CN1632109A - 高效表达含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒及其用途 - Google Patents
高效表达含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1632109A CN1632109A CNA2003101226967A CN200310122696A CN1632109A CN 1632109 A CN1632109 A CN 1632109A CN A2003101226967 A CNA2003101226967 A CN A2003101226967A CN 200310122696 A CN200310122696 A CN 200310122696A CN 1632109 A CN1632109 A CN 1632109A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- constant region
- antibody
- human constant
- ghost
- adenovirus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 130
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims description 187
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 122
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 120
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 33
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 108
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 107
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 48
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 48
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 15
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 13
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 9
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 9
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 9
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 8
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 claims description 8
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 7
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 claims description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 5
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 claims description 2
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 claims description 2
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 claims description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims description 2
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 54
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 24
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 24
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 23
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 9
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 9
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 8
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 7
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 6
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 6
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 6
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 5
- 101001035782 Gallus gallus Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 5
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 230000002137 anti-vascular effect Effects 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 5
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 4
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 3
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 3
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 3
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 3
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 3
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000004059 Male Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 101000985214 Mus musculus 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- 102100025067 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4 Human genes 0.000 description 2
- 101710163352 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4 Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 2
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 229960003297 gemtuzumab ozogamicin Drugs 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 2
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 201000003175 male breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000010907 male breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 229950003063 mitumomab Drugs 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 229940107685 reopro Drugs 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 229940115586 simulect Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 2
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 1
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000405758 Betapartitivirus Species 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 108010014064 CCCTC-Binding Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010036239 CD4-IgG(2) Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 1
- 101710139422 Eotaxin Proteins 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150043052 Hamp gene Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 101100288498 Mus musculus Large1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101150030083 PE38 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241001417524 Pomacanthidae Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102100027671 Transcriptional repressor CTCF Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000013228 adenopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000003263 anti-adenoviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002391 anti-complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 230000003097 anti-respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 108010008730 anticomplement Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940126608 cBR96-doxorubicin immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229950007296 cantuzumab mertansine Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 229960001776 edrecolomab Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229950009760 epratuzumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 229950007283 oregovomab Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010010 raising Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 208000030925 respiratory syncytial virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 229940036185 synagis Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940099073 xolair Drugs 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种高效表达含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒及其用途。本发明通过将编码含有人恒定区全抗体基因的核苷酸序列插入重组空壳腺病毒基因组中，从而在细胞内或体内高效表达含有人恒定区全抗体，从而达到治疗疾病的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种能高效表达治疗疾病含有人恒定区全抗体的重组空壳腺病毒及其用途。
背景技术
Kohler和Milstein在1975年创立的单克隆抗体制备技术，为疾病的治疗提供一种新的方法——导向治疗法。在导向治疗研究初期，人们给予极大的热情和不切合实际的期望，但早期的临床研究的疗效十分不理想。其主要原因为：1.在早期的临床试验中应用的是鼠源性抗体，在人体内会产生针对鼠源性抗体的抗体(HAMA)，它会中和治疗性的鼠源性抗体，使其被快速清除，因此鼠源性抗体在人体内半衰期很短，故疗效不确切，同时鼠源性抗体段会导致人体过敏反应，从而产生毒副作用；2.抗体的亲和力和特异性不高，多数抗体特别是一些基因工程小分子抗体或人源化抗体自身亲和力较低，特异性不高，从而不能有效靶向细胞，因此其临床上疗效不确切。近5年来随着现代生物技术的发展，抗体技术两个关键性技术获得突破，1.人鼠嵌合抗体、人源化抗体和人抗体技术及制备技术的成熟，基本上可以克服了鼠源性抗体人体应用时产生抗抗体的问题；同时由于在人鼠嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中采用人的Fc片段(可结晶的片段，是指用木瓜酶消化免疫球蛋白所得的片段，其分子量大约为50 000)，在人体内的半衰期从鼠源性抗体小于20小时到人源化抗体和人抗体的半衰期为数天、甚至到21天之久；另外在人的Fc片段的改造可进一步提高对肿瘤的杀伤。2.抗体库的建立和筛选以及多价重组抗体制备技术的发展使人们能够直接获得特异性强和亲和力高的单克隆抗体，如SLAM法(Selected Lymphocyte AntibodyMethod)制备的抗体的亲和力比杂交瘤技术制备的提高1000倍。抗体技术的发展终于使导向治疗研究走出低谷，并在近几年取得了突破性进展，应用抗体治疗疾病初显曙光。
但目前对于抗体治疗疾病仍存在着两个难题：1.由于治疗疾病的抗体需要量极多，目前的生物工程生产比较困难；同时由于需要量极多，要求其产品纯度极高，因此其产品生产成本及价格均非常昂贵。2.对于很多疾病而言，需要抗体长期应用，才能达到治疗疾病的目的。
基因治疗是近年兴起的一种新的治疗恶性肿瘤方法。其基因转染方法分病毒法及非病毒法两种。病毒法通常采用逆转录病毒、重组腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒及痘苗病毒。逆转录病毒在体外具有较高的转染率，但病毒滴度偏低，在体内转染率较低，而且只能感染分裂期的细胞，同时具有整合至染色体，存在癌变的可能性的缺点。非病毒法包括脂质体及基因枪等方法，其转染基因表达时间较短，转染率较低。腺相关病毒具有转染分裂及静止细胞的能力，能持久的表达，但表达量较低。腺病毒目前基因治疗中最常见病毒载体，已广泛地应用于人体基因治疗方案中，腺病毒具有容易生产及纯化的特点，它在体内及体外均能有效转染分裂及静止细胞，无致癌性，但第一代腺病毒与第二代腺病毒系统由于存在着微量腺病毒蛋白表达，因此具有强免疫源性，其目的基因表达时间短的缺点。
重组空壳腺病毒(gutless or gutted adenovirus vectors)或(hdAd，helper-dependent adenovirus vector)载体是第三代腺病毒，它有不同叫法，如空壳病毒、高容量，去除或无基因组的载体，完全删除的假腺病毒载体，有关这种腺病毒载体的设想来源于对一些无感染能力的腺病毒颗粒的观察。研究发现，尽管这些无感染能力腺病毒颗粒的基因组成千差万别，但是它们都共同含有腺病毒基因组最左端的一段序列，即包装信号(ψ)。因此人们设想：构建一种腺病毒载体，仅保留包括左右端ITR以及包装信号的约500bp的顺式作用元件，去除腺病毒基因组中全部的反式作用元件，而这部分功能由辅助病毒提供。这无疑是防止腺病毒晚期蛋白表达最简单、直接也是最有效的方法。它在保留了第一代新病毒载体基因转在效率高等一些优点的同时，外源基因的装载容量扩大到约37kb。由于去除了全部的腺病毒蛋白编码序列，安全性进一步提高，引起机体免疫反应的可能性降低。由于腺病毒的本身病毒基因表达即使在很低水平也可能导致转基因表达的消失，空壳腺病毒虽然载体不能阻止天然免疫反应，很多研究已证实它明显减少毒性和延长转基因表达，例如在小鼠模型中，高脂血症得到终身改善。在这个实验中，检测到表达时间长达2.5年。在一个鼠血友病模型中，表达VIII因子，纠正血友病时间超过9个月。另外，由于空壳腺病毒的特征之一是载体的血清型是由辅助病毒决定的，只需采用不同的辅助病毒，就很容易包装出不同血清型的空壳载体，实现血清型转换(serotype switching)，因此空壳腺病毒可以反复经系统途径给药，而无需担心机体抗腺病毒中和含有人恒定区全抗体的影响。
虽然有很多应用空壳腺病毒在体内表达各种治疗性蛋白质，但在体内血清中蛋白质浓度为0.5-10μg/ml，而全抗体的血清中治疗浓度通常需要40-60μg/ml，因此人们普遍认为应用重组空壳腺病毒携带含有人恒定区全抗体基因治疗不能达到有效的抗体治疗浓度。故迄今为止，尚未见到应用重组空壳腺病毒携带含有人恒定区全抗体基因治疗疾病献报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种高效低毒的编码治疗疾病并含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒。
本发明的目的在于提供一种含有上述重组空壳腺病毒的药物组合物。
人腺病毒是DNA肿瘤病毒家族成员，能造成人类良性呼吸道感染，人腺病毒分为A、B、C、D、E及F共6种及1-47个血清型。人腺病毒在人体内不会引起癌症，但A与B种在啮齿类动物中有一定致癌性，而其它人腺病毒致癌作用弱或无。目前应用于基因治疗腺载体绝大多数采用C种的2及5血清型腺病毒，均无致癌性。感染时病毒在细胞核中保持游离状态，能有效地转染分裂期和非分裂期细胞。
所有腺病毒载体均有转染分裂期和非分裂期细胞的能力，转染率较高，它是非整合型载体，无致癌性。腺病毒载体的缺点在于运输的基因不能持续表达，通常只表达5～20天，其基因短期表达是由于腺病毒蛋白激发的免疫反应所致。
腺病毒很容易进行临床应用规模的商业化生产，其病毒滴度很容易达到1012vp/ml，其病毒储藏及运送条件均十分清楚，目前它在肿瘤基因治疗中占主导地位。
空壳腺病毒是第三代腺病毒，除了保留病毒DNA复制和包装所必须的顺式作用序列外，它缺失了其它所有的病毒基因，这样的病毒载体从理论上能够装载大小约为37kb的多个外源基因。
空壳腺病毒载体生产需要一个提供必要病毒功能但包装信号已被删除而不能被包装的辅助病毒。典型的删除是由识别在必需的包装区两侧的loxP位点的噬菌体P1 Cre重组酶介导。另一个应用的方法是酵母重组酶(FLPe)，这时loxP位点被酵母重组酶(FLPe)重组的靶位FRT所代替。Umana等报道用酵母重组酶具有极高的效率，应用色谱病毒纯化技术可大批量生产空壳病毒载体。
抗体(Ab)是一种对特异抗原的结合特异性的糖蛋白。天然含有人恒定区全抗体约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链与重链通过一个共价二硫键与其相连。每条重链是由一个可变区(VH)和多个恒定区组成。每条轻链是由一个可变区(VL)和一个恒定区组成；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。
抗体的可变区中较为保守的区域称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，在4个框架区中间夹了3个高变区，它们大致上成β-折叠构型，由三个高变区相连。每条链中的高变区通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的高变区一起形成了抗体的抗原结合部位。
抗体的高变区(CDR)指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”即“CDR”的氨基酸残基。
恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应子功能，例如参与含有人恒定区全抗体的依赖于含有人恒定区全抗体的细胞毒性。
木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(该名称反映了其容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab’)2片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联。
“Fv”是最小的抗体片段，它含有全部抗原识别和结合位点。该区域由非共价紧密结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚物组成。在该构型中，各可变区中的三个高变区相互作用，在VH-VL二聚物表面上界定了抗原结合位点。6个高变区共同组成抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv的一半，它只包含对抗原有特异性三个可变区)，也能识别并结合抗原，只是其亲和力比完整的结合位点低。
Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1区的羧基端多几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)。Fab’-SH在本发明表示恒定区的半胱氨酸残基携带了游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段最初是以Fab’片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。
在本发明中，术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同两类(称为kappa(κ)和lambda(λ)中一类。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgGT和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区称为α、β、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
在本发明的上下文中，术语“抗体”应理解为可以是IgA、IgD、IgE、IgGT或IgM，包括天然人恒定区全抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，该重组空壳腺病毒基因组中至少包含编码一个含有人恒定区全抗体基因。
本发明中含有人恒定区全抗体可选自：
1)人鼠嵌合抗体的核苷酸序列；
2)人源化全抗体的核苷酸序列；
3)人的全抗体的核苷酸序列。
人鼠嵌合抗体是最早研究的含有人恒定区全抗体。抗体与抗原的结合完全取决于抗体的可变区，抗体的恒定区与抗原结合无关，但恒定区是抗体分子免疫原性的主要部位，因此通过用人的恒定区取代鼠单抗的恒定区，即人鼠嵌合抗体。它可消除抗体在人体中大部分异源性，并保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力，由于抗体各功能区形成相对独立的空间构象，使得恒定区的置换操作较为简单，目前已构建了多个人鼠嵌合抗体，分别为ReoPro(抗血小板受体IIbIIIa的人鼠嵌合抗体，用于治疗冠心病)、Rituxan(抗CD20的人鼠嵌合抗体，用于治疗淋巴瘤)、Simulect(抗CD25的人鼠嵌合抗体，用于治疗移植排斥)及Remicade(抗TNF-α的人鼠嵌合抗体，用于治疗炎症性肠病、类风湿性关节炎)，并在临床应用中取得良好疗效。
由于仅将鼠单抗的恒定区替换成人的抗体恒定区，不能完全消除单抗的异源性，可变区中存在的鼠源性序列仍然可以诱导人体产生针对鼠源性抗体的抗抗体(HAMA)，它会中和治疗抗体，使其被快速清除。抗体轻、重链可变区的6个高变区(CDR)形成CDR平面直接接触抗原，决定了抗体的特异性，抗体的可变区中框架区(FR)只是作为支持CDR的支架，其立体构象极为保守，因此人鼠嵌合抗体的鼠源性FR改变成人源性的FR区，从而最大限度地减少鼠单抗的异源性，这种单抗称之为人源化的抗体。目前，美国已正式批准6个人源化抗体上市，分别为Zanapax(抗CD25的人源化抗体，用于治疗移植排斥)、Herceptin(抗Her2的人源化抗体，用于治疗乳腺癌)、synagis(抗呼吸道合胞病毒F蛋白的人源化抗体，用于治疗呼吸道合胞病毒感染)、mylotarg(抗CD33的人源化抗体，用于治疗急性髓性白血病)及CAMPATH(抗CD52的人源化抗体，用于治疗慢性淋巴细胞性白血病)并在临床应用中取得良好疗效。
人的抗体是指完全来源于人的单克隆抗体，它的可变区及恒定区均为人源性。它来源于转基因小鼠及抗体库技术。目前已有多个人的抗体进入临床试验。
在本发明中，所述的含有人恒定区全抗体可以选自下表中之一种：
治疗性抗体
批准日期或
抗体名称 靶向抗原 抗体种类 公司名称 适应证
临床试验
治疗肿瘤的抗体
Panorex EpCam 鼠源性单抗 GlaxoSmithKline， Dukes’ 1995(德国)
Centocor 结肠癌
(Edrecolomab) (17-IA)
Rituxan 人-鼠嵌合
CD20 Genentech 淋巴瘤 1997
抗体
(rituximab)
Herceptin
HER-2 人源化抗体 Genentech 乳腺癌 1998
(Trastuzumab)
人源化抗体 Wyeth 急性髓性
Mylotarg CD33 2000
(偶联毒素) Laboratories 白血病
慢性淋巴
Millennium
Campath CD52 人源化抗体 细胞性白 2001
Pharmaceuticals
血病
人-鼠嵌合 头颈部肿
IMC-C225 EGFR ImClone System III
抗体 瘤
Titan
CeaVac 抗id(CEA)* 鼠源性单抗 大肠癌 III
Pharmaceuticals
ImClone System
BEC2 抗id(GD3)* 鼠源性单抗 肺癌 III
Merck KGaA
Avastin
人源化鼠单
VEGF Genentech 肿瘤 III
(Bevacizumab) 抗
Epratuzumab
CD22 人源化单抗 Immunomedics 淋巴瘤 III
(LymphoCide)
Smart M195 人源化鼠单 Protein Design 急性髓性
CD33 III
(Zamyl) 抗 Labs 白血病
Medarex，Immuno
HER-2/CD64
MDX-210 双功能抗体 Designed 卵巢癌 III
(FcγRI)
Molecules
OvaRex CA125 鼠源性单抗 Altarex 卵巢癌 III
人源化鼠单
TheraCIMh-R3 EGFR 不详 头颈部癌 II
抗
鼠源性单抗-
SGN-15 不详 Seattle Genetics 前列腺癌 II
化疗药
Titan
TriGem 抗id(GD2)* 鼠源性单抗 黑色素瘤 II
Pharmaceuticals
Protein Design
Smart ID10 HLA DR 人源化抗体 淋巴瘤 II
Labs
人源化鼠单
C242 CanAg
SB-408075 抗-化疗药交 ImmunoGen 实体瘤 I/II
antigen
联物
αVβ3 人源化鼠单 Applied Molecular 大肠癌，
Vitaxin I/II
integrin 抗 Evolution 肉瘤
4B5 抗id(GD2) 人源抗体 Viventia Biotech 黑色素瘤 I/II
SS1(dsFv)PE38 mesothelin dsFv-PE38 NeoPharm 实体瘤 I/II
ABX-EGF EGFR 人的抗体 Abgenix 实体瘤 I/II
CEA、放射性 IBC
Pentacea 双特异抗体 肿瘤 I/II
核素 Pharmaceuticals
2C4
(OmnitaragTM，P HER2 人源化抗体 Genentech 肿瘤 II
ertuzumab)
BrevaRex MUC1 鼠源性单抗 AltaRex 肿瘤 I
治疗牛皮癣的抗体
ABX-IL8 IL8 人的抗体 Abgenix 牛皮癣 II
Anti-CD11a CD11a 人源化抗体 Genentch/Xoma 牛皮癣 III
ICM3 ICAM-3 人源化抗体 ICOS Pharm 牛皮癣 I
IDEC
IDEC-114 CD80 Primatized 牛皮癣 I
Pharm/Mitsubishi
Medimmune/Bio
MEDI-507 CD2 人源化抗体 牛皮癣 I
Transplant
Protein Design
Smartanti-CD3 CD3 人源化抗体 牛皮癣 I/II
Lab
Smart Protein Design 牛皮癣炎
IFN-γ 人源化抗体 I/II
anti-IFN-γ Labs 症性肠病
治疗类风湿关节炎抗体
类风湿关
5G1.1 Complement 人源化抗体 Alexiom Pharm II
节炎
类风湿关
D2E7 TNF-α 人的抗体 CAT/BASF I
节炎
类风湿关
人源化抗体
CDP870 TNF-α Celltech 节炎 II
(Fab)
类风湿关
人-鼠嵌合
Infliximab TNF-α Centocor 节炎 1998
抗体
类风湿关
IDEC
节炎
IDEC-151 CD4 Primatized Pharm/SmithKline II
Beecham
类风湿关
Medarex/Eisai/Ge
MDX-CD4 CD4 人的抗体 节炎 II
nmab
治疗过敏性疾病单抗
过敏性疾
Xolair IgE 人源化抗体 Genentech III
病
过敏性疾
SCH55700 IL-5 人源化抗体 Celltech II
病
SB-240563 IL-5 人源化抗体 SmithKline 过敏性疾 II
Beecham 病
SmithKline 过敏性疾
SB-240683 IL-4 人源化抗体 II
Beecham 病
过敏性疾
CAT-213 eotaxin 人源化抗体 CAT I
病
灵长类化鼠 过敏性疾
IDEC-152 CD23 IDEC I
抗体 病
同种免疫抑制治疗性单抗
同种免疫
OKT3 CD3 鼠单抗 Ortho Biotech 1986
抑制
同种免疫
Zanapax CD25 人源化抗体 PDL 1997
抑制
人-鼠嵌合抗 同种免疫
Simulect CD25 Novartis Pharm 1998
体 抑制
同种免疫
ABX-CBL CD147 鼠单抗 Abgenix III
抑制
同种免疫
Anti-LFA-1 CD18 鼠F(ab’) Pasteur-Merieux III
抑制
同种免疫
OKT4A CD4 人源化抗体 Ortho Biotech II
抑制
同种免疫
BTI-322 CD2 大鼠单抗 Medimmune II
抑制
同种免疫
Smartanti-CD3 CD3 人源化抗体 PDL I/II
抑制
同种免疫
MEDI-507 CD2 人源化抗体 Medimmune I/II
抑制
LDP-01 β2整合素 人源化抗体 LeukoSite 同种免疫 I/II
抑制
同种免疫
Anti-CD11a CD11a 人源化抗体 不详 I/II
抑制
同种免疫
Antova CD40L 人源化抗体 Biogen I/II
抑制
感染性疾病治疗单抗
人-鼠嵌合抗 呼吸道合
Synsgis RSV F蛋白 Medimmune 1998
体 胞病毒
Progenics/Genzym
PRO542 Gp120 不详 爱滋病 II
etransgenics
XTL001 HepB 人源化抗体 XTL 乙型肝炎 II
Protein Design
Ostavir HepB 人源抗体 乙型肝炎 II
Lab/Novartis
Protein Design 巨细胞病
Protovir CMV 人源化抗体 III
Lab/Novartis 毒
XTL002 HepC 人源抗体 XTL 乙型肝炎 I
系统性红斑狼疮
系统性红
5G1.1 C5 人源化抗体 Alexion Pharm I
斑狼疮
系统性红
Antova CD40L 人源化抗体 Biogen II
斑狼疮
系统性红
IDEC-131 CD40L 人源化抗体 IDEC Pharm/Eisai II
斑狼疮
Complement 系统性红
5G1.1 人源化抗体 Alexion Pharm I/II
(C5) 斑狼疮
其它
血小板受体 人-鼠嵌合
ReoPro Centocor/Lilly 冠心病 1994
IIbIIIa (Fab)
人源化
Anti-CD18 CD18 Genentech 心肌梗塞 II
F(ab)2
人源化 冠心病术
CDP860 PDGFβR Celltech II
F(ab)2 后
人-鼠嵌合抗
Corsevin M VII因子 Centocor 抗凝血 I
体
休克、移植
LDP-01 β2整合素 人源化抗体 LeukoSite I/II
排斥
中毒性休
MAK-195 TNF-α 鼠F(ab)2 Knoll Pharma/BASF III
克
中毒性休
IC-14 CD14 不详 ICSO Pharm I
克
眼部术后
CAT-152 TGF-β2 人源抗体 Cambride Ab Tech I/II
瘢痕形成
器官纤维
CAT-192 TGF-β1 人源抗体 Cambride Ab Tech I
化
多发性硬
VLA-4 Antegren 人源化抗体 Elan II
化病
Infliximab TNF-α 嵌合抗体 Centocor 克隆病 1998
CDP571 TNF-α 人源化抗体 Celltech 克隆病 II
LeukoSite/Genent 溃疡性结
LDP-02 α4β7 人源化抗体 II
ech 肠炎
抗独特型单抗，扩号中为其所模拟的抗原
绝椽子(insulator)
众所周知，哺乳类动物的基因组是由不连续的染色质结构域构成的，这些染色质结构域是一些独立的基因表达调控单位，它们不受邻近区域顺式元件的影响，这些结构域的功能和结构上的独立性由边界元件(boundary element)界定。Udvardy等人在对果蝇多线染色体87A7座位hsp70基因两端的边界元件进行研究后发现，其中的核酸酶高度敏感区scs和scs′能使其界定的染色体结构域内的基因免受区域外其它调控元件(正调控或负调控)的影响，当将其插入到启动子与增强子之间时，可以有效抑制增强子对启动子的活性。因其功能类似于电学中的绝缘效应，故称之为绝缘子。此后，在诸多果蝇染色体基因座(如，逆转录转座子gpysy、hairy wing抑制子以及Fab-7)的边界元件中也发现有绝缘子存在。在脊椎动物的染色体中(如鸡的β-珠蛋白基因座以及T细胞受体基因座)也找到了绝缘子。另外，研究表明将牛生长激素转录终止信号(BGHpA，bovine growth hormone transcription stop singal)加在基因表达盒的两侧也可以起到绝缘子的效果。由于人们对β-珠蛋白基因座的了解比较充分，而且其染色体结构非常保守，因此目前绝大部分关于绝缘子的研究是以鸡的β-珠蛋白基因座绝缘子为基础进行的。该绝缘子是位于鸡β-珠蛋白基因座5′端边界元件中的一段长约1,200bp的DNA片断。进一步的研究表明，该片段近一半的绝缘活性是由其5′端一段长约250bp包含有DNA酶I超敏位点(5′HS4)的CpG岛样结构(即所谓核心元件)决定的。该核心元件的G+C含量在70％左右，CpG双核苷酸序列的密度非常高(有22处之多)。这样的结构是否是真核生物绝缘子所共有的特点尚有待于其它一些绝缘子的发现以及更加深入的研究。
绝缘子是一种具有顺式调控功能的边界元件，可以阻断邻近的调控元件(增强子或沉默子)对其所界定基因的启动子的增强或抑制作用，还可以保护整合到基因组中得基因表达盒，使其不受染色体位置效应(chromosomal position effect)的影响。关于绝缘子的作用机制，人们提出了多种模型或假说，概括起来主要有两大类，即空间模型(steric models)和轨迹模型(tracking models)。前者认为，两个绝缘子间相互作用，在空间上形成一个与外界隔绝的襻状结构，阻抑其外面其它因子的影响；轨迹模型说认为，绝缘子是作为一种抑制增强子复合物沿DNA向启动子移动的信号来起作用的。目前尚缺乏足够的证据以认定其中任何一种是正确的，当然绝缘子也完全有可能并非是通过单一的机制起作用。另外，最近的研究表明绝缘子的功能会受到其两侧的DNA序列的影响，这进一步说明了绝缘子作用机制是非常复杂的。虽然如此，经过过去数年的研究还是获得了许多非常有益的发现。首先，利用DNA酶足迹分析的方法，Gary等人在鸡β-珠蛋白绝缘子核心元件内发现了一段长约49bp的序列单独也可以在一定程度上产生绝缘效应，并以此为基础进一步证实了一种已知的带有锌指结构的调控蛋白CTCF可以与该段DNA序列紧密结合，并阻断增强子的活性。其次，同一个工作小组通过染色体免疫沉淀实验(ChIP)发现5′HS4上游的组氨酸乙酰化程度很低，形成异染色质，与其下游形成鲜明的对比，并推测这可能是绝缘子能够有效防止整合基因免受染色体位置效应影响的关键所在。
关于绝缘子作用特点的研究也有许多突破，概括起来主要有以下几个方面：首先，绝缘子具有位置特异性，即只有当位于增强子与启动子之间时，绝缘子才具有阻断增强子活性的功能；其次，绝缘子抑制增强子功能有极性特点，即只抑制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子的作用，而对处于同一染色体结构域的增强子没有作用，被某一结构域绝缘子所抑制的增强子仍可对处于同一结构域的启动子起作用；再次，绝缘子具有方向性，Lieber等人在对多种不同的组合方式进行研究后发现：当两侧的绝缘子与报告基因表达盒其呈同向排列时，其绝缘功能可以发挥到最大；最后，绝缘子活性具有数量依赖性，两个绝缘子核心元件的活性即与整个1.2Kb绝缘子相当，而且随着数量的增加其活性也进一步增强。
本发明的重组空壳腺病毒基因组中含有人恒定区全抗体基因表达盒的上下游区至少含有一个绝椽子(insulater)的核苷酸序列。从而使抗体表达盒能够在空壳腺病毒中重复进行。
本发明提供一类重组空壳腺病毒中所含绝椽子(insulater)的核苷酸序列可以是鸡的β球蛋白的绝椽子的核苷酸序列。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，该重组空壳腺病毒基因组中至少包含编码两个相同的含有人恒定区全抗体基因。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，该重组空壳腺病毒基因组中至少包含编码两个不同的含有人恒定区全抗体基因。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，本发明所述的重组空壳腺病毒中，编码治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有治疗肿瘤作用并含有人恒定区全抗体基因，均可被用于本发明。其编码治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：编码抗新生血管生成的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞生长因子受体的含有人恒定区全抗体核苷酸序列，编码抗肿瘤细胞膜抗原的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，所述治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体为编码抗新生血管生成的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，本发明所述的重组空壳腺病毒中，编码治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗新生血管生成的含有人恒定区全抗体蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗新生血管生成的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗血管内皮生长因子的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，抗血管内皮生长因子受体2的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，抗整合素的αvβ3的含有人恒定区的核苷酸序列，抑制新生血管内皮生成的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中起关键作用，它通过促进血管生成从而在肿瘤生成及转移中发挥重要作用。抗血管内皮生长因子的含有人恒定区全抗体可阻断血管内皮生长因子与其受体(特别血管内皮生长因子受体2)结合，抑制肿瘤新生血管的生成，从而抑制肿瘤的生长及转移。美国Genentech公司的抗血管内皮生长因子的嵌合性含有人恒定区全抗体(Avastin，另一个名称为Bevacizumab)在结肠癌的III期临床试验取得明显疗效。美国ImClone Systems公司的针对抗血管内皮生长因子受体2(KDR)的抗体IMC-1C11已进入肿瘤的I期临床试验。整合素的αvβ3通过细胞间基质与内皮细胞之间信号传递从而参予新生血管的生成，抗整合素的αvβ3的含有人恒定区全抗体可抑制新生血管生成，从而抑制肿瘤的形成。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，所述治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体为编码抗肿瘤细胞生长因子受体的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，本发明所述的重组空壳腺病毒中，编码抗肿瘤细胞生长因子受体的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗肿瘤细胞生长因子受体的含有人恒定区全抗体蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗肿瘤细胞生长因子受体的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗表皮生长因子受体1的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，抗表皮生长因子受体2的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor)在多种恶性肿瘤细胞转化上起关键作用，它在多种肿瘤细胞中过表达。人表皮生长因子受体也被称为ErbB受体，目前已有四个成员被识别，分别为表皮生长因子受体1(HER1，又称为ErbB1或EGFR)、表皮生长因子受体2(HER2，又称为ErbB1或Neu)、表皮生长因子受体3(HER3，又称为ErbB3)及表皮生长因子受体4(HER4，又称为ErbB4)。阻断表皮生长因子受体信号传导可抑制肿瘤细胞生长。美国ImClone Systems公司的针对表皮生长因子受体1嵌合抗体IMC-C225对多种晚期肿瘤有明显的治疗作用，目前该含有人恒定区全抗体已在III及IV期临床试验。美国另一家生物公司Abgenix公司的针对表皮生长因子受体1的人的抗体ABX-EGF对多种晚期肿瘤有明显的治疗作用，目前该抗体已在II期临床试验。美国Genentech公司的针对表皮生长因子受体2的人源化抗体Herceptin(又称为Trastuzumab)已于1998年美国FDA批准进行临床应用，它与化疗联合产生明显的临床疗效。该公司的另一个针对表皮生长因子受体2的人源化抗体2C4亦已进入I期临床试验。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，所述治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体为编码抗肿瘤细胞膜抗原的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，本发明所述的重组空壳腺病毒中，编码抗肿瘤细胞膜抗原的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗肿瘤细胞膜抗原的含有人恒定区全抗体蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗肿瘤细胞膜抗原的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗CD20的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，抗CD52的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，抗MUC1的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
由于CD20存在于所有的B淋巴细胞中，抗CD20含有人恒定区全抗体可杀灭所有的B淋巴细胞，从而大大降低针对腺病毒载体含有人恒定区全抗体的产生，从而使腺病毒载体重复使用成为可能。同时由于B细胞淋巴瘤本身亦存在着含有人恒定区全抗体产生障碍，这也可导致针对腺病毒载体抗体减少。因此应用含有腺病毒携带抗CD20的全含有人恒定区全抗体，具有明显的治疗B细胞淋巴瘤的作用。美国Genentech公司的抗CD20的嵌合Rituxan(又称为Rituximab)用于治疗B-细胞淋巴瘤，已于1997年批准临床正式应用。
CD52在大多数正常和恶性成熟淋巴细胞(包括T淋巴细胞和B淋巴细胞)表面具有高表达，而不表达于造血干细胞，抗CD52含有人恒定区全抗体可杀灭所有的成熟淋巴细胞，从而大大降低针对腺病毒载体抗体及T细胞免疫的产生，从而使腺病毒载体重复使用成为可能。因此应用含有腺病毒携带的抗CD52的全含有人恒定区全抗体，具有明显的治疗淋巴瘤的作用。抗CD20的人源化抗体Campath用于治疗慢性淋巴细胞性白血病，已于2001年批准临床正式应用。
MUC1广泛存于多种肿瘤中，美国Antisoma公司抗MUC1人源化抗体已进入临床试验。
本发明提供一类重组重组空壳腺病毒，所述治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体为编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，本发明所述的重组空壳腺病毒中，编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的蛋白，均可被用于本发明。其所述编码抗肿瘤抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：抗17-1A的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，抗癌胚抗原的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，抗GD3的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列，抗MUC1的独特型单克隆全抗体的核苷酸序列。
抗独特型单克隆抗体(anti-idiotypic mAb，也可用Ab2表示)又称之抗个体基因型抗体，它模拟肿瘤细胞表面的抗原，可引起细胞毒T细胞和辅助T细胞反应，从而达到治疗肿瘤的目的。17-1A在上皮来源的肿瘤细胞内高表达，德国于1997年已批准由Glaxo Wellcome/Centocor公司生产的抗17-1A独特型单克隆抗体(Panorex)用于治疗结肠癌。美国ImClone Systems公司的针对抗GD3的独特型单克隆抗体BEC2抗体IMC-1C11已进入肿瘤的III期临床试验。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，本发明所述的重组空壳腺病毒中，编码治疗微生物感染的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有治疗微生物感染作用含有人恒定区全抗体基因，均可被用于本发明。其编码治疗微生物感染的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：编码治疗病毒含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码治疗细菌含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码治疗支原体含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，本发明所述的重组空壳腺病毒中，编码治疗病毒的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有治疗病毒的含有人恒定区全抗体基因，均可被用于本发明。其编码治疗病毒的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：编码治疗乙肝病毒的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码治疗爱滋病病毒的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码治疗呼吸道合胞病毒的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗狂犬病病毒的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码治疗巨细胞病毒的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码治疗丙型肝炎病毒的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，本发明所述的重组空壳腺病毒中，编码治疗自身免疫性疾病的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列包括，但不限于选自编码的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有治疗自身免疫性疾病的含有人恒定区全抗体基因，均可被用于本发明。其编码治疗自身免疫性疾病的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：编码抗肿瘤坏死因子α含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗IgE含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗CD11a含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗CD80含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗CD4含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗CD2含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗CD25含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗CD40L含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗VLA-4含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗α4β7含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗CD64含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗IL-5含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗IL-6含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗补体C5含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗eotaxin含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，编码抗CD23含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
本发明提供一类的重组重组空壳腺病毒，所述编码治疗疾病的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：Ig G的核苷酸序列或Ig M的核苷酸序列。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同两类(称为kappa(κ)和lambda(λ)中一类。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgGT和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区称为α、β、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
本发明提供一类重组空壳腺病毒， 其中编码治疗疾病的含有人恒定区全抗体的-核苷酸序列受启动子控制。只要能够启动子功能，均可被用于本发明。其启动子可以为以下启动子之一：猴重组空壳腺病毒40(Simian virus40，按常规简称为SV40)启动子，劳斯氏肉瘤重组空壳腺病毒(Rous Sarcoma Virus，按常规简称为RSV)LTR启动子，人巨细胞重组空壳腺病毒(按常规简称为HCMV)IE启动子，鼠巨细胞重组空壳腺病毒(按常规简称为MCMV)IE启动子及人腺病主要晚期表达启动子(按常规简称为MLP)。
本发明提供一类重组空壳腺病毒，该重组空壳腺病毒是腺病毒体时，在控制编码治疗疾病的含有人恒定区全抗体表达的启动子的转录起始位点与含有人恒定区全抗体的翻译起始位点中插入内含子，插入内含子后可使含有人恒定区全抗体表达量大大增加。这种内含子包括，但不限于选自的核苷酸序列。本领域技术人员知晓，只要能够具有增加含有人恒定区全抗体的表达的内含子，均可被用于本发明。其所述的内含子可以为杂合内含子，杂合内含子可以选下述之一：含有腺病毒主要晚期mRNA的第三个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子，含有腺病毒主要晚期mRNA的第一个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子。
本发明在上述这种修饰重组空壳腺病毒基因组中插入编码治疗疾病的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。随着重组空壳腺病毒感染细胞，使细胞高效表达治疗疾病的含有人恒定区全抗体，从而治疗疾病的目的。
本发明的又一方面，提供了一种利用本发明的重组空壳腺病毒应用于肿瘤的治疗，其包括如下步骤：1)将该重组空壳腺病毒体外或体内感染细胞，2)在细胞内表达治疗疾病的含有人恒定区全抗体，从而达到治疗疾病的目的，本发明中所述的哺乳动物包括但不限于人，猴，牛，羊，猪，犬，猫等等。
本发明的又一方面，提供了一种利用本发明的重组空壳腺病毒应用于肿瘤治疗药物，其包括如下步骤：1)将该重组空壳腺病毒体外或体内感染正常细胞，2)在正常细胞内表达治疗疾病的含有人恒定区全抗体，从而达到治疗疾病的目的。本发明中所述的哺乳动物包括但不限于人，猴，牛，羊，猪，犬，猫等等。
本发明还包括内含本文所述重组空壳腺病毒的组合物，如药物组合物。这类组合物可体内给药。优选地，这些组合物更进一步包含药物学上可接受的赋形剂。这些可包含有效量的本发明重组空壳腺病毒于药物学上可接受的赋形剂中的组合物适于以单位剂量形式、无菌的胃肠道外溶液或悬浮液、无菌的非胃肠道外溶液或口服液或悬浮液，水包油或油包水乳液等全身性给药于个体。非胃肠道外和胃肠道外药物送递配方为本领域已知，可参见Remington’s药物科学，18版，Mack Publishing(1990)。药物组合物还包括本发明重组空壳腺病毒的冻干形式和/或重建形式(包括包装成重组空壳腺病毒的那些)。
本发明还提供治疗方法，其中将有效量的本文所述重组空壳腺病毒施用于个体。应用重组空壳腺病毒的治疗方法可用于疾病的患者。还可用于疾病高危人群，如那些有此类病的家族史和/或有已切除或以其它形式(如化疗)治疗过的疾病的个体。决定是否适于施用本发明的重组空壳腺病毒将特别依据可评估的临床参数，如血清学指标及组织活检样品的组织学检查。通常施用含重组空壳腺病毒的药物组合物。药物组合物如上述。
重组空壳腺病毒的用量取决于多种因素，如具体的重组空壳腺病毒类型，给药途径，个体的身体状况，疾病发展程度，所用的具体肿瘤治疗基因。
若施用包装的重组腺病毒，则用量为约104至约1014，优选约104至约1012，更优选约104至约1010。可同时或先后施用不止一种重组空壳腺病毒。通常是周期性给药，同时监控任何反应。可经如皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内给药。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一类治疗肿瘤的重组空壳腺病毒，动物实验证明，这种重组空壳腺病毒药物可用于治疗疾病。
本发明提供一类高效表达治疗疾病的含有人恒定区全抗体的重组空壳腺病毒的构建方法。该方法通常易行可用于构建高效表达治疗疾病的含有人恒定区全抗体的细胞内的重组空壳腺病毒。
本发明提供一种在体内及体外治疗体内及体外肿瘤细胞内高效表达治疗疾病的含有人恒定区全抗体，达到高效低毒应用于治疗疾病的目的。
人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本发明以腺病毒C亚属中的5型(Ad5)作为例证，对本发明加以进一步具体说明，本发明构建手段均是现有技术人员能够实现。
本发明创造性地提供了用重组空壳腺病毒携带治疗抗体对疾病进行治疗，即：采用重组空壳腺病毒携带治疗疾病的并含有人恒定区全抗体基因，将该重组空壳腺病毒转染细胞，使细胞表达大量治疗疾病并含有人恒定区全抗体。本发明携带治疗疾病并含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒，可在细胞或组织中使抗体基因长期高水平的表达，由于含有人恒定区的全抗体基因在体内较稳定，本发明结果令人惊奇发现，应用携带含有人恒定区的全抗体基因的重组空壳腺病毒治疗疾病，在体内血清中抗体浓度能达到50-150μg/ml，其浓度达到抗体蛋白血清水平，明显高于应用重组空壳腺病毒携带戴其它基因的水平。通常应用重组空壳腺病毒表达蛋白在体内蛋白浓度为0.5-10μg/ml，因此它能够在体内避免反复给予的麻烦。同时由于携带治疗疾病的含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒生产成本低廉，从而解决了治疗抗体生产成本高的难题，因而从疗效及经济上均优于抗体治疗法。这种携带含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒系统的抗体治疗方法还可用于腺相关病毒载体系统，尤其腺相关病毒1型载体系统，也可用于其它能在体内长期高水平表达载体系统。
附图说明
图1.空壳腺病毒载体SGG示意图
图2.重组腺病毒SGG002及对照腺重组空壳腺病毒Ad5-Lac Z体外感染的WI-38、BJ及SK-Br-3后，WI-38、BJ及SK-Br-3细胞上清中人源化抗体的表达量
图3.重组腺病毒SGG002体外感染的WI-38及SK-Br-3后，WI-38及SK-Br-3细胞上清分泌人源化抗体与Herceptin对人表皮生长因子受体2(Her2)阳性的乳腺癌细胞SK-Br-3增殖抑制作用。细胞增殖率＝治疗细胞数/对照细胞数×100％
图4.重组腺病毒SGG002及对照腺重组空壳腺病毒Ad5-Lac Z分别按5×1010VP、1×1011VP及2×1011VP尾静脉给予Balb/c nu裸鼠治疗后裸鼠血清中人源化抗体的表达量
图5.重组腺病毒SGG002及对照腺重组空壳腺病毒Ad5-Lac Z的2×1011VP尾静脉给予Balb/c裸鼠治疗1周后小鼠血清中人源化抗体的蛋白印迹杂交图
图6.重组腺病毒SGG004感染的正常肝细胞L02上清中人鼠嵌合抗体的纯化后的抗体亲和常数测定曲线
图7.重组腺病毒SGG004及对照腺重组空壳腺病毒Ad5-Lac Z分别按1×1011VP及5×1011VP尾静脉给予Balb/c nu裸鼠治疗后裸鼠血清中人鼠嵌合抗体的表达量
图8.重组腺病毒SGG004及对照腺重组空壳腺病毒Ad5-Lac Z的5×1011VP尾静脉给予Balb/c裸鼠治疗1周后小鼠血清中人鼠嵌合抗体的蛋白印迹杂交图
具体实施方式
例1.分别携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因、抗人表皮生长因子受体(EGFR)的人的抗体SG-EGFR基因、抗人CD20的人嵌合抗体SG-CD20基因及抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗体SG-anti HBV preS2基因的表达载体的构建
pShuttle-CMV购于美国Qbiogene，含有人巨细胞病毒启动子(CMV IE)及SV40 poly A加尾信号，应用PCR技术克隆人巨细胞病毒启动子(CMV IE)及SV40poly A加尾信号，并在上下游位置中分别加入Bgl II酶切位点，在其人巨细胞病毒启动子(CMV IE)及SV40 poly A加尾信号之间插入多克隆位点，分别为EcoRI、Sal I、Hind III、Xho I及BamH I酶切位点，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见PCR Protools Current Methods and Applications，White BA主编，Humana Press Inc.1993年出版-文献1)。其引物分别为应用引物1与引物2对pShuttle-CMV进行PCR，其产物长度为621bp。
引物1：GGG GTA CCT AGA TCT TAG TAA TCA ATT ACG GGG TCA
引物2：GAG AAG CTT GTC GAC GAA TTC CTA GCG GAT CTG ACG GTT CAC
应用引物3与引物4对pShuttle-CMV进行PCR，其产物长度为293bp。
引物3：GAA TTC GTC GAC AAG CTT CTC GAG GGA TCC ATC TAG ATA ACT GAT
CAT A
引物4：ATA GTT TAG CGG CCG CTA AGA TCT AAG ATA CAT TGA TGA GTT TG
应用引物1与引物4对上述片断进行PCR，其产物长度为893bp
应用Kpn I与Not I双酶切后，插入pBluescript(购于美国ATCC公司)中.进行测序，正确者命名为pClonel，其Bgl II酶切后长度为861bp。
脑心肌炎病毒(EMCV)的多顺反子(IRES)来源于pIRES-EYFP，该质粒购于美国Clontech公司。应用引物5与引物6对其进行PCR，其扩增长度为624bp
引物5：CCG GAA TTC ATC GAT TCT GTC GAC CTG CAG GAA TTG CCC CTC TCC
CTC
引物6：TGC TCT AGA CCC GGG CTC GAG GGA TCC TTA ATC ATC GTG TTT TTC
AAA G
用EcoR I+Xba I双酶切插入pUC19的EcoR I+Xba I酶切位点中，进行测序，命名为pUC19-IRES
用EcoR I+Xba I双酶切分别插入pClonel的EcoR I+Xba I酶切位点中，命名为pClone2。
质粒pClone2为含有脑心肌炎病毒(EMCV)的多顺反子(IRES)的双基因表达载体，其启动子为人巨细胞病毒启动子(CMV IE)，含有两个多克隆位点，第一个多克隆位点的酶切位点依次为EcoR I、Cla I、Sal I及Pst I，第二个多克隆位点的酶切位点依次为BamH I、Xho I、Xma I及Xba I。
抗人表皮生长因子受体1(EGFR)的人的抗体SG-EGFR由上海捷倍思基因技术有限公司进行全长基因合成，其轻链基因与重链基因的可变区与美国Abgenix公司的针对表皮生长因子受体1的人的抗体ABX-EGF的轻链基因与重链基因的可变区相同。含有SG-EGFR重链基因并在重链上游区引入BamH I酶切位点和重链下游区引入Xba I酶切位点的pUC19质粒命名为pUC-SG-EGFRH。含有SG-EGFR轻链基因并在轻链上游区引入EcoR I和轻链下游区引入Sal I酶切位点的pUC19质粒为pUC-SG-EGFRL。
SG-EGFR的重链基因的核苷酸序列
CGCGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCA
GTGTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGATTACTACTGGACCTGGATTCGGCAGTCCCCAGGGAA
GGGACTGGAGTGGATTGGACACATCTATTACAGTGGGAACACCAATTATAACCCCTCCCTCAAGAGTCG
ACTCACCATATCAATTGACACGTCCAAGACTCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGA
CACGGCCATTTATTACTGTGTGCGAGATCGAGTGACTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAAT
GGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCAC
CTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG
GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTC
CCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCA
CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCC
ACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACAC
CCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGT
CAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTA
CAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA
CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA
GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT
GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGA
GAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC
CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAATCTAGAAAGCTTGGG→
SG-EGFR的轻链基因的核苷酸序列
CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATAC
CACCGGAACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATCAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACC
AGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAG
TGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATA
TTTCTGTCAACACTTTGATCATCTCCCGCTCGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAACTGT
GGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGT
GTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATC
GGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCT
GACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAG
CTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC→→
应用BamH I+Xba I将pUC-SG-EGFRH切下，定向插入pClone2载体BamHI+Xba I中，命名为pCtone2-SG-EGFRH。应用EcoR I+Sal I将pUC-SG-EGFRL切下，定向插入pClone2-SG-EGFRH载体EcoR I+Sal I中，命名为pClone2-SG-EGFR。
抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因由上海捷倍思基因技术有限公司进行全长基因合成，其轻链基因与重链基因的可变区与美国Genentech公司的针对表皮生长因子受体2的人源化抗体Herceptin的轻链基因与重链基因的可变区相同。含有SG-HER重链基因并在重链上游区引入BamH I酶切位点和重链下游区引入Xho I酶切位点的pUC19质粒命名为pUC-SG-HERH。含有SG-HER轻链基因并在轻链上游区引入EcoR I和轻链下游区引入Sal I酶切位点的pUC19质粒为pUC-SG-HERL。
SG-HER的重链基因的核苷酸序列
GGATCCACCATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCA
AGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGG
CAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCA
GGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGG
TGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATAC
ACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATA
CTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACC
TGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCT
TCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGCCCAT
CGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA
AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCT
TCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT
TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTG
AGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG
TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC
ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG
TCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC
CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT
CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA
TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT
CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT
TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAATAGTAACTCGAG
SG-HER的轻链基因的核苷酸序列
CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATA
CCACCGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCA
TCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTC
CGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGAT
CTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGC
AACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAACTGTGGCTGCACCAT
CTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGA
ATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC
AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCA
AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCA
CAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC→
应用BamH I+Xho I将pUC-SG-HERH切下，定向插入pClone2载体BamH I+XhoI中，命名为pClone2-SG-HERH。应用EcoR I+Sal I将pUC-SG-HERL切下，定向插入pClone2-SG-HERH载体EcoR I+Sal I中，命名为pClone2-SG-HER。
抗人CD20的人鼠嵌合抗体SG-CD20基因由上海捷倍思基因技术有限公司进行全长基因合成，其轻链基因与重链基因的可变区与美国IDEC公司的针对CD20的人鼠嵌合抗体IDEC-C2B8(Rituximab)的轻链基因与重链基因的可变区相同。含有SG-CD20重链基因并在重链上游区引入BamH I酶切位点和重链下游区引入Xba I酶切位点的pUC19质粒命名为pUC-SG-CD20H。含有SG-CD20轻链基因并在轻链上游区引入EcoR I和轻链下游区引入Sal I酶切位点的pUC19质粒为pUC-SG-CD20L。
SG-CD20的重链基因的核苷酸序列
CGCGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCC
AGTGTCAGGTACAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCT
GCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCC
TGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGG
CCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACT
CTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACGGCGGTGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAG
GGACCACGGTCACCGTCTCTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCA
AGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG
TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC
TCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA
CATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA
AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC
CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA
AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA
AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGG
TCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC
AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCA
AGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTC
TGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAATCTAGA
SG-CD20的轻链基因的核苷酸序列
CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATA
CCACCGGACAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAA
TGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCA
AACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTG
GGACTTCTTACTCTCTCACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGT
GGACTAGTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCAT
CTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGA
ATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC
AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCA
AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCA
CAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC
应用BamH I+Xba I将pUC-SG-CD20H切下，定向插入pClone2载体BamHI+Xba I中，命名为pClone2-SG-CD20H。应用EcoR I+Sal I将pUC-SG-CD20L切下，定向插入pClone2-SG-CD20H载体EcoR I+Sal I中，命名为pClone2-SG-CD20。
抗人HBV pres2的人鼠嵌合抗体SG-anti HBV preS2基因由上海捷倍思基因技术有限公司进行全长基因合成，其轻链基因与重链基因的可变区与韩国的生物科学与研所的针对HBV pres2的人鼠嵌合抗体H8的轻链基因与重链基因的可变区相同(参见文献Park SS，Ryu CJ，Gripon P，Guguen-guillouzo C and HongHJ.Generation and characterization of a humanized antibody withspecificity for preS2 surface antigen of hepatitis B virus.Hybrdoma1996，15：435-441)。含有SG-anti HBV preS2重链基因并在重链上游区引入BamHI酶切位点和重链下游区引入Xba I酶切位点的pUC19质粒命名为pUC-SG-antiHBV preS2。含有SG-anti HBV preS2轻链基因并在轻链上游区引入EcoR I和轻链下游区引入Sal I酶切位点的pUC19质粒为pUC-SG-anti HBV preS2。
SG-anti HBV preS2的重链基因的核苷酸序列
ggatccACCATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTG
TCCAGAGTGAAGTGAAGCTCGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGAT
CCATGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGG
GTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGGTGAAATTAGAAGCAAAGCT
AATAATCATGCAACATACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGA
TGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAAGACACTGGC
ATTTATTACTGTACCCCCATTACTACGGGCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGAC
TCTGGTCACTGTCTCTGCAAAGCTTGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG
CGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG
ACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCG
TGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAA
GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACAC
AACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGC
CCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAG
AGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCAGCACCTGAACTCCT
GGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGATACCCTTATGATTTCCC
GGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCC
AGTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCTGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG
ACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC
CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACA
CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGG
TCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG
AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA
CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTC
CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG
GGTAAATGAtctaga
SG-anti HBV preS2的轻链基因的核苷酸序列
GaattcACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTG
GTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGA
GAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCATTCAAAA
GAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTAC
TGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGAGA
CAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT
CAGCAATATTATAACTATCCGTCCACGTTCGGAGGGGGGACCTACCTGGAAATAAAACG
TACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTG
GAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA
GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCA
GGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAG
ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC
CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGAGTCGAC
应用BamH I+Xba I将pUC-SG-anti HBV preS2H切下，定向插入pClone2载体BamH I+Xba I中，命名为pClone2-SG-anti HBV preS2H。应用EcoR I+SalI将pUC-SG-anti HBV preS2L切下，定向插入pClone2-SG-anti HBV preS2H载体EcoR I+Sal I中，命名为pClone2-SG-anti HBV preS2。
合有鸡珠蛋白绝缘子的表达载体pSGEI构建，将pUC19(购于美国ATCC公司)应用EcoR I及HindIII酶切，合成两个DNA寡核苷酸片段做一个连接头，其DNA寡核苷酸序列为
primer7 AATTGACCGGTAGCTA
primer8 GCTTAGCTACCGGTC
将两个DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃变性5分钟，然后缓慢降温复性，复性后应用T4噬菌体多核苷酸激酸进行磷酸化。将该磷酸化后的连接头与pUC19应用EcoR I及HindIII载体片段进行连接，命名为pCLON3(方法参见分子克隆实验指南，科学出版社1992出版)，pCLON3的多克隆位点为Age I与Hind III。
鸡β-珠蛋白基因座绝缘子位于鸡β-珠蛋白基因座5′端边界元件中的一段长约1,200bp的DNA片断。进一步的研究表明，该片段近一半的绝缘活性是由其5′端一段长约250bp包含有DNA酶I超敏位点(5′HS4)的CpG岛样结构(即所谓核心元件)决定的。其鸡珠蛋白绝缘子的序列根据Genebank中Gallusgallus beta-globin insulator sequence(基因号为U78775，参见网站为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ent-rez/querv.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝nucleot ide&list uids＝7981030&dopt＝GenBank&term＝chicken+insulator&qty＝1)的cDNA序列1-239bp作为绝缘子。将PDC315小鼠巨细胞病毒启动子、多克隆点及SV40 poly A的两侧各含有两个上述绝缘子的序列至上海捷倍思基因技术有限公司进行全长合成，序列如下：
Actagt(Spe I)GAGCTCACGGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTC
CCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGA
GCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTC
TCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGATACGGGGAAAAtctagtGAGCTCACGGGGACAGCC
CCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGG
GCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGG
GGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGG
GATACGGGGAAAA(Insulator×2)
(小鼠CMV启动子)GATATACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGT
CAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATT
GGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACA
TAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACC
ATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTA
ATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACC
GCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACTCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGT
ATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGATC(小
鼠CMV启动子)
(多克隆位点)GAATTCAAGCTGCTAGCAAGGATCCAGCTTGTCGACT(多克隆位点)
(SV40 poly A)TCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCAC
AAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATC
TTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAAGATCC(SV40 poly A)
(Insulator×2)GAGCTCACGGGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCT
CCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCG
AGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTT
CTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGATACGGGGAAAAtctagtGAGCTCACGGGGACAGC
CCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGG
GGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACG
GGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGG
GGATACGGGGAAAAtctaga(Xba I)
用Age I加Hind III将其插入pClon3的Age I加Hind III中，命名为鸡珠蛋白绝缘子的表达载体pSGEI，其多克隆位点分别EcoR I、Nhe I、BamH I和SalI。
将pClone2-SG-EGFR、pClone2-SG-CD20和pClone2-SG-anti HBV preS2质粒用EcoR I+Xba I双酶切插入pSGEI的EcoR I+Nhe I的酶切位点中，分别命名为pSGEI-SG-EGFR、pSGEI-SG-CD20及pSGEI-SG-anti HBV preS2。pClone2-SG-HER质粒用EcoR I+Xho I双酶切插入pSGEI的EcoR I+Sal I的酶切位点中，分别命名为pSGEI-SG-HER。
例2.分别携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因、抗人表皮生长因子受体(EGFR)的人的抗体SG-EGFR基因、抗人CD20的人嵌合抗体SG-CD20基因及抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗体SG-anti HBV preS2基因的空壳腺病毒载体的构建及重组
空壳腺病毒辅助病毒(FL Helper)及含有酵母重组酶FLPe的293(203-FLPe6)由美国Cedars-Sinai医学中心(Las Angeles CA 90048-1860)的Lowenstein PR教授惠赠(参见文献Umana P，Gerdes CA， Stone D，Davis JRE，Ward D，CastroMG，Lowenstein PR.Efficient FLPe recombinase enables scalable productionof helper-dependent adenoviral vectors with negligible helper-viruscontamination.Nature Biotechnology 2001 19 582-585)。
空壳腺病毒载体pSGG的构建，将下列序列上海捷倍思基因技术有限公司进行全长合成。
ACCGGT(Age I)TCGCCATTCAGGATCGAATTAATTCTTTAATTAA
(1nt)CATCATCAATAATATACCTTAITTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGG
TGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAG
TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGG
ATGTGGCAAAAGT
GACGTTTTTGGTGTGCGCCGG(191nt)
GAAGTTCCIATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC(FRT)
(192NT)TGIACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTIAGGCGGATGTTGTAGT
AAATTTGGGCGTAACCGAGIAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAG
AGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTIACTCAIAGCGCGTAATA(342NT)
CTGAATTCTCGAGACTAGTGGATCCGCGGCCGCATCTAGAGATCTGTCGAC
(35570nt)CACTCGACACGGCACCAGCTCAAICAGTCACAGTGTAAAAAAGGGCCAA
GTGCAGAGCGAGTATATTATAGGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTCCACAA
AAAACACCCAGAAAACCGCACGCGAACCTACGCCCAGAAACGAAAGCCAAAAAA
CCCACAACTTCCTCAAATCGTCACTTCCGTTTTCCCACGTTACGTAACTTCCCATT
TIAAGAAAACTACAATTCCCAACACATACAAGTTACTCCGCCCTAAAAC(35832nt)
E4Promotor
(35833nt)CTACGTCACCCGCCCCGTTCCCACGCCCCGCGCCACGTCACAAACTCCA
CCCCCTCATTATCATATTGGCTTCAATCCAAAATAAGGIATATTATT
GATGATG(3593
5nt)
TTAATTAACATGCAAGCTT(Hind III)
其序列由上海捷倍思基因技术有限公司进行全长合成，其结构见图1
将pSGEI-SG-EGFR、pSGEI-SG-HER、pSGEI-SG-CD20及pSGEI-SG-anti HBVpreS2。分别用Spe I+Xba I双酶切，分别获包含2×绝缘子、小鼠CMV启动子、抗体轻链、脑心肌炎病毒(EMCV)的多顺反子(IRES)、抗体重链、SV40-PolyA及2×绝缘子全长片段，分别正向插入pSGG的Xba I酶切位点，以后再重复插入3次，共4考贝，分别命名为pSGG-SG-EGFR、pSGG-SG-HER、pSGG-SG-CD20及pSGG-SG-anti HBV preS2。
将pSGG-SG-EGFR、pSGG-SG-HER、pSGG-SG-CD20及pSGG-SG-anti HBVpreS2通过Lipofectamine转染含有酵母重组酶FLPe的293(203-FLPe6)。转染后16小时后加入空壳腺病毒辅助病毒(FL Helper)，4天后获得分别携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因、抗人表皮生长因子受体(EGFR)的人的抗体SG-EGFR基因、抗人CD20的人嵌合抗体SG-CD20基因及抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗体SG-anti HBV preS2基因的重组空壳腺病毒，分另命名为Ad-SGG-EGFR、Ad-SGG-HER、Ad-SGG-CD20及Ad-SGG-anti-HBV preS2，分别记为SGG001、SGG002、SGG003及SGG004。
由上述方法构建的重组空壳腺病毒的列表如下：
重组空壳腺病毒 名称 空壳腺病毒载体 辅助腺病毒
Ad-SGG-EGFR SGG001 pSGG-SG-EGFR FL helper
Ad-SGG-HER SGG002 pSGG-SG-HER FL helper
Ad-SGG-CD20 SGG003 pSGG-SG-CD20 FL helper
Ad-SGG-anti-HBV preS2 SGG004 pSGG-anti-HBV preS2 FL helper
重组腺空壳腺病毒与空壳腺病毒辅助病毒(FL Helper)在293-F1Pe细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化重组腺空壳腺病毒(方法参见Gene Transfer and Expression Protocols，Murray EJ主编，Humana Press 1991出版-文献2)。
例3：携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组空壳腺病毒(SGG002)的体外及体内表达人源化抗体
正常细胞株肺成纤维细胞WI-38、正常细胞株肺成纤维细胞BJ及人表皮生长因子受体2(Her2)阳性的肿瘤细胞SK-Br-3购于美国ATCC公司，将上述细胞株按5×105细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO2培养，第二天换无血清液体1ml，然后，分别加入对照腺病毒Ad5-Lac Z或携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组空壳腺病毒SGG002。其病毒量为5×108VP/孔，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液3ml培养，分别在72小时收集上清，应用夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测其上清的表达量。结果可见重组空壳腺病毒SGG002体外感染的WI-38、BJ及SK-Br-3后，WI-38、BJ及SK-Br-3均分泌大量人源化抗体，而对照腺病毒Ad5-Lac Z则阴性。结果见图2。
其经SGG002体外感染的WI38及SK-Br-3分泌的人源化抗体与美国Genentech公司的Herceptin分别按10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml及0μg/ml加入人表皮生长因子受体2(Her2)阳性的乳腺癌细胞SK-Br-3，其杀伤作用相似，见图3。说明经SGG002体外感染的MAC-5及SK-Br-3分泌的人源化抗体与美国Genentech公司的Herceptin作用相同。
将对照腺病毒Ad5-Lac Z或携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组空壳腺病毒(SGG002)分别以5×1010Vp、1×1011VP及2×1011VP在尾静脉给予Balb/c裸鼠治疗，1周后的应用夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测其小鼠血清的表达量，结果可见应用携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组空壳腺病毒(SGG002)体内感染后，其小鼠血清有大量人源化抗体表达，其表达水平与给予的病毒剂量成正比，其体内人源化抗体的血清浓度高于文献中Herceptin的治疗浓度，而对照腺病毒Ad5-Lac Z则阴性。结果见图4。其小鼠血清应用羊抗人IgG进行蛋白质印迹分析(Western Blot)，其携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组空壳腺病毒(SGG002)治疗的小鼠血清中可见两条与Herceptin相同的杂交带，而对照腺病毒Ad5-Lac Z则无，见图5。
例4：携带抗人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组空壳腺病毒(SGG002)在裸鼠体内治疗移植乳腺癌肿瘤的治疗作用
进行了携带人表皮生长因子受体2(Her2)的人源化抗体SG-HER基因的重组腺病毒(SGG002)在裸鼠体内研究，治疗人表皮生长因子受体2(Her2)阳性的肿瘤细胞移植瘤。
乳腺癌细胞株BT-474购于美国ATCC公司，将4-5周龄的裸鼠皮下接种乳腺癌细胞株BT-474细胞1×107，八周后形成100mm3肿瘤，分为末治疗组、对照腺病毒(Ad-Lac Z)及治疗组(SGG002)，末治疗组不加任何治疗，对照腺病毒及治疗组在鼠尾静脉分别给予1×1011VP对照腺病毒Ad5-Lac Z或用相同剂量的治疗重组空壳腺病毒SGG002，其未治疗组及对照腺病毒治疗组4周后肿瘤体增加3倍以上，而治疗组则肿瘤增大不明显，部分完全消褪。
例5：携带抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗体SG-anti HBV preS2基因重组空壳腺病毒(SGG004)的体外及体内表达人嵌合抗体
正常肝细胞株L02购于中科院细胞库，将上述细胞株按5×105细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO2培养，第二天换无血清液体1ml，然后，分别加入对照腺病毒Ad5-Lac Z或携带人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗体SG-anti HBVpreS2基因重组空壳腺病毒(SGG004)。其病毒量为5×108VP/孔，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液3ml培养，分别在72小时收集上清，应用夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测其上清的表达量。结果可见重组空壳腺病毒SGG004体外感染的L02分泌420±35ng/ml/5×105嵌合抗体，而对照腺病毒Ad5-Lac Z则阴性。将其上清用Protein G柱子(Pharmacia公司)纯化，进行乙型肝炎病毒表面前S2抗原抗体亲和力的检测，以重组乙肝表面前S蛋白(中科院生化所汪垣惠赠)1ug/ml、0.4ug/ml、0.1ug/ml包被酶标反应板。参照Beaty测抗体亲和常数方法，设两种包被浓度为[Ag]和[Ag，]，[Ag]/[Ag，]＝n，以log[Ab]为横坐标每种抗体得出两条S型曲线，曲线的最高平台为A100，取A100的一半即A50所对应的抗体浓度分别为[Ab][Ab，]，则抗体亲和力常数为Kaff＝(n-1)/2(n[Ab，]-[Ab])，抗体分子量约为166Kd。根据相应抗原的浓度及A450值作出抗体亲和常数曲线如图6。根据抗体亲和力常数公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]-[Ab])计算出抗体亲和力常数为2.16±0.20×108L/mol(方法参见文献Bertty JD，Beatty BG andVlahos WG.Measurement of monoclal antibody affinity by non-competitive enzymeimmunoassay.I Immunol Methods 1983，100：173-179)。
将对照腺病毒Ad5-Lac Z或携带抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗体SG-anti HBV preS2基因重组空壳腺病毒(SGG004)分别以1×1011VP及5×1011VP在尾静脉给予Balb/c nu裸鼠治疗，1周后的应用夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测其裸鼠血清的表达量，结果可见应用携带抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗体SG-anti HBV preS2基因重组空壳腺病毒(SGG004)体内感染后，其小鼠血清有大量人源化抗体表达，其表达水平与给予的病毒剂量成正比，而对照腺病毒Ad5-Lac Z则阴性。结果见图7。其小鼠血清应用羊抗人IgG进行蛋白质印迹分析(Western Blot)，携带抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗体SG-anti HBV preS2基因重组空壳腺病毒(SGG004)治疗的小鼠血清中可见两条与人抗体相同的杂交带，而对照腺病毒Ad5-Lac Z则无，见图8。
Claims (19)
1.一种重组空壳腺病毒，其特征在于所述空壳腺病毒基因组中至少包含编码一种含有人恒定区全抗体的核苷酸序列，该含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可选自下述之一种：
1)人鼠嵌合抗体的核苷酸序列；
2)人源化抗体的核苷酸序列；
3)人抗体的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述空壳腺病毒基因组中含有人恒定区全抗体基因表达盒的上下游区至少含有一个绝椽子术语即insulater的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述绝椽子即insulater的核苷酸序列为鸡的β球蛋白的绝椽子的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码含有人恒定区全抗体的核苷酸序列为编码治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列为抗表皮生长因子受体1含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列为抗表皮生长因子受体2含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
7.根据权利要求4所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列为抗CD20含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
8.根据权利要求1所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码含有人恒定区全抗体的核苷酸序列为编码治疗微生物感染的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码治疗微生物感染的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列为治疗病毒含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码抗病毒的含有人恒定区的核苷酸序列为治疗乙肝病毒含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
11.根据权利要求1所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码含有人恒定区全抗体的核苷酸序列为编码治疗自身免疫性疾病的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码治疗自身免疫性疾病的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列为编码抗肿瘤坏死因子α含有人恒定区全抗体的核苷酸序列。
13.根据权利要求1所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述编码含有人恒定区全抗体的核苷酸序列是IgG或IgM。
14.根据权利要求1所述的重组空壳腺病毒，其特征在于编码的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列的表达受启动子控制，所述启动子可选自下述之一种：SV40启动子，RSV LTR启动子，人巨细胞病毒IE启动子，肿瘤细胞特异性激活的顺式作用元件，鼠巨细胞重组空壳腺病毒IE启动子，人腺病毒主要晚期表达启动子。
15.根据权利要求1所述的重组空壳腺病毒，其特征在于所述病毒为腺病毒，其中在控制所述含有人恒定区全抗体的启动子的转录起始位点与含有人恒定区全抗体的翻译起始位点之间可操作连接了内含子，所述启动子可选自下述之一种：含有腺病毒主要晚期mRNA的第三个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子，含有腺病毒主要晚期mRNA的第一个引导顺序的5’剪接位点和一个免疫球蛋白的3’剪接位点的杂合内含子。
16.根据权利要求1所述的重组空壳腺病毒，其特征在于编码治疗肿瘤的含有人恒定区全抗体的核苷酸序列可操作连接了编码分泌型信号肽的核苷酸序列。
17.根据权利要求16所述的重组空壳腺病毒，其特征在于该分泌型信号肽可以是下述中的一种：含有人恒定区全抗体自身信号肽，M-成瘤蛋白信号肽，肿瘤坏死因子α的信号肽。
18.根据权利要求1-17所述的重组空壳腺病毒的应用，是将该重组空壳腺病毒用于体外感染细胞，导致细胞表达含有人恒定区全抗体。
19.根据权利要求1-17所述的重组空壳腺病毒用于制备治疗哺乳类动物尤其是人类疾病的药物，该药物(1)重组空壳腺病毒感染体外或体内细胞，(2)在细胞内表达含有人恒定区全抗体。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2003101226967A CN1632109A (zh) | 2003-12-24 | 2003-12-24 | 高效表达含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒及其用途 |
| PCT/CN2004/001519 WO2005071084A1 (en) | 2003-12-24 | 2004-12-24 | Construction of gutted recombinant adenovirus effectively expressing antibodies comprising human constant region and uses thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2003101226967A CN1632109A (zh) | 2003-12-24 | 2003-12-24 | 高效表达含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1632109A true CN1632109A (zh) | 2005-06-29 |
Family
ID=34800338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2003101226967A Pending CN1632109A (zh) | 2003-12-24 | 2003-12-24 | 高效表达含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒及其用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1632109A (zh) |
| WO (1) | WO2005071084A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016192621A1 (zh) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 一种基于腺病毒载体表达全长西妥昔单抗治疗肿瘤的方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643579A (en) * | 1984-11-01 | 1997-07-01 | American Home Products Corporation | Oral vaccines |
| DE4339922C1 (de) * | 1993-09-03 | 1994-10-06 | Max Planck Gesellschaft | Vektor für Leber-Gentherapie |
| CN1177053C (zh) * | 2001-04-13 | 2004-11-24 | 上海华康生物技术有限公司 | 靶向性、高表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒及其制法和用途 |
| DE10294594D2 (de) * | 2001-10-04 | 2004-08-19 | Probiogen Ag | Adenovirales Vektorsystem |
| CN1348005A (zh) * | 2001-11-14 | 2002-05-08 | 中国人民解放军第四军医大学 | 重构、靶向半胱天冬酶基因的制备及其用途 |
-
2003
- 2003-12-24 CN CNA2003101226967A patent/CN1632109A/zh active Pending
-
2004
- 2004-12-24 WO PCT/CN2004/001519 patent/WO2005071084A1/zh not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016192621A1 (zh) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 一种基于腺病毒载体表达全长西妥昔单抗治疗肿瘤的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005071084A1 (en) | 2005-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1200737A (zh) | 用于人治疗的重组抗cd4抗体 | |
| CN1192796C (zh) | 联合应用抗血管生成和免疫治疗以治疗肿瘤和转移的方法 | |
| CN1317303C (zh) | 抗人腱生蛋白单克隆抗体 | |
| CN1077991A (zh) | 具有人属性的抗人白细胞介素-5的单克隆抗体的设计，克隆和表达 | |
| CN1439022A (zh) | 抗协同刺激信号转导分子ailim的人单克隆抗体及其药物用途 | |
| CN1235639A (zh) | 重新构建的人抗hm1.24抗体 | |
| CN101028519A (zh) | 治疗免疫性疾病的药用组合物 | |
| CN1087681A (zh) | 具有抗人体内病原菌感染的被动免疫力的新抗体 | |
| CN1183802A (zh) | 在植物中生产含有保护性蛋白质的免疫球蛋白的方法和应用 | |
| CN1606453A (zh) | Cripto阻断抗体及其用途 | |
| CN1961071A (zh) | 使用可选剪接在真核细胞中表达多肽多聚体的方法和构建物 | |
| CN1738646A (zh) | 可用来抵御并治疗hiv感染的去免疫化单克隆抗体 | |
| CN101074261A (zh) | Trail受体1和/或trail受体2特异性抗体及其应用 | |
| CN101037671A (zh) | 杂交瘤细胞株及其产生的抗人红细胞表面h抗原的单克隆抗体 | |
| CN1551783A (zh) | 治疗多发性骨髓瘤的方法 | |
| CN101058609A (zh) | 人源抗体及其表达 | |
| CN1531554A (zh) | 血纤维蛋白d-二聚体片段特异性的、来源于dd-3b6/22的人源化抗体 | |
| CN1803842A (zh) | 一种治疗或预防老年性痴呆的抗体及其表达载体和在制药中的应用 | |
| CN1798767A (zh) | 通过诱变来改变抗体对FcRn的结合亲和力或血清半衰期 | |
| CN1254487C (zh) | 抗免疫球蛋白等模式标本的重整形单克隆抗体 | |
| CN1703240A (zh) | LFA－1α亚基抗体及使用方法 | |
| CN1674779A (zh) | 利用逆转录病毒载体表达转基因鸟类中的基因的方法以及由此得到的转基因鸟类 | |
| CN1632109A (zh) | 高效表达含有人恒定区全抗体基因的重组空壳腺病毒及其用途 | |
| CN1193278A (zh) | 化合物 | |
| CN1542132A (zh) | 高效表达治疗肿瘤并含有人恒定区全抗体基因的重组病毒及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |