DE10247403A1

DE10247403A1 - Adenovirales Vektorsystem

Info

Publication number: DE10247403A1
Application number: DE10247403A
Authority: DE
Inventors: Volker Sandig; Ingo Jordan
Original assignee: ProBioGen AG
Current assignee: ProBioGen AG
Priority date: 2001-10-04
Filing date: 2002-10-04
Publication date: 2003-09-25
Also published as: DE10294594D2; WO2003031633A3; EP1434868A2; WO2003031633A2; AU2002342536A1; US20050054105A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen adenoviralen Vektor auf der Basis von humanen Adenoviren der Gruppe B, insbesondere des Subtyp 11, der erfindungsgemäß heterologe Elemente, invertet terminal repeats (ITRs) in Kombination mit dem entsprechenden Packsignal eines Virus eines anderen Serotyps, bevorzugt eines Virus des Typs B, enthält. Im viralen Vektor ist ein heterologer Promoter, bevorzugt der SV40 Promoter, enthalten und zwischen Packsignal und der natürlichen Position für Protein IX positioniert. Dieser Vektor kann in Leserahmen der Regionen E1, E2, E3 oder E4 zusätzlich deletiert sein. Die Erfindung beschreibt auch die Nutzung dieses viralen Vektors zur Herstellung eines Hochkapazitätsvektors auf Basis des Adenovirus 11, der an adenoviralen Sequenzen nur über ITRs und Packsignal verfügt und humane genomische Füllsequenzen enthält. Beschrieben werden weiterhin Zelllinien zur Amplifikation dieser viralen Vektoren sowie die Anwendung der Vektoren in der Medizin.

Description

Die Erfindung betrifft einen speziellen adenoviralen Vektor auf der Basis von humanen Adenoviren der Gruppe B, insbesondere des Subtyp 11, der erfindungsgemäß heterologe Elemente, inverted terminal repeats (ITRs) in Kombination mit dem entsprechenden Packsignal eines Virus eines anderen Serotyps, bevorzugt eines Virus des Typs B, enthält. Im viralen Vektor ist ein heterologer Promoter, bevorzugt der SV40 Promoter, enthalten und zwischen Packsignal und der natürlichen Position für Protein IX positioniert. Dieser Vektor kann in Leserahmen der Regionen E1, E2, E3 oder E4 zusätzlich deletiert sein. Die Erfindung beschreibt auch die Nutzung diese viralen Vektors zur Herstellung eines Hochkapazitätsvektors auf Basis des Adenovirus 11, der an adenoviralen Sequenzen nur über ITRs und Packsignal verfügt und humane genomische Füllsequenzen enthält. Diese heterologen Elemente im viralen Vektor ermöglichen einerseits stabile Vermehrbarkeit in komplementierenden Zelllinien und ermöglichen andererseits Nutzung als Helfervirus zur Vermehrung eines viralen Vektors mit Füllsequenzen (Hochkapazitätsvektors). Dabei ist eine Selektion des Hochkapazitätsvektors gegen den Helfervirus auf der Grundlage der heterologen Elemente möglich. Dieses Selektionsprinzip kann mit anderen Selektionsprinzipien kombiniert werden. Beschrieben werden weiterhin Zelllinien zur Amplifikation dieser viralen Vektoren sowie die Anwendung der Vektoren in der Medizin.

WISSENSCHAFTLICHER HINTERGRUND

Der Erfolg viraler Gentherapien hängt wesentlich von der Verfügbarkeit geeigneter Vektoren ab. Der Vektor sollte das therapeutische Gen mit hoher Effizienz in den Zellkern der Zielzelle transportieren und zur Expression bringen, es dort stabilisieren und darüber hinaus weder direkt toxisch wirken noch eine Immunantwort auslösen. Für eine breite medizinische Anwendung eines gentherapeutischen Medikaments muss der Vektor außerdem im industriellen Maßstab produzierbar sein.

Während die meisten nichtviralen Vektoren die Produktionskriterien erfüllen, bleiben sie in ihrer Effektivität trotz großer Forschungsintensität im letzten Jahrzehnt für eine Anwendung in situ und in vivo weit hinter viralen Systemen zurück.

Adenovirale Vektoren nehmen eine Sonderstellung unter den viralen Systemen ein. Sie zeichnen sich durch ein breites Wirtsspektrum, die Fähigkeit, ruhende Zellen zu infizieren und extrem hohe Titer aus. Die Infektionseffektivität, bezogen auf die erforderliche Mengen von Nukleinsäure, übertrifft die aller anderen viralen Systeme und übersteigt die von nackter DNA (bei i. m. Applikation) um das 100 000fache. Adenoviren der Typen 4 und 7 sind in großem Maßstab als Lebendvaccine eingesetzt worden und weisen ein gutes Sicherheitsprofil auf. Als weiterer Sicherheitsaspekt ist auch die äußerst geringe Integrationsneigung von Adenoviren von Vorteil, weil dadurch das Risiko von Insertionsmutagenese und Onkogenaktivierung minimiert wird. 52 verschiedenen Serotypen von humanen Adenoviren bieten eine Auswahl verschiedener Virushüllen mit sehr unterschiedlichem Tropismus und sind deshalb besonders infektiös für Leber oder Muskel (Gruppe C), Zellen des Zentralnervensystems (Vertreter der Gruppe D) oder Zellen des hemopoetischen Systems (Gruppe B).

Der Anwendung von Vektoren aus den häufig verwendeten Serotypen 2 und 5 (Gruppe C) steht deren weite Verbreitung und ein dadurch generell hoher Antikörpertiter in wesentlichen Teilen der Bevölkerung entgegen. Diese kann die Effektivität der Anwendung bis hin zur Wirkungslosigkeit reduzieren. Die Durchseuchung der Bevölkerung mit Viren verschiedener Serotypen variiert jedoch stark. Demzufolge können Viren gefunden werden, deren Hüllen nur in seltenen Fällen durch Antikörper inaktiviert werden und die eine besondere Eignung für bestimmte Zielgewebe aufweisen. Adenoviren des Typs 11, eines in der westlichen Hemisphäre seltenen Serotyps, infizieren effektiv hemopoetische Stammzellen, dentritische Zellen und bestimmte Tumoren. Es existiert jedoch bisher kein Vektorsystem diesen Typs.

Trotz dieser entscheidenden Vorteile sind die Anwendungsmöglichkeiten von Adenovirusvektoren eingeschränkt. Dies ist zum einen darauf zurückzuführen, dass übliche Adenoviren der 1. und 2. Generation virale Gene enthalten. Trotz der Deletion der wichtigsten Transaktivatoren des Virus (E1 Region) werden diese Gene im Zielgewebe exprimiert. Daraus resultieren eine direkte Toxizität, Expressionsabschaltung, Entzündung des Gewebes (Simon et al. 1993) und eine Attacke zytotoxischer T-Lymphozyten, die schließlich zur Zerstörung infizierter Zellen führt. Für bisher wenig charakterisierte Serotypen kommt die Gefahr der Übertragung transformierender Gene hinzu.

Eine Vielzahl von Gruppen hat Versuche unternommen, die Immunogenität adenoviraler Vektoren zu reduzieren. E2 und E4 Regionen, die ebenfalls transaktivierende Funktion besitzen, wurden aus dem Virusgenom entfernt und in die Helferzelllinie übertragen. Es bleibt jedoch unklar, ob diese Veränderungen, die außerdem zu einer Verringerung der Virustiter führen, die Expressionsdauer in vivo steigern können. Als konsequente Fortführung dieses Konzepts wurden in den letzten Jahren Adenovirus-Vektoren entwickelt, die frei von viralen Genen sind (Hardy et al. 1997; Kochanek et al. 1996; Kumar-Singh and Chamberlain 1996; Mitani et al. 1995; Parks et al. 1996). Diese helferabhängigen oder Hochkapazitäts-Vektoren zeigen ein deutlich verändertes Verhalten im Tier. Die sonst typischen Entzündungserscheinungen nach Infektion der Leber mit mittleren Dosen von Adenoviren bleiben vollkommen aus, und die Expression pro Virus steigt auf das bis zu 100-fache, was eine deutliche Dosisreduktion möglich macht. Langzeitexpression bis zu einem Jahr ist in verschiedenen Tiermodellen einschließlich Makaken gezeigt worden. Ein weiterer wesentlicher Vorteil dieser Vektoren liegt in der hohen Packkapazität. Die Produktion dieser Vektoren erfordert derzeit die Koinfektion mit einem Helfervirus, der die notwendigen adenoviralen Proteine in trans bereitstellt. Die Vektoren selbst enthalten nur die nicht kodierenden Sequenzen, die in cis für Replikation und Verpackung notwendig sind. Damit bleiben etwa 35 kb an genomischem Raum verfügbar. Damit ist genügend Platz für den Einbau mehrerer Gene gegeben.

Frühe Versuche, Vektoren dieses Typs zu etablieren, waren wenig praktikabel, weil alle Präparationen große Mengen an Helfervirus enthielten, der schwer abzutrennen ist und eine Aufreinigung im Cs-Gradienten erfordert (Alemany et al. 1997; Mitani et al. 1995). Heute dominiert ein System, bei dem das Packsignal des Helfervirus in der Produktionszelllinie durch die site-spezifische Rekombinase (cre) ausgeschnitten wird (Parks et al. 1996; Hardy et al. 1997). Der Helfervirus repliziert danach noch normal, kann aber nicht mehr in Virushüllen verpackt werden. Das Prinzip ermöglicht die Herstellung von Vektoren mit geringerer Helferkontamination. Die cre-Rekombinase wird dabei von der Produktionszelllinie bereitgestellt. Alternativ hierzu wird die flp Rekombinase genutzt. Der Helfervirus selbst wird in Zellen ohne Rekombinase im Vorfeld gewonnen.

Dieses System ist wenig robust: Sowohl ein Auswachsen von modifizierten Helferviren als auch Instabilität des Helfer abhängigen Vektors wurden beobachtet (Sandig et al. 2000). Dennoch wurden Vektoren im Labormaßstab erfolgreich hergestellt. Die Optimierung von beiden Komponenten des Systems, Helfervirus und helferabhängigen Vektor, hat zu einer robusteren Herstellung und weiter verbesserter Effektivität in vivo geführt (Sandig et al. 2000). Die Überführung in die Großproduktion ist jedoch nach wie vor schwierig. Dadurch wird eine breite Anwendung dieses vielseitigen Vektorsystems in der Korrektur von Stoffwechseldefekten, der lokalen Bereitstellung von Zytokinen, der Tumortherapie und der Vakzinierung eingeschränkt.

Die Herstellung beginnt mit der Transfektion eines helferabhängigen Vektors, dessen ITRs entweder nach Restriktionsspaltung endständig oder als Kopf an Kopf-Fusion vorliegen (Parks et al. 1996), in die Produktionszelllinie (293cre). Die Zellen werden außerdem mit dem Adenovirus-Helfer infiziert. Nach Erreichen eines zytopatischen Effekts werden die Zellen geerntet und die Vektoren durch frier-tau-Schritte oder milde Detergenzien befreit. Der Zellextrakt wird zur Infektion weiterer Passagen genutzt, die ebenfalls mit Helfervirus infiziert werden müssen, soweit das Inocculum aus Zellen stammt, die einen Selektionsdruck auf den Helfer ausüben. Dieser Prozess wird für 5-6 Passagen fortgesetzt, bis genügend Vektor für eine Infektion im großen Maßstab vorhanden ist. Der Amplifikationsfaktor bewegt sich dabei um 20 und ist damit niedriger als bei Vektoren der 1. Generation (30-80). Bei allen gegenwärtig angewendeten Verfahren entstehen mit großer Häufigkeit während der Selektion Helferviren, die durch Mutation dem Selektionsdruck entgehen und entsprechend mit amplifiziert werden. Diese machen eine Vektorpräparation unbrauchbar.

Bisher wurden solche Hochkapazitätsvektoren für Adenoviren der Gruppe C (typ 2 und 5) beschrieben. Mangelnde Sequenzinformation und die Schwierigkeit, vollständig E1 oder multipel deletierte Viren der Gruppe B einschließlich des Subtyps 11 stabil und hochtitrig zu erzeugen, haben dazu geführt. Die in den Patentansprüchen aufgeführten Vektoren enthalten spezifische zusätzliche Elemente, welche diese Vektoren stabilisieren und Virustiter wesentlich erhöhen und darüber hinaus ein neues Prinzip der Selektion gegen das Helfervirus ermöglichen.

WESEN DER ERFINDUNG

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen viralen Vektor auf Grundlage des humanen Adenovirus 11 zu etablieren. Dieser Vektor soll stabil vermehrbar und in der Anwendung sicher sein. Es besteht weiterhin die Aufgabe, robuste Produktionsverfahren für solche Vektoren zu finden, die eine Minimierung der Helferkombination ermöglichen.

Die Etablierung eines solchen Vektors erfolgt mit dem Ziel, die Neutralisierung des Vektors durch preexisitierende Antikörper einzuschränken und neue Zielzellen bzw. Gewebe infizieren zu können und somit das Wirtsspektrum zu erweitern.

Um die Sicherheit des viralen Vektors zu erhöhen, müssen Leserahmen verschiedener Regionen oder alle viralen Leserahmen entfernt werden.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass heterologe Elemente in den viralen Vektor inkorporiert werden. Solche Elemente sind inverted terminal repeats (ITRs) in Kombination mit dem entsprechenden Packsignal die von Virus eines anderen Serotyps, bevorzugt eines Virus des Typs B stammen. Diese Elemente erlauben eine Amplifikation des Virus, gestatten aber auch die Nutzung als Helfer zur Herstellung eines adenovirualen Vektors mit Füllsequenzen (Hochkapazitätsvektor) Sie umfassen aber auch einen heterologer Promoter, bevorzugt den SV40 Promoter, der zwischen Packsignal und der natürlichen Position für Protein IX positioniert wird. Die Aufgabe wird weiterhin dadurch gelöst, dass spezielle Füllsequenzen für einen Hochkapazitätsvektor bereitgestellt werden, die die stabile Amplifikation dieses Vektors erlauben.

Durch die erstmalige Konstruktion von Vektoren, die auf dem in der westlichen Hemisphäre seltenen Adenovirus-Subtyp 11 beruhen, wird die Inaktivierung durch Antikörper eingeschränkt. Dieses Virus nutzt von den bislang verwendeten Adenovirus-Subtypen verschiedene Infektionswege und erweitert so das Anwendungsspektrum.

Die Vektoren finden in als Therapeutika oder Vakzine Anwendung.

Vektorsystem auf Grundlage des humanen Adenovirus Typ 11

Im folgenden wird die Etablierung eines Vektorsystems für einen in der westlichen Hemisphäre seltenen Serotyps, Adenovirus Typ 11, beschrieben. Das gehäufte Auftreten von Adenoviren der Gruppe C Typ 2 und 5, der in gentherapeutischen Entwicklungen und Versuchen üblichen Serotypen, bedingt hohe Titer neutralisierender Antikörper in weiten Teilen der Bevölkerung und reduziert damit die Effektivität eines gentherapeutischen Einsatzes. Die geringe Verbreitung des Ad11 Serotyps stellt somit gegenüber der Nutzung von bislang herkömmlichen Vektoren, die zum Beispiel auf Ad5 basieren, einen großen Vorteil dar. Die Nucleinsäuresequenz dieses Virus ist bisher unbekannt.

Als Ausgangspunkt der Vektorentwicklung diente die Klonierung des viralen Genoms in ein bakterielles Plasmid. Die Klonierung und Sequenzierung ergab überraschende, wesentliche Unterschiede von Ad11 zum prototypischen Serotyp 5:

1. Das rekombinante Genom erweist sich erstaunlich unstabil in den bakteriellen Wirtszellen und erscheint besonders anfällig gegenüber Rekombinationsereignissen. Dieses Problem führte zu äußerst geringen Effizienzen bei der Findung von vollständigen Genomen. Da die Klonierung derart langer Sequenzen über Rekombination erfolgen muss, konnte dieses Problem erst nach erfolgreicher Klonierung durch eine geeignete Wahl von Bakterienstämmen für die Amplifikation und Aufreinigung von Plasmid-DNA gemindert werden.
2. Zum anderen zeigten sich in den Sequenzen der Inverted Terminal Repeats Unterschiede zu Viren der Gruppe C und anderen Vertretern der Gruppe B: Ad11 weicht in der Sequenz der endständigen 22 bp deutlich von anderen Vertretern der Gruppe B zb Ad7 ab, stimmt aber vollständig mit der Sequenz von Viren der Gruppe C (Ad2 und 5) überein. Außerdem verfügt das ITR von Ad11 über deutlich weniger Zielsequenzen für Transkriptionsfaktoren als Ad5. Besonders auffällig ist das Fehlen der NF3 Bindungssequenz. Dieser zelluläre Faktor ist bei Adenoviren der Gruppe C an der Initiation der Replikation beteiligt, der kovalenten Aktivierung des Terminalen Proteins (pTP) durch die Reaktion mit Desoxycytidintriphosphat (dCTP).

Dieser auffällige Unterschied zu Ad2 und Ad5 erklärt möglicherweise Beobachtungen, nach denen Ad11 langsamer repliziert, und schränkt das Spektrum von permissiven Zelltypen über die Kapsid-Rezeptor-Interaktion hinaus ein. Im Gegensatz zu Ad5 braucht Ad11 eine andere, möglicherweise weniger ubiquitäre und effiziente Unterstützung durch die Wirtszelle. (3) Darüber hinaus konnte in der Region zwischen den Genen für E1B 55K und pIX keine TATA-Box für die Expression des Reifungsfaktors pIX gefunden werden. Sequenz Nr. 1. Diese Unterschiede eröffnen neuartige Möglichkeiten für die Entwicklung adenoviraler Vektoren, machen aber auch Modifikationen gegenüber herkömmlichen Konstruktionen notwendig.

E1 Proteine werden aus Vektoren aufgrund ihrer transformierenden Eigenschaften und der transaktivierenden Wirkung auf alle anderen viralen Promotoren aus dem Genom von Vektoren entfernt. Diese Proteine bzw. homologe mit identischer Funktion müssen dann in einer Helferzelle bereitgestellt werden. Der teilweise Verbleib von E1 Sequenzen führt zu einer Überlappung von Sequenzen zwischen Helferzelllinie und Vektor und ist Ursache für die Entstehung von Wildtypviren durch homologe Rekombination. Deshalb werden E1 Sequenzen aus den Vektoren vollständig entfernt. Dabei verbleiben nur 64 bp vor dem Startkodon von Protein IX, einem für die effiziente Virusverpackung notwendigen Protein, die keine Bindungsstellen für bekannte Transkriptionsfaktoren oder eine Startregion typisch für Viren der Gruppe C aufweisen. Der Mechanismus der Expression des Faktors pIX ist unklar. Bei Viren der Gruppe C wird dieses Protein durch eine spezifische m-RNA, die von einem eigenständigen Promoter gesteuert wird, codiert. Für die Transkription von Ad11 Protein IX könnten Elemente in der E1A oder B Region verantwortlich sein. Deshalb sollte die Expression dieses offenen Leserasters durch die Insertion von heterologen bekannten Promotorelementen, namentlich des frühen SV40 Promoter unterstützt werden. Die Insertion führt zu einer dramatischen Steigerung der Virusvermehrung. Unerwarteterweise tritt diese Steigerung auch dann auf, wenn der Promoter durch ein direkt anschließendes Poly A Signal daran gehindert wird, die Expression von PXI anzutreiben. Daraus wird geschlussfolgert, dass spezifische Transkriptionsfaktorbindungssequenzen, die in der SV40 Promoterregion zu finden sind, generell die Amplifikation von Adenovirus der 11 als Vertreter der Gruppe B2 unterstützen. Nur nach Einfügen dieser Sequenz konnten Viren reproduzierbar nach Plasmidtransfektion gewonnen und mit stabilem unveränderten Genom amplifiziert werden. Unerwarteterweise wird diese Wirkung wird durch CMV Enhancersequenzen inseriert in gleicher Position nicht vermittelt. Erfindungsgemäß wird ein stabilisierter Ad 11 Vektor durch die Insertion von SV40 Promotersequenzen erzeugt.

Die Verpackung von Adenovirus DNA erfordert die spezifische Interaktion von ITR und Packsignal mit viralen und zellulären Proteinen. Die Interaktion mit viralen Proteinen wird als Subtyp-spezifisch beschrieben (Zhang, 2001) So kann ein Ad5 Virus mit einem mutanten Protein L152/55k seine DNA nicht verpacken und dieser Defekt wird nicht durch das entsprechende Protein anderer Serotypen komplementiert. Dabei liegt nahe, dass die Spezifität durch eine Interaktion mit dem Packsignal vermittelt wird. Ein viraler Ad11-Vektor mit heterologem ITR jedoch autologem Packsignal sollte demzufolge aufgrund zu Ad5 identischer endständiger Sequenzen im ITR replikationsfähig, durch das Adll Packsignal auch verpackungsfähig sein. Unerwarteterweise ist ein solcher Vektor nicht lebensfähig. Um so mehr sollte ein Vektor mit Ad11 Genom und ITR und Packsignal von Ad5 nicht lebensfähig sein. Ein solcher Vektor, der erfindungsgemäß beschrieben wird, ist jedoch ohne zusätzliche Helferfunktion im Abwesenheit von Ad11 Packsequenzen effektiv vermehrbar. Er generiert einem deutlichen Überschuss an leeren Virushüllen und ist deshalb in einer besonderen Anwendung als Helfervirus für einen Hockapazitätsvektor genutzt. Diese Sperre für die Verpackung können mit anderen Verfahren, die auf eine Deletion von cis aktiven Sequenzen für die Verpackung abzielen, kombiniert werden. Beschriebene Systeme dieses Typs sind die Rekombination mittels Cre oder flp Rekombinase. In einem solche Fall wird das heterologe Packsignal, von den Zielsequenzen der Rekombinasen flankiert und in Zellen, die entsprechende Rekombinasen exprimieren, ausgeschnitten oder invertiert.

Die Modifikationen des auf Ad11 basierenden Vektors können getrennt voneinander genutzt werden in einer bevorzugten Anwendung werden sie gemeinsam in den Vektor eingesetzt. In einem Aspekt der genannten Anwendung wird zusätzlich zur Deletion in E1 im wie oben beschrieben modifizierten Ad11 Vektor eine Deletion in einem weiteren Bereich des Genoms eingeführt, um so ein Ad11 Virus der 2. Generation zu generieren. Die Möglichkeiten für solche Deletionen sind dem Fachmann bekannt. Im besonderen wird die Deletion im E2B Bereich vorgenommen. Die Produktion erfolgt dann in einer Zelle, die das DNA Polymerasegen eines Adenovirus der Gruppe C trägt. Alternativ kann das Polymerasegen von Adenovirus Typ 11 in der Zelle exprimiert werden. Im 1. Fall kann zusätzlich das Gen des preterminalen Proteins eines C-typ Virus ebenfalls exprimiert werden.

Das gesteigerte onkogene Potential ist voraussichtlich in der Region E4 lokalisiert. Es wird deshalb die E4 Region des Virus teilweise deletiert.

In einer bevorzugten Anwendung wird die E1 Region von Ad11 deletiert und so ein Virus generiert, das in seiner Replikation auf die Trans-Komplementierung der E1 Proteine durch die Wirtszelle angewiesen ist.

Es wird erwartet, dass die effektivste Komplementierung durch die E1 Region von Ad 11 erreicht wird. Die Regionen E1A und E1B können dabei entweder als getrennte Kassetten, jeweils fusioniert mit heterologen Transkriptionssignalen (Promoter, Poly A) oder als Einheit, verbunden mit nur einem heterologen Promoter vor E1A und einem heterologen Poly A im Anschluss an den Leserahmen von E1B 55k in der Produktionszelle etabliert werden. Dabei muss gewährleistet werden, dass keine oder nur kurze Überlappungen zwischen den Sequenzen in Zelllinie und Vektor vorkommen, die keine homologe Rekombination ermöglichen. Solche Überlappungen können zwischen 1 und 6 bp groß sein. Die Etablierung in getrennten Kassetten bietet einen weiteren Schutz vor homologer Rekombination.

Es ist bekannt, dass die Proteine der Region E1A eine Umstellung des Zellzyklus verbunden mit einer Stimulation der Virusreplikation bewirken. Sie wirken auch transkriptionsaktivierend, binden jedoch nicht selbständig an DNA, sondern interagieren mit zellulären Faktoren. Dem Fachmann ist deshalb weiterhin bekannt, dass E1A eines Serotyps den Vektor eines anderen Serotyps komplementieren kann. Bekannterweise trifft dies für E1B nicht zu, weil es mit weiteren viralen Proteinen, im besonderen mit E4orf6 interagiert. Es ist deshalb nicht möglich den erfindungsgemäßen Vektor in der Zelllinie 293, die die E1 Region von Ad5 exprimiert, zu amplifizieren. Die E1B Region kodiert für 2 unabhängige Proteine von 19k und 55k, die von einer gemeinsamen mRNA kodiert werden. Der Promoter von E1B liegt in der E1A Region. Es liegt deshalb nahe, die E1B Region als Einheit entweder vom autologen Promoter oder von einem heterologen Promoter aus zu exprimieren. Unerwarteterweise wird jedoch gefunden, dass die Region als Einheit von 55k und 19K Potein den Vektor nur ungenügend komplementiert, unabhängig davon, ob die Expression von einem heterologen oder autologen Promoter erfolgt. Eine effektive Komplementation ist erfindungsgemäß nur möglich, wenn E1B 55k getrennt von E1B 19k von einem eigenen Promoter gesteuert wird. Die Ineffektivität der gemeinsamen Expression könnte darauf zurückzuführen sein, dass der 55k Leserahmen als zweiter Leserahmen dieser mRNA vorliegt und der Mechanismus zu dessen Initiation ineffektiv ist.

Hochkapazitätsvektoren

Hochkapazitätsvektoren erfordern nur wenige Sequenzen, die für die Replikation und Verpackung absolut notwendig sind. Diese nehmen weniger als 2% der Genomgröße ein. Eine effektive Verpackung erfordert jedoch ein lineares DNA-Molekül von 75-103% der Genomgröße des Wildtyps, dessen Enden von viralen terminal repeats (ITR) flankiert sind und ein Packsignal nahe einem der ITRs enthalten.

Zur Herstellung eines effektiven Vektors sind deshalb Füllsequenzen erforderlich. Diese können aus nichtviralen Quellen stammen oder vollsynthetischer Natur sein. Die Auswahl dieser Sequenzen ist jedoch bestimmend für die Stabilität des Vektors während der Herstellung wie auch für dessen biologische Wirkung. Sollen die Vektoren für die langanhaltende Expression in einem Zielgewebe verwendet werden, hat sich die Verwendung von humaner DNA als Vorteil erwiesen. Es wird vermutet, dass diese von der Zelle nicht als fremd erkannt und folglich nicht inaktiviert wird. Darüber hinaus könnte eine Stabilisierung im Zellkern durch spezielle Sequenzen, die mit der nuklearen Matrix interagieren (MAR), erfolgen.

Der Replikationsmechanismus von Adenovirus basiert auf der Synthese linearer DNA- Moleküle ausgehend von einem Protein-Priming durch terminales Protein (TP) und stabilisierte einzelsträngige DNA als Zwischenstufe. Dieser Zustand fördert das Aneinanderlagern verschiedener Moleküle in homologen Bereichen mit dem Resultat einer hohen Rekombinationsfrequenz. Rekombination an homologen Abschnitten innerhalb der Füll-DNA resultiert in heterogenen Populationen von Vektoren, möglicherweise unter Verlust des Transgens. Häufige Sequenzwiederholungen müssen deshalb in der Füll-DNA vermieden werden. Dies stellt bei der Verwendung humaner DNA ein zusätzliches strenges Ausschlusskriterium dar.

Die verwendete DNA sollte darüber hinaus frei von zusätzlichen, potentiell exprimierbaren Genen sein. Genfreie Sequenzen sind jedoch häufig heterochromatinisiert und können auch im Vektor diesen Zustand wiedererlangen. Damit können sie die Expression des Transgens einschränken.

Um diesen Wiederspruch zu lösen, werden erfindungsgemäß DNA-Abschnitte aus großen Introns zellulärer Gene verwendet. Aus Sicherheitsgründen werden nur DNA-Abschnitte ausgewählt, die keine endogenen Retroviren oder Elemente dieser Viren enthalten.

Für eine Vielzahl von Anwendungen ist es erwünscht, dass diese DNA in der Zelle nicht als fremd erkannt wird und keinerlei Abwehrreaktionen auslöst. Dieser Zustand wird bestmöglich bei Verwendung humaner DNA realisiert.

Trotz der scheinbaren Fülle von verfügbaren humanen Sequenzen ist die Auswahl von Abschnitten, die den gewünschten Kriterien entsprechen, limitiert. Darüber sind theoretische Gesichtspunkte nicht hinreichend für die Findung von stabilen effektiv replizierenden Füll- Sequenzen mit guter Genexpression. Deshalb wurden 2 verschiedene Füllsequenzen anhand der beschriebenen Kriterien ausgewählt:

A) Sequenzen des X Chromosoms von X152941900- X152976000

Aus dieser Region wurden 3 Abschnitte im Vektor verwendet:

1. X152941900- X152951600 Fragment 1
2. X152952900- X152963100 Fragment 2
3. X152966000- X152976000 Fragment 3.

Diese Sequenzen bestehen aus Introns des Gens CXorf6 und Exons von weniger als 200 bp, die keine eigenständigen offenen Leserahmen ergeben. Sie enthalten keine retroviralen LTRs. Repeats sind auf kurze caca, gaga und gtttgttt simple repeats beschränkt. Der GC Gehalt des Vektors beträgt 47,1% und weicht damit weit von dem von Adenovirus 5 ab. Die Replikationsfähigkeit eines Vektors ist von den Eigenschaften von dessen DNA abhängig. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind nicht näher untersucht. Es liegt nahe, dass ein GC (GC: Gehalt an Desoxyguanosin- und Desoxycytidin-Nukleotiden in der DNA) Gehalt, der dem des Adenovirus ähnlich ist, in der Effektivität der Replikation einem Vektor mit stark abweichendem GC Gehalt unterlegen ist. Entsprechend wurde publizierten Hypothesen folgend mit reduzierter Replikation des Vektors gerechnet. Unterwarteterweise wird unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren gezeigt, dass die Replikation eines Vektors mit GC weit unter dem von Adenovirus Typ5 (55,2%) effektiver verläuft.

A) Außerdem wurden für einen Vektor Sequenzen des X Chromosoms von chrX 149493805- 149526200 ausgewählt. Es wurden 2 Abschnitte festgelegt:
X149495450- X149512868
X1495159901-149526107.

Die Sequenzen enthalten DNA aus dem 1. Intron des FMR2 Gens. Sie sind ebenfalls frei von retroviralen Elementen und enthalten nur phylogenetisch alte shine, line und simple repets, die bereits weit von den jeweiligen Konsensus-Sequenzen entfernt sind.

Der GC Anteil im Vektor beträgt 38,1%. Der Vektor ist damit besonders für GC-arme Adenovirus-Typen, z. B. des genus der AT- Adenoviren, geeignet.

Die Sequenzen wurden aus genomischer DNA, extrahiert aus Vollblut eines gesunden Probanden, durch PCR gewonnen und in Vektoren, die sowohl ITR und Packsequenzen von Adenoviren verschiedener Serotypen enthalten, kloniert. Nachfolgend wurde als Fremdgen das DsRed1-Gen eingeführt. Die Replikation des Vektors wurde mit der vorhandener Vektoren A und B durch Koreplikation unter Verwendung des Cre-Lox-Helfersystems untersucht.

Die Replikationsfähigkeit eines Vektors ist von den Eigenschaften von dessen DNA abhängig. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind nicht näher untersucht. Es liegt nahe, dass ein GC Gehalt der dem des Adenovirus ähnlich ist, in der Effektivität der Replikation einem Vektor mit stark abweichendem GC Gehalt unterlegen ist. Unterwarteterweise wird unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren gezeigt, dass die Replikation eines Vektors mit GC weit unter dem von Adenovirus Typ 5 (55,2%) effektiver verläuft. Entsprechend wurde publizierten Hypothesen folgend mit reduzierter Replikation des Vektors gerechnet. Entgegen den Erwartungen wurde experimentell gefunden, dass ein Vektor mit diesen Sequenzen jedoch in der Replikation überlegen ist.

Diese Füllsequenzen werden mit den cis-Elementen eines bestimmten Serotypes, dem linken ITR und Packsignal auf der einen Seite, dem rechten ITR auf der anderen Seite gekoppelt. Damit wird die Replikation und Verpackung von helferabhängigen Viren durch die Proteine eines Helfers dieses Serotyps in einer für diesen Serotyp permissiven Zelllinie ermöglicht. Beispielhaft sei hier eine Fusion mit dem Packsignal und den ITRs von Adenovirus Typ 5 nt 1-450 entsprechend der unter NCBI veröffentlichten Sequenz NC001406 sowie die Fusion mit der Sequenz No. 3, die ITR und Packsignal von Adenovirus 11 enthält, an einem Ende und derselben Sequenz von nt 1-132 der Sequenz No 3 am anderen Ende gegeben.

Die Erfindung ha einen viraler Vektor auf Basis der Sequenz des humanen Adenovirus Serotyp 11 zum Inhalt, der Inverted terminal repeats und das Packsignal von einem Virus eines anderen Serotyps enthält, wobei ITRs und Packsignal gemeinsam von einem Adenovirus der Gruppe C, bevorzugt von Adenovirus Typ 5, stammt. Dabei ist der Vektor in Genombereichen derart deletiert, dass eine eigenständige Replikation ohne Trans- Komplementierung durch Faktoren, deren Gene durch die Deletion inaktiviert wurden, unmöglich ist und die rekombinanten Viren in einem oder mehreren Leserahmen der E1 Region und vorzugsweise weiteren Leserahmen der E2 und /oder E4 Region deletiert sind.

Der erfindungsgemäße Vektor beruht auf der Basis der Sequenz des humanen Adenovirus Serotyp 11, insbesondere auf einem viralen Vektor, der einen heterologen Promoter enthält. Dabei ist der heterologe Promotor bevorzugt ein SV40 Promotor, wobei sich der Promoter zwischen Packsignal und der natürlichen Position des Protein IX befindet.

Der erfindungsgemäße Vektor ist des weiteren dadurch gekennzeichnet, dass in den rekombinanten Viren anstelle bestimmter Genombereiche oder im gesamten Genom unter Ausschluss des linken und rechten ITR sowie des Packsignals Füllsequenzen als Ersatz eingefügt sind.

Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Vektorkonstrukte, die Komponenten des viralen Vektors enthalten oder zu dessen Herstellung geeignet sind.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Zelllinie, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch humanen Adenovirus Serotyp 11 infizierbar ist und Deletionen im viralen Vektor nach Anspruch 1-7 komplementiert. Sie ist dadurch gekennzeichnet, dass sie Adenovirus 11 E1B 55k oder ein funktionelles Homolog desselben als unabhängige, von E1B19k getrennte Expressionseinheit mit eigenem Promoter bildet. Die Zellline ist von HEK 293 abgeleitet.

Der erfindungsgemäße virale Vektor ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass er als Helfervirus die Vermehrung eines viralen Vektors ermöglicht, wobei der Helfervirus dadurch gekennzeichnet ist, dass das Packsignal des Virus von Sequenzen sitespezifischer Rekombinasen flankiert ist und das in einer Adenovirusfunktionen komplementierenden Zelllinie, welche die entsprechende Rekombinase trägt, inaktiviert wird. Dabei werden als Fremdsequenzen humane Sequenzen verwendet, die fortlaufend, unterbrochen oder invertiert vorliegen und als Füllsequenzen zu mehr als 80% Intron-Sequenzen verwendet werden. Dabei werden Füllsequenzen vollständig oder teilweise der Region des X Chromosoms von X 152941900- X152976000 und/oder chrX149493805-149526200 entnommen.

Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf ein Therapeutikum oder eine Vakzine, enthaltend einen viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1-6 oder 14-16.

Das erfindungsgemäße Vakzinierungsverfahren umfasst das Verabreichen eines viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1-6 oder 14-16. an die zu vakzinierende Person.

Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Kombination besteht aus bekannten (viralen Vektoren, in einzelnen oder allen Leserahmen deletierien Adenoviren) und neuen Elementen (Hererologen ITRs, Promotoren und Füllsequenzen), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer Gesamtwirkung die vorteilhafte Gewinnung rekombinanter Viren ermöglichen.

Die Erfindung führt zu deletierten adenoviralen Vektoren des humanen Subtyps 11, einschließlich von in allen viralen Leserahmen (vollständig) deletierten adenoviralen Vektoren. Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten die Sequenz Adenovirus Typ 11 Sequenz in rekombinanter Form, kombiniert mit spezifischen heterologen Sequenzen. Diese Viren sind in Genombereichen derart deletiert, dass eine eigenständige Replikation ohne Trans-Komplementierung durch geeignete Faktoren unmöglich ist

- in den Leserahmen der E1 Region deletiert sind
- artifizielle Promotersequenzen zur Transkription enthalten
- zusätzlich im Gen der DNA Polymerase deletiert sind
- in Genen der E4 Region deletiert ist
- anstelle bestimmter Genombereiche oder im gesamten Genom unter Ausschluss des linken und rechten ITR sowie des Packsignals Füllsequenzen als Ersatz eingefügt sind. Als Fremdsequenzen werden humane Sequenzen verwendet, die fortlaufend, unterbrochen oder invertiert vorliegen. Als Füllsequenzen finden zu mehr als 80% Intron-Sequenzen Verwendung, wobei die Füllsequenzen vollständig oder teilweise der Region des X Chromosoms
- von X152941900- X152976000 oder
- chrX149493805-149526200

entnommen werden.

Der erfindungsgemäße virale Vektor wird in einer Zelllinie amplifiziert, die adenovirale Genfunktionen komplementiert. Die Zelllinie enthält Gene der E1 Region von Adll als fortlaufende Sequenz mit heterologem Promoter vor E1A und heterologem Poly A Signal nach dem Stopkodon von E1B55K. Die Zelllinie ist dadurch charakterisiert, dass sie das Ad 11E1B55k oder ein funktionelles Homolog desselben als unabhängige, von E1B19k getrennte Expressionseinheit mit eigenem Promoter bildet.

- sie zusätzlich Gene der E2 Region von Ad11 exprimiert
- sie zusätzlich Gene der E2 Region von Ad2 oder 5 exprimiert
- sie zusätzlich ein oder mehrere Gene der E4 Region von Ad11 exprimiert.

Das Helfervirus stellt ein in für die Replikation essentiellen Bereichen, wie zum Beispiel E1, deletiertes Adenovirus dar. Es trägt ein heterologes ITR und Packsignal. Zusätzlich kann das Packsignal des Virus von Sequenzen sitespezifischer Rekombinasen flankiert sein. Es wird von der in einer Adenovirusfunktionen komplementierenden Zelllinie, welche die entsprechende Rekombinase trägt, in diesem Fall zusätzlich inaktiviert. Kennzeichen des Helfervirus bestehen darin, dass

- Rekombinasesites von Rekombinasen des Integrasetyps
- mutierte Rekombinasesites der Rekombinasen flp oder cre enthalten sind, deren Halbsites nur in der ursprünglichen, nicht aber in der rekombinierten Form erkannt werden
- Rekombinasesites invertiert vorliegen.

Die erfindungsgemäße Verwendung des viralen Vektors in Form eines einfach, multipel und maximal deletierter Adenovirus des Serotyps 11 ist als Therapeutikum oder Vakzine möglich.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiele

Ausführungsbeispiel 1

Klonierung des Adenovirus Typ11 in ein Plasmid mit Möglichkeit der Freisetzung eines Viralen Vektors

Ad11, erworben aus American Type Culture Collection (VR-12), wurde auf Hep-2 Zellen amplifiziert und mittels Cs Gradient gereinigt. Virus DNA wurde mittels Pronase- Behandlung, Phenol-Extraktion und Ethanolprezipitation isoliert. Die DNA wurde einer Behandlung mit 4 N NaOH für 60 min bei 37°C unterzogen, mit 0.4 N NaCl, 3 M NaCl, 0.5 M Tris 7.5 für 6 h bei 65°C und 12 h bei Raumtemperatur renaturiert und reprezipitiert. Diese DNA ist vollständig deproteiniert. Sie wurde mit Klenow-Polymerase behandelt, mit Hind III gespalten, und das Fragmentgemisch wurde zwischen die Hinc II und Hind III sites von pUC18 kloniert.
Ein 1,3 kb Fragment wurde in mehreren Klonen gefunden. Dieses Fragment ist homolog zu bekannten Sequenzen von ITR und Packsignal von Adenovirus 11. Sie ist in den terminalen 22nt CATCATCAATAATATACCTTAT vollständig identisch zu der von Adenovirus Typ 5. Zur Gewinnung des 3'Endes wurde Primer mit der terminalen Sequenz flankiert von einem PacI site Ad11ITRF CTTAATTAACATCATCAATAATATC und Primer 11-S2 mit der Sequenz GCTCCGTGCGACTGCTGTTT, ausgewählt aus der Fiber Region des Virus gb L08232, verwendet. Ad11ITRF enthält eine Einzelbasen-Deletion TAATATAC gegenüber der wt Sequenz, verursacht durch einen Sequenzierfehler. Ein 2,B kb Fragment wurde amplifiziert und kloniert. Es enthält das 3'Ende des Virus. Die Sequenz ist identisch zum 5'Ende von nt 1-132, das ITR somit 132 bp lang. Ein 472 bp Fragment des 5'Endes, flankiert von PacI und dem internen SnaBI Ort, womit das Packsignal vollständig eingeschlossen ist. des 5'Endes wurde gewonnen und so kloniert, dass ein Shuttle Vektor für die homologe Rekombination der Virus DNA in ein Plasmid entsteht. Als Resultat der Rekombination in E coli BJ 5183 RecBC-sbcB- entstand gehäuft ein Plasmid von etwa 15 kb, welche das linke Virusende in doppelter Ausführung enthält. Das Vorhandensein einer internen, natürlich vorkommenden revertierten Sequenz könnte dafür Ursache sein. In nur 1 Fall entstand ein Plasmid (pAd11wt) von 37,5 kb, das interne Hind III Fragmente von ca 14 kb, 5,7 kb 5,1 kb 3,3 kb, 2,5 kb 2,2 kb, 1,3 kb 0,7 kb 0,3 kb freisetzt.
Nur das Plasmid von 35 kb Länge ist in der Lage, nach Spaltung mit PacI und Ca- Transfektion in 293 Zellen nach 16 Tagen einen zytopatischen Effekt hervorzurufen. Es wurde festgestellt, dass bei dieser Spaltung zwei große virale Fragmente entstanden. Demzufolge ist ein interner PacI Ort im Virusgenom enthalten. Dieser erschwert die Herstellung rekombinanter Viren. Ein Freisetzen des viralen Genoms aus dem Plasmidvektor ist jedoch Voraussetzung für die Entstehung von Viren. Plasmid pAd11wt wurde deshalb mit NcoI gespalten und ein 4600 bp Fragment religiert. Mit nur 1 Primer Ad11ITR-F-Pme (Sequenz ACCGGTTTAAACATCATCAATAATATACCTTAT) das Ad11ITR Ende flankiert von einem PmeI site enthaltend, wurde ein 2000 bp Frament amplifiziert und in einen KanR Minimalvektor kloniert (pAd11Nco). Nach PvuII Spaltung wurde ein gfp kodierendes Fragment, einen unikalen NotI Ort enthaltend in pAd11Nco kloniert und der resultierende Vektor nach NcoI Spaltung mit pAd11wt rekombiniert. Das Resultierende Plasmid pAd11wtgfp enthält ein von PmeI sites flankiertes vollständiges Ad11 Genom mit einem in E1 Orientierung am Ende des Packsignals in Position 459 vom linken Virusende klonierten gfp Gen. Dieses Plasmid diente als Lieferant der Ad11 Sequenzen. Mit einem anhand von Sequenzhomologien im Protein IX zwischen den Serotypen 7, 5 und 17 ausgewählten Primer wurden Teile der Protein IX Region und der terminale Bereich von E1B55k sequenziert.

Ausführungsbeispiel 2

Klonierung von Vektoren mit heterologem ITR und oder Packsignalen

Des weiteren wurde Ad11wt mit EcorV im Plasmidvektor und AfeI im Virus gespalten, das resultierende Plasmid religiert und zwischen SnaBi am Ende des Packsignals und BgIII gfp inseriert (pAd11Afegfp). Nach Rekombination mit pAd11wtgfp gespalten mit NotI entstand pAd11deltaElgfp. Mit Hilfe des Shuttlevektors pi5p11gfpPme, Ad55'ITR und flankierende Sequenzen nt 1-190, das Ad11 Packsignal nt 198-440, das Ad53'ITR (103 bp) sowie Ad11 Fragmente von 3361 (PIX Region) sowie -330- -80 vom Rechten Ad11 Ende (E4 Region) enthaltend wurden pAdi5p11wtgfp und pAdiSp11dE1gfp durch Rekombination mit pAd11wtgfp und pAd11dE1gfp respektive gewonnen. Beide Plasmide enthalten AdSITRs und ein Ad11 Packsignal in einem Ad11 Vektor.
Des weiteren wurde in pi5p11gfpPme die von 11 stammende ITR-Packregion durch die entsprechende Region von Ad5 nt1-450 ersetzt. Nach Rekombination in mit pAd11Iwtgfp und pAd11dE1gfp respektive wurden pAdip5-11wtgfp und pAdip5-11dE1gfp gewonnen. Beide enthalten nun das Ad5 ITRs und das Ad5 Packsignal.

Ausführungsbeispiel 3

Klonierung des SV40 Promoters und eines von frt sites flankierten Ad5 Packsignals in E1 deletierte Vektoren.

Ein Hind III Fragment, den 5V40 Promoter und die Protein IX Genregion enthaltend, wurde aus pAd11FRT(1-5)SV40 entnommen und in den unikalen Hind III Ort von pshAd5frt kloniert, dass das vollständige Ad5 ITR, gefolgt von einem mit frt sites flankierten Packsignal (Sequenz No 5) enthält (pshAdip511frt). wurde mit pAdi5p11wtgfp rekombiniert. Der resultierende Vektor pHip511frt enthält die Ad11 Sequenz deletiert in E1, ITRs und Packsignal von AdS, wobei das Packsignal von frt sites flankiert ist, sowie den SV40 Promoter vor dem Leserahmen von PXI.
Desgleichen wurde das HindIII Fragment aus pAd11FRT(1-5)SV40 downstream von gfp in. Zur Kontrolle der Wirkung dieses Promoters wurde ein tk Polyadenylierungssignal aus pgfpN1 als PvuII BspHI entnommen und in StuI von pshAdip511frt kloniert. Dieses Poly A signal liegt direct nach dem 5V40 Promoter und blockiert dessen direkte Wirkung als Promotor, jedoch nicht eine indirekte Wirkung als Enhancer auf andere Genomabschnitte.

Ausführungsbeispiel 4

Herstellung einer komplementierenden Zellinie für E1 deletierte Vektoren von Ad11

Die kodierende Sequenz von Ad11E1B55k ohne Promoter und Poly A wurde mit Hilfe der PrimerAdl 155kF-XhoIAACTCGAGAATGGATCCCGCAGACT und Ad11E1R-KpnI AATGGTACCTTAGTCAGTTTCTTCTCCAC am Template pAd11wi amplifiziert und nach KpnI und XhoI Verdau in den Vektor phPGKLgfp kloniert. Dabei steht E1A unter Kontrolle des humanen PGK Promoters und das Polyadenylierungssignal von E1B wird durch das frühe Poly A Signal von SV40 ersetzt. Dieses Plasmid wurde mittels Polyfect (Qiagen) in HEK293 Zellen transfiziert und für 3 Wochen mit 400 µg/ml G418 selektiert. Klone wurden durch Verdünnungsaussaat in 96 Wellplatten vereinzelt und nachfolgend per PCR mit den Primern Ad1155kF-XhoI und Ad11E1R-KpnI für das Vorhandensein des Gens von Ad11E1B55k geprüft. Positive Klone wurden mit dem Plasmid Ad11deltaE1gfp nach Linearisierung transfiziert und Klone mit sichtbarem CPE nach 9 Tagen für eine Reamplifikation des Virus im Vergleich eingesetzt. Der Klon mit der Höchstzahl gebildeter gfp-induzierender Einheiten D7 wurde als kryokonserviert und als Helferzellinie eingesetzt.

Ausführungsbeispiel 5

Herstellung rekombinanter Viren des Subtyps 11 durch Transfektion

Je 2 µg der Plasmide, welche das Genom adenoviraler Vektoren enthalten, wurden mit PmeL linearisiert, und mit Effectene (Qiagen) ensprechend der Anweisung des Herstellers in 293 Klon D7 (Ad1155k exprimierend) bzw in 293 Zellen in je 2 wells einer 6 Well Platte transfiziert. Die Zellen wurden täglich auf das Vorhandensein eines zytopatischen Effekts hin untersucht. Für Vektoren mit dem gfp Gene wurde das Well gleichzeitig auf eine Expansion der gfp Expression hin untersucht.
Unerwarteterweise sind sowohl Wildtyp als auch E1 deletierte Viren von Ad11 mit heterologen ITRs, jedoch autologem Packsignal nicht vermehrungsfähig. Es fällt demgegenüber auf, dass ein vollständiger Austausch von ITRs und Packsignal gegen Elemente von Ad5 keine deutliche Verlangsamung der Virusreplikation nach sich zieht. Die Anwesenheit eines SV40 Promoters zwischen Packsignal und Protein IX verkürzt den Zeitraum bis zum volltändigen zytopatischen Effekt und ein Poly A Signal im Anschluß an diesen Promoter hat keinen Einfluß auf diesen Effekt.
Alle lebensfähigen Viren wurden geerntet, zur Infektion einer 2. Passage im geeigneten Zellsubstrat (293 oder 293D7) verwendet. Viren dieser Passage wurden zur Herstellung von Passage 3 genutzt und daraus entstandene Viren im Plaqueassay getestet. Dabei wurde der Effekt der beschriebenen Elemente bestätigt.
Daraufhin wurde Hip511frt und Ad11de1gfp aus jeweils 20 15 cm Zellkulturschalen 293 Klon D7 über einen CsC1 Stufengradienten sowie einen kontinuierlichen Gradienten gereinigt. Dabei wurde festgestellt, dass für Hip511frt eine 20 fach kräftigere obere Bande (leere Virushüllen) und eine schwache untere Bande(kompletter Virus) bildete. Demgegenüber trat bei Ad11de1gfp eine deutliche untere Bande und eine schwache obere Bande auf. Dies bestätigt die Hypothese, dass Hip511frt zwar in 293Klon D7 gut amplifizierbar ist, jedoch aufgrund ineffektiver Verpackung einen Überschuß leerer Hüllen produziert.

Ausführungsbeispiel 6

Klonierung des Vectors pHCA

Aus 15 ml Vollblut eines Probanden wurde mittels SDS-Lyse, gefolgt von Kochsalzfällung und Ethanolprezipitation, genomische DNA isoliert. Jeweils 100 ng DNA wurden als Template in PCR Reaktionen mit Taq Polymerase (expand long template PCR Kit, Roche) eingesetzt. Es wurden folgende Primerpaare verwendet:
152-1 CTTCGAATGAACCTGGAGTTGACTT und
152-2 CTTAATTAACCTCACCTGGCCAACATC für Fragment 1
152-3 CATCGATCGGCACGCTGTTGATT und
152-4 CTTCGAACCTGCTCTGTGAAGCACTG für Fragment 2
152-5 ACGGCCGAAGGATTACATGAGCTTAG und
152-6 CATCGATCAGGCTTGGCTTCTCT für Fragment 3.
Das Fragment 3 wurden zuerst in den Vektor pPCR4blunttopo (Invitrogene) kloniert.
Für die Konstruktion eines Hochkapazitätsvektors mit ITR und Packsignalen des Adenovirus Typ 5 wurde ein Shuttle-Vektor erstellt. Dafür wurde die Adenovirus 5-Sequenz von nt1 -nt 443 flankiert durch PmeI am 5'und Ecor52I und Hind III am 3' Ende, sowie die Sequenz von 35520-35935 flankiert von Hind III und Ecor52I am 5'Ende und PmeI am 3'Ende durch PCR (expand high fidelity PCR Kit, Roche) amplifiziert. Beide Fragmente wurden dann mit äußeren Primern durch Annealing in der Überlappungsregion koamplifiziert und in den EcoRV Ort des Vektor pAC kloniert.
Nachfolgend wurde zwischen Hind III und Eco 52I ein Polylinker mit der Sequenz GGCCGGATATCGATATCTTCGAACGGTTAATTA eingefügt.
In diesen Polylinker wurde zwischen CIaI und Eco 52I Fragment 3 direkt kloniert und damit pHCA3 erstellt. Bei Kontrollspaltungen wurde das Fehlen eines SacI Ortes im Fragment 3 gegenüber der genomischen Sequenz festgestellt.
Zur Klonierung der Fragmente 1 und 2 wurden je 300 bp und 400 bp an deren Enden amplifiziert, durch überlappende Primer mittels PCR verbunden und nach Spaltung mit PacI und BstBI als Flanke 1 und ClaI und BstBI als Flanke 2 in HCA3 kloniert. Flankel und 2 enthalten jeweils unikale Not I und SalI Orte.
Der entstehende Vektor wurde mit NotI linearisiert und zur homologen Rekombination mit dem PCR Fragment 1 in Ecoli RecA + RecBC-sbcBC- eingesetzt. Nachfolgend wurde auf dem gleichen Wege nach Linearisierung mit SaII Fragment 2 eingefügt. Der entstehende Vektor hat unikale BstBI und CIaI Orte an den Übergängen von Fragment 1 und 2, und 2 und 3 entsprechend. Für beide Orte wurden Shuttle Vektoren erstellt, die 300 bp zu beiden Seiten der unikalen Orte enthalten. In den Shuttle Vektor für BstBI wurden ein vom RSV Promoter gesteuertes β-Galaktosidasegen und DsRed 1 (rotes Fluoreszenzprotein, ClonTech) unter Kontrolle des CMV Promoters kloniert und mittels Rekombination in pHCA eingefügt.
PHCAredfp sowie ein Kontrollvektor A, der das gfp-Gen unter Kontrolle des CMV Promoters trägt, wurden durch Restriktionsspaltung vom Plasmidrückgrat getrennt und jeweils 2 µg gemeinsam mit 2 µg aus dem Plasmid freigesetzten Helfervirusgenom in 293 Zellen mittels Calziumphosphatpräzipitation kotransfiziert. Nach vollständiger Infektion der Kultur wurde das Lysat geerntet und wiederum 293 Zellen infiziert. Der Anteil Zellen mit grüner und roter Fluoreszenz wurde in den nachfolgenden Passagen evaluiert. Es wurde festgestellt, dass in Passage 3 etwa 15% der Zellen rot, jedoch nur 7% grün fluoreszieren. Der Vektor pHCA ist somit dem Kontrollvektor in der Amplifikationsgeschwindigkeit als Resultat aus Replikation und Verpackung überlegen.
Zum Vektorsystem auf Grundlage des humanen Adenovirus Typ 11 wird des weiteren ausgeführt:
Es ist bekannt, dass die Proteine der Region ElA eine Umstellung des Zellzyklus verbunden mit einer Stimulation der Virusreplikation bewirken. Sie wirken auch transkriptionsaktivierend, binden jedoch nicht selbständig an DNA, sondern interagieren mit zellulären Faktoren. Dem Fachmann ist deshalb weiterhin bekannt, dass ElA eines Serotyps den Vektor eines anderen Serotyps komplementieren kann. Bekannterweise trifft dies für E1B nicht zu, weil es mit weiteren viralen Proteinen, im besonderen mit E4orf6, interagiert. Es ist deshalb nicht möglich, den erfindungsgemäßen Vektor in der Zellinie 293, die die E1-Region von Ad5 exprimiert, zu amplifizieren. Die E1B-Region kodiert für 2 unabhängige Proteine von 19k und 55k, die von einer gemeisamen mRNA kodiert werden. Der Promoter von E1B liegt in der E1BA-Region. Da 19k von Ad5 in 293 Zellen vorliegt und gebildet wird und aufgrund der apoptosehemmenden Funktion keine Serotypspezivitzät erwartet wird, wird E1B55k als einzelnes Gen, kontrolliert von heterologen Poly A und Promoter in HEK293 Zellen exprimiert.
Die Zellinie nach Anspruch 9 ist des weiteren dadurch gekennzeichnet, dass sie Adenovirus 11E1B55k exprimiert. Sequenzen

Abkürzungsverzeichnis Ad/AdV: Adenovirus
Ad2, 5, oder 11: Adenovirus Serotyp
bp: Basepaare
cDNA: zur mRNA komplementäre DNA
CMV: Cytomegalievirus
Cre: Rekombinase des Phage P1
dCTP: Cytidintriphosphat
E1A, E1B, E3, oder E4: Organisatorische, subgenomische Regionen im AdV Genom
flp: Rekombinase
GC: Gehalt an Desoxyguanosin- und Desoxycytidin-Nukleotiden in der DNA
i. m.: intramuskulär
ITR: Inverted Terminal Repeats
NF1, NF2, NF3: zelluläre Faktoren, die an der AdV-Replikation beteiligt sind
PCR: Polymerasekettenreaktion
pIX, pIVa2: adenovirale Proteine
RSV: Rous Sarkom Virus Promoter
SDS: Natriumdodecylsulfat
TATA-Box: Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle für das TATA bindende Protein
Tet: Tetracylin
pTP: Terminales Protein Literaturverzeichnis: Alemany, R., Dai, Y., Lou, Y. C., Sethi, E., Prokopenko, E., Josephs, S. F., and Zhang, W. W. (1997). "Complementation of helper-dependent adenoviral vectors: size effects and titer fluctuations." J Virol Methods, 68(2), 147-59.
Chen, H. H., Mack, L. M., Kelly, R., Ontell, M., Kochanek, S., and Clemens, P. R. (1997). "Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes." Proc Notl Acad Sci U S A, 94(5), 1645-50.
Fisher, K. J., Choi, H., Burda, J., Chen, 5. J., and Wilson, J. M. (1996). "Recombinant adenovirus deleted of all viral genes for gene therapy of cystic fibrosis." Virology, 217(1), 11-22.
Hardy, S., Kitamura, M., Harris-Stansil, T., Dai, Y., and Phipps, M. L. (1997). "Construction of adenovirus vectors through Cre-lox recombination." J Virol, 71 (3), 1842-9.
Kochanek, S., Clemens, P. R., Mitani, K., Chen, H. H., Chan, S., and Caskey, C. T. (1996). "A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase." Proc Natl Acad Sci U S A, 93(12), 5731-6.
Kumar-Singh, R., and Chamberlain, J. 5. (1996). "Encapsidated adenovirus minichromosomes allow delivery and expression of a 14 kb dystrophin cDNA to muscle cells." Hum Mol Genet, 5(7), 913-21.
Mitani, K., Graham, F. L., Caskey, C. T., and Kochanek, 5. (1995). "Rescue, propagation, and partial purification of a helper virus- dependent adenovirus vector." Proc Natl Acad Sci U S A, 92(9), 3854-8.
Parks, R. J., Chen, L., Anton, M., Sankar, U., Rudnicki, M. A., and Graham, F. L. (1996). "A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal." Proc Natl Acad Sci USA, 93(24), 13565-70.
Sandig, V., Youil, R., Bett, A. J., Franlin, L., Oshima, M., Maione, D., Wang, Metzker, M. L., Savino, R., and Caskey, C. (2000). "Optimization of the Helper Dependent Adenovirus System for Production and Potency in vivo." Proc Natl Acad Sci U S A, 1; 97(3): 1002-7.

Claims

1. Viraler Vektor auf Basis der Sequenz des humanen Adenovirus Serotyp 11, der Inverted terminal repeats und das Packsignal von einem Virus eines anderen Serotyps enthält.

2. Viraler Vektor nach Anspruch 1, wobei ITRs und Packsignal gemeinsam von einem Adenovirus der Gruppe C, bevorzugt von Adenovirus Typ 5, stammt.

3. Viraler Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor in Genombereichen derart deletiert ist, dass eine eigenständige Replikation ohne Trans- Komplementierung durch Faktoren, deren Gene durch die Deletion inaktiviert wurden, unmöglich ist.

4. Viraler Vektor nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten Viren in einem oder mehreren Leserahmen der E1 Region und vorzugsweise weiteren Leserahmen der E2 und/oder E4 Region deletiert sind.

5. Viraler Vektor auf der Basis der Sequenz des humanen Adenovirus Serotyp 11, insbesondere ein viraler Vektor gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-4 der einen heterologen Promoter enthält.

6. Viraler Vektor nach Anspruch 5, wobei der heterologe Promotor ein bevorzugt den von SV40 Promotor ist und/oder wobei sich der Promoter zwischen Packsignal und der natürlichen Position des Protein IX befindet.

7. Viraler Vektor nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass in den rekombinanten Viren anstelle bestimmter Genombereiche oder im gesamten Genom unter Ausschluss des linken und rechten ITR sowie des Packsignals Füllsequenzen als Ersatz eingefügt sind.

8. Vektorkonstrukte, die Komponenten des viralen Vektors nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-7 enthalten oder zu dessen Herstellung geeignet sind.

9. Zelllinie, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch humanen Adenovirus Serotyp 11 infizierbar ist und Deletionen im viralen Vektor nach Anspruch 1-7 komplementiert.

10. Zelllinie nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie Adenovirus 11 E1B 55k oder ein funktionelles Homolog desselben als unabhängige, von E1B 19k getrennte Expressionseinheit mit eigenem Promoter bildet.

11. Zellline nach Anspruch 9 oder 10, die von HEK 293 abgeleitet ist.

12. Viraler Vektor nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass er als Helfervirus die Vermehrung eines viralen Vektors nach Anspruch 7 ermöglicht.

13. Helfervirus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Packsignal des Virus von Sequenzen sitespezifischer Rekombinasen flankiert ist und das in einer Adenovirusfunktionen komplementierenden Zelllinie nach Anspruch 9-11, welche die entsprechende Rekombinase trägt, inaktiviert wird.

14. Viraler Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremdsequenzen humane Sequenzen verwendet werden, die fortlaufend, unterbrochen oder invertiert vorliegen.

15. Viraler Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Füllsequenzen zu mehr als 80% Intron-Sequenzen verwendet werden.

16. Viraler Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Füllsequenzen vollständig oder teilweise der Region des X Chromosoms von X152941900-X152976000 und/oder chrX149493805-149526200 entnommen werden.

17. Therapeutikum oder Vakzine, enthaltend einen viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1-6 oder 14-16.

18. Vakzinierungsverfahren, umfassend das Verabreichen eines viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1-6 oder 14-16. an die zu vakzinierende Person.