DE10253720A1

DE10253720A1 - 10-Phenylimino-9(10H)-anthracenone als neue Inhibitoren der Tubulin-Polymerisation

Info

Publication number: DE10253720A1
Application number: DE2002153720
Authority: DE
Inventors: Helge Dr. Prinz; Eberhard Prof. Dr. Unger; Thomas Dr. Stoiber; Angelika Dr. Burger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-11-19
Filing date: 2002-11-19
Publication date: 2004-07-29

Abstract

Die erfindungsgemäßen Phenylimino-9(10H)anthracenone der allgemeinen Formeln I und II DOLLAR F1 haben sich als sehr potente Hemmstoffe des Tumorzellwachstums und der Tubulinpolymerisation erwiesen. Sie sind daher zur Behandlung von Erkrankungen geeignet, die mit einer erhöhten zellulären Proliferation einhergehen. Die erfindungsgemäßen Tubulin-bindenden Substanzen können somit beispielsweise als wirkungsvolle anti-Krebs wirksame Verbindungen fungieren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Hemmstoffe der Tubulinpolymerisation. Es handelt sich um 10-Phenylimino-9(10H)-anthracenone und deren Derivate als anti-Tumor wirksame Verbindungen.

Krebs stellt eine der größten Gesundheitsbedrohungen der Menschheit dar, und deshalb werden beträchtliche Anstrengungen hinsichtlich der Entwicklung neuer Chemotherapeutika für eine potentere und spezifischere anti-Krebs-Therapie unternommen. Das augenfälligste und medizinisch bedeutsamste Merkmal von Krebszellen ist deren unkontrollierte Vermehrung. Die zelluläre Proliferation ist ein Resultat der Zellteilung oder Mitose.

Mikrotubuli besitzen eine herausragende Bedeutung für verschiedenste Funktionen der Zelle, darunter etwa die Mitose, die Bewegung der Zelle, Zollform sowie auch für den Transport von Organellen innerhalb der Zelle. Bei den Mikrotubuli handelt es sich um eine eigene Klasse von Zytoskelett-Bestandteilen. Die Bedeutung der Mikrotubuli für das zelluläre Leben und speziell für die Zellteilung und damit verbunden für die Induktion und das Fortschreiten der Apoptose machen sie zu einem der attraktivsten therapeutischen Targets für die Entwicklung neuer Verbindungen mit Bedeutung für die anti-Krebs-Chemotherapie. Tubulin zusammen mit seinen Isoformen bildet den Hauptbestandteil der Mikrotubuli und existiert seinerseits als Heterodimer der beiden globulären Polypeptiduntereinheiten α- und β-Tubulin. Beide Peptide besitzen eine molekulare Masse zwischen 50–55. Unter physiologischen Bedingungen polymerisiert das Tubulin zu Mikrotubuli. Im Zuge des Einbaus des αβ-Dimers in den Mikrotubulus bindet das Hetrodimer zwei Moleküle Guanosintriphosphat (GTP) und hydrolysiert eines davon zu GDP und anorganischem Phosphat. Elektronenmikroskopische Untersuchungen und Röntgenstrukturanalysen belegten den Aufbau des Mikrotubulus aus 13 parallelen, versetzt angeordneten Protofilamenten, die einen Hohlraum umschließen. Mikrotubuli werden ständig auf- und abgebaut, sie zeigen eine dynamische Instabilität. Für zahlreiche natürlich vorkommende antimitotisch wirksame Verbindungen konnte gezeigt werden, dass sie ihren Effekt durch eine Bindung an das Tubulin ausüben. Die sogenannten MAPs („mikrotubuli-assoziierte Proteine") oder andere in das Geschehen der Mitose involvierte Proteine spielen hier eine eher untergeordnete Rolle. Allgemein kennt man drei Hauptklassen antimitotisch wirksamer Verbindungen. Es handelt sich einmal um Mikrotubulistabilisierende Verbindungen, um Substanzen die an die Vinca-Alkaloid-Bindestelle binden sowie um Substanzen die an der Colchicin-Bindestelle angreifen. Erstere wirken durch Bindung und somit Blockade der Depolymerisation, die beiden zuletzt genannten Verbindungsklassen entfalten ihre Wirkung dagegen primär durch eine Hemmung der Tubulin-Polymerisation. Einige klinisch vielversprechende Substanzen mit dokumentierter zytotoxischer und anti-Tumor-Wirkung wirken durch eine Interaktion mit dem Prozess der Mikrotubuli-Assemblierung-Disassemblierung oder der Mikrotubulidynamik, was letztlich zu einer Blockade des Zellzyklus in der Mitosephase sowie zur Induktion von Apoptose führt. Unter den bedeutendsten anti-Mikrotubuli wirksamen Substanzen zur Krebstherapie befinden sich die Vinca-Alkaloide, so z.B. das Vinblastin und das Vineristin sowie die neueren Taxane wie das Paclitaxel (Taxol) und das Docetaxel (Taxotere), welche erfolgreich in die klinische Onkologie eingeführt wurden. Beim Colchicin handelt es sich um eine weitere wichtige, antimitotisch wirksame Substanz. Obwohl Colchicin auf Grund des sehr kleinen therapeutischen Fensters eine nur sehr eingeschränkte medizinische Anwendbarkeit besitzt, spielte die Substanz eine fundamentale Rolle bei der Aufklärung der Eigenschaften und Funktionen des Tubulins und der Mikrotubuli. Weiterhin üben die Naturstoffe Rhizoxin¹, Combretastatin A-4 and A-2^2,3, Curacin A, Podophyllotoxin⁴, die Epothilone A and B⁵ und das Dolastatin⁶ sowie einige synthetische Verbindungen wie das Phenstatin, die 2-Styrylchinazolin-4(3H)-one⁷ und hoch oxygenierte Derivate von cis- and trans-Stilbenen⁸ ihre zytotoxischen Eigenschaften über eine Bindungsinteraktion mit dem Tubulin aus. Die spezifischen Interaktionen mit der Bindungsstelle sind in vielen Fällen nicht vollständig bekannt und für eine ganze Anzahl von Tubulin-bindenden Substanzen weitestgehend unbekannt.

Die gegenwärtige Erfindung betrifft neue Inhibitoren der Tubulinpolymerisation mit Phenylimino-9(10H)-anthracenonstruktur sowie deren Analoga. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass bestimmte 10-Phenylimino-9(10H)-anthracenone potente Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind und daher zur Behandlung von Erkrankungen geeignet sind, die mit einer erhöhten zellulären Proliferation einhergehen. Die erfindungsgemäßen Tubulin-bindenden Substanzen können somit beispielsweise als wirkungsvolle anti-Krebs wirksame Verbindungen fungieren.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Die folgenden Abbildungen sind Bestandteil der vorliegenden Patentschrift und dienen dein besseren Verständnis sowie der Spezifizierung der gegenwärtigen Erfindung.

1 zeigt ein representatives Reaktionsschema für die Synthese der erfindungsgemäßen 10-Phenylimino-9(10H)-anthracenone und die 1,8-Dichloranaloga.

2 zeigt den Effekt von Verbindung A143 auf das Wachstum humaner chronisch myelogener K562 Zellen. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindung über einen Zeiraum von 48 h behandelt und die Zellzahl durch Zählung mittels eines Hämozytometers (Neubauer-Kammer) bestimmt. Der 100% Wert entspricht einer Zellzahl von 1.20 × 10⁶ K562-Zellen pro ml. Die Werte repräsentieren das Mittel ± SD (Standardabweichung) aus sechs Proben; Balken, SD.

3 zeigt das Chemosensitivitätsprotiil von Verbindung A145 und A146 gegeüber ausgewählten Tumorzell-Linien Propidiumiodid-Assay). Balken nach links zeigend: sensitivere Zell-Linien, Balken nach rechts zeigend: resistentere Zell-Linien.

4 zeigt die Assemblierung des Tubulins in PIPES-Puffer bei pH = 6.8 und 37 °C. Die Tubulinkonzentration beträgt 1.1 × 10^–5 M.

Detailierte Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung sind 10-Phenylimino-9(10H)-anthracenone sowie 1,8-Dichlor-10-phenylimino-9(10H)-anthracenone der allgemeinen Formeln I und II,

worin die erfindungsgemäßen Verbindungen einen oder mehrere Substituenten (R1–R5) enthalten. Bevorzugte Verbindungen gemäß der Erfindung sind die in Tabelle I dargestellten sowie die in den Beispielen exemplarisch aufgeführten Verbindungen. Eine besonders bevorzugte Verbindung der allgemeinen Formel I ist diejenige mit R2 = OH and R3 = OCH₃. Eine besonders bevorzugte Verbindung der allgemeinen Formel II ist diejenige mit R2 = OH and R3 = OCH₃.

Representativ für die erfindungsgemäßen Verbindungen stehen die im Folgenden aufgeführten:
Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung kann in der Phenylimino-9(10H)anthracenonstruktur der terminale Phenylrest durch eine Struktur mit terminaler heterocyclischer Gruppe wie Thiophen, Pyrrol oder Imidazol ersetzt (modifiziert) werden.

10-(3',5'-Dimethoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon; 10-(3',4'-Dimethoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon; 10-(4'-Methoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon; 10-(3'-Hydroxy-4'-methoxy-phenylimino)-9(10H)-anthracenon; 10-(3',4',5'-Trimethoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon; 10-(2',4'-Dimethoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon; 1,8-Dichlor-10-(3-hydroxy-4-methoxy-phenylimino)-9(10H)-anthracenon; 1,8-Dichlor-10-(4'-methoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon;

Antineoplastischer Effekt

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine anti-Tubulin-Wirkung durch Hemmung der Tubulinassemblierung (Polymerisation). Die erfindungsgemäßen tubulinbindenden Verbindungen sind daher brauchbar als neue anti-Krebs wirksame Verbindungen.

Salze Die Erfindung beinhaltet ebenfalls die pharmazeutisch verträglichen Säuren- und Basenadditionssalze der Verbindungen zur pharmazeutischen Anwendung. Die pharmazeutisch verträglichen Salze können Basenadditionssalze sein. Dazu zählen Salze der Verbindungen mit Metallen und Aminen, wie Alkali- oder Erdalkalimetallen oder organischen Aminen. Beispiele für brauchbare Metallkationen wären Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und dergleichen. Eingeschlossen sind auch Schwermetallsalze mit den Kationen Silber, Zink, Kobalt, und Cer. Beispiele für brauchbare Amine sind N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chlorprocain, Cholin, Diethanolamin, Ethylendiamin, N-Methylglucamin, und Procain. Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze der Verbindungen werden diejenigen, die mit organischen und anorganischen Säuren gebildet werden. Beispiele geeigneter Säuren zur Salzbildung sind Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Salicylsäure, Äpfelsäure, Gluconsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, und dergleichen. Die Salze können durch Behandlung der freien basischen Form mit einer ausreichenden Menge der gewünschten Säure unter Bildung eines Monosalzes, Disalzes, etc. auf herkömmliche Art und Weise erhalten werden. Die freie basische Form kann durch Behandeln eines Salzes mit einer Base regeneriert werden. Es können z.B. verdünnte Lösungen der wässrigen Base verwendet werden. Verdünntes wässriges Natriumhydroxid, Kaliumcarbonat, Ammoniak und Natriumhydrogencarbonat sind für diesen Zweck brauchbar. Die freien basischen Formen unterscheiden sich von den Salzen in einigen physikalischen Eigenschaften wie z.B. der Löslichkeit in polaren Solventien, die Salze verhalten sich jedoch entsprechend den basischen Formen im Sinne der Erfindung.

Depolymerisation von Tubulin

Die erfindungsgemäßen Verbindungen binden an Tubulin. Durch Bindung der erfindungsgemäßen tubulinbindenden Substanzen kommt es zu einer Hemmung der Tubulinassemblierung (Polymerisation). Geeignete Assays zur Feststellung der Tubulinwirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen finden sich in den angegegeben Beispielen.

Behandlung proliferativer Erkrankungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben sich als potente Inhibitoren der Tubulinpolymerisation erwiesen. Sie sind daher auch geeignet zur Hemmung der Zellteilung und Proliferation von nicht-Krebszellen. Solche Krankheiten umfassen EBV-induzierte lymphoproliferative Erkrankungen und Lymphome, proliferative Sekundäreffekte im Zusammenhang mit Diabetes, einschließlich vaskulärer Proliferation und Retinopathie und Psoriasis; desweiteren benigne Tumore, einschließlich Angiome, Fibrome, Myome, Osteoporose, Mastozytose und myeloproliferative Erkrankungen.

Anti-Tumor Wirkung

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind brauchbar zum Zwecke der Tumorbehandlung, um beispielsweise eine Hemmung der Tubulinassemblierung des Tumorzelltubulins zu erreichen, eine Hemmung des Tumorzellwachstums zu erzielen, Tumorzellen abzutöten, Apoptose zu induzieren und/oder die Lebensdauer eines Patienten zu verlängern.

Die krebswirksamen, tubulinbindenden erfindungsgemäßen Verbindungen sind brauchbar zur Anwendung in Säugetieren. Säugetier bezeichnet im Sinne dieser Erfindung jede Klasse höherer Vertebraten, die ihre Jungen mit Milch, produziert in Milchdrüsen ernähren, einschließlich dem Menschen, Kaninchen und Affen.

Die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind geeignet zur Behandlung jeder Krankheit, bei der die Polymerisation von Tubulin von Bedeutung ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind außerdem geeignet zur- Behandlung von Krankheiten , welche durch parasitische Protozoen, wie Sporozoen (z.B. Plasmodium, Toxoplasma), Amöben (z.B. Acanthamoeba, Entamoeba), Flagellaten (z.B. Trypanosoma, Leishmania), Ciliaten (z.B. Balantidium) hervorgerufen werden und für die die Tubulinpolymerisation von Bedeutung für deren Bewegung ist. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind insbesondere nützlich zur Behandlung der Chagas-Krankheit oder von Krankheiten, die durch Würmer hervorgerufen werden.

Methoden zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können entweder als einzelne therapeutische Wirkstoffe oder als Mischung mit anderen therapeutischen Wirkstoffen verabreicht werden. Im allgemeinen werden sie in Form pharmazeutischer Mittel verabreicht, das heißt als Mischungen der Wirkstoffe mit geeigneten Trägern oder Verdünnungsmitteln. Die Verbindungen oder Mittel können oral, parenteral (z.B. intravenös, intraperitoneal), durch Inhalation oder topisch (einschließlich dermal, transdermal, buccal, und sublingual) verabreicht werden.

Die Art des pharmazeutischen Mittels und des pharmazeutischen Trägers bzw. Verdünnungsmittels hängt von der gewünschten Verabreichungsart ab. Orale Mittel können beispielsweise als Tabletten oder Kapseln, auch in retardierter Form, vorliegen und können übliche Exzipienzien enthalten wie Bindemittel (z.B. Sirup, Akazia, Gelatine, Sorbit, Tragart oder Polyvinylpyrrolidon), Füllstoffe (z.B. Lactose, Saccharose, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin), Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Talcum, Polyethylenglykol oder Siliciumdioxid), desintegrierende Mittel (z.B. Stärke) oder Netzmittel (z.B. Natriumlaurylsulfat). Orale flüssige Präparate können in Form wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren oder Sprays usw. vorliegen oder können als Trockenpulver zur Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vorliegen. Derartige flüssige Präparate können übliche Additive, beispielsweise Suspendiermittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel oder Emulgatoren enthalten. Für die parenterale Verabreichung kann man Lösungen oder Suspensionen mit üblichen pharmazeutischen Trägern einsetzen. Für die Verabreichung durch Inhalation können die Verbindungen in wässriger oder teilweise wässriger Lösung vorliegen, die in Form eines Aerosols angewendet werden kann. Mittel für die topische Anwendung können z.B. als pharmazeutisch verträgliche Puder, Lotionen, Salben, Cremes, Gele oder als therapeutische Systeme vorliegen, die therapeutisch wirksame Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten. Die erforderliche Dosierung ist abhängig von der Form des angewendeten pharmazeutischen Mittels, von der Art der Anwendung, der Schwere der Symptome und dem speziellen Subjekt (Mensch oder Tier), das behandelt wird. Die Behandlung wird üblicherweise mit einer Dosis begonnen, die unterhalb der optimalen Dosis liegt. Danach wird die Dosis erhöht, bis der für die angegebene Bedingungen optimale Effekt erzielt wird. Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen am besten in Konzentrationen verabreicht, mit welchen sich effektive Wirkungen erzielen lassen, ohne dass schädliche oder nachteilige Wirkungen auftreten. Sie können in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden.

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen lässt sich anhand verschiedener Testsysteme bestimmen. Nähere Angaben erfolgen in den angegebene Beispielen.

Methoden zur Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen

Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen kann wie unterstehend in Beispiel 1 beschrieben erfolgen.

Tabelle 1. Wachstumshemmende Aktivität der substituierten 10-Phenylimino-9(10H)-anthracenone gegenüber dem Wachstum von K562 Zellen und Hemmung der Tubulinpolymerisation in vitro

Tabelle 2 Chemische Daten der Phenylimino-9(10H)-anthracenone sowie der 1,8-Dichlor-l0-phenylimino-9(10H)-anthracenone

Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung ohne sie zu beschränken sowie dem besseren Verständnis der Erfindung.
Beispiel 1
Synthese der Hemmstoffe der Tubulinpolymerisation
Chemische Methoden
Die Schmelzpunkte wurden mittels eines Kofler Schmelzpunktbestimmungsapparates ermittelt und sind nicht korrigiert. Spektren wurden wie folgt erhalten: ¹H NMR Spektren wurden mit einem Varian Gemini 200 (50,3 MHz) Spektrometer, unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard, aufgenommen. Fouriertransformierte IR-Spektren wurden mit einem Bio-Rad Laboratorien Typ FTS 135 Spectrometer aufgenommen und mittels WIN-IR Foundation Software analysiert. Verbrennungsanalysen wurden im mikroanalytischen Labor der Universität Münster unter Verwendung eines Heraeus CHN-O-Rapid analyser 240 drchgeführt. Alle Werte befinden sich innerhalb ± 0.4% der berechneten Zusammensetzung. Massenspektren (EI) wurden im EI Modus mittels eines MAT 44S Finnigan Massenspektrometers aufgenommen. Alle organischen Lösungsmittel wurden vor dem Gebrauch sorgfältig getrocknet bzw. gereinigt. Aromatische Aldehyde waren überwiegend kommerziell erhältlich. Analytische Dünnschichtchromatographie wurde auf mit Kieselgel bezogenen Aluminiumplattten (Merck Kieselgel 60 F₂₅₄, E. Merck, Darmstadt) durchgeführt. Säulenchromatographie mit Kieselgel wurde unter Verwendung von Kieselgel der Firma Merck (70–230 mesh) durchgeführt.
Die hier beschriebenen strukturellen Variationen betreffen in erster Linie die Phenyliminopartialstruktur der Moleküle. Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Anilinderivate waren kominerziell erhältlich.
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der 10-Phenylimino-9(10H)anthracenone.
Herstellung von Bromanthron: Man löst 9(10H)-Anthracenon (10 g, 51.5 mmol) in 80 ml Chloroform. Dann tropft man langsam Brom (8.15 g, 2.6 ml, 51 mmol) dazu. Es tritt kräftige Bromwasserstoffentwicklung auf und nach kurzer Zeit fällt das Rohprodukt kristallin aus. Man rührt 30 min bei Raumtemperatur, lässt den Ansatz dann einige Zeit im Eisbad stehen, saugt den Niederschlag ab und wäscht den Filterkuchen mit ca. 50 ml Hexan nach. Man erhält stets etwa 6.0 g Bromanthron als Rohprodukt, welches für die weiteren Umsetzungen genügend rein ist. Das Bromanthron wird nach Trocknung im Ölpumpenvakuum ohne weitere Reinigung verwendet. Herstellung der Phenylimino-9(10H)anthracenone. Man suspendiert Bromanthron (1.0 g, 7.2 mmol) sowie das jeweilige Anilin (7.2 mmol) in 50 ml Benzen und rührt das Gemisch auf dem Ölbad (80 °C) für die Dauer von zunächst 3h. Nach dem Verschwinden des Eduktes (DC-Kontrolle!) lässt man das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen, überführt den Kolben in ein Eisbad und versetzt mit 150 ml Petrolether. Der entstehende Niederschlag wird nach 15 min abgesaugt und mit Hexan oder Petrolether nachgewaschen. Das Produkt befindet sich ganz überwiegend im Filtrat (DC-Kontrolle!). Man engt im Wasserstrahlvakuum zur Trockene ein. Der rotbraune Rückstand wird in allen Fällen säulenchromatographisch mittels einer kurzen (!) (Cave Zersetzung !, nicht bei 1,8-Cl-Substitutionsmuster) Kieselgelsäule gereinigt. Beim Einengen der Reinfraktionen kristallisiert das Produkt nach Zugabe von Hexan und Stehenlassen im Eisbad aus. Die Phenyliminoanthracenone lösen sich in den gängigen organischen Lösungsmitteln mit intensiv roter Farbe.
Der beschriebene Synthesevorgang kann analog ausgehend vom 1,8-Dichlor-9(10H)-anthracenon durchgeführt werden.
10-(3',5'-Dimethoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon
FTIR 1656 cm^–1; ¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ 8.33–7.38 (in, 8H), 6.26–6.01 (m, 3H), 3.76 (s, 6H); MS m/z (M⁺); Anal. (C₂₂H₁₇NO₃) C, H, N.
10-(3',4'-Dimethoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon
FTIR 1666 cm^–1; ¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ 8.40–7.30 (m, 8H), 6.89–6.35 (m, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.81 (s, 3H); MS m/z (M⁺); Anal. (C₂₂H₁₇NO₃) C, H, N.
10-(4'-Methoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon
FTIR 1665 cm^–1; ¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ 8.49–7.29 (m, 8H), 6.95, 6.85 (AA', BB', J_AB = 6.70 Hz), 3.84 (s, 3H); MS m/z (M⁺); Anal. (C₂₁H₁₅NO₂) C, H, N.
10-(3'-Hydroxy-4'-methoxy-phenylimino)-9(10H)-anthracenone
FTIR ungenau cm^–1; ¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ 8.47–7.31 (m, 8H), 6.85–6.25 (m, 3H), 5.71 (s, 1H), 3.92 (s, 3H); MS m/z (M⁺); Anal. (C₂₁H₁₅NO₃) C, H, N.
10-(3',4',5'-Trimethoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon
FTIR 2835, 1667 cm^–1; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 8.31–7.26 (m, 8H), 6.08 (s, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.77 (s, 6H); MS m/z (M⁺); Anal. (C₂₃H₁₉NO₄) C, H, N.
10-(2',4'-Dimethoxyphenylimino)-9(10H)-anthracenon
mp °C; FTIR cm^–1; 'H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 8.51–7.31 (in, 8H), 6.77–6.50 (m, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.58 (s, 3H); MS m/z (M⁺); Anal. (C₂₂H₁₇NO₃) C, H,
Beispiel 2
Prüfung auf wachstumshemmende Eigenschaften an K562-Zellen
Wir prüften die neu synthetisierten Verbindungen auf wachstumshemmende Eigenschaften an der in Suspension wachsenden K562 Leukämie Zell-Linie.²² Der IC₅₀-Wert (definiert als die effektive Konzentration, die für eine 50%ige Hemmung des Zollwachstums benötigt wird) von 10-(3'-Hydroxy-4'-methoxy-phenylimino)-9(10H)-anthracenone (A 146) beträgt in diesem Assay 0.85 μM (2).
Humane chronisch myelogene K562 Leukämie-Zellen wurden von der Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zollkulturen (DSMZ), Braunschweig, bezogen und in RPMI 1640 Medium (Zusätze: 10% Rinderserum (FBS), Kanamycin (0.1 mg/ml), Penicillin G (100 units/ml), and L-Glutamin (30 mg/liter) bei 37 °C und 5% CO₂ kultiviert.
Die K562-Zellen wurden in einer Zolldichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml in Platten zu je 48 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) ausgesäät. Unbehandelte Kontrollen wurden dabei als 100% betrachtet. Die zu prüfenden Verbindungen wurden in DMSO/Methanol im Verhältnis 1:1 gelöst, den Kontrollen wurde lediglich das Lösungsmittel zugesetzt. In jede Vertiefung wurden jeweils 5 μL der gelösten Verbindung pipettiert, das Gesamtvolumen im Endbehältnis betrug somit 500 μl. Die Zollzahl wurde mittels eines Model ZM Coulter Counters (Coulter Electronics, Luton, England) nach Inkubation mit den zu prüfenden Verbindungen über einen Zeitraum von 48 h ermittelt.
Eine Übersicht über die synthetisierten Phenylimino-9(10H)-anthracenone sowie über deren wachstumshemmende Eigenschaften (IC₅₀-Werte) gibt Tabelle 1.
Die beobachteten antiproliferativen Effekte hängen vom Substitutionsmuster ab. 10-(3'-Hydroxy-4'-methoxy-phenylimino)-9(10H)-anthracenone A146 zeigte stark wachstumshemmende Eigenschaften (IC₅₀ (K562) 0.85 μM). Ebenfalls gute Aktivität zeigten die Verbindungen 2, 4 und 7 mit IC₅₀ Werten im submikromolaren Bereich < 0.1 μM.
Beispiel 3
Wachstumshemmende Eigenschaften gegenüber weiteren Tumorzoll-Linien Wir prüften die aktivsten unserer Verbindungen (A145, A146, A214, und A215) in vitro auf ihre tumorhemmenden Eigenschaften (Tabelle 2) unter Verwendung eines auf Propidiumiodid basierenden Zytotoxizitätsassays nach einer von Dengler et al. etablierten Methode.²³ Wiederum erwiesen sich A145 und A146 als sehr potent und zeigten stark wachstumshemmende Eigenschaften gegenüber allen verwendeten Zell-Linien. Insbesondere erwies sich die Verbindung sehr aktiv gegenüber der OVCAR-3 Zell-Linie (IC₅₀ = 0.06 μM).
Beispiel 4
Mikrotubuliassemblierung-Turbidimetrischer Assay
Prinzip der Methode
Bei physiologischer Temperatur und in Gegenwart von Kofaktoren (GTP und Mg²⁺-Ionen) assembliert das Mikrotubuliprolein (MTP) in vitro unter Mikrotubulibildung. Dieser Prozess ist umkehrbar. Antagonisten der Assemblierung, wie z.B. Ca²⁺-Ionen oder auch niedrige Temperaturen (für Mikrotubuli aus Säugerhirn Temperaturen < 10 °C) bedingen eine Desassemblierung, Promotoren dagegen bedingen eine Stabilisierung. Die Kinetiken und "steady state"-Bedingungen der MT-Bildung sowie der MT-Disintegration könnendurch zeit- und temperaturabhängige turbidimetrische Messungenbei 360 nm verfolgt werden.
Isolierung von MTP und Hemmung der MT Assemblierung
Mikrotubuliprotein wurde aus Schweinehirn durch Zyklen temperaturabhängiger Disassemblierung/Reassemblierung nach einer von Shelanski et al. etablierten Methode gewonnen. ²⁷. Zur Steigerung der Ausbeute wurden die Schritte der Reassemblierungin Gegenwart von Glycerol durchgeführt. Eine zufriedenstellende Reinheit des Mikrotubuliproteins war nach zwei Zyklen von Disassemblierung/Reassemblierung gewährleistet.
Mikrotubuli zur Bestimmung antimikrotubulärer Effektoraktivitäten wurden durch in vitro Assemblierung von Mikrotubuliprolein erhalten. Die Mikrotubulikonzentration in den Assemblierungsstudien betrug 1 mg/ml (bestimmt nach dem Lowry Verfahren unter Verwendung von bovinem Serumalbumin). Die Mikrotubuli assemblierten in einem Puffer der Zusammensetzung 20 mM PIPES (1,4-Piperazinediethansulfonsäure, pK_a 6.8), 80 mM NaCl, 0.5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (Ethyleneglykole-bis-(2-aminoethylen)-tetraessigsäure) nach Zugabe von 0.25 mM GTP (Guanosin-5'-triphosphat) und Erwärmung der Proben auf 37 °C. Der Gleichgewichtszustand, erkennbar an der nicht weiter zunehmenden Menge an polymerisiertem Tubulin, wurde in den Turbiditätsmessungen nach einer Inkubationsdauer von 20 min erreicht.
Turbidimetrische Messung
Die turbidimetrischen Messungen wurden spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 360 nm durchgeführt. Die Temperatur in der Assemblierungs-/Disasseinblierungs Küvette wurde mittels einer Kryostat/Thermostat-Kombination reguliert. Die zu prüfenden Verbindungen wurden zu einer kalten MTP-Lösung (MTP Konzentration 1 mg/ml, Temperatur 2 bis 4 °C) in PIPES Puffer (zur Zusammensetzung siehe oben) bei pH = 6.8 gegeben. Unmittelbar mit Beginn der Messung wurde die Temperatur auf 37 °C erhöht. Nach einer kurzen "Gap-Phase" kommt es zur Assemblierung des MTP zu MT. Die Lösung trübt sich und erreicht nach ca. 20 min einen Gleichgewichtszustand. Um die Trübung von unspezifischen Proteinpräzipitaten zu unterscheiden, wird die Lösung auf 2 °C gekühlt und für 5 min bei dieser Temperatur gehalten, was eine MT Disassemblierung bedingt. Die MTP Lösung wird erneut transparent. Bindet oder interferiert die zu prüfende Verbindung mit Tubulin, so nimmt der "steady state"-Zustand für Inhibitoren der Asseinblierung ab bzw. zu für MT stabilisierende Substanzen. Der IC₅₀ Wert gibt diejenige Konzentration an, die eine 50%ige Abweichung vom "steady-state" Zustand bedingt.
In der Tabelle 1 sind die IC₅₀-Werte der Polymerisationshemmung von Schweinehirntubulin angegeben. Als Referenzsubstanzen sind Colchicin, Nocodazol, Podophyllotoxin und Vinblastinsulfat mit einbezogen. Als sehr potente Inhibitoren sind beispielsweise die Verbindungen A145 (IC₅₀ = 1.9 μM), A142 (IC₅₀ = 1.45 μM) und A146 (IC₅₀ = 0.53 μM) hervorzuheben.
Die gefundenen Daten belegen, dass die erfindungsgemässen Phenylimino-9(l0H)anthracenone potente zytotoxische Wirkstoffe darstellen, deren Wirkmechanismus auf einer Hemmung der Tubulinassemblierung beruht.
Literatur

(1) Hamel, E. Natural products which interact with tubulin in the vinca domain: maytansine, rhizoxin, phomopsin A, dolastatins 10 and 15 and halichondrin B. Pharmacol. Ther. 1992, 55, 31–51.
(2) Pettit, G. R.; Singh, S. B.; Hamel, E.; Lin, C. M.; Alberts, D. S.; Garcia Kendall, D. Isolation and structure of the strong cell growth and tubulin inhibitor combretastatin A-4 [published erratum appears in Experientia 1989 Jul 15;45(7):680]. Experientia 1989, 45, 209-211.
(3) Pettit, G. R.; Singh, S. B.; Boyd, M. R.; Hamel, E.; Pettit, R. K.; Schmidt, J. M.; Hogan, F. Antineoplastic agents. 291. Isolation and synthesis of combretastatins A-4, A-5, and A-6. J. Med. Chem. 1995, 38, 1666–1672.
(4) Damayanthi, Y.; Lown, J. W. Podophyllotoxins: current status and recent developments. Curr. Med. Chem. 1998, 5, 205–252.
(5) Flörsheimer, A.; Altmann, K.-H. Epothilones and their analogues – a new class of promising microtubule inhibitors. Expert Opin. Ther. Patents 2001, 11, 951–968.
(6) Poncet, J. The dolastatins, a family of promising antineoplastic agents. Curr. Pharm. Design 1999, 5, 139–162.
(7) Jiang, J. B.; Hesson, D. P.; Dusak, B. A.; Dexter, D. L.; Kang, G. J.; Hamel, E. Synthesis and biological evaluation of 2-styrylquinazolin-4(3H)-ones, a new class of antimitotic anticancer agents which inhibit tubulin polymerizadon. J. Med. Chem. 1990, 33, 1721–1728.
(8) Cushman, M.; Nagarathnam, D.; Gopal, D.; He, H. M.; Lin, G M.; Hamel, E. Synthesis and evaluation of analogues of (Z)-1-(4-mcthnxyphenyl)-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethene as potential cytotoxic and antimitotic agents. J. Med. Chem. 1992, 35, 2293–2306.
(9) de Barry Barnett, E.; Goodway, N. F.; Wiltshire, J. L. Beiträge zur Kenntnis der Anthracen-Derivate (I. Mitteil.). Chem. Ber. 1930, 63, 1960–1967.
(10) de Barry Barnett, E.; Hewett, C. L. The influence of Bz..-substituents upon some reactions of the anthrones. Part I. J. Chem. Soc. 1932, 1452–1458.
(11) Ingram, V. M. The stereochemistry of 10-benzylideneanthrone and 9-benzylidenefluorene. J. Chem. Soc. 1950, Part III, pp. 1975–2914, 2318–2323.
(12) Bergmann, E. D.; Rabinovitz, M.; Glily, S. A ring enlargement in the 9,10-dihydroanthracene series. Tetrahedron Suppl. 1966, 8, 141–148.
(13) Rabinovitz, M.; Salemnik, G. The hydroboration of 10-benzylidene-9-anthrones. J. Org. Chem. 1968, 33, 3935–3936.
(14) Schultz, O.-E.; Schulze, V. In meso-10-Stellung substituierte Derivate von hydroxyanthron-9. Pharm. Acta Helv. 1969, 45, 282–285.
(15) Rappoport, Z.; Apeloig, Y.; Greenblatt, J. Vinylic cations from solvolysis. 29. Solvolysis of 9-(α-bromoarylidene)anthrones as a probe to the reactivity-selectivity relationship in solvolysis reactions. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 3837–3848.
(16) Weitz, E. Über einige Anthronabkömmlinge. Liebigs Ann. Chem. 1919, 418, 29–35.
(17) Dimmel, D. R.; Shepard, D. Regioselective alkylation of anthrahydroquinone and anthrone in water with quinonemethides and other alkylating agents. J. Org. Chem. 1982, 47, 22–29.
(18) Zhang, L.; Lau, Y.-K.; Xi, L.; Hong, R.-L.; Kim, D. S.; Chen, C.-F.; Hortobagyi, G. N.; Chang, C.; Hung, M.-C. Tyrosine kinase inhibitors, emodin and its derivative repress HER-2/neu-induced cellular transformation and metastasis-associated properties. Oncogene 1998,16, 2855–2863.
(19) Müller, K.; Gürster, D.; Piwek, S.; Wiegrebe, W. Antipsoriatic anihrones with modulated redox properties. 1. Novel 10-substituted 1,8-dihydroxy-9(10H)-anthracenones as inhibitors of 5-lipoxygenase. J. Med. Chem. 1993, 36, 4099–4107.
(20) Bullington, J. L.; Cameron, J. C.; Davis, J. E.; Dodd, J. H.; Harris, C. A.; Henry, J. R.; Pellegrino-Gensey, J. L.; Rupert, K. C.; Siekierka, J. J. The development of novel and selective p56^lek tyrosine kinase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 2489–2494.
(21) Hünig, S.; Schweeberg, H.; Schwarz, H. Farbe and Konstitution I. Über Farbstoffe mit gekreuzten Absorptionssystemen. Liebigs. Ann. Chem. 1954, 587, 132–145.
(22) Lozzio, C. B.; Lozzio, B. B. Human chronic myelogenous leukemia cell-line with positive philadelphia chromosome. Blood 1975, 45, 321–334.
(23) Dengler, W. A.; Schulte, J.; Berger, D. P.; Mertelsmann, R.; Fiebig, H. H. Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assays. Anti-Cancer Drugs 1995, 6, 522–532.
(24) Tashiro, E.; Simizu, S.; Takada, M.; Umezawa, K.; Imoto, M. Caspase-3 activation is not responsible for vinblastine-induced Bel-2 phosphorylation and G2/M arrest in human small cell lung carcinoma Ms-1 cells. Jpn. J. Cancer Res. 1998, 89, 940–946.
(25) Minotti, A. M.; Barlow, S. B.; Cabral, F. Resistance to antimitotic drugs in Chinese hamster ovary cells correlates with changes in the level of polymerized tubulin. J. Biol.. Chem. 1991, 266, 3987–3994.
(26) Scala, S.; Wosikowski, K.; Giannakakou, P.; Valle, P.; Biedler, J. L.; Spengler, B. A.; Lucarelli, E.; Bates, S. E.; Thiele, C. J. Brain-derived neurotrophic factor protects neuroblastoma cells from vinblastine toxicity. Cancer Res. 1996, 56, 3737–3742.
(27) Shelanski, M. L.; Gaskin, F.; Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1973, 70, 765–768.

Claims

Ein 10-Phenylimino-9(10H)anthracenon der allgemeinen Formel I,

worin die Substituenten R1 – R4 unabhängig voneinander für die folgenden Substituenten stehen können: für Wasserstoff, für Alkoxy (C1–C6), für Alkyl (C1–C6), für Aryloxy, für COOH, für SO₃H, für SO₃ ^–M⁺ (wobei es sich bei M um ein Kation handelt), für eine Estergruppe, für eine Thioestergruppe, für CN, für einen Acylrest, für eine Aryloxygruppe, für Phenylmethoxy, Nitro, Hydroxy, Amino, Imino, Mercapto, Halogen, für eine Phosphatesterstruktur (-OP(O)(O-M⁺)₂) oder ein Phosphoramidat (-NP(O)(O-M⁺)₂) , wobei M für ein Kation steht, oder (-NP(O)(OR)₂) wobei es sich bei R um einen Alkylrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen handelt (die beiden Reste R können identisch oder unterschiedlich sein, es kann sich um Benzyl- oder Arylreste handeln).
Ein 1,8-Dichlor-10-phenylimino-9(10H)anthracenon der allgemeinen Formel II,
worin die Substituenten R1 – R4 unabhängig voneinander für die folgenden Substituenten stehen können: für Wasserstoff, für Alkoxy (C1–C6), für Alkyl (C1–C6), für Aryloxy, für COOH, für SO₃H, für SO₃ M⁺ (wobei es sich bei M um ein Kation handelt), für eine Estergruppe, für eine Thioestergruppe, für CN, für einen Acylrest, für eine Aryloxygruppe, für Phenylmethoxy, Nitro, Hydroxy, Amino, Imino, Mercapto, Halogen, für eine Phosphatesterstruktur (-OP(O)(O-M⁺)₂) oder ein Phosphoramidat (-NP(O)(O-M⁺)₂) , wobei M für ein Kation steht, oder (-NP(O)(OR)₂) wobei es sich bei R um einen Alkylrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen handelt (die beiden Reste R können identisch oder unterschiedlich sein, es kann sich um Benzyl- oder Arylreste handeln).
Eine Verbindung nach Patentanspruch 1 mit der Struktur:
Eine Verbindung nach Patentanspruch 2 mit der Struktur:
Eine Verbindung nach Patentanspruch 1 mit der Struktur:
Eine Verbindung nach Patentanspruch 1 mit der Struktur
Eine Verbindung nach Patentanspruch l mit der Struktur
Eine Verbindung nach Patentanspruch 1 mit der Struktur
Eine therapeutische Zusammensetzung mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer der Verbindungen entsprechend Patentanspruch 1 sowie einen pharmazeutischen effektiven Träger.
Eine pharmazeutische Zubereitung entsprechend Patentanspruch 9, worin es sich bei der pharmazeutisch wirksamen Verbindung um die Verbindung
handelt.
Eine therapeutische Zusammensetzung mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer der Verbindungen entsprechend Patentanspruch 2 sowie einen pharmazeutischen effektiven Träger.
Eine pharmazeutische Zubereitung entsprechend Patentanspruch 11, worin es sich bei der pharmazeutisch wirksamen Verbindung um die Verbindung
handelt.