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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der
Konzentration eines Analyten. Derartige Verfahren werden im gesamten
Bereich der Analytik, insbesondere der Medizin und der Umweltanalytik
eingesetzt.
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Für derartige
Verfahren werden insbesondere Immunoaffinitätsassays eingesetzt, die nach
dem Ligand-Rezeptor-Prinzip
funktionieren. Der Rezeptor stellt dabei eine Bindungsstelle dar,
an die ein Analyt als Ligand hochspezifisch binden kann. Die verschiedenen
Ausgestaltungen derartiger Ligand-Rezeptor-Assays erzeugen jeweils
auf unterschiedliche Art und Weise ein Signal, wenn ein Teil der
Bindungsstellen (Rezeptoren) durch einen Analyten besetzt sind.
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Derartige
Ligand-Rezeptor-Assays werden insbesondere im Bereich der Biosensoren
als Immunoaffinitätsassays
verwendet. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf Immunoaffinitätsassays
beschränkt,
sondern umfasst den gesamten Bereich von Ligand-Rezeptor-Bindungsassays, wobei
sowohl Ligand als auch Rezeptor anorganische Moleküle, organische
Moleküle
oder auch biologische Moleküle,
wie Antigene, Antikörper,
Proteine, Haptene und dergleichen umfassen sollen.
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Die
Erzeugung eines Signals erfolgt bei diesen Assays gewöhnlich an
einer Erkennungsschicht, die den Besetzungsgrad der Rezeptoren in
ein detektierbares Signal umsetzt.
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Beispielsweise
werden im Bereich der Biosensoren Enzymimmunoassays eingesetzt,
die die spezifische Wechselwirkung zwischen Antigenen und zugehörigem Antikörper zur
hochspezifischen und selektiven molekularen Erkennung ausnutzen. Hierzu
wird beispielsweise der Antikörper
auf einer Metalloberfläche
eines Transducers immobilisiert, so dass der Transducer ein spezifisches
Signal abgibt, wenn ein Antigen an den Antikörper bindet.
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Da
die Erkennungsschicht eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen
(Rezeptoren) bindet, nimmt bei wiederholter Verwendung derselben
Erkennungsschicht die Anzahl an durch Analyten besetzten Bindungsstellen
zu, da aufgrund der hochspezifischen und selektiven Wechselwirkung
zwischen Rezeptor und Analyt eine Rezeptor-Analyt-Bindung gewöhnlich nicht
ohne weiteres lösbar ist.
Dies führt
dazu, dass die Signalstärke
des Sensors mit jeder weiteren Kontaktierung des Sensors mit einer
analythaltigen Probe kleiner und kleiner wird und letztlich in einer
Sättigung
der Biosensorantwort resultiert. Wenn sämtliche Bindungsstellen auf
der Erkennungsschicht durch den Analyten besetzt sind, erzeugt der
Sensor ein maximales akkumuliertes Sensorsignal (Gesamtsensorsignal).
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Aus
diesem Grund werden Rezeptor-Ligand-Bindungsassays, insbesondere Immunoaffinitätssensoren,
gewöhnlich
zwischen zwei Verwendungen chemisch regeneriert, indem der Analyt,
insbesondere das Antigen bei Antikörper-Antigen-Assays, von der
Immunoaffinitätsschicht
entfernt werden. Ziel derartiger Regenerierungsverfahren ist es dabei,
dieselbe oder wenigstens einen Großteil der Aktivität des Sensors
durch diese Behandlung wiederherzustellen. Die üblichen Regenerierungsverfahren,
wie beispielsweise Waschen mit saurem oder basischen Lösungen,
besitzen jedoch den Nachteil, dass sie teilweise oder vollständig die
auf der Immunoaffinitätsschicht
immobilisierten Antikörper
denaturieren. Dies führt
zu einer verminderten Anzahl von Bindungsstellen bei der Wiederverwendung
der Immunoaffinitätsschicht
und damit zu einer verringerten Sensitivität bzw. Aktivität.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es nun, ein Verfahren zur Bestimmung
der Konzentration eines Analyten zur Verfügung zu stellen, bei dem die
oben genannten Nachteile vermieden werden können.
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Diese
Aufgabe wird durch das Verfahren nach Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte
Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden in den abhängigen
Ansprüchen
gegeben.
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Das
vorliegende erfindungsgemäße Verfahren
verwendet einen Rezeptor-Liganden-Bindungsassay, derart, dass der
Assay mit einer Probe kontaktiert wird, in der sich ggf. ein Analyt
als Ligand befindet. Es wird nun nicht nur das durch die Kontaktierung
der Probe mit dem Immunoaffinitätsassay
erzeugte Signal bestimmt, sondern auch das Gesamtsignal, das sich
seit der erstmaligen Verwendung des Bindungsassays ergibt. Als Gesamtsignal
wird hierbei dasjenige Signal bezeichnet, das sich als Differenz
zwischen dem Signal des neuen und unbenutzten Bindungsassays und
dem Signal nach Kontaktierung mit der Probe ergibt. Alternativ,
sofern der Sensor auf einem rein differentiellen Prinzip beruht,
kann als Gesamtsignal auch die Summe aller Signal betrachtet werden,
die sich bei den einzelnen Messungen ergeben, die insgesamt bereits
mit dem Bindungsassay durchgeführt
wurden. Unter Gesamtsignal wird also hier in der Beschreibung als
auch in den Ansprüchen
das akkumulierte Gesamtsignal verstanden.
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Überraschenderweise
hat sich herausgestellt, dass es auf diese Art und Weise möglich ist, aus
dem Gesamtsignal auf die Empfindlichkeit des Sensors zuverlässig zu
schließen,
selbst wenn dieser bereits mehrmals vorbenutzt wurde, ohne zwischendurch
regeneriert zu werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es
also, auf eine Regenerierung der Bindungsassays zu verzichten bzw.
keine Regenerierung durchzuführen
und so die damit verbundenen Nachteile zu vermeiden. Insbesondere
wird die Degenerierung der Empfindlichkeit des Sensors aufgrund
einer Regenerierung sowie der mit einer Regenerierung verbundene
Aufwand vermieden.
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Dies
ist möglich,
da die Verringerung der Sensorempfindlichkeit mit der Besetzung
der Bindungsstellen für
den Analyten korreliert. Diese korreliert jedoch bei hochspezifischen
und selektiven Bindungsassays ihrerseits mit dem wie oben beschriebenen
Gesamtsignal seit der ersten Kontaktierung des Assays mit dem Analyten.
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Das
gesamte Signal des Sensors kann also zwischen 0 und demjenigen Gesamtsignal
liegen, das sich bei vollständiger
Besetzung sämtlicher
Rezeptor-Bindungsstellen
durch Analyten ergibt. Vorteilhafterweise hat sich nun ergeben,
dass dieser Bereich in einige wenige bzw. mehrere Abschnitte unterteilt
werden kann, innerhalb derer die Empfindlichkeit des Sensors als
konstant betrachtet werden kann. Als konstant betrachtet werden
kann die Empfindlichkeit dabei dann, wenn ein bestimmtes Maß an Ungenauigkeit
(Standardabweichung) bzw. Linearität innerhalb dieses Bereiches
des Gesamtsignal eingehalten wird. Die entsprechenden Werte können aus Vergleichsversuchen
an Sensoren, beispielsweise mittels einer numerischen linearen Regression
ermittelt werden. Als Grenzwerte für einen Bereich bietet sich
an, die Standardabweichung auf < 0,1
anzunehmen bzw. eine Linearität > 0,98, vorteilhafterweise > 0,99 anzunehmen. Wird
dann ein bestimmtes Gesamtsignal gemessen, so kann der entsprechende Empfindlichkeitsbereich,
der diesem Gesamtsignal entspricht, ausgewählt werden und anhand dieser Empfindlichkeit
(Sensitivität)
aus dem Einzelsignal die Konzentration des Analyten bestimmt werden.
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Bei
neuen, noch unbenutzten Immunoassays ist nach dem erfindungsgemäßen Verfahren dann
möglich,
diesen so oft wiederzuverwenden, bis das Gesamtsignal den ersten
Grenzwert erreicht, bei dem der Bereich mit der anfänglichen
Empfindlichkeit des Bindungsassays endet und der nächste Bereich mit
verringerter Empfindlichkeit beginnt. Es ist also auch möglich, in
einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung einen Bindungsassay
bis zu einem Grenzwert des Gesamtsignals ohne Berücksichtigung
möglicher
Sensitivitätsänderungen
mehrfach ohne Regenerierung zu verwenden und dennoch eine ausreichende
Genauigkeit der Analytkonzentration ermitteln zu können.
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Im
folgenden werden nun Beispiele erfindungsgemäßer Verfahren beschrieben.
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1 zeigt die Cberflächenplasmonenresonanz
bei wiederholter Anwendung von Proben bei vier verschiedenen Spreeta®-Chips;
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2 zeigt das Bemittelte Signal
von vier Spreeta®-Chips bei wiederholtem
Auftrag von Proben; und
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3 zeigt die Oberflächenplasmonenresonanz
bei wiederholtem Auftrag von Proben auf einen einzelnen Spreeta®-Chip.
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Für die folgenden
Beispiele wurden ausschließlich
Chemikalien von analytischem Reinheitsgrad verwendet. Rinderserumalbumin
(BSA), polyclonale Anti-BSA-Antikörper, 11-Mercaptoundecansäure, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-Ethylcarbodiimide
(EDAC), N-Hydrosuccinimid
(NHS) wurden von der Firma Sigma-Aldrich
Chemical Co. (Deisenhofen, Deutschland) erworben.
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Als
Immunoaffinitätsschicht
wurde ein Spreeta®-Chip (Texas Instruments,
Dallas, USA) verwendet, der in einer Durchflusszelle mit einer Kapazität von 50 μl angeordnet
war. Diese Durchflusszelle wurde an eine peristaltische Pumpe angeschlossen. Zur
Erzeugung der Immunoaffinitätsschicht
wurde eine Anti-BSA-Schicht auf der Goldoberfläche des Spreeta®-Chips
erzeugt, in dem diese zuerst mit 1μM 11-Mercaptoethanol für zwei Stunden
bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Daraufhin wurde die Goldoberfläche unter
Verwendung eines Überschussvolumens
an Ethanol und PBS (10 mg/ml) zugewaschen. An diese Oberfläche wurde
nun Rinderserumalbumin (BSA) immobilisiert. Hierzu wurde die Oberfläche mit 100
mM EDAC/10 mM NHS für
10 min. inkubiert und daraufhin eine BSA-Lösung (10mg BSA/ml PBS) für eine Stunde
bei Zimmertemperatur auf die Goldoberfläche gegeben. Um restliche reaktive
Zentren auf der Goldoberfläche
zu blockieren, wurde diese anschließend nochmals mit 0,1 M Ethanolamin-Lösung für 10 min.
behandelt.
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Die
Messungen wurden anschließend
mit einem Anti-BSA-Antikörper als
Analyten durchgeführt, der
spezifisch und selektiv an das auf der Goldoberfläche des
Spreeta®-Chips
immobilisierte BSA bindet.
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Die
Probe wurde in die Durchflusszelle mit einem Autosampler (MIDAS,
Spark Holland BV, Emmen, Holland) und einer peristaltischen Pumpe (Amersham-Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Schweden) gegeben. Sowohl die peristaltische
Pumpe als auch der Autosampler wurden mittels eines Mikroprozessors
gesteuert. Das von dem Spreeta®-Chip erzeugte Oberflächenplasmonenresonanz-Signal (SPR-Signal)
wurde online auf ein PC mittels eines 12-bit-Wandlers übertragen.
Die gesamte Anordnung wurde in einem Inkubator bei einer Temperatur
von 37° C
temperiert.
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Vor
den Messungen wurde der Spreeta®-Chip
kalibriert, indem zuerst Luft und dann deionisiertes Wasser mit
einem Brechungsindex von 1,33 in die Durchflusszelle gegeben wurde.
Die Pumprate wurde auf 1,0 ml/min festgelegt. Die Grundlinienschwankung
wurde auf weniger als 5 m°/h
eingestellt. Zwischen den einzelnen Probeninjektionen in die Durchflusszelle
wurde in der Durchflusszelle PBS zirkuliert. Als Waschschritt wurde
jeweils eine 0,1 % Tween 20-Lösung
verwendet. Das Volumen der einzelnen injizierten Probe betrug 500 μl, wobei
der Spreeta®-Chip
jeweils für
10 min. mit jeder Probe inkubiert wurde. Nach einer derartigen Inkubation
wurde jeweils 1 min. mit Tween 20 und anschließend zweimal für jeweils
1 min. mit PBS die Oberfläche des
Spreeta®-Chips
gewaschen. Das SPR-Einzelsignal
wurde als Differenzsignal vor Kontaktierung des Spreeta®-Chips
mit der Probe und nach Kontaktierung des Spreeta®-Chips
mit der Probe bestimmt.
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1 zeigt nun die SPR-Signale
bei wiederholter Anwendung von Proben bei vier verschiedenen Spreeta®-Chips, die wie vorbeschrieben
präpariert
wurden. Vor der ersten Probenmessung wurde eine Standardprobe mit
einer bekannten Konzentration von 16,33 μg/ml auf die Spreeta®-Chips gegeben.
Wie in 1 zu erkennen
ist, betrug das Signal für
diese Standardprobe 37,22 m° mit
einer Standardabweichung von 0,56 m° (1,5 %). Dies bedeutet, dass
die erzeugten BSA-Schichten
auf sämtlichen vier
Spreeta®-Chips
mit hoher Reproduzierbarkeit auf die Anti-BSA-Antikörper reagieren.
Mit anderen Worten wurde die BSA-Schicht auf den vier Spreeta®-Chips in
reproduzierbarer Weise erzeugt.
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Daraufhin
wurden die Spreeta®-Chips mit insgesamt fünf verschiedenen
Konzentrationen von Anti-BSA-Antikörpern kontaktiert
und die zugehörigen
Einzelsignale aufgezeichnet. Dies ist in der letzten Spalte in 1 angegeben. Die Konzentrationen der
Proben (1), (2), (3), (4) und (5) betrugen 8,2 μg/ml, 9,8 μg/ml, 16,3 μg/ml, 24,5 μg/ml bzw. 49,0 μg/ml. Das
in der vorletzten Spalte in 1 angegebene
akkumulierte Signal schließt
auch das Signal der zuerst gegebenen Standardprobe mit ein.
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Obwohl
die Anti-BSA-Antikörper
nacheinander ohne Regenerierung der Chips auf die Chips gegeben
wurden, zeigt sich, dass die Signalkurven der Spreeta®-Chips
eine hohe Linearität
sowie eine Empfindlichkeit (Sensitivität) von 2,36 m°/(μg/ml) mit
einer Standardabweichung von 0,10 (4,2 %) zeigen. Die akkumulierten
Signale aus der zweitletzten Spalte sind ein Maß für die Belegung der Immunoaffinitätsschicht
mit Anti-BSA-Antikörpern.
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Für jeden
einzelnen Chip wurden die jeweiligen Einzelsignale aufsummiert,
um das akkumulierte Signal (Gesamtsignal) vor jeder neuen Probenbestimmung
zu ermitteln. Das Gesamtsignal über
sämtliche
fünf Proben
und die Standardprobe wurde zu 271,7 m° zu einer Standardabweichung
von 12,8 m° (4,6
%) ermittelt. In diesem Bereich des akkumulierten Signals wurde
also die Empfindlichkeit des Sensors nur unwesentlich verändert. Dies
bedeutet, dass der SPR-Chip innerhalb eines vorbestimmten Besetzungsgrades
der Rezeptoren auf der Immunoaffinitätsschicht mehrfach verwendet werden
kann, ohne Regenerierung zwischen den einzelnen Messungen. Die Linearität der einzelnen
Empfindlichkeiten wurde hier auf 0,99 bestimmt. Die Empfindlichkeit
wurde aus der Steigung eines Graphen, der mit linearer Regression
ausgewertet wurde, auf 2,45 m° (μg/ml) und die
Ungenauigkeit der Messungen zu 1,93 μg/ml bestimmt. Bei Messungen
mit einem jeweils unbenutzten und neuen Spreeta®-Chips
wurde aus der entsprechenden Kurve eine Steigung (Sensitivität) von 2,47
m°/(μg/ml) mit
einer Linearität
von 0,99 bestimmt. Dies zeigt, dass innerhalb eines akkumulierten
Gesamtsignals, das bis zu 200 m° betragen
kann, sich die Empfindlichkeit des Sensors nicht wesentlich ändert und
daher innerhalb dieses Gesamtsignalbereichs die Immunoaffinitätsschicht
mehrfach verwendet werden kann.
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2 zeigt nun den Auftrag
der durchschnittlichen Signalgröße der in 1 dargestellten vier Spreeta®-Chips
bei wiederholter Anwendung der Proben. Dabei wurde wie in 1 zu erkennen ist, die Reihenfolge
des Probenauftrags variiert. 2 zeigt
nun die einzelnen Meßwerte
mit den zugehörigen
Standardabweichungen und eine Gerade entsprechend einer linearen
Regressionsanalyse. Aus dieser Geraden wurde die Empfindlichkeit
auf 2,45 m°/(μg/ml) und
die Ungenauigkeit der Messung auf 1,93 μg/ml bestimmt.
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Da
die Immunoaffinitätsschicht
nur eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen aufweist, wird das
Sensorsignal mit zunehmender Anzahl von gemessenen Proben kleiner
und kleiner bei gleicher Probenkonzentration.
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Die
Sensorantwort wird daher bei wiederholter Verwendung des Chips saturieren,
so dass zuletzt ein maximales, akkumuliertes Gesamtsignal erreicht wird.
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Um
den Einfluß weiterer
Verwendungen des Spreeta®-Chips zu untersuchen, wurden wiederholt Proben
auf einen einzelnen SPR-Chip aufgebracht. Dabei wurden jeweils Zyklen
von insgesamt fünf Messungen
von Proben durchgeführt.
Diese fünf
Zyklen sind in 3 mit
den jeweiligen ermittelten durchschnittlichen Empfindlichkeiten,
Ungenauigkeiten, Linearität
und dem am Ende des jeweiligen Zyklus für den jeweiligen Zyklus erzielte
akkumulierte Signal dargestellt. Das gesamte akkumulierte Signal für jeden
Zyklus ergibt sich aus der Summe des akkumulierten Signals des jeweiligen
Zyklus zuzüglich sämtlicher
akkumulierter Signale der vorangegangenen Zyklen.
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Wie
aus 3 zu erkennen ist,
nimmt die Sensorempfindlichkeit graduell über die Zyklen ab, wobei diese
Abnahme des akkumulierten Signals eine Linearität von R = 0,987 mit einer Steigung
von –33,06
m°/Zyklus
und einem y-Achsenschnittpunkt von 200,68 m° aufweist. Dies bedeutet, dass
bis zum 6,1 Zyklen nacheinander durchgeführt werden können, bis
das maximale akkumulierte Sensorgesamtsignal erreicht wird.
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Es
zeigt sich, dass die Linearität
und die Ungenauigkeit innerhalb der einzelnen Zyklen sich innerhalb
eines Toleranzniveaus bewegen, so dass innerhalb jedes einzelnen
Zykluses die Empfindlichkeit als konstant betrachtet werden kann
und damit die Einzelmes sungen des einzelnen Zyklus mit der jeweils
für den
Zyklus spezifischen Empfindlichkeit ausgewertet werden können.
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Damit
ist es möglich,
mit Hilfe des akkumulierten Gesamtsignals, das sich bei einer Einzelmessung
ergibt, die Einzelmessung in einen bestimmten Zyklus einzuordnen
und so auszuwerten, auch wenn der Chip ohne Regenerierung vielfach
vorher verwendet wurde.
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Die
Einteilung der Zyklen kann dabei anhand eines Toleranzniveaus für die Linearitätskonstante, beispielsweise > 0,98, vorteilhafterweise > 0,99 erfolgen. Je
nach gewünschter
Genauigkeit der Auswertung der Messung können jedoch auch andere Toleranzniveaus,
beispielsweise 0,80, 0,90 oder 0,95 verwendet werden.
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In 3 wurden als Proben (1)
bis (5) dieselben Konzentrationen wie in 1 verwendet.
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Wie
in 2 gezeigt, weist
die Sensorantwort innerhalb jedes Zyklus eine gute Linearität auch ohne
chemische Regenerierung der Immunoaffinitätsschicht auf. Dies bedeutet,
dass Messungen wie in 3 auch
als Standardkurve (Eichkurve) verwendet werden können, um bei baugleichen Rezeptor-Liganden-Assays über das
akkumulierte Signal und einen Abgleich mit einer derartigen Eichkurve
Signale auszuwerten. Wenn beispielsweise das akkumulierte Signal
eines baugleichen Sensors 200 m° und
das Einzelsignal einer aufgebrachten Probe 15 m° beträgt, so kann die Konzentration
des Analyten in der Probe ermittelt werden, in dem auf 3 bezug genommen wird. Dies
bedeutet in diesem Fall, dass offenbar eine Messung innerhalb des
Bereiches für
das akkumulierte Gesamtsignal in Zyklus 2 (zwischen 171,8 m° und 308,77
m°) durchgeführt wurde
und folglich eine Empfindlichkeit von 1,55 m°/(μg/ml) zur Auswertung verwendet
werden kann.