DE10316689A1

DE10316689A1 - Dreidimensionaler Chip

Info

Publication number: DE10316689A1
Application number: DE2003116689
Authority: DE
Inventors: Dimitrij Dr. Plachov
Original assignee: Gavrushkin Alexander Dr
Current assignee: Gavrushkin Alexander Dr
Priority date: 2003-04-10
Filing date: 2003-04-10
Publication date: 2004-10-28
Also published as: EP1615717A1; WO2004089532A1; DE10316689A8

Abstract

Chip zur Untersuchung biologischen Materials mit einer Trägereinheit aus porösem Material, an dem die der Detektion der Probenmoleküle dienenden Referenzmoleküle immobilisiert sind.

Description

Die Erfindung betrifft einen Chip zur Untersuchung biologischer Proben sowie Verfahren zur Herstellung dieser Chips.
Biochips finden in jüngster Zeit eine umfangreiche Anwendung beispielsweise bei der Genanalyse, der Mutationsdetektion oder der Untersuchung von Protein/Protein-Interaktionen sowie – allgemein – bei der Diagnose von Erkrankungen oder der Abschätzung der entsprechenden genetischen Disposition.
Es sind sowohl Genchips als auch Proteinchips (Mikroarrays) bekannt.
Die bekannten Chips bestehen aus einem Träger und den auf dem Träger immobilisierten "Target"-Molekülen (nachfolgend auch Referenzmoleküle). Die Referenzmoleküle werden in Abhängigkeit von dem Untersuchungszweck ausgewählt. Das Prinzip des Biochips besteht darin, die Interaktionen zwischen dem bekannten Referenzmolekül und einem noch unbekannten Probenmolekül – beispielsweise aus einem Patienten oder einem anderen biologischen Material – nachzuweisen und aus diesem Nachweis Rückschlüsse für den Untersuchungszweck zu ziehen.
Zum Nachweis von Nukleinsäuren müssen die Probenmoleküle zunächst mit den referenzmolekülen hybridisieren. Bei Proteinchips werden Protein-Proteininteraktionen untersucht, beispielsweise die Interaktionen zwischen einem immobilisierten Antigen als Referenzmolekül und einem Antikörper aus der Patientenprobe. Die erfolgten Interaktionen werden häufig durch Fluoreszenz- oder Isotopenmarkierungen sichtbar gemacht. Die Auswertung der Chips setzt voraus, daß die Position der Referenzmoleküle auf dem Chip bekannt ist.
Es ist eine Vielzahl von Methoden der Chip-Herstellung bekannt. Diese basieren häufig entweder auf der direkten Synthese der Referenzmoleküle auf dem Träger oder aber der Vorabsynthese der Referenzmoleküle und ihrem anschlie ßenden Immobilisieren auf den Träger. Die Notwendigkeit, die Position der Referenzmoleküle auf dem Chip zu determinieren, macht die bekannten Verfahren aufwendig und kostenintensiv.
Biochips haben im Vergleich zu anderen Nachweismethoden den besonderen Vorteil, daß sie die Bearbeitung einer komplexen Fragestellung erlauben. Die Festlegung der Proben auf dem Träger ermöglicht darüber hinaus eine weitgehend automatisierte Auswertung der Ergebnisse, die von den Möglichkeiten der Informationstechnologie unterstützt wird. Gleichwohl haben die bekannten Biochips noch nicht das gewünschte Maß an Sensitivität und Spezifität erreicht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Biochip bereitzustellen, der insbesondere hinsichtlich seiner Sensitivität einen Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik darstellt. Des weiteren werden Verfahren vorgeschlagen, die eine möglichst einfache, schnelle und kostengünstige Herstellung dieser Chips ermöglichen.
Unter Sensitivität wird im vorliegenden Zusammenhang die kleinste Konzentration an Probemolekülen verstanden, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Chips noch detektiert werden kann.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung gemäß dem Hauptanspruch. Die Herstellungsverfahren sind jeweils Gegenstand unabhängiger Verfahrensansprüche.
Der vorliegenden Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, ein poröses Material als Träger des Biochips zu verwenden und die Referenzmoleküle an diesem porösen Material zu immobilisieren. Die Herstellungsverfahren basieren übereinstimmend darauf, diese Polymere derart anzuordnen, daß sie im einen dreidimensionalen Chip darstellen.
Der erfindungsgemäße Chip hat aufgrund des porösen Materials den Vorteil, daß für die Immobilisierung der Referenzmoleküle eine vergrößerte Oberfläche zur Verfügung steht. Die Dichte der Referenzmoleküle pro Trägereinheit kann somit erhöht werden.
Des weiteren kann die Verwendung von porösem Material es ermöglichen, auf eine weitere feste Trägersubstanz im Sinne einer Stützschicht zu verzichten. Dies hat nicht nur produktionstechnische und kostenminimierende Vorteile, sondern ermöglicht darüber hinaus den allseitigen Zugang der Probenmoleküle aus der Untersuchungsprobe zu den Referenzmolekülen. Im Gegensatz dazu ist der Zugang zu den Probenmolekülen bei bekannten Chips immer nur einseitig möglich. Durch den erleichterten Zugang wird eine Verbesserung der Sensitivität des Chips erreicht.
Als Trägermaterial können ein oder mehrere Polymere aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Polyethylen, Polyviniylchlorid, Polypropylen, Polyethylentereftalat (PET), Polyamid, Polyimid, Polystyrol, Polyvinylidenchlorid (PVDC), Polycarbonat, Cellophan, Acetat oder Polysulfonat.
Eine Übersicht über die vorteilhaften Eigenschaften dieser Polymere gibt die Tabelle 1.
Der erfindungsgemäße Chip kann lediglich aus einer Schicht des Trägermaterials bestehen. Die notwenige Stabilität der Schicht kann durch die Wahl einer dafür geeigneten Schichtdicke erreicht werden. Vorteilhafterweise werden aber verschiedenen Schichten kombiniert. Die Schichten können aus demselben oder aber aus verschiedenen Polymeren bestehen.
Vorteilhafterweise werden die Referenzmoleküle noch vor dem Zusammenbringen der Schichten auf den Polymeren immobilisiert. Die Immobilisierung der Referenzmoleküle auf dem Träger erfolgt mittels der dem Fachmann bekannten Methoden. Die Schichten mit jeweils einer Qualität von Referenzmolekülen werden nachfolgend als "Trägereinheiten" bezeichnet.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform besteht der Chip aus einer Vielzahl von Trägereinheiten, die – schachbrettartig – in X- und Y-Richtung sowie übereinander in Z-Richtung nebeneinander liegen.
Durch die Erhöhung der Anzahl der verwendeten Trägereinheiten läßt sich die Anzahl der unterschiedlichen für die Untersuchung bereitgestellten Referenzmoleküle variieren. Selbstverständlich können einzelne Trägereinheiten auch mehrfach – z.B. zu Kontrollzwecken – vorkommen.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die einzelnen Schichten der Trägereinheiten 0,01 bis 1 Mikrometer betragen. Die Fläche der Trägereinheiten kann bis zu einigen Quadratmetern ausgedehnt sein.
Bei einigen als poröses Trägermaterial verwendeten Polymeren, oder bei sehr geringen Schichtdicken, kann es vorteilhaft sein, die Trägereinheiten zumindest teilweise von Stützmitteln zu umgeben. Auch kann weitere Stützmittel auf der Oberseite oder Unterseite des Trägers vorteilhaft sein. Diese können ebenso aus durchlässigem oder porösem Material bestehen. Sie sind in der Regel nicht mit Referenzmolekülen bestückt. Darüber hinaus können die Schichten über Haltemittel, wie beispielsweise Klammern, miteinander verbunden sein.
Die erfindungsgemäßen Träger lassen sich leicht und kostengünstig herstellen.
In einer ersten Alternative beginnt der Herstellungsprozeß damit, einzelne Polymerschichten mit Referenzmolekülen zu beschicken. Die Anzahl der Schichten variiert in Abhängigkeit von dem Untersuchungszweck. In einem nächsten Schritt werden die Schichten (Trägereinheiten) zu einem ersten Block aufeinandergelegt und beispielsweise mit einem Mikrotom rechtwinklig zu der Schichtebene geschnitten. Daraus ergeben sich zunächst flächenartige Schnitte mit „Bändern" aus Trägereinheiten, die jeweils unterschiedliche Referenzmoleküle enthalten.
Schnitte von unterschiedlichen Blöcken können erneut zu einem zweiten Block aufeinandergelegt werden ("Multilayerblocks"). Auch dieser Block wird in dünne schichtförmige Einheiten rechtwinklig zu der Ebene der Schichten geschnitten.
Im Ergebnis entsteht bei dieser Kombination verschiedener Trägereinheiten mit anschließendem Schnitt eine "Multimatrix", die jede Trägereinheit, die ursprünglich in den jeweiligen Blöcken eingesetzt wurde, enthält. Dieses Herstellungsprinzip ist in der 1 dargestellt.
Bei Kenntnis der eingesetzten Schichten und Kenntnis der Schnittführung sowie erneutem Zusammensetzen der Schnitte läßt sich die Position einer jeden Trägereinheit zweifelsfrei vorherbestimmen oder auch nachträglich nachvollziehen.
Der erfindungsgemäße Träger läßt sich alternativ auch über ein zweites Verfahren herstellen. Dieses wird in 2 skizziert:
Dieses Verfahren besteht im Kern darin, die Trägereinheiten zunächst auf einem Stützmittel anzuordnen und am gegenüberliegenden Ende der Trägereinheiten mit einer verschieblichen Maske zu bedecken. Diese Maske weist Öffnungen auf, durch die die Trägermaterialien mit Reagenzien – beispielsweise auch mit den Referenzmolekülen – beschickt werden können. Die Öffnungen können beispielsweise zylindrisch oder konisch ausgestaltet sein. Die Maske selber kann über die bekannten Verfahren der Lithographie erzeugt werden.
Nach der in der 2 dargestellten Übersicht kann eine Vorrichtung eingesetzt werden, die eine Maske aus einem festen Material von 400 bis 500 μm Dicke umfaßt. Sie weist konische Öffnungen auf, deren oberer Durchmesser beispielsweise 100 μm und der untere 5 μm betragen kann. Diese Maske ist in X- und Y-Richtung relativ zu den Stützmitteln 4, 2 verschieblich. Es sind auch anderen Abmessungen möglich.
Die Stützmittel bestehen in dieser Ausführungsform aus 50 bis 100 μm starken Plastikeinheiten mit Durchlässen von 5 bis 10 μm. Das Trägermaterial selber ist in Aufnahmemitteln 3 angeordnet, die in der dargestellten Ausführungsform 50 μm dick sein können. Die in diesen Stützmitteln vorgesehenen Aufnahmen für das Trägermaterial haben ebenso einen Durchmesser von 5 bis 10 μm. Diese Ausnehmungen können vollständig aus dem porösen Trägermaterial bestehen oder aber mit ihm angefüllt sein.
Eine schematische Darstellung der mit verschiedenartigen Trägermaterialien gefüllten Ausnehmungen (kugelförmig, stäbchenförmig oder gelartig) ist in den 4 und 5 erkennbar.
Zur Beschickung des Chips wird die Maske in X- und Y-Richtung relativ zu den Stützmitteln bewegt. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis alle gewünschten Trägereinheiten das Reagenz enthält. Dabei entsteht zunächst ein Chip mit verschiedenen Trägereinheiten, die sich in X- und Y-Richtung ausdehnen. Dieser Chip ist demnach zweidimensional. Zur Fertigstellung des Chips kann die Maske sowie das ihr gegenüberliegende Stützmittel, auf dem die Trägereinheit angeordnet sind, entfernt werden. Somit wird das Trägermaterial erneut von beiden Seiten dem Probenmaterial zugänglich.
Die in den Ausnehmungen befindlichen Träger können mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens beispielsweise sukzessiv mit Nukleinsäuren bestückt werden (6). Dazu werden Oligonukleotide in definierter Reihenfolge über den Träger gegeben. Dieses „Wachstum" der Referenzmoleküle auf dem Träger ist ebenso in der 7 dargestellt.
In einer weiteren Ausführungsform können die derart hergestellten Chips in Z-Richtung aufeinandergelegt werden, so daß die Trägereinheiten fluchten. Damit entsteht im Ergebnis ein dreidimensionaler Chip (2).
Die Auswertung der erfindungsgemäßen Träger setzt voraus, daß die mit den Referenzmolekülen interagierenden Probenmoleküle innerhalb der Trägereinheit detektierbar sind.
Die Untersuchung dreidimensionaler Anordnungen ist beispielsweise durch die konfokale Laserscanmikroskopie (LCSM) möglich. Diese erlaubt eine Auswertung auch unterhalb der Chipoberfläche.
Die Verwendung der konfokalen Laserscanmikroskopie zur Auswertung des erfindungsgemäßen Chips wird in 3 schematisch dargestellt:
Die dargestellten Schritte 1 bis 4 zeigt die Aufnahmen der Signale entlang der Z-Achse. Der Schritt 5 gibt die Bewegung entlang der Y-Achse wieder.
Im Schritt 1 tritt der Laserstrahl durch die licht-brechende Platte zu dem Objektiv des Mikroskops und wird damit auf Punkte mit einem Durchmesser von 5 bis 10 μm fokussiert. Damit wird die Lumineszenz in dem Spot angeregt. Als Ergebnis dieser Anregung wird ein zweiter Lichtstrahl durch die Platte zu dem Detektor geschickt. Das Signal und deren räumliche Koordinaten werden dokumentiert. Danach bewegt sich der Laser und fokussiert auf einen weiteren Spot.

Claims

Chip zur Untersuchung biologischen Materials mit einer Trägereinheit aus porösem Material, an dem die der Detektion der Probenmoleküle dienenden Referenzmoleküle immobilisiert sind.
Chip nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch mindestens zwei Trägereinheiten mit unterschiedlichen Referenzmolekülen, die in der X- oder Y-Achse aneinander liegen.
Chip nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einige der Trägereinheiten in der Z-Achse aneinander liegen.
Chip nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägereinheiten mindestens teilweise von Stützmitteln oder Haltemitteln umgeben sind.
Chip nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Trägereinheiten eins der folgenden Polymere umfassen: Polyethylen, Polyviniylchlorid, Polypropylen, Polyethylentereftalat (PET), Polyamid, Polyimid, Polystyrol, Polyvinylidenchlorid (PVDC), Polycarbonat, Cellophan, Acetat oder Polysulfonat.
Verfahren zur Herstellung eines Chips nach einem der vorherigen Ansprüche mit folgenden Schritten: a. Immobilisieren einer Gruppe von Probenmolekülen auf einer ersten Trägereinheit und Immobilisieren einer zweiten Gruppe von Probenmolekülen auf einer zweiten Trägereinheit, b. Anordnen der Trägereinheiten zu einem Block mit gemeinsamer Z-Achse, c. Anfertigen von Schnitten rechtwinklig zur Ebene des Blockes, d. Wiederholen der Schritte a. bis b. zur Bereitstellung eines zweiten Blockes aus Trägereinheiten sowie Schnitten davon, e. Kombinieren der Schnitte aus c. und d. zu einem Block mit gemeinsamer Z-Achse, f. Wiederholen des Schrittes von b.
Verfahren zur Herstellung eines Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit folgenden Schritten: a) Anordnen von Trägereinheiten aus porösem Material auf einem Stützmittel b) Bedecken der Trägereinheiten an ihrem dem Stützmittel gegenüberliegenden Ende mit einer Maske mit mindestens einer Öffnung, die einen Durchlaß zu einer unterhalb der Maske liegenden Trägereinheit ermöglichen kann. c) Verfahren der Maske, so daß die Öffnung über eine Trägereinheit liegt. d) Beschicken der Trägereinheit mit Referenzmolekülen. e) Untersuchung von biologischen Molekülen eines dreidimensionalen Trägers gekennzeichnet durch die Verwendung der konfokalen Laserscanmikroskopie
Verwendung der konfokalen Laserscanmikroskopie zur Auswertung eines dreidimensionalen Chip.