DE10314750A1

DE10314750A1 - Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts

Info

Publication number: DE10314750A1
Application number: DE2003114750
Authority: DE
Inventors: Werner Dr. Knebel
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2004-11-04

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts, mit einer zur Mehrphoton-Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle (2), einem Mikroskopobjektiv (6), einer Kondensoroptik (9), einem von der Lichtquelle (2) zum Objekt (1) verlaufenden Beleuchtungsstrahlengang (3) und einem vom Objekt (1) zu mindestens zwei Detektoren (8, 10, 11, 12, 19, 20) verlaufenden Detektionsstrahlengang (7), wobei mindestens ein Detektor (10, 11, 12) auf der dem Objekt (1) abgewandten Seite der Kondensoroptik (9) angeordnet ist. Ein bereits bestehendes Rastermikroskop ist in möglichst einfacher Weise um einen Hoffman-Modulations-Kontrast-Modus nachrüstbar, wobei eine kompakte Bauweise angestrebt ist. Das erfindungsgemäße Rastermikroskop ist hierzu dadurch gekennzeichnet, dass dem Mikroskopobjektiv (6) ein zum Hoffman-Modulations-Kontrast geeignetes Kontrastmittel (13) zugeordnet ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts, mit einer zur Mehrphotonen-Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, einem Mikroskopobjektiv, einer Kondensoroptik, einem von der Lichtquelle zum Objekt verlaufenden Beleuchtungsstrahlengang und einem vom Objekt zu mindestens zwei Detektoren verlaufenden Detektionsstrahlengang, wobei mindestens ein Detektor auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordnet ist.
Unter Rastermikroskopen im Sinn der vorliegenden Erfindung sind Mikroskope zu verstehen, bei denen das zu detektierende Objekt mit einem Beleuchtungsmuster beleuchtet und abgerastert wird. Das vom Objekt reflektierte Beleuchtungslicht und/oder emittierte Fluoreszenzlicht wird hierbei von den Detektoren detektiert. Dieser Rastervorgang erfolgt bei einem punkt- oder kreisförmigen Beleuchtungsmuster üblicherweise mäanderförmig, so dass das Objekt mit dem Beleuchtungsmuster in ähnlicher Weise abgerastert wird, wie beispielsweise ein Elektronenstrahl auf den Bildschirm einer Braun'schen Röhre gelenkt wird. Eine Objektdetektion mit einem linienförmigen Beleuchtungsmuster ist ebenfalls denkbar, in diesem Fall wird das linienförmige Beleuchtungsmuster entlang der Richtung quer zur Linie relativ zum Objekt bewegt.

Insbesondere bei biomedizinischen Anwendungen werden seit geraumer Zeit ganz besondere Rastermikroskope, nämlich konfokale Rastermikroskope, dann eingesetzt, wenn – verglichen zu konventionellen Auflicht- oder Durchlichtmikroskopen – eine verbesserte Auflösung entlang der optischen Achse benötigt wird. Bezüglich der Ausgestaltung und Einsatzmöglichkeiten konfokaler Rastermikroskope wird beispielsweise auf die Literaturstelle „Handbook of biological confocal microscopy", Editor: J. Pawley, Plenum Press 1995 verwiesen.

Bei der Mehrphotonen-Rastermikroskopie werden Fluoreszenzphotonen detektiert, die auf einen Mehrphotonenanregungsprozess zurückzuführen sind. Bei Mehrphotonenanregungsprozessen erfolgt der Übergang von einem Zustand eines Fluorochroms in den angeregten Zustand durch die simultane Absorption mehrerer Photonen. Die Wahrscheinlichkeit eines N-Photonenübergangs ist von der N-ten Potenz der Anregungslichtleistung des Beleuchtungslichts abhängig. Zum Erzielen hoher Lichtleistungen wird üblicherweise das zur Beleuchtung dienende Anre gungslicht gepulst und in ein kleines Volumen bzw. Beleuchtungsmuster fokussiert. Lediglich beispielhaft wird auf die US 5 034 613 bzw. DE 44 14 940 hingewiesen, aus denen konfokale Rastermikroskope bekannt sind, bei denen ein Objekt mit einem fokussierten Lichtstrahl angeregt wird, wobei hier Zweiphotonenübergänge mit gepulstem Licht angeregt werden. Die Pulsdauern der einzelnen Pulse beträgt Femptosekunden bzw. Picosekunden.

Der Hoffman-Modulations-Kontrast für konventionelle Hellfeld-Mikroskope ist beispielsweise in der Literaturstelle Optimizing Light Microscopy for Biological and Clinical Laboratories, Barbara Foster, ASCLS, Kendall/Hunt Publ. Com., 1997, Seiten 66-68 beschrieben. Hiernach wird das Objekt von der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik mit Licht beleuchtet. Hierbei ist eine Spaltapertur in der rückwärtigen Fokalebene der Kondensoroptik angeordnet, wobei die räumlichen Ausmaße des Spalts nur einen kleinen Teil des dort vorliegenden Strahldurchmessers ausmacht. Dieses Licht durchläuft nach dem Durchgang durch das Objekt das Mikroskopobjektiv. In der rückwärtigen Fokalebene des Mikroskopobjektivs – auf der dem Objekt abgewandten Seite – ist ein Kontrastmittel, ein sogenannter Modulator, entsprechend angeordnet. Dieses Kontrastmittel ist eine Art Filter und umfasst Bereiche mit unterschiedlichen Transmissionseigenschaften für das Licht des Hoffman-Modulations-Kontrasts. Das Kontrastmittel ist derart angeordnet, dass die Bereiche auf das durch das Mikroskopobjektiv verlaufende Licht des Hoffman-Modulations-Kontrasts wirken. Hierdurch ist ein Helligkeitsgradient für dieses Licht erzeugt, der kausal für diese Kontrastierungsart verantwortlich ist. Mit dem Hoffman-Modulations-Kontrast können Gradienteninformationen des Objekts sichtbar gemacht werden, d.h. Brechungsindexunterschiede bzw. Brechungsindexübergänge. Nachteilig bei dieser Anordnung ist, dass eine zusätzliche Lichtquelle notwendig ist. Dies ist teuer und in der Realisierung konstruktiv aufwendig, da diese kondensorseitig einzukoppeln ist. Bereits bestehende Rastermikroskopsysteme ohne Hoffman-Modulations-Kontrast sind nur mit erheblichem Aufwand auf diese Kontrastierungsart nachzurüsten.

Aus der DE 195 14 358 C2 ist das sogenannte Dodt-Verfahren bekannt, bei dem insbesondere der Hoffman-Modulations-Kontrast in Verbindung mit einem konventionellen Mikroskop verbessert wird. Das Kontrastmittel ist dort im Beleuchtungsstrahlengang der Lichtquelle nachgeordnet, wobei eine Zwischenabbildung vorge sehen ist, die eine Fourierebene aufweist, in der das Kontrastmittel angeordnet ist. Eine Nachrüstung eines bereits bestehenden Rastermikroskopsystems ohne Hoffman-Modulations-Kontrast auf diese Kontrastierungsart erfordert eine umfangreiche Änderung des Beleuchtungsstrahlengangs.

Nun könnte der Hoffman-Modulations-Kontrast in Verbindung mit der Mehrphotonen-Rastermikroskopie angewandt werden, wie das beispielsweise in der DE 100 03 570 angedeutet ist. Insbesondere im Zusammenhang mit physiologischen biomedizinischen Applikationen ist die Anwendung des Hoffman-Modulations-Kontrasts zusammen mit der Mehrphotonen-Rastermikroskopie wünschenswert. Vor diesem Zusammenhang ist vor allem ein Nachrüsten bereits bestehender, also beim Anwender installierter Mehrphotonen-Rastermikroskope erforderlich. Das Einbringen des Kontrastmittels in den Beleuchtungsstrahlengang eines Mehrphotonen-Rastermikroskops nach der in der DE 195 14 358 C2 vorgeschlagenen Weise ist aufgrund der erforderlichen Zwischenabbildung zwischen Lichtquelle und Rastermikroskop nicht nur platzraubend sondern ganz besonders schwierig zu justieren und daher mit erheblichem Aufwand verbunden.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein bereits bestehendes Rastermikroskop in möglichst einfacher Weise um einen Hoffman-Modulations-Kontrast-Modus nachzurüsten wobei eine kompakte Bauweise angestrebt wird.

Das erfindungsgemäße Rastermikroskop der gattungsbildenden Art löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist ein solches Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts dadurch gekennzeichnet, dass dem Mikroskopobjektiv ein zum Hoffman-Modulations-Kontrast geeignetes Kontrastmittel zugeordnet ist.

Ein Kontrastmittel im Sinn der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein optisches Bauteil, das einen Bereich mit sich ändernder Transmissionseigenschaft für das Licht des Hoffman-Modulations-Kontrasts oder einzelne Bereiche mit unterschiedlichen Transmissionseigenschaften für das Licht des Hoffman-Modulations-Kontrasts aufweist.

Erfindungsgemäß ist zunächst erkannt worden, dass eine möglichst kompakte Bauweise dann gewährleistet ist, wenn das Kontrastmittel dem Mikroskopobjektiv zugeordnet ist. So könnte das Kontrastmittel zwischen Lichtquelle und Mikroskopobjektiv unmittelbar vor dem Mikroskopobjektiv angeordnet sein. Dies könnte beispielsweise in einer Aufnahme im Objektivrevolver eines konventionellen Mikroskopstativs erfolgen, an dem die für ein Rastermikroskop spezifischen Baugruppen adaptiert sind. Eine direkte Adaption des Kontrastmittels an das Gehäuse des Mikroskopobjektivs wäre ebenfalls denkbar, beispielsweise mittels eines Schnapp- oder Schraubverschlusses oder dergleichen.

Ein Nachrüsten bereits bestehender Rastermikroskope ist in ganz besonders vorteilhafter Weise einfach dadurch möglich, dass ein entsprechendes Mikroskopobjektiv in das Rastermikroskop eingebracht wird, wobei dem Mikroskopobjektiv ein Kontrastmittel – in welcher Form auch immer – zugeordnet ist. Somit muss keine Zwischenabbildung zwischen der Lichtquelle und dem Stativ des Rastermikroskops in den Beleuchtungsstrahlengang allein zur Realisierung eines Hoffman-Modulations-Kontrast-Modus eingefügt werden. Eine aufwändige Justage dieses Teils des Beleuchtungsstrahlengangs ist somit nicht erforderlich. Dementsprechend entspricht der Platzbedarf des in erfindungsgemäßer Weise modifizierten Rastermikroskops dem des bereits bestehenden Rastermikroskops.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Kontrastmittel im Wesentlichen in einer Fourierebene des Mikroskopobjektivs angeordnet. Hierbei könnte es sich um eine Fourierebene handeln, die unmittelbar in der Umgebung des Mikroskopobjektivs oder sogar darin liegt.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Kontrastmittel im Mikroskopobjektiv angeordnet. Hierdurch ist in besonders vorteilhafter Weise eine kompakte Bauweise und darüber hinaus auch eine ganz besonders einfache Handhabung möglich. Da mit dem Einschrauben des Mikroskopobjektivs in einen Revolver des Rastermikroskops eine wesentliche Voraussetzung zur Durchführung des Hoffman-Modulations-Kontrasts erfüllt ist, ist lediglich eine Modifikation der restlichen erforderlichen Komponenten – beispielsweise ein entsprechend betreibbarer Detektor – im Rastermikroskop vorzusehen bzw. zu modifizieren.

Im Konkreten umfasst das Kontrastmittel mehrere Bereiche, die für das Licht der Lichtquelle jeweils einen unterschiedlichen Transmissionskoeffizienten aufweisen. Hierbei nehmen die Bereiche vorzugsweise nur einen geringen Anteil des auf den Beleuchtungsstrahlengang wirkenden Teils des Kontrastmittels in Anspruch. Das Kontrastmittel hat bei einer geeigneten Anordnung im optischen Strahlengang die Wirkung eines Phasenfilters, das einen Phasengradienten erzeugt.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind drei Bereiche vorgesehen, die für das Licht der zur Mehrphotonen-Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle einen Transmissionskoeffizienten von jeweils im Wesentlichen 0,01, 0,15 und 1,0 aufweisen. Dies entspricht im Wesentlichen dem Aufbau des Kontrastmittels, das beim klassischen Hoftman-Modulations-Kontrast zum Einsatz kommt, wie es letztendlich in der eingangs genannten Literaturstelle zum Hoffman-Modulations-Kontrast beschrieben ist.

Ein Kontrastmittel mit mehreren Bereichen unterschiedlicher Transmissionskoeffizienten könnte eine beschichtete optische Platte umfassen. Diese könnte mit einer Interferenz- oder Absorptionsbeschichtung versehen sein, wobei eine Interferenzbeschichtung bevorzugt wird. Falls nämlich das Kontrastmittel eine Absorptionsbeschichtung umfasst, würde sich das Kontrastmittel während des Betriebs sehr schnell erwärmen, da die Absorptionsbeschichtung Licht im Infrarot-Bereich der zur Mehrphotonen-Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle absorbieren würde. Eine mit einer Interferenzbeschichtung versehene optische Platte reflektiert das nicht transmittierte Licht, so dass eben keine Erwärmung des Kontrastmittels auftritt. Üblicherweise dient zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts gepulstes Licht einer Wellenlänge in einem Wellenlängenbereich von 700 bis 1000 nm. Für das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht, insbesondere für Licht im sichtbaren Spektralbereich weist das Kontrastmittel einen Transmissionskoeffizienten von im Wesentlichen 1,0 auf.

Die zum Hoffman-Modulations-Kontrast erforderliche Segmentoptik ist in einer konkreten Ausführungsform der Kondensoroptik zugeordnet. So könnte beispielsweise die Segmentoptik in einer Filterposition eines Filterrads eingebracht sein, wobei bei einer Kondensorbaugruppe eines konventionellen Mikroskopstativs üblicherweise ein Filterrad vorgesehen ist. Somit kann diese Anordnung der Segmentoptik ge wählt werden, wenn die für ein Rastermikroskop spezifischen Baugruppen an einem konventionellen Mikroskopstativ adaptiert sind.

Nun könnte die Segmentoptik auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordnet sein. Dort ist üblicherweise auch das bereits beschriebene Filterrad des Kondensors eines konventionellen Mikroskopstativs wirksam, so dass die Segmentoptik in einer Filterposition des Filterrads eingebracht werden kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Segmentoptik im Wesentlichen in einer Fourierebene der Kondensoroptik angeordnet. Insbesondere wenn die Kondensoroptik derart ausgebildet ist, dass eine Fourierebene auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik liegt, könnte die Segmentoptik in dem oben beschriebenen Filterrad angeordnet sein. Hierdurch ist in vorteilhafter Weise eine kompakte Bauweise erzielbar, bei der die einzelnen optischen Komponenten nahezu unmittelbar nacheinander angeordnet sind. Eine einfache Handhabung ist durch eine Einbringung der Segmentoptik in ein Filterrad gewährleistet. Jedenfalls kann der Hoffman-Modulations-Kontrast durch einfaches Drehen des Filterrads aktiviert bzw. deaktiviert werden. Ein Nachrüsten eines bereits bestehenden Rastermikroskops kann bei einer solchen Anordnung nahezu gänzlich ohne Justiervorgänge durchgeführt werden.

Im Konkreten weist die Segmentoptik für das vom Objekt kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht einen Transmissionskoeffizienten von im Wesentlichen 1,0 auf. Eine nahezu verlustfreie Detektion dieses Lichts bei zusätzlichem Hoffman-Modulations-Kontrast ist somit möglich, da zumindest die Segmentoptik einen nahezu maximalen Transmissionskoeffizienten aufweist und das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht hierdurch in seiner Leistung nicht vermindert wird. Die Wellenlängen des vom Objekt kommenden Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts liegen üblicherweise einen Wellenlängenbereich von 400 bis 700 nm.

Die Segmentoptik weist nur in einem geringen Bereich einen Transmissionskoeffizienten von im Wesentlichen 1,0 für das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienende Licht der Lichtquelle auf. Im übrigen Bereich der Segmentoptik ist für dieses Licht vorzugsweise ein Transmissionskoeffizient von nahezu 0 vorgesehen. Insoweit wird zur Durchführung des Hoffman-Modulations-Kontrasts mit einem geeignet angeordneten Detektor lediglich das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienende Licht der Lichtquelle detektiert, das die Segmentoptik passiert, mit anderen Worten also durch diesen Bereich hindurchtritt. In diesem Bereich ist der Transmissionskoeffizient für das vom Objekt kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht ebenfalls 1,0, so dass auch dieser Bereich zur Detektion des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts genutzt werden kann. Hierdurch kann in ganz besonders vorteilhafter Weise eine hohe Signalausbeute bei der Detektion des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts erzielt werden, das ohnehin eine geringe Intensität aufweist.

Zum Erzielen eines brauchbaren Hoffman-Modulations-Kontrasts ist die Segmentoptik derart angeordnet, dass der vom Kontrastmittel beeinflusste Teil des zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienenden Lichts der Lichtquelle im Wesentlichen den geringen Bereich der Segmentoptik durchläuft. Insoweit sind die beiden Mittel in ihrer relativen Anordnung aufeinander angepasst. Bei geeigneter Strahlführung ist der zur Erzeugung des Hoffman-Modulations-Kontrasts dienende Lichtweg bzw. Teilstrahlengang dem Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang überlagert.

Zur Justage bzw. Einstellung des Hoffman-Modulations-Kontrasts ist die Segmentoptik und/oder das Kontrastmittel um eine Drehachse drehbar angeordnet, die vorzugsweise parallel zur optischen Achse des Detektionsstrahlengangs oder des Beleuchtungsstrahlengangs ist. Falls beispielsweise die Segmentoptik in einem der Kondensoroptik zugeordneten Filterrad eingebracht ist, könnte die Segmentoptik hierbei in einer drehbaren Fassung im Filterrad untergebracht sein. Da Filterräder mit diesen Eigenschaften aus dem Stand der Technik bekannt sind, kann hierzu auf Standardkomponenten zurückgegriffen werden und somit eine Einstellmöglichkeit kostengünstig geschaffen werden. Alternativ oder zusätzlich könnte beispielsweise auch das im Mikroskopobjektiv angeordnete Kontrastmittel drehbar angeordnet sein, das beispielsweise über einen drehbar angeordneten Ring am Mikroskopobjektivgehäuse betätigt werden könnte.

Grundsätzlich können die zum Hoffman-Modulations-Kontrast erforderlichen Komponenten beispielsweise durch eine Aufnahme in ein Filterrad oder ähnliches in den Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengang verbracht werden und/oder justiert werden. Für physiologische Applikationen ist jedoch ein erschütterungsfreies Arbeiten erforderlich, da ein noch lebendes Objekt unter Verwendung von Mikro-Pipetten untersucht wird und eine Erschütterung am Stativ des Rastermikroskops gegebenenfalls das Objekt zerstören kann. Eine Verstellung der für den Hoffman-Modulations-Kontrast erforderlichen Komponenten ist jedoch nach einmaliger Justage üblicherweise nicht erforderlich, so dass solche Untersuchungen in vorteilhafter Weise nach entsprechender Justage durchgeführt werden können.

Das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht könnte beispielsweise mit mindestens einem Detektor detektiert werden, der auf der der Lichtquelle zugewandten Seite des Mikroskopobjektivs angeordnet ist. Insoweit könnte hierzu ein konventioneller Auflicht-Detektionsstrahlengang vorliegen, insbesondere auch dann, falls das Rastermikroskop einen konfokalen Strahlengang aufweist. Ein solcher Detektor detektiert das vom Mikroskopobjektiv aufgesammelte Licht, das vom Objekt kommt.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform detektiert der Detektor vom Objekt kommendes Licht, das zwischen dem Mikroskopobjektiv und einer Rastereinrichtung des Rastermikroskops verläuft. Bei einer solchen Detektionsanordnung handelt es sich um eine sogenannte Non-Descan-Anordnung, da das vom Objekt kommende sich in gleicher Weise wie das zur Objektbeleuchtung dienende Licht bewegt, das von der Rastereinrichtung ausgelenkt wird. Hierdurch ist eine effiziente Detektion des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts möglich, da keine Detektionslochblende erforderlich ist und hierdurch auch keine Lichtverluste beim konfokalen Detektionsstrahlengang auftreten. Eine Detektionslochblende ist bei Mehrphotonen-Anregungsprozessen nicht erforderlich, da das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht lediglich aus dem Fokusbereich des konfokalen Beleuchtungsmusters stammt. Eine konfokale Detektionslochblende würde aufgrund des sich bewegenden Detektionsstrahlengangs an dieser Stelle so gut wie kein Licht durchlassen.

Zur Detektion zumindest eines Teils des zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht dienenden Lichts der Lichtquelle ist in einer bevorzugten Ausführungsform ein auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordneter Detektor vorgesehen. Dieser Detektor detektiert letztendlich das Licht, das zur Erzeu gung des Hoffman-Modulations-Kontrasts erforderlich ist. Insoweit detektiert dieser Detektor einen Teil des vom Objekt kommenden Lichts, das von der Kondensoroptik aufgesammelt wird.

Zur Detektion des von der Kondensoroptik aufgesammelten, vom Objekt kommenden Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts ist mindestens ein auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordneter Detektor vorgesehen. Die auf der dem Objekt abgewandten Seite der Kondensoroptik angeordneten Detektoren detektieren das vom Objekt kommende Licht im Non-Descan-Modus, da das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht dienende Licht der Lichtquelle aufgrund des Rastervorgangs relativ zum Objekt bewegt wird und dementsprechend auch das vom Objekt kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht ebenfalls keinen ortsfesten Strahlenverlauf aufweist.

Grundsätzlich könnte zur separaten Detektion des zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht dienenden Lichts der Lichtquelle und des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht dienende Licht der Lichtquelle und das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht aufgespalten werden. Hierdurch wäre eine räumliche Trennung des Anregungslichts und des Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht erreicht. Dies ermöglicht die separate Messung der entsprechenden Lichtleistungen mit verschiedenen Detektoren.

Im Konkreten könnte zur Aufspaltung mindestens ein Farbstrahlteiler eingesetzt sein. Dabei könnten mehrere Farbstrahlteiler hintereinander angeordnet sein, um eine Abspaltung unterschiedlicher Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche zu ermöglichen.

Alternativ hierzu könnte zur Aufspaltung mindestens ein teildurchlässiger Spiegel eingesetzt sein. Diesem Spiegel oder diesen Spiegeln könnte ein Band- oder Blockfilter nachgeordnet sein. Auch bei der Verwendung von Spiegeln als Aufspaltungsbauteil könnten mehrere derartige Spiegel hintereinander, gegebenenfalls mit einem nachgeordneten Band- oder Blockfilter, angeordnet sein. Auch hierdurch ist eine Aufspaltung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts in mehrere Spektralbereiche möglich.

Alternativ zur Verwendung von Farbstrahlteilern oder Spiegeln könnte zur Aufspaltung ein Multibanddetektor eingesetzt werden, der beispielsweise in der DE 199 02 625 A1 beschrieben ist. Mit einem derartigen Multibanddetektor ist ebenfalls eine Aufspaltung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts in mehrere Spektralbereiche möglich. Insoweit kann durch diese Maßnahmen das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht und das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienende Licht der Lichtquelle mit Separierungsmitteln räumlich getrennt und unterschiedlichen Detektoren zugeleitet werden. Somit ist eine simultane oder sequenzielle Detektion des unterschiedlichen Lichts möglich. Auch eine Detektion lediglich eines einzelnen Wellenlängenbereichs des vom Objekt kommenden Lichts ist möglich, so dass hierdurch in ganz besonders vorteilhafter Weise ein vielseitig einsetzbares Rastermikroskopsystem gebildet ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist zur Beleuchtung des Objekts eine weitere Lichtquelle vorgesehen. Diese Lichtquelle emittiert Weißlicht, also kein monochromatisches Licht, sondern Licht eines größeren Wellenlängenbereichs. Insoweit sei angemerkt, dass das Kontrastmittel grundsätzlich keine Einschränkung auf eine Laserlichtquelle darstellt, die sichtbares Licht emittiert. Bei Verwendung einer Weißlichtquelle sollte der Lichtstrahl vor der Rastereinrichtung eingekoppelt werden, nämlich kondensorseitig über einen Strahlteiler. Eine zusätzliche Kamera bzw. ein Detektor könnte im Detektionsstrahlengang über einen entsprechenden Strahlteiler zum Einsatz kommen.

Beispielsweise könnte als weitere Lichtquelle eine Lichtquelle eingesetzt werden, wie sie aus der DE 101 15 488 bekannt ist. Insoweit könnte beispielsweise in besonders vorteilhafter Weise auch Einphotonen-Fluoreszenzlicht angeregt werden, wodurch weitere Applikationsmöglichkeiten eröffnet werden.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Rastermikroskop einen konfokalen Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang auf. Dies könnte beispielsweise durch das Vorsehen von entsprechend angeordneten Beleuchtungs- bzw. Detektionslochblenden im Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengang erfolgen. Aber auch ohne Beleuchtungs- bzw. Detektionslochblenden kann bei der Mehrphotonen-Fluoreszenzmikroskopie ein konfokaler Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang gebildet werden, indem die Strahlfüh rung entsprechend dem eines konfokalen Rastermikroskops ohne Lochblenden ausgebildet ist.

Da das Kontrastmittel dem Mikroskopobjektiv zugeordnet ist, könnte in einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ein Mikroskopobjektiv derart ausgestaltet sein, dass es zur Verwendung für ein Rastermikroskop nach einem der Patentansprüche 1 bis 20 geeignet ist. Dies könnte beispielsweise durch eine geringfügige Modifikation erzielt werden, beispielsweise durch Einschrauben eines in einer entsprechenden Fassung vorgesehenen Kontrastmittels am Mikroskopobjektivgehäuse am Mikroskopobjektivwechselbereich eines herkömmlichen Mikroskopobjektivs. Eine Fertigung einer speziell für das erfindungsgemäße Rastermikroskop geeigneten Mikroskopobjektivserie wäre ebenfalls denkbar.

Bei dem Mikroskopobjektiv könnte es sich um ein Immersionsobjektiv der Klasse HCX APO der Anmelderin handeln. Vorzugsweise weist es eine Vergrößerung von 20x und einen relativ großen Arbeitsabstand auf. Hierdurch ist es insbesondere für physiologische bio-medizinische Applikationen geeignet. Es hat eine feste oder eine verstellbare Numerische Apertur von 0,8 bis 1,0 und ist für den Einsatz mit einem Immersionsmedium mit einem Brechungsindexbereich von 1,33 bis 1,45 optimiert bzw. ebenfalls einstellbar. Als Immersionsmedium kann beispielsweise ein Wasser-Dextran-Gemisch verwendet werden, wobei der Brechungsindex der Probe als Vorgabe zur Anpassung und damit für die Wahl des Verhältnisses in dem Gemisch maßgeblich ist. Dadurch wird der optische Fluss vom Mikroskopobjektiv in die Probe ideal angepasst.

Das Mikroskopobjektiv ist für Licht aus einem Wellenlängenbereich von 350 bis 1100 nm transmittierend ausgeführt. Die Farbkorrektion des Mikroskopobjektivs erfolgt in vergleichbarer Weise wie bei einem HCX APO Mikroskopobjektiv der Anmelderin. Durch den großen Arbeitsabstand des Mikroskopobjektivs ist eine Untersuchung dicker Präparate möglich. Bei Verwendung des Objektivs ist wesentlich, dass ein erschütterungsfreies Arbeiten bei gleichzeitig hoher Penetration in die Probe möglich ist.

An dieser Stelle sei angemerkt, dass sowohl das Kontrastmittel als auch die Segmentoptik austauschbar sind.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung,
2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung,
3 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung,
4 eine schematische Darstellung eines Kontrastmittels der Ausführungsbeispiele gemäß den 1 bis 3 und
5 eine schematische Darstellung einer Segmentoptik der Ausführungsbeispiele gemäß den 1 bis 3.
Die 1 bis 3 zeigen jeweils in einer schematischen Darstellung Ausführungsbeispiele eines Rastermikroskops zur Detektion eines Objekts 1. Das Rastermikroskop umfasst eine zur Mehrphotonen-Fluoreszenzanregung geeignete Lichtquelle 2, die Licht zur Beleuchtung des Objekts 1 emittiert. Der Beleuchtungsstrahlengang 3 verläuft von der Lichtquelle 2 über den Strahlteiler 4, die Rastereinrichtung 5, durch das Mikroskopobjektiv 6 zu dem Objekt 1. Der Detektionsstrahlengang 7 verläuft vom Objekt 1 durch das Mikroskopobjektiv 6, über die Rastereinrichtung 5, durch den Strahlteiler 4 zum Detektor 8. Ein auf der dem Objekt 1 abgewandten Seite der Kondensoroptik 9 vorgesehener Detektionsstrahlengang 7 verläuft vom Objekt 1 zu den Detektoren 10, 11 und 12 – wie in den 1 und 3 gezeigt – beziehungsweise zum Detektor 10 – wie in 2 gezeigt.
Erfindungsgemäß ist dem Mikroskopobjektiv 6 ein zum Hoffman-Modulations-Kontrast geeignetes Kontrastmittel 13 zugeordnet. Das Kontrastmittel 13 ist im Wesentlichen in einer Fourierebene des Mikroskopobjektivs 6 angeordnet und zwar in der Weise, dass es im Mikroskopobjektiv 6 integriert angeordnet ist, was in den 1 bis 3 gezeigt ist.
Das in 4 mit seiner im Beleuchtungsstrahlengang 3 wirkenden Fläche gezeigte Kontrastmittel 13 umfasst drei Bereiche 14, 15 und 16, die für das Licht der Lichtquelle 2 jeweils einen unterschiedlichen Transmissionskoeffizienten aufweisen. Der Bereich 14 weist einen Transmissionskoeffizienten von 0,01 auf, der Bereich 15 einen Transmissionskoeftizienten von 0,15 und der Bereich 16 einen Transmissionskoeffizienten von nahezu 1,0. Das Kontrastmittel 13 besteht aus einer beschichteten optische Glasplatte.
In den 1 bis 3 ist gezeigt, dass der Kondensoroptik 9 eine Segmentoptik 17 zugeordnet ist, und zwar in der Weise, dass sie auf der dem Objekt 1 abgewandten Seite der Kondensoroptik 9 in einer Fourierebene der Kondensoroptik 9 angeordnet ist.
Die Segmentoptik 17 weist für das vom Objekt 1 kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht einen Transmissionskoeffizienten von nahezu 1,0 auf. In dem Bereich 18 weist die Segmentoptik 17 einen Transmissionskoeffizienten von nahezu 1,0 für das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienende Licht der Lichtquelle 2 auf. Außerhalb des Bereiches 18 weist die Segmentoptik 17 für das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienende Licht der Lichtquelle 2 einen Transmissionskoeffizienten von nahezu 0 auf.
In den 1 und 3 ist auf der der Lichtquelle 2 zugewandten Seite des Mikroskopobjektivs 6 ein Detektor 8 vorgesehen, der das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht detektiert, das vom Mikroskopobjektiv 6 aufgesammelt wird.
Die Detektoren 19 und 20 aus 2 detektieren das vom Objekt 1 kommende Licht, das zwischen dem Mikroskopobjektiv 6 und der Rastereinrichtung 5 verläuft. Bei diesen Detektoren 19, 20 handelt es sich um sogenannte Non-Descan-Detektoren, da der Detektionsstrahlengang 7 in dem unmittelbaren Bereich vor den Detektoren 19, 20 nicht ortsfest verläuft. Mit dem Strahlteiler 21 wird das vom Mikroskopobjektiv 6 aufgesammelte Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht eines bestimmten Wellenlängenbereichs zu den Detektoren 19, 20 gelenkt. Ein Teil des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts mit einem anderen Wellenlängenbereich passiert den Strahlteiler 21 in Richtung des Detektors 8. Mit dem Strahlteiler 22 wird das vom Strahlteiler 21 kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht in zwei weitere Wellenlängenbereiche unterteilt und jeweils den Detektoren 19 und 20 zugeführt.
Wie in den 1 bis 3 gezeigt ist, ist auf der dem Objekt 1 abgewandten Seite der Kondensoroptik 9 ein Detektor 10 zur Detektion eines Teils des zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienenden Lichts der Lichtquelle 2 vorgesehen. Dieses Licht passiert den zwischen der Kondensoroptik 9 und dem Detektor 10 angeordneten Strahlteiler 23.
In den Ausführungsbeispielen der 1 und 3 sind zwei auf der dem Objekt 1 abgewandten Seite der Kondensoroptik 9 angeordnete Detektoren 11, 12 zur Detektion des vom Objekt 1 kommenden Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts vorgesehen. Das vom Objekt 1 kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht wird nahezu vollständig vom Strahlteiler 23 reflektiert, so dass in besonders vorteilhafter Weise nahezu das gesamte, von der Kondensoroptik 9 aufgesammelte Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht mit den Detektoren 11 und 12 detektiert werden kann. Hierdurch kann eine hohe Signalausbeute erreicht werden. Mit dem Strahlteiler 24 wird das vom Strahlteiler 23 kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht in zwei weitere Wellenlängenbereiche unterteilt und jeweils den Detektoren 11 und 12 zugeführt. Somit weisen die in den 1 und 3 gezeigten Rastermikroskope jeweils drei simultan betreibbare Detektionskanäle für das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht auf.
Der in den 1 und 3 gezeigte Strahlteiler 23 trennt als Separierungsmittel das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht von dem zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienenden Licht der Lichtquelle 2 räumlich und leitet es den unterschiedlichen Detektoren 10, 11 und 12 zu.
Bei dem in 3 gezeigten Ausführungsbeispiel ist zur Beleuchtung des Objekts 1 eine weitere Lichtquelle 25 vorgesehen. Dabei handelt es sich im Konkreten um eine Weißlichtquelle, deren emittiertes Weißlicht über den Strahlteiler 26 vor der Rastereinrichtung 5 in den Beleuchtungsstrahlengang 3 eingekoppelt wird. Ein weiterer Detektor 27 ist über den Strahlteiler 28 in den Detektionsstrahlengang 7 eingebunden.
Die in den 1 bis 3 gezeigten Rastermikroskope weisen einen konfokalen Beleuchtungsstrahlengang 3 und einen konfokalen Detektionsstrahlengang 7 auf, von denen lediglich die optischen Achsen gezeigt sind.
Bei dem Mikroskopobjektiv 6 handelt es sich um ein Immersionsobjektiv der Klasse HCX APO der Anmelderin, das eine Vergrößerung von 20x und einen relativ großen Arbeitsabstand aufweist. Es hat eine feste oder eine verstellbare Numerische Apertur von 0,8 bis 1,0 und ist für den Einsatz mit einem Immersionsmedium mit einem Brechungsindexbereich von 1,33 bis 1,45 optimiert bzw. ebenfalls einstellbar. Als Immersionsmedium kann beispielsweise ein Wasser-Dextran-Gemisch verwendet werden. Das Mikroskopobjektiv 6 ist für Licht aus einem Wellenlängenbereich von 350 bis 1100 nm in hohem Grad lichtdurchlässig. Die Farbkorrektion des Mikroskopobjektivs 6 erfolgt in vergleichbarer Weise wie bei einem HCX APO Mikroskopobjektiv der Anmelderin. Durch den großen Arbeitsabstand des Mikroskopobjektivs 6 ist eine Untersuchung dicker Präparate möglich.
Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

Claims

Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts, mit einer zur Mehrphoton-Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle (2), einem Mikroskopobjektiv (6), einer Kondensoroptik (9), einem von der Lichtquelle (2) zum Objekt (1) verlaufenden Beleuchtungsstrahlengang (3) und einem vom Objekt (1) zu mindestens zwei Detektoren (8, 10, 11, 12, 19, 20) verlaufenden Detektionsstrahlengang (7), wobei mindestens ein Detektor (10, 11, 12) auf der dem Objekt (1) abgewandten Seite der Kondensoroptik (9) angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass dem Mikroskopobjektiv (6) ein zum Hoffman-Modulations-Kontrast geeignetes Kontrastmittel (13) zugeordnet ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontrastmittel (13) im Wesentlichen in einer Fourierebene des Mikroskopobjektivs (6) angeordnet ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontrastmittel (13) im Mikroskopobjektiv (6) angeordnet ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontrastmittel (13) mehrere Bereiche (14, 15, 16) umfasst, die für das Licht der Lichtquelle (2) jeweils einen unterschiedlichen Transmissionskoeffizienten aufweisen.
Rastermikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass drei Bereiche (14, 15, 16) vorgesehen sind, die einen Transmissionskoeffizienten von jeweils im Wesentlichen 0,01, 0,15 und 1,0 aufweisen.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontrastmittel (13) eine beschichtete optische Platte umfasst.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Kondensoroptik (9) eine Segmentoptik (17) zugeordnet ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentoptik (17) auf der dem Objekt (1) abgewandten Seite der Kondensoroptik (9) angeordnet ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentoptik (17) im Wesentlichen in einer Fourierebene der Kondensoroptik (9) angeordnet ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentoptik (17) für das vom Objekt (1) kommende Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht einen Transmissionskoeffizienten von im Wesentlichen 1,0 aufweist.
Rastermikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentoptik (17) nur in einem geringen Bereich (18) einen Transmissionskoeffizienten von im Wesentlichen 1,0 für das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienende Licht der Lichtquelle (2) aufweist.
Rastermikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentoptik (17) derart angeordnet ist, dass der vom Kontrastmittel (13) beeinflusste Teil des zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienenden Lichts der Lichtquelle (2) im Wesentlichen den geringen Bereich (18) der Segmentoptik (17) durchläuft.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentoptik und/oder das Kontrastmittel (13) um eine Drehachse drehbar ist, die vorzugsweise parallel zur optischen Achse des Detektionsstrahlengangs (7) oder des Beleuchtungsstrahlengangs (3) ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Detektor (8, 19, 20) vorgesehen ist, der auf der der Lichtquelle (2) zugewandten Seite des Mikroskopobjektivs (6) angeordnet ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (19, 20) vom Objekt (1) kommendes Licht detektiert, das zwischen dem Mikroskopobjektiv (6) und einer Rastereinrichtung (5) des Rastermikroskops verläuft.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein auf der dem Objekt (1) abgewandten Seite der Kondensoroptik (9) angeordneter Detektor (10) zur Detektion zumindest eines Teils des zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienenden Lichts der Lichtquelle (2) vorgesehen ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein auf der dem Objekt (1) abgewandten Seite der Kondensoroptik (9) angeordneter Detektor (11, 12) zur Detektion des vom Objekt (1) kommenden Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts vorgesehen ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Mehrphotonen-Fluoreszenzlicht und das zur Anregung des Mehrphotonen-Fluoreszenzlichts dienende Licht der Lichtquelle (2) mit Separierungsmitteln (23) räumlich getrennt und unterschiedlichen Detektoren (10, 11, 12) zugeleitet wird.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lichtquelle (25) zur Beleuchtung des Objekts (1) vorgesehen ist, die Weißlicht emittiert.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 19, gekennzeichnet durch einen konfokalen Beleuchtungs- (3) und Detektionsstrahlengang (7).
Mikroskopobjektiv gekennzeichnet durch eine Verwendung für ein Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 20.
Mikroskopobjektiv nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch eine vorzugsweise einstellbare Numerische Apertur von 0,8 bis 1,0, einen relativ großen Arbeitsabstand, geeignet für ein Immersionsmedium mit einem vorzugsweise einstellbaren Brechungsindexbereich von 1,33 bis 1,45, hohe Lichtdurchlässigkeit für Licht aus einem Wellenlängenbereich von 350 bis 1100 nm und einer Vergrößerung, die im Bereich zwischen 10x und 64x liegt.