
austauschbar an der Vorrichtung angeordnet, weshalb es nach einem
Reaktionsvorgang einfach durch ein anderes, sauberes Deckelmodul
ersetzt werden kann. Ein benutztes Deckelmodul kann einfach gereinigt
werden, so dass es für
einen neuen Reaktionsvorgang zur Verfügung steht.
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Die
Vorrichtung nach Anspruch 11 zeichnet sich dadurch aus, dass es
ein Deckelmodul mit Ausnehmungen zur Begrenzung von Reaktionskammern aufweist,
wobei das Deckelmodul mit Mitteln zum Erhöhen des Druckes und/oder der
Temperatur in den Reaktionskammern ausgebildet ist. Hierdurch ist
es möglich,
den Tau- bzw. Siedepunkt zu erhöhen,
wodurch dem Verdampfen einer wässrigen
Probenlösung
entgegengewirkt wird und die biologischen und chemischen Reaktionen
innerhalb eines kleinen Flüssigkeitstropfens
ausgeführt
werden können.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen beispielhaft erläutert. Die
Zeichnungen zeigen in:
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1 eine
Draufsicht auf ein erfindungsgemäßes Substrat,
in der die hydrophilen Punkte markiert sind,
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2 einen
Ausschnitt des Substrates aus 1 mit einem
Tropfen Reaktionsflüssigkeit,
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3 einen
Ausschnitt eines weiteren Substrates in der Draufsicht mit einem
Reaktionspunkt,
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4 den
Ausschnitt des Substrates aus 3 in einer
Schnittdarstellung zusammen mit einem Tropfen Reaktionsflüssigkeit
und einer die Reaktionsflüssigkeit
abdeckenden Ölschicht,
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5 ein
erfindungsgemäßes Substrat
mit einer oberen und unteren Schutzfolie in einer Seitenansicht,
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6 eine
weitere Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Substrates
mit einer integrierten Metallschicht,
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7 eine
Inkubationseinrichtung zum Heizen und Kühlen des erfindungsgemäßen Substrates,
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8 ein
Deckelmodul für
eine Inkubationseinrichtung in einer Schnittdarstellung,
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9 das
Deckelmodul aus 8 bei Verwendung in einer Inkubationsvorrichtung,
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10 eine
weitere Inkubationsvorrichtung mit einem weiteren Deckelmodul in
einer Schnittdarstellung,
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11 eine
weitere Inkubationsvorrichtung mit einem weiteren Deckelmodul,
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12 ein Substrat und eine Abdeckfolie zum
Abdecken des Substrates, und
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13 eine
weitere Inkubationsvorrichtung zum Inkubieren des Substrates 1 und
der Abdeckfolie aus 12.
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Das
erfindungsgemäße Substrat 1 zum Durchführen von
chemischen und biologischen Reaktionen weist eine Vielzahl von Reaktionspunkten 2 auf,
die zur örtlichen
Festlegung von Flüssigkeitstropfen
dienen (1).
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Das
Substrat 1 ist aus Kunststoff, wie z.B. Polyolephin (Polypropylen,
Polyethylen, Polymethylpenten), Polyetherketone, Polyemit oder einem
Fluorkohlenstoffpolymer oder einem anderen geeigneten thermoplastischen
Polymer ausgebildet. Das Substrat kann ein starres Kunststoffpäckchen sein. Vorzugsweise
ist es jedoch eine dünne,
biegsame Kunststofffolie, die zu Lagerzwecken beispielsweise auf
eine Rolle gewickelt werden kann.
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Das
erfindungsgemäße Substrat 1 zeichnet sich
durch Reaktionspunkte 2 aus, die kreisscheibenförmige Bereiche
auf der ebenflächigen
Oberfläche des
Substrates 1 sind, die hydrophil ausgebildet sind. Die übrige Oberfläche des
Substrates 1 ist vorzugsweise hydrophob ausgebildet. Der
Durchmesser a der Reaktionspunkte 2 liegt typischerweise
im Bereich von 0,5 mm bis 3 mm und vorzugsweise im Bereich von 0,8
mm bis 1,6 mm bzw. im Bereich von 1,0 mm bis 1,2 mm.
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Die
hydrophile bzw. hydrophobe Ausbildung der Oberfläche des Substrates 1 kann
mit einer der eingangs beschriebenen Plasmabehandlungen hergestellt
werden. Hierzu wird ein Plasmastrahl auf die Oberfläche des
Substrates mittels einer entsprechenden Düse gerichtet. Bei der Herstellung
des erfindungsgemäßen Substrates
wird dieses zunächst vollständig hydrophob
beschichtet und dann werden die einzelnen Reaktionspunkte 2 durch
punktuelles Bestrahlen mit einem Plasmastrahl hergestellt, dessen
Durchmesser dem Durchmesser der Reaktionspunkte 2 entspricht,
so dass jeder Reaktionspunkt 2 mit einem Strahlpuls erzeugt
wird. Hiermit werden die einzelnen Reaktionspunkte 2 mit
hoher Präzision
auf der Oberfläche
des Substrates 1 ausgebildet.
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Grundsätzlich ist
es auch möglich,
die Reaktionspunkte 2 als ringförmige hydrophile Bereiche auszubilden,
was jedoch in der Herstellung aufwendiger als kreisscheibenförmige Bereiche
ist.
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2 zeigt
einen Ausschnitt des Substrates 1 aus 1 im
Schnitt durch einen Reaktionspunkt 2, wobei ein Flüssigkeitstropfen 3 auf
dem Reaktionspunkt 2 angeordnet ist. Dieser Flüssigkeitstropfen weist
einen Kontaktwinkel α auf,
der im vorliegenden Ausführungsbeispiel
etwa 40° beträgt. Die
Reaktionspunkte 2 sind vorzugsweise derart hydrophil ausgebildet,
dass sich je nach aufgetragener Menge an Kontaktflüssigkeit
ein Kontaktwinkel zwischen 35° bis 50° einstellt.
Dadurch, dass der Bereich außerhalb der
Reaktionspunkte 2 hydrophob ausgebildet ist, wird verhindert,
dass der Flüssigkeitstropfen 3 aus dem
Reaktionspunkt 2 austritt und auf der Oberfläche des
Substrates 1 verläuft.
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Der
Flüssigkeitstropfen 3 stellt
einen Reaktionsansatz für
eine chemische und/oder biologische Reaktion dar. Vorzugsweise ist
der Flüssigkeitstropfen 3 ein
Reaktionsansatz für
eine PCR-Reaktion (Polymerase-Kettenreaktion oder andere thermozyklische
Reaktionen).
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Das
Volumen des Flüssigkeitstropfens
beträgt
typischerweise 0,5 μl
bis 5 μl
und vorzugsweise 1 μl
bis 2 μl.
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3 zeigt
einen Ausschnitt eines weiteren Substrates 1 mit einem
Reaktionspunkt 2. Der Reaktionspunkt 2 ist genauso
ausgebildet wie bei dem in 1 gezeigten
Substrat. Zusätzlich
zu dem Reaktionspunkt 2 ist konzentrisch um den Reaktionspunkt 2 ein
Stoppring 4 vorgesehen. Der Stoppring 4 ist ein sehr
schmaler Ring, der stark lipophob ausgebildet ist. Der Zwischenbereich
zwischen dem Reaktionspunkt 2 und dem Stoppring 4 ist
vorzugsweise lipophil und stark hydrophob ausgebildet. Hierdurch
wird zum einem verhindert, dass eine wässrige Reaktionsflüssigkeit
aus dem Bereich des Reaktionspunktes 2 austritt und zum
anderen wird sichergestellt, dass eine Ölschicht 5 (4),
die den Flüssigkeitstopfen 3 abdeckt, örtlich festgelegt
ist und vom Stoppring 4 abgehalten wird, sich über die
Oberfläche
des Substrates 1 zu verbreiten. Diese Ölschicht 4 verhindert,
dass beim Erhitzen des Flüssigkeitstropfens 3 Flüssigkeit
verdampft und Flüssigkeitsmaterial
von einem Reaktionspunkt 2 zu einem anderen Reaktionspunkt 2 gelangen
kann. Hierdurch wird eine Kontamination der Reaktionsansätze durch
andere Reaktionsansätze
sicher verhindert.
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5 zeigt
in einer Seitenansicht ein erfindungsgemäßes Substrat 1 mit
einer oberen Schutzfolie 6 und einer unteren Schutzfolie 7.
Die obere Schutzfolie 6 dient zum Schutz (insbesondere
Kontaminationsschutz) der Reaktionspunkte 2 und kann unmittelbar
vor Gebrauch des Substrates 1 von diesem abgezogen werden.
Die untere Schutzfolie 7 dient zum Schutz einer Klebeschicht,
die auf der Unterseite des Substrates 1 aufgetragen ist.
Diese Klebeschicht ist eine temperaturstabile Klebeschicht, mit welcher
das Substrat 1 auf eine Inkubationsvorrichtung (7)
aufgeklebt werden kann. Diese Schutzfolie 7 wird somit
auch vor dem Gebrauch des Substrates abgezogen. Will man ein solches
Substrat jedoch in aufeinanderfolgenden Arbeitsschritten an unterschiedlichen
Vorrichtungen, wie z.B. einem Inkubator, einem Mikroskop oder dergleichen
verwenden, so kann es auch zweckmäßig sein, das Substrat 1 auf
einen steifen Träger,
wie z.B. ein Glas-, Keramik- oder Kunststoffplättchen aufzukleben. Auf dem
steifen Plättchen – z.B. einem
Objektträger – kann das Substrat
somit einfach gehandhabt werden.
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Das
Adhäsionsmittel,
mit welchem die Schutzfolie 7 auf dem Substrat 1 gehalten
wird, ist vorzugsweise ein Mittel, das die Reaktionspunkte 2 nicht
beeinträchtigt.
Beispielsweise kann die Schutzfolie 6 am Substrat 1 mittels
elektrischer Ladung gehalten werden. Es kann jedoch zweckmäßig sein, das
Adhäsionsmittel,
das auch eine herkömmliche Klebeschicht
sein kann, im Bereich der Reaktionspunkte 2 auszunehmen
oder ringförmige
oder scheibenförmige
Abstandselemente vorzusehen, so dass im Bereich der Reaktionspunkte 2 die
Schutzfolie 7 nicht mit dem Substrat 1 in Berührung kommt.
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6 zeigt
eine weitere Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Substrates 1,
das wiederum mit einer oberen Schutzfolie versehen ist. Dieses Substrat 1 ist
ein mehrlagiges Composite-Material mit zwei Kunststoffschichten 8, 9 und
einer dazwischen angeordneten Metallschicht 10, die vorzugsweise
eine Kupfer- bzw. Aluminiumschicht ist. Die Metallschicht 10 weist
eine hohe Wärmeleitfähigkeit auf,
so dass beim Verwenden des Substrates 1 im Inkubator sicher
gestellt ist, dass das gesamte Substrat 1 auf der gleichen
Temperatur gehalten wird.
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7 zeigt
schematisch eine einfache Ausführungsform
eines Inkubators zum Erhitzen und Kühlen des erfindungsgemäßen Substrates 1.
Dieser Inkubator 11 weist eine ebenflächige Heiz-/Kühlplatte 12 auf,
an deren Unterseite eine Heiz- und Kühleinrichtung in Form eines
Peltierelementes 13 angeordnet ist. Die Heiz-/Kühlplatte 12 ist
vorzugsweise eine Metallplatte. Sie kann jedoch auch aus anderen
gut wärmeleitenden
Materialien bestehen. An der Unterseite des Peltierelementes 13 befindet
sich ein Kühlkörper 14 mit
Kühlrippen 15.
Der Kühlkörper 14,
das Peltierelement 13 und die Heiz-/Kühlplatte 12 sind mit
einem guten Wärmekontakt
zueinander ausgebildet. Das Peltierelement 13 ist an eine
Steuereinrichtung 16 angeschlossen, mit welcher das Peltierelement
zum Erwärmen
bzw. zum Kühlen
der Heiz-/Kühlplatte 12 gesteuert
werden kann. Der Temperaturbereich beträgt typischerweise 0°C bis 100°C, wo bei
auch für
spezielle Reaktionen Temperaturbereiche bis 150°C zweckmäßig sein können. Das erfindungsgemäße Substrat
wird im Gebrauch auf die ebenflächige
Heiz-/Kühlplatte 12 aufgelegt,
oder falls eine Klebeschicht vorhanden ist, auf die Heiz-/Kühlplatte 12 aufgeklebt.
Das erfindungsgemäße Substrat 1 kann
auch bei Verwendung eines steifen Trägers, auf dem das Substrat
aufgeklebt ist, mittels dieses Trägers auf der Heiz-/Kühlplatte 12 aufgelegt werden.
Wesentlich ist, dass ein guter Wärmeübergang
zwischen der Heiz-/Kühlplatte 12 und
dem Substrat 1 erzielt wird. Daher ist eine unmittelbare
Auflage des Substrates 1, das zudem möglichst dünnwandig ausgebildet ist, bevorzugt.
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Weiterhin
ist es zweckmäßig, die
Metallplatte 12 mit dünnen
Saugöffnungen
(nicht dargestellt) zu versehen, an welchen Unterdruck zum Fixieren
des Substrates 1 an der Heiz-/Kühlplatte 12 angelegt werden
kann. Hierdurch kann ein sehr guter Wärmekontakt zwischen der Heiz-/Kühlplatte 12 und
dem Substrat 1 hergestellt werden.
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Mit
dem in 7 gezeigten Inkubator wird vorzugsweise ein Substrat 1 verwendet,
das Reaktionspunkte 2 mit Stoppringen 4 aufweist,
so dass die Flüssigkeitstropfen
mit einer Ölschicht 5 beschichtet werden
können.
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Nachfolgend
werden einige Inkubatoren erläutert,
bei welchen keine Ölschicht
zum Abdecken der Flüssigkeitstropfen
notwendig ist.
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8 und 9 zeigen
einen Inkubator 17 mit einem Deckelmodul 18. Der
Inkubator 15 weist eine Basiseinheit 19 auf, die
dem Inkubator aus 7 im wesentlichen entspricht
und eine Heiz-/Kühlplatte 12,
eine Heiz-/Kühleinrichtung
in Form des Peltierelementes 13 und einen Kühlkörper 14 aufweist.
Das Peltierelement 13 ist wiederum mit einer Steuereinrichtung 16 versehen.
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Der
Inkubator 17 weist weiterhin einen Deckel auf, der aus
dem Deckelmodul 18 und einer Deckelbetätigungseinrichtung 20 ausgebildet
ist. Die Deckelbetätigungseinrichtung 20 ist
in 9 lediglich schematisch durch einen Stempel dargestellt,
in dem das Deckelmodul 18 lösbar befestigt ist und der angehoben
und derart abgesenkt werden kann, dass das Deckelmodul 18 mit
einem vorbestimmten Druck gegen die Basiseinheit 19 bzw.
gegen ein auf der Basiseinheit 19 aufliegendes Substrat 1 gedrückt wird.
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Das
Deckelmodul 18 umfasst eine Grundplatte 21 und
einen Druckstempel 22. Die Grundplatte 21 ist
eine Metallplatte mit einer Dicke von etwa 1 cm bis 2 cm. In der
Grundplatte 21 sind im Raster der Reaktionspunkte 2 auf
dem Substrat 1 zylindrische Durchgangsbohrungen 23 eingebracht.
Der Durchmesser der Durchgangsbohrungen 23 ist ein Stück größer als
der Durchmesser der Reaktionspunkte 2 bzw. der Stoppringe 4.
Der Druckstempel 22 ist aus einer dünnen Metallplatte 24 ausgebildet,
an deren Unterseite eine Vielzahl von nach unten vorstehenden Stempelstiften 25 angeordnet
sind. Zu jeder Durchgangsbohrung 23 der Grundplatte 21 ist
ein korrespondierender Stempelstift 25 vorgesehen, wobei
die Stempelstifte 25 mit geringem Spiel in die Durchgangsbohrung 23 passen.
An der Oberseite der Metallplatte 24 des Druckstempels 22 ist
ein Ansatz 25a ausgebildet, um das Deckelmodul 18 mit
der Deckelbetätigungseinrichtung 20 lösbar zu
verbinden.
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Am
Umfangsbereich der Grundplatte 21 erstreckt sich eine umlaufende,
dünnwandige
Wandung 26 nach oben, die den Druckstempel 22 umschließt. Zwischen
dem Umfangsbereich des Druckstempels 22 und der Wandung 26 ist
ein O-Ring 27 angeordnet, der eine gasdichte Abdichtung
bewerkstelligt.
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Am
oberen Randbereich der Wandung 26 sind nach innen vorstehende
Vorsprünge 28 ausgebildet,
die derart schwenkbar an der Wandung 26 befestigt sind,
so dass sie nach außen
weggeklappt werden können.
Durch die Vorsprünge 28 wird
verhindert, dass der Druckstempel 22 beim Anheben des Deckelmoduls 18 aus
dem Bereich innerhalb der Wandung 26 herausgezogen wird
und sich die Stempelstifte 25 vollständig aus den Durchgangsbohrungen 23 bewegen.
D.h., wenn der Druckstempel 22 an den Vorsprüngen 28 anschlägt, befinden
sich die Stempelstifte 25 mit ihren unteren Enden im oberen Randbereich
der Durchgangsbohrung 23 der Grundplatte 21.
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Wird
dieses Deckelmodul 18 auf ein an der Basiseinheit 19 aufliegendes
Substrat 1 abgesenkt, so liegt zunächst der Druckstempel 22 mit
seiner Oberseite an den Vor sprüngen 28 an,
bis die Grundplatte 21 das Substrat 1 berührt. Beim
weiteren Absenken des Druckstempels 22 wird die Grundplatte 21 gegen
das Substrat 1 gedrückt,
wodurch die Grundplatte 21 gasdicht gegenüber dem
Substrat 1 abgedichtet wird. Dies hat zur Folge, dass der
Innenraum der Durchgangsbohrungen 23 und die Zwischenräume zwischen
dem Druckstempel 22 und der Grundplatte 21 ein
geschlossenes System bilden. Durch weiteres Absenken des Druckstempels
wird das Volumen dieses Systems verringert (8 ⇒ 9),
wodurch sich der darin befindliche Gasdruck erhöht. Bei einer Verringerung
des Volumens auf ein Drittel des Ausgangsvolumens wird der Druck
auf das Dreifache des normalen Umgebungsdruckes erhöht. Die
Reaktionspunkte 2 des Substrates mit den darauf befindlichen
Reaktionsansätzen
befinden sich somit in durch die Durchgangsbohrung 23 und
die untere Stirnfläche
der Stempelstifte 25 begrenzten Reaktionskammern 29 mit
erhöhtem
Druck. Diese Druckerhöhung
bewirkt, dass der Siedepunkt der Reaktionsansätze gegenüber normalen Umgebungsbedingungen
wesentlich erhöht
wird, wodurch sicher verhindert wird, dass die Reaktionsansätze bzw.
Reaktionsgemische bis in die Nähe
Ihrer Siede- bzw. Taupunkte erwärmt
werden. Hierdurch wird ein Sieden und übermäßiges Verdampfen der Reaktionsflüssigkeit
verhindert, so dass die Reaktionsflüssigkeiten ohne Verwendung
eines Ölfilms
auf die für PCR-Reaktionen üblichen
Temperaturen erhitzt werden können.
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Nach
dem Durchführen
der biologischen oder chemischen Reaktionen wird das Deckelmodul wieder
angehoben und das Substrat 1 kann zur weiteren Bearbeitung
entfernt werden.
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Es
kann nicht vollständig
ausgeschlossen werden, dass Moleküle in die Dampfphase treten,
mit dem Deckelmodul 8 in Berührung kommen und dort verbleiben.
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Das
Deckelmodul kann deshalb von der Deckelbetätigungseinrichtung 20 gelöst werden.
Die Vorsprünge 28 können nach
außen
geklappt werden und dann kann der Druckstempel 22 von der
Grundplatte 21 abgehoben und von der Grundplatte 21 getrennt
werden. Diese beiden Teile können
beispielsweise mittels Alkohol oder Perchlorat oder einem andern
starken Oxidationsmittel für
einen erneuten Gebrauch gereinigt werden. Vorzugsweise sind für einen
solchen Inkubator 17 mehrere De ckelmodule 18 vorgesehen,
die in aufeinanderfolgenden Reaktionsvorgängen abwechselnd verwendbar
sind, so dass jeder Reaktionsvorgang mit einem sauberen Deckelmodul 18 ausgeführt wird.
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Besonders
zum Durchführen
von biologischen Reaktionen ist es zweckmäßig eine Heizeinrichtung vorzusehen,
mit welcher das Deckelmodul auf Temperaturen von mehr als 130°C, vorzugsweise 150°C bis 200°C, erhitzt
wird, wodurch eventuell am Deckelmodul haftendes biologisches Material
vollständig
zerstört
wird und das Deckelmodul wieder ohne Kontaminationsgefahr bei weiteren
Reaktionsvorgängen
eingesetzt werden kann.
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Durch
die Verwendung eines Deckels, der gegen das Substrat 1 gedrückt wird,
wird auch sichergestellt, dass das Substrat 1 in gutem
thermischen Kontakt mit der Heiz-/Kühlplatte 12 steht.
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Vorzugsweise
ist das Deckelmodul 18 mit Heizelementen (nicht dargestellt)
versehen, die die Grundplatte 21 und/oder den Druckstempel 22 auf eine
vorbestimmte Temperatur, beispielsweise bis 100°C–150°C erhitzen. Durch das Erhitzen
können auf
der Oberfläche
des Deckelmoduls 18 befindliche Moleküle abgedampft bzw. biologische
Moleküle
denaturiert werden. Dies stellt eine alternative Form der Reinigung
dar.
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Es
kann zweckmäßig sein,
während
der einzelnen Reaktionsvorgänge
das Deckelmodul auf einer vorbestimmten Temperatur von z.B. 80°C bis 120°C zu halten.
Es kann auch sinnvoll sein, das Deckelmodul lediglich am Ende der
Reaktionsvorgänge auf
eine hohe Temperatur zu erhitzen.
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10 zeigt
einen weiteren Inkubator 30. Dieser Inkubator 30 weist
wiederum eine Basiseinheit 19 auf, die identisch zu der
Basiseinheit des Inkubators 17 ist. Das hierbei verwendete
Deckelmodul 31 ist ein plattenförmiger Körper, der an seiner Unterseite
zylinderförmige
Ausnehmungen 32 aufweist, die im Raster der Reaktionspunkte 2 des
Substrates 1 angeordnet sind und jeweils eine Reaktionskammer
bilden. Die Reaktionskammern 32 sind, über in dem Deckelmodul 31 ausgebildeten
Leitungen 33, mit einem Gasanschluss 34 verbunden.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel
ist der Gasanschluss 34 an einem sich nach oben erstreckenden
Ansatz des Deckelmoduls angeordnet, so dass dieser mit einer Gasleitung,
die durch den Stempel der Deckelbetätigungseinrichtung 20 verläuft, in
Verbindung bringbar ist. Die Gasleitung führt zu einem Gasreservoir 35. Das
Gasreservoir kann ein Gasdruckbehälter sein, in dem inertes Schutzgas,
wie z.B. Helium oder Argon gespeichert ist. Das Gasreservoir 35 kann
jedoch auch durch einen Kompressor ausgebildet sein, der Luft mit Überdruck
in die Reaktionskammern 32 pumpt.
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Nach
dem Aufdrücken
des Deckelmoduls 31 auf das Substrat 1 wird den
Reaktionskammern 32 Gas (Luft, Schutzgas, etc.) mit Überdruck
zugeführt, wodurch
eine Erhöhung
des Siede- bzw. Taupunktes der in den Reaktionskammern befindlichen
Reaktionsgemische herbeigeführt
wird. Auch hier wird ein übermäßiges Verdampfen
der Reaktionsflüssigkeit während des
Erhitzens auf Temperaturen bis zu 100°C sicher vermieden. Dieses Reaktionsmodul
ist wiederum einfach von der Deckelbetätigungseinrichtung lösbar und
austauschbar. Zu Reinigungszwecken kann es in eine Reinigungsflüssigkeit,
wie z.B. Alkohol, eingetaucht werden und/oder mittels einer integrierten
oder externen Heizeinrichtung erhitzt werden.
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11 zeigt
einen weiteren Inkubator 36, der wiederum eine Basiseinheit 19 aufweist,
das genauso ausgebildet ist, wie bei den Inkubatoren 17 und 30.
Dieser Inkubator 36 weist ein Deckelmodul 37 auf,
das aus einem plattenförmigen,
gut wärmeleitenden
Körper,
vorzugsweise einem Metallkörper, ausgebildet
ist. An der Unterseite des Deckelmoduls 37 sind wiederum
Ausnehmungen zur Ausbildung von Reaktionskammern 38 eingebracht.
Dieses Deckelmodul 37 weist ein Heizelement 39 auf.
An der Oberseite des Deckelmoduls 37 sind Kühlrippen 40 und
ein Ansatz 41 zum Befestigen des Deckelmoduls an der Deckelbetätigungseinrichtung 20 vorgesehen. Das
Heizelement 39 des Deckelmoduls 37 ist auch mit
der Steuereinrichtung 16 verbunden.
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Im
Betrieb wird das Deckelmodul 37 auf eine vorbestimmte Temperatur
von beispielsweise 70°C bis
100°C erwärmt, wodurch
ein Kondensieren von Flüssigkeit
an den Innenflächen
der Reaktionskammern 38 verhindert, die Temperatur der
sich in den Reaktionskammern 38 befindlichen Luft hoch
gehalten wird, wodurch der Druck und damit der Tau- bzw. Siedepunkt
etwas erhöht
wird.
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Bei
den oben erläuterten
Ausführungsformen,
bei welchen mittels einer Druck- und/oder
Temperaturerhöhung
in den Reaktionskammern eine Erhöhung
des Tau- bzw. Siedepunktes
bewirkt wird, wird diese Erhöhung
des Druckes bzw. der Temperatur zweckmäßigerweise vor Beginn des Reaktionsvorgangs
eingestellt, d.h., dass zuerst der Tau- bzw. Siedepunkt erhöht wird
und danach der Reaktionsvorgang durch Heizen und Kühlen der
Heiz-/Kühlplatte
ausgeführt
wird.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
nach 11 ist an Stelle des Heizelementes 39 ein
Heiz-/Kühlelement
vorgesehen, das z.B. als Peltierelement ausgebildet ist. Bei einer
solchen Ausführungsform
kann das Deckelmodul 37 und die Heiz-/Kühlplatte 12 der Basiseinheit 19 immer
auf der gleichen Temperatur gehalten werden, so dass eine absolut
perfekte Temperatureinstellung erzielt wird.
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12 zeigt ein erfindungsgemäßes Substrat 1,
das genauso ausgebildet ist, wie das in 1 gezeigte
Substrat. Auf dem Substrat 1 befinden sich an den Reaktionspunkten 2 Flüssigkeitstropfen 3 einer
wässrigen
Probenlösung. Über dem
Substrat 1 ist eine Abdeckfolie 42 (12) dargestellt. Diese Abdeckfolie 42 weist
an der zum Substrat 1 weisenden Unterseite Ausnehmungen 43 auf,
die in einem zu den Reaktionspunkten 2 korrespondierendem
Raster in der Abdeckfolie 42 angeordnet sind. Die Abdeckfolie 42 ist
vorzugsweise eine Kunststofffolie mit einer Dicke von 2 mm bis 3
mm. sie kann jedoch auch als Kunststoffplatte mit einer höheren Dicke
von beispielsweise 3 mm bis 5 mm oder aus einem anderen Material
ausgebildet sein. Die Abdeckfolie 42 ist an der Unterseite
vollständig
hydrophob beschichtet.
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Durch
Auflegen der Abdeckfolie 42 auf das Substrat 1,
werden durch die Ausnehmungen 43 über den Reaktionspunkten 2 jeweils
eine Reaktionskammer begrenzt (13). Diese „Sandwich-Anordnung" wird vorzugsweise
mit einem Inkubator 44 erwärmt und gekühlt, der zwei Basiseinheiten 19 mit
jeweils einer Heiz-/Kühlplatte 12,
einem Heiz-/Kühleelement 13 und
einem Kühlkörper 14 umfasst.
Die Heiz-/Kühleelemente 13 sind
mit einer Steuereinrichtung 16 verbunden. Die Steuerein richtung
steuert, bzw. regelt beide Basiseinheiten 19 jeweils auf
die gleiche Temperatur.
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Die
Sandwich-Anordnung umfasst das Substrat 1 und die Abdeckfolie 42,
welche zwischen den Heiz-/Kühlplatten
der Basiseinheiten 19 angeordnet sind, und wird vorzugsweise
von den Basiseinheiten 19 mit Druck beaufschlagt.
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Nach
dem Durchführen
der Reaktionsvorgänge
wird die obere Basiseinheit 19 und die Abdeckfolie 42.
vom Substrat 1 abgehoben. Da die mit dem Substrat 1 in
Berührung
stehende Seite der Abdeckfolie 42 hydrophob ausgebildet
ist, bleibt keine oder kaum eine Probenlösung an der Abdeckfolie 42 haften.
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Wie
es oben bereits erläutert
ist, ist das Substrat 1 vorzugsweise als eine dünne, biegsame Kunststofffolie
ausgebildet, die auf eine Rolle gewickelt werden kann. Ein derartiges
Rollenformat erlaubt eine kontinuierliche Durchführung von einer Vielzahl von
PCR-Reaktionen, indem die Folie von der Rolle kontinuierlich abgezogen,
an einer Pipitierstation, an der auf die Reaktionspunkte Probenlösung pipitiert
wird, entlang bewegt wird und dann kontinuierlich durch eine Vorrichtung
bewegt wird, die unterschiedliche Temperaturabschnitte aufweist. Durch
die Länge
der Temperaturabschnitte kann die Verweildauer der Probenlösung in
den jeweiligen Temperaturabschnitten festgelegt werden. Eine derartige
Vorrichtung erlaubt den Massendurchsatz von PCR-Reaktionen in einem
Endlosprozess.
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Weiterhin
kann es sinnvoll sein, das Substrat 1 an den Reaktionspunkten 2 mit
einem PCR-Ansatz vorzubelegen, so dass nur noch das zu amplifizierende
Probenmaterial zu den einzelnen PCR-Ansätzen pipitiert werden muss.
Ein solcher PCR-Ansatz umfasst die für PCR-Reaktionen notwendige
Reaktionsgemische und kann auch bereits geeignet Primer enthalten.
Ein solches vorbelegtes Substrat kann über lange Zeit gelagert werden.
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Die
Erfindung ist oben anhand einiger Ausführungsbeispiele erörtert worden.
Bei all den oben erläuterten
Ausführungsbeispielen
ist es zweckmäßig, Temperatursenso ren
an der Heiz-/Kühlplatte
der Basiseinheiten bzw. an den Deckelmodulen vorzusehen, wenn diese
mit einem Heizelement versehen sind.
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- 1
- Substrat
- 2
- Reaktionspunkt
- 3
- Flüssigkeitstropfen
- 4
- Stoppring
- 5
- Ölschicht
- 6
- Schutzfolie
- 7
- Schutzfolie
- 8
- Kunststoffschicht
- 9
- Kunststoffschicht
- 10
- Metallschicht
- 11
- Inkubator
- 12
- Heiz-/Kühlplatte
- 13
- Heiz-/Kühlelement
- 14
- Kühlkörper
- 15
- Kühlrippe
- 16
- Steuereinrichtung
- 17
- Inkubator
- 18
- Deckelmodul
- 19
- Basiseinheit
- 20
- Deckelbetätigungseinrichtung
- 21
- Grundplatte
- 22
- Druckstempel
- 23
- Durchgangsbohrung
- 24
- Metallplatte
- 25
- Stempelstift
- 25a
- Ansatz
- 26
- Wandung
- 27
- O-Ring
- 28
- Vorsprung
- 29
- Reaktionskammer
- 30
- Inkubator
- 31
- Deckelmodul
- 32
- Ausnehmung/Reaktionskammer
- 33
- Leitung
- 34
- Gasanschluss
- 35
- Gasreservoir
- 36
- Inkubator
- 37
- Deckelmodul
- 38
- Reaktionskammer
- 39
- Heizelement
- 40
- Kühlrippe
- 41
- Ansatz
- 42
- Abdeckfolie
- 43
- Ausnehmung
- 44
- Inkubator