DE10261825A1

DE10261825A1 - Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Tumorprävention

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Publication number: DE10261825A1
Application number: DE10261825A
Authority: DE
Inventors: Ivar Prof. Dr. Roots; Dieter Dr. Schwarz
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2004-07-01
Also published as: WO2004056350A1; AU2003298237A1; EP1583521A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Tumorprävention. Gegenstand der Erfindung sind auch die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittels und das Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel, umfassend Hypericin, in einer ernährungswirksamen Menge. Bevorzugt kann Hypericin in Form eines hypericinreichen pflanzlichen Trockenextrakts, vorzugsweise aus Johanniskraut, eingesetzt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Tumorprävention. Gegenstand der Erfindung sind auch die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittels und das Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel, umfassend Hypericin, in einer ernährungswirksamen Menge. Bevorzugt kann Hypericin in Form eines hypericinreichen pflanzlichen Trockenextrakts, vorzugsweise aus Johanniskraut, eingesetzt werden.
In Anbetracht der bis heute begrenzten therapeutischen Möglichkeiten besteht unter Fachleuten die Ansicht, dass die Chemoprävention der Krebserkrankungen durch spezifische Nahrung, Nahrungsergänzungsmittel und spezifische Arzneimittelzusammensetzungen enormes Potential zur Lebensverbesserung beinhaltet.

Es ist bekannt, dass beispielsweise polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs) krankheitsauslösende Substanzen sind. PAKs können aus der Umgebung (Abgase) oder beim Rauchen aufgenommen werden, aber auch beim Grillen entstehen polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe. Sie werden insbesondere für die Entstehung mutagener Veränderungen und maligner Tumore verantwortlich gemacht. Die Metabolisierung dieser Substanzen im Körper war Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten und ist am Beispiel eines der wichtigsten Vertreter, dem Benzo[a]pyren(B[a]P), in 1 dargestellt. Aus 1 wird deutlich, dass das humane Enzym Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) in der Krankheitsentstehung eine wichtige Rolle spielt.

Die erste Stufe der Bioaktivierung des B[a]P führt über die CYP1A1-katalysierte Bildung des B[a]P-7,8-Epoxids und dessen Hydrolyse durch Epoxidhydrolase (EH) zum B[a]P-7,8-Dihydrodiol (7,8-diol-B[a]P). In einem zweiten Schritt wird dann das entstandene 7,8-diol-B[a]P durch CYP1A1 zum genotoxischen (±)-B[a]P-r-7,t-8-dihydro-diol-t-9,10-Epoxid (Diolepoxid 2, DE2) metabolisiert. Das Enzym Cytochrom P450 1A1 katalysiert also beide Epoxidationsschritte der Aktivierung von Benzpyrenen zu den Diolepoxiden, deren DNA-Addukte als die eigentlichen Krankheitsauslöser angesehen werden. Shimada et al. beschreiben in Drug Metab. Dispos. 29 (2001) 1176–1182, dass das humane Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) das wichtigste in die chemische Carcinogenese involvierte Enzym ist. Es wird durch PAKs wie z.B. Benzo[a]pyren induziert und aktiviert diese und viele andere Umweltgifte und Procarcinogene zu den eigentlichen Carcinogenen (Guengerich, F. P., Cancer Res. 48 (1988) 2946–2954). CYP1A1 ist im Wesentlichen ein extrahepatisches Enzym, neben der Lunge wird es vor allem im gesamten gastro-intestinalen Trakt (Speiseröhre, Magen, Dünn- und Dickdarm), in der Placenta, dem Gehirn und den Lymphozyten exprimiert.

Aus 1 wird allerdings auch deutlich, dass CYP1A1 daneben die Hydroxylierung des B[a]P, die zu den Phenolen führt, hauptsächlich zu 3-OH-B[a]P, die keine carcinogenen Produkte darstellen und den Detoxifikationsweg charakterisieren, katalysiert.

Als eine wichtige chemopräventive Verbindung, die die Bildung von DNA-Addukten verhindert, gilt Quercetin, als natürlich vorkommendes Flavonoid Bestandteil vieler Früchte und Gemüse, das z.B. auch im Johanniskraut enthalten ist. So beschreiben Kang et al. in "Nutrition and Cancer" 35(2) (1999), 175–179, dass Quercetin die Entstehung Benzo[a]pyren-induzierter DNA-Addukte in humanen Hep G2-Zellen durch Beeinflussung der CYP1A1-Genexpression inhibiert. Die Autoren schlussfolgern, dass Quercetin eine langanhaltende präventive Wirkung auf die chemische Cancerogenese von Menschen haben kann, die eine an Gemüse und Früchten reiche Nahrung zu sich nehmen.

Natürlich vorkommende pflanzliche Phenole wie Tanninsäure, Quercetin, Myricetin und Anthraflavonsäure werden von Das, M. et al. in "Cancer Res. 47 (3) (1987), 767–73" als potente Inhibitoren der PAK-DNA-Addukt-Bildung in der Epidermis und der Lunge von SENCAR-Mäusen beschrieben. Die Autoren schlussfolgern, dass sich diese pflanzlichen Phenole als geeignet erweisen könnten, das Risiko der Tumorinduktion durch PAKs zu modifizieren.

DE 100 16 771 A1 beschreibt Quercetin und strukturell ähnliche Verbindungen zur Chemoprävention von Darmerkrankungen, insbesondere von Colonkarzinomen. US 6,008,260 offen bart Resveratrol (Stilben-3,4',5-triol) als Mittel zur Cancerprophylaxe.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, hochwirksame Verbindungen zur Tumorprävention aufzufinden.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass Hypericin und seine Derivate hochpotente chemopräventive Verbindungen zur Prophylaxe jeglicher Erkrankungen, die mit mutagenen Veränderungen einhergehen, wie z.B. neoplastische Transformationen, und insbesondere zur Cancerprophylaxe sind.

Bisher wird Hypericin in der Literatur zur Behandlung viraler Infektionen ( EP 0 332 679 ), zur photodynamischen Diagnose/Therapie von malignen Erkrankungen (WO 00/53170, WO 01/89576) und in kombinierter Gabe mit Hyperforin zur Behandlung von Hautkrebs (WO 00/30660 A2) beschrieben.

Hypericin gehört zu den Naphthodianthronen und hat folgende Strukturformel:

Hypericin ist ein Bestandteil von Pflanzen, die zur Art Hypericum (Johanniskraut) gehören [vgl. A. Nahrstedt et al., Pharmacopsychiat. 30 (1997) (supplement) 129–134]. Die Reinsubstanz Hypericin kann aus Pflanzen isoliert werden oder auch chemisch synthetisiert werden. Eine ganze Reihe von Synthesewegen sind beschrieben (vgl. z.B. US 2,707,704 , EP 0 432 496 ). Es wurde nun festgestellt, dass Hypericin ein potenter Inhibitor der Epoxidation des 7,8-diol-B[a]P zu den Diolepoxiden ist, also des terminalen, zu den letztendlich genotoxischen und carcinogenen Produkten führenden Schrittes. Daneben hat Hypericin keinen oder einen nur sehr geringen Einfluss auf die Hydroxylierung des B [a] P, die zu den Phenolen führt und den Detoxifikationsweg darstellt (vgl. 1).

Damit ist Hypericin beispielsweise dem als Cancerprophylaktikum beschriebenen Resveratrol überlegen, das zwar die Hydroxylierung des B[a]P nicht hemmt, aber andererseits auch die Epoxidation des 7,8-diol-B[a]P zu den genotoxischen Diolen nur leicht inhibiert (vgl. 2). 3 zeigt, dass Hypericin dagegen die Epoxidation außerordentlich stark inhibiert, ohne einen wesentlichen Einfluss auf den Hydroxylierungsweg zu nehmen, zumindest nicht bei Konzentrationen bis zu 5 μM, die weit über dem IC₅₀-Wert von 0,5 μM für die Hemmung der Epoxidation liegen.

Um die Aktivität des CYP1A1 bei der Hydroxylierung des B[a]P zum 3-OH-B[a]P zu charakterisieren, wurde der AHH-Test (aryl hydrocarbon hydroxylase assay) angewendet (Nebert, D.W. et al., J. Biol. Chem. 243 (1968) 6242–6249). Die Durchführung des Tests ist in Beispiel 1 beschrieben.

Um die Epoxidationsaktivität des CYP1A1 zu untersuchen, wurde erfindungsgemäß dessen Effekt auf die Epoxidation des 7,8-diol-B[a]P zu den Diolepoxiden bestimmt, also der zweite, terminale Epoxidationsschritt untersucht. Die Durchführung dieses Epoxidationstests ist in Beispiel 2 beschrieben. Vergleichende Untersuchungen wurden zum EROD-Test vorgenommen, einem klassischen Test unter Verwendung eines (unphysiologischen) Modellsubstrates, zur Bestimmung der CYP1A1-Aktivität. Hierbei wird die O-Deethylierung von 7-Ethoxyresorufin untersucht. Die Durchführung des EROD-Tests ist in Beispiel 3 beschrieben.

Es hat sich gezeigt, dass die alleinige Anwendung des EROD-Tests zu einer falschen Einschätzung der inhibitorischen Potenz einer Substanz führen kann. So wurde Resveratrol auf der Basis von EROD-Studien als ein starker selektiver Inhibitor des humanen CYP1A1 identifiziert (Chun et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 262 (1999), 20–24), während sich im hier erstmalig angewendeten Epoxidationstest zeigt, dass Resveratrol die Epoxidation des 7,8-diol-B[a]P nur leicht hemmt (vgl. 2.).

IC₅ ₀-Werte wurden für Hypericin und vergleichsweise für Quercetin und α-Naphthoflavon bestimmt. Der IC₅₀-Wert ist definitionsgemäß diejenige Inhibitorkonzentration, die zur 50%-igen Hemmung der Reaktion führt. Der IC₅₀-Wert des Hypericins wurde zu 0,5 μM bestimmt, während z.B. der von Quercetin, auch einem pflanzlichen Phenol, das präventiv auf die chemische Cancerogenese wirkt, bei 1,5 μM liegt. Selbst der IC₅₀-Wert des α-Naphthoflavons (α-NF, Alpha-NF), einem gut bekannten selektiven CYP1A1-Inhibitor, liegt bei 0,8 μM. Letzterer Wert wurde von den Erfindern erstmalig für die Hemmung der CYP1A1-abhängigen Epoxidation von 7,8-diol-B[a]P bestimmt. In 4 sind die reziproken IC₅₀-Werte für Hypericin, Quercetin und α-Naphthoflavon zum Vergleich des relativen inhibitorischen Potentials dieser Substanzen dargestellt.

Enzymkinetische Studien (Inhibitorkinetik) haben gezeigt, dass Hypericin ein potenter nicht-kompetitiver Inhibitor der CYP1A1-Epoxidationsaktivität ist, mit einer Hemmungskonstante (K_i-Wert) von ca. 0,6 μM. Dagegen ist Quercetin ein Inhibitor vom Mischtyp (kompetitive plus nicht-kompetitive Hemmung) mit einem K_i = 2,4 μM.

Es wurde somit gefunden, dass Hypericin und/oder seine Derivate vorteilhaft zur Prävention PAK-induzierter Tumore eingesetzt werden können, insbesondere zur Prävention von Lungenkarzinom, Mammakarzinom, Portiokarzinom, Darmkarzinom, Hautkarzinom und Hirnkarzinom. Die Substanzen sind auch zur Prävention anderer, durch PAK induzierte Erkrankungen einsetzbar, z.B. zur Prävention von neoplastischen Transformationen.

Basierend auf den oben dargelegten Ergebnissen ist auch die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Hemmung der Epoxidationsaktivität des Enzyms CYP1A1 Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Als Hypericin-Derivate kommen erfindungsgemäß insbesondere Pseudohypericin, Protohypericin, Pseudoprotohypericin, Cyclopseudohypericin und Emodinanthron in Frage. Vorzugsweise werden Hypericin und seine Derivate in Form ihrer Salze mit organischen oder anorganischen Säuren, z.B. als Acetate oder Phosphate, eingesetzt.

Zur Herstellung eines Arzneimittels werden diese Verbindungen oder Gemische dieser Verbindungen in an und für sich bekannter Art und weise mit geeigneten Hilfs- und/oder Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln zu festen Darreichungsformen, zu Injektions- oder Infusionslösungen oder zu topischen Darreichungsformen formuliert. Die orale Gabe der erfindungsgemäßen Wirkstoffe ist bevorzugt. Die parenterale Gabe ist selbstverständlich auch möglich. Die Herstellung der galenischen Formulierungen stellt für den Fachmann kein Problem dar. Ein Verfahren zur galenischen Zubereitung von Infusions- oder Injektionslösungen von Hypericin oder Hypericinderivaten ist beispielsweise in DE 39 12 433 A1 beschrieben.

Es ist erfindungsgemäß auch möglich, anstelle des reinen Hypericins/Hypericinderivats einen hypericinreichen pflanzlichen Extrakt, insbesondere aus Johanniskraut, besonders bevorzugt aus Hypericum perforatum, einzusetzen. Die Herstellung eines solchen Extraktes ist beispielsweise in DE 39 35 772 A1 beschrieben. Aber auch kommerziell erhältliche Johanniskraut-Trockenextrakte, beispielsweise Esbericum^®-Kapseln (Schaper und Brümmer, Salzgitter Deutschland), sind hypericinreich. Hypericinreich bedeutet im Sinne der Erfindung, dass mindestens 0,3 bis 0,35 Gew% Hypericin im Trockenextrakt enthalten sind. Im Johanniskraut kommen Hypericin und Pseudohypericin nebeneinander vor, so dass hypericinreiche Johanniskrautextrakte neben dem Hypericin auch immer das Pseudohypericin enthalten, das ebenfalls im erfindungsgemäßen Sinne wirkt.

Da bekanntermaßen kommerziell erhältliche Johanniskraut-Extrakte, darunter auch die hypericinreichen, zur Behandlung von Verstimmungszuständen und nervöser Unruhe eingesetzt werden, und von großen Teilen, insbesondere der älteren Bevölkerung genutzt werden, wird damit erfindungsgemäß gleichzeitig ein tumorpräventativer Effekt erzielt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Tumorprävention, bei dem die oben beschriebenen pharmazeutischen Zubereitungen dem menschlichen oder tierischen Körper in einer Menge appliziert werden, die ausreichend und effektiv ist, die Epoxidationsaktivität des Enzyms CYP1A1 zu inhibieren. Es hat sich gezeigt, dass Plasmakonzentrationen von ca. 13 μg Hypericin/L, die bei üblicher Verabreichung von 900 mg Johanniskraut-Trockenextrakt/Tag durchschnittlich im stationären Zustand erreicht werden (Johne et al., in Clin. Pharmacol. Ther. (1999) 338–345) im in-vitro-Experiment zu einer mehr als 90%-igen Hemmung von CYP1A1 führen. Davon ausgehend sollte die Hypericin- bzw. Hypericin-Derivat-Dosis üblicherweise ca. 10 bis 200 μg/Tag betragen, bevorzugt von 70 bis 200 μg/Tag.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines den Abbau toxischer und procarcinogener Substanzen fördernden Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittels sowie das Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel, das Hypericin und/oder dessen Derivate in einer ernährungswirksamen Menge enthält. Es handelt sich damit um ein Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel, das die Epoxidationsaktivität des Enzyms CYP1A1 hemmt. Bevorzugt kann das Hypericin auch in Form eines hypericinreichen pflanzlichen Trockenextrakts, vorzugsweise aus Johanniskraut, im erfindungsgemäßen Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel enthalten sein.

Das erfindungsgemäße Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel kann beispielsweise ein Nahrungsmittelpulver aus Milchpulver, Kohlenhydraten, Vitaminen, Mineralien und Lipiden sein, das mindestens 0,3 Gew.% Hyperin/Hypericinderivat enthält. Es ist selbstverständlich möglich, auch jedes andere Nahrungsmittelpulver mit Hypericin/Hypericinderivaten anzureichern.

Nachfolgend wird die Erfindung näher beschrieben, ohne sie auf die dargelegten Ausführungsformen einzuschränken.
Es zeigen:
1: Aktivierung von Benz[a]pyren durch CYP1A1 zu seiner letztendlich carcinogenen Form;
2: Inhibition humaner CYP1A1-Aktivitäten durch Resveratrol;
3: Inhibition humaner CYP1A1-Aktivitäten durch Hypericin;
Die EROD-Aktivität ist auf rund der starken Eigenfluoreszenz von Hypericin nicht bestimmbar.
4: Inhibitorisches Potential von Hypericin, Quercetin und α-NF;
Wirkung auf die 7,8-diol-B[a]P-Epoxidationsaktivität des humanen CYP1A1.
Die reziproken IC₅₀-Werte wurden für alle drei Inhibitoren dargestellt.
Ausführungsbeispiele Materialien
Quercetin, B[a]P, 7-Ethoxyresorufin, Resorufin, Alpha-Naphthoflavon, Dilaurylphosphatidylcholin (DLPC) wurden bei SIGMA (Deisenhofen, BR Deutschland) gekauft. 3-OH-B[a]P, 7,8-dihydrodiol-B[a]P, die Tetrole r-7,t-8,t-9,c-10-tetrahydroxy-7,8,9,10-tetrahydro-B[a]P (RTTC), r-7,t-8,t-9,t-10-tetrahydroxy-7,8,9,10-tetrahydro-B[a]P (RTTT), r-7,t-8,c-9,t-10-tetrahydroxy-7,8,9,10-tetrahydro-B[a]P (RTCT), r-7,t-8,c-9,c-10-tetrahydroxy-7,8,9,10-tetrahydro-B[a]P (RTCC) wurden bei NCI Chemical Carcinogen Repository (Midwest Research Institute, Kansas City, MI, USA) gekauft.
Klonen, heterologe Expression und Reinigung des rekombinanten-CYP1A1
Humanes CYP1A1 und P450-Reductase wurden heterolog in Spodoptera frugiperda (Sf9)-Insektenzellen mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystem exprimiert und anschließend isoliert und gereinigt. Die Klonierung der cDNAs in Baculovirus-Transfervektoren pBlueBac4.5 (Invitrogen, Niederlande) erfolgte wie durch Schwarz et al. in Pharmacogenetics 10 (2000) 519–530 beschrieben. Danach wurde ein N-terminales 72 bp SphI-SexAI-Fragment ersetzt durch ein gleiches mit folgenden Modifizierungen: die codierende Sequenz upstream des Stop-Codons wurde erweitert durch eine codierende Sequenz für eine Thrombin-Spaltstelle und 6xHis-Reste. Danach wurde die gesamte modifizierte CYP1A1-Sequenz in den Vektor pAcMP3 (Pharmingen, USA) umkloniert (unter Kontrolle des 'late basic protein promotor' P_cor). Das auf diese Weise modifizierte pAcMP3-Plasmid wurde in E. coli amplifiziert und zur Präparation rekombinanter Baculoviren (nach dem Protokoll des Herstellers Pharmingen) verwendet. Die Expression erfolgte in 400 ml-Sf9-Spinnerkulturen über ca. 55 h, danach wurden die Zellen geerntet, lysiert und das CYP1A1-Protein als 6xHis-Fusionsprotein isoliert und gereinigt wie beschrieben durch Modi et al. in Biochemistry 35 (1996) 4540–4550, aber mit der Modifikation, daß eine Mischung von Emulgen 913 (2%) und Cholat (0.2%) für die Solubilisierung der Membranen eingesetzt wurde. CYP1A1 war elektrophoretisch homogen mit einem spezifischen P450-Gehalt von 11 nmol/mg Protein. Die Expression der Reductase erfolgte analog, deren Reinigung wurde nach der von Tamura et al. in Arch. Biochem. Biophys 293 (1992) 219–223 beschriebenen Methode durchgeführt.
Beispiel 1
Durchführung des Epoxidationstests
Dieser Test (Epoxidation von 7,8-diol-B[a]P) dient dem Nachweis der terminalen Epoxidation beider Aktivierung von B[a]P zu den B[a]P-Diolepoxiden 1 und 2 (DE1 und DE2), wobei DE2 der ultimativ carcinogene Metabolit ist, der durch DNA-Adduktbildung zur Cancerogenese führt. Die 7,8-diol-B[a]P-Epoxidation wurde durch HPLC-Trennung und spektralphotometrischen Nachweis der Produkte entsprechend veröffentlichter Methodik nachgewiesen (Yang et al., in Cancer Res. 35 (1975) 3642–3650; Schwarz et al., in Carcinogenesis 22 (2001) 453–459), ausgenommen der Verwendung eines rekonstituierten Enzymsystems bestehend aus den gereinigten Enzymen (CYP1A1 und P450-Reductase) und Lipid (DLPC). Das rekonstituierte System, bestehend aus 200 pmol gereinigtem CYP1A1 (28 nmol/ml), 900 pmol gereinigter Reductase (56 nmol/ml) und 0.5 mg DLPC (5 mg/ml), wurde in 200 μl Puffer (50 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 7,5) 10 min auf Eis inkubiert. Für den Test wurden 10 μl-Aliquote dieses Enzym-Lipid-Mix (entsprechend 10 pmol CYP1A1) pro Reaktion mit dem Substrat 7,8-diol-B[a]P (Endkonzentration: 2 μM) und der entsprechenden Inhibitorkonzentration in 200 μl Puffer inkubiert, danach auf 990 μl verdünnt und nochmals 1 min bei 37 °C präinkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl NADPH (16,6 mg/200 μl) gestartet und im Wasserbad bei 37 °C für 15 min durchgeführt. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 1M K-Phosphat-Puffer (pH 3,5) gestoppt und die Suspension für 1h bei 4 °C der Hydrolyse überlassen. Nach Zugabe von 10 μg 1,1'-bi-2-Naphthol (10 μg/1Oμl Methanol) als internem HPLC-Standard wurden die Produkte und Substrat zweimal mittels Ethylacetat extrahiert. Nach Eindampfen des Lösungsmittels wurden Produkte und Substrat in 100 μl Methanol aufgenommen, in einem Ultraschallbad homogenisiert und in die HPLC-Anlage injiziert. Für die IC₅₀- und die kinetischen Studien wurden Stamm-Lösungen mit geeigneter Inhibitorkonzentration in DMSO präpariert um zu gewährleisten, daß die DMSO-Konzentration < 0.5% war. Die Kontrollen (ohne Inhibitor, 100% Aktivität) wurden mit der entsprechenden Menge DMSO durchgeführt.
Trennung und Identifizierung der Produkte und ihre Analyse wurden mittels 'Reversed-Phase'-HPLC nach der durch Schwarz et al., in Carcinogenesis 22 (2001) 453–459 und Shou et al. in Mol. Carcinogenesis 10 (1994) 159–168) publizierten Methodik durchgeführt. Obwohl beide Diolepoxide DE1 und DE2) als Produkte analysiert wurden, beziehen sich alle in der vorliegenden Arbeit aufgeführten und diskutierten Aktivitäten und Bildungsraten, einschließlich der kinetischen Analysen, auf DE2, da es das ultimativ cancerogene Produkt darstellt und mit einer erheblich größeren Rate als DE1 gebildet wird.
Beispiel 2
Durchführung des AHH-Tests
Dieser Test (Aryl Hydrocarbon Hydroxylation, AHH) ist ein Assay zur Quantifizierung der CYP1A1-katalysierten Hydroxylierung von B[a]P zu 3-OH-B[a]P. Die Reaktion charakterisiert den Entgiftungsweg (vgl. 1). Die B[a]P-Hydroxylierung wurde durch Fluoreszenznachweis der Produkte entsprechend dem klassischen AHH-Test quantifiziert (Nebert und Gelboin in J. Biol. Chem. 243 (1968) 6242–6249). Das rekonstituierte CYP1A1-System (Enzym-Lipid-Mix) wurde, wie für den Epoxidations-Test (Beispiel 1) beschrieben, präpariert. Jedoch wurden hier 20 μl-Aliquote (entsprechend 20 pmol CYP1A1) pro Assay eingesetzt und in 250 μl Endvolumen zusammen mit dem Substrat B[a]P (Endkonzentration: 5 μM) und der entsprechenden Inhibitorkonzentration gelöst. Präinkubation und Reaktion erfolgten wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die Reaktion wurde mit 1 ml Aceton (kalt) gestoppt und die Produkte und Substrat mit 3,25 ml n-Hexan extrahiert. 1 ml-Aliquote der organischen Phase wurden gemischt mit 3 ml 1N NaOH und das gebildete 3-OH-B[a]P fluorimetrisch nachgewiesen (Anregung: 396 nm, Emission: 519 nm, Spektralfluorimeter RF5000-PC, Shimadzu, Japan). Die Quantifizierung erfolgte mittels einer Eichkurve, die unter gleichen Bedingungen mit authentischem 3-OH-B[a]P auf genommen wurde.
Beispiel 3
Durchführung des EROD-Tests
Dieser Test (7-Ethoxyresorufin-O-Deethylierung, EROD) ist der bekannte Standard-Assay zur Charakterisierung der Aktivität von CYP1A1, der die Umsetzung des Substrates zu Resorufin mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie misst (Burke und Mayer in Chem. Biol. Int. 45 (1983) 243–258). Das rekonstituierte CYP1A1-System wurde wie unter Beispiel 1 beschrieben präpariert. 10 μl-Aligote (entsprechend 10 pmol CYP1A1) wurden mit dem Substrat (Endkonzentration: 0.5 μM) und der entsprechenden Inhibitorkonzentration in 200 μl inkubiert, auf 790 μl verdünnt und 1 min bei 37 °C präinkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von 10 μl NADPH gestartet wurde. Nach 15 min bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,5 ml Aceton (kalt) gestoppt. Danach wurde die Suspension 5 min bei 3000 U/min zentrifugiert und das gebildete Produkt Resorufin durch Messung seiner Fluoreszenz nachgewiesen (Anregung: 530 nm, Emission: 585 nm). Die Quantifizierung erfolgte mittels einer Eichkurve, die unter den gleichen Bedingungen mit authentischem Resorufin erstellt wurde.
Beispiel 4
Bestimmung der IC₅₀-Werte, Bestimmung der Hemmungskonstanten für Hypericin und Quercetin
Für die Bestimmung der IC₅₀-Werte wurden die Aktivitäten (z.B. die Bildungsrate von DE2) in Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration, wie in Beispiel 1–3 beschrieben, gemessen. Die gemessenen Aktivitäten wurden auf die Kontrollaktivität (100%) in Abwesenheit des Inhibitors bezogen. Danach erfolgte die Bestimmung des IC₅₀-Wertes durch lineare Regression der prozentualen Aktivitäten vs. der logarithmisch transformierten Inhibitorkonzentrationen. Die Bestimmung der Hemmkonstanten für Hypericin und Quercetin erfolgte durch Analyse der Inhibitorkinetik, d.h. durch Messungen der Enzymkinetik für verschiedene Inhibitorkonzentrationen. Für Hypericin wurde die Analysen mit einer Substratkonzentration von 2 μM für vier Inhibitorkonzentrationen durchgeführt (0, 1, 2 und 5 μM). Für Quercetin erfolgten die Messungen bei der gleichen Substratkonzentration für folgende Inhibitorkonzentrationen: 0, 1, 5 und 10 μM. Danach wurden die Umsatzraten zunächst durch Lineweaver-Burk-Plots analysiert und der Typ der Inhibierung bestimmt (kompetitiv, nicht kompetitiv, unkompetitiv oder Mischtyp), ehe die kinetischen Konstanten, einschließlich der Hemmkonstanten K_i, durch nichtlineare Regression mittels SIGMA-PLOT-2001 und ENZYME-KINETICS-Modul 1.1 (Software von SPSS Science Software, Erkrath, BR Deutschland) bestimmt wurden.

Claims

Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Tumorprävention.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein hypericinreicher pflanzlicher Trockenextrakt eingesetzt wird, vorzugsweise ein Johanniskraut-Extrakt.
Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Epoxidationsaktivität des Enzyms CYP1A1 (Cytochrom P450 1A1).
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein hypericinreicher pflanzlicher Trockenextrakt eingesetzt wird, vorzugsweise ein Johanniskraut-Extrakt.
Verfahren zur Tumorprävention durch Gabe einer präventiven pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Menge, die ausreichend ist, um die Epoxidationsaktivität des Enzyms CYP1A1 zu hemmen, wobei die Zusammensetzung eine effektive Menge an Hypericin und/oder dessen Derivaten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zu applizierende Zusammensetzung einen hypericinreichen pflanzlichen Trockenextrakt umfasst, vorzugsweise einen Johanniskraut-Extrakt.
Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittels.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein hypericinreicher pflanzlicher Trockenextrakt eingesetzt wird, vorzugsweise ein Johanniskraut-Extrakt.
Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel umfassend eine ernährungswirksame Menge an Hypericin und/oder dessen Derivaten.
Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 9, umfassend einen hypericinreichen pflanzlichen Trockenextrakt, vorzugsweise einen Johanniskraut-Extrakt.