DE10244859A1 - Bioreaktor mit modularem Aufbau, insbesondere zur ex-vivo Zellvermehrung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Bioreaktor mit modularem Aufbau, welcher insbesondere zur ex-vivo Zellvermehrung Anwendung findet. DOLLAR A Der erfindungsgemäße Bioreaktor besitzt einen modularen Aufbau, wobei übereinander eine durchsichtige Temperierkammer, eine mit dieser in thermischem Kontakt stehende Zellkulturkammer und eine mit der Zellkulturkammer über eine Membran in stofflichem Kontakt stehende Nährlösungskammer angeordnet sind. In der Zellkulturkammer ist eine funktionalisierte Schicht mit biologischem Material über ein Inversmikroskop von unten beobachtbar angeordnet. DOLLAR A Bei dem erfindungsgemäßen Bioreaktor ist die Zellkultur während der Kulturlaufzeit beobachtbar, und er gewährleistet durch seine Konstruktion eine hohe Ausbeute an Zellen.

Description

• Die Erfindung betrifft einen Bioreaktor mit modularem Aufbau, welcher insbesondere zur ex-vivo Zellvermehrung Anwendung findet.
• Bioreaktoren nach dem Oberbegriff der Erfindung finden auf dem Gebiet der ex-vivo Zellvermehrung Anwendung.
• Dabei wird das biologische Material derart konditioniert, dass dieses unter optimalen Bedingungen wachsen kann.
• Der biomedizinische Gerätebau stellt für diese Aufgabe verschiedenste Bauarten von Bioreaktoren zur Verfügung.
• Im Stand der Technik sind Bioreaktoren bekannt, die einen zylinderförmigen Zellkulturraum aufweisen, der von Kapillarmembranbündeln durchzogen wird. Über die Kapillarmembran wird das System mit einer Nährlösung und einem Gasgemisch versorgt.
• Weiterhin sind Festbettbioreaktoren bekannt, bei denen in einem zylinderförmigen Gefäß auf einem Siebboden eine Schüttung makroporöser, beispielsweise collagenbeschichteter, Partikel gelagert ist. Diese Schüttung wird von einer Nährlösung durchströmt, die optimal temperiert ist und über eine Gasaustauscheinheit die physiologische Konzentration von Luft, Stickstoff, Sauerstoff und Kohlendioxid aufweist. Adherierende Zellen siedeln sich in den Poren und Zwischenräumen der Partikelschüttung an und wachsen schließlich unter optimalen äußeren Bedingungen.
• Auch ist nach der US 5,688,687 ein System zur ex-vivo Zellvermehrung bekannt, in welchem eine kreiszylindrische Zellkulturkammer verwendet wird, die kontinuierlich vom Medium durchströmt wird. Über eine Membran findet der Gasaustausch mit der Kulturkammer statt. Im Mediumstrom befindet sich eine behandelte Kunststoffplatte, auf deren Unterseite die Nährlösung im Mittelpunkt des Kreiszylinders radial in die Kulturkammer eintritt und an derem Umfang Austrittsöffnungen vorgesehen sind. Durch die Austrittsöffnungen fließt das zellhaltige Medium ab.
• Die Zellkulturkammer ist eingebunden in ein System mit weiteren peripheren Komponenten, die durch ihre Zusammenwirkung die optimalen Bedingungen für die Vermehrung von Zellen gewährleisten sollen. Die Kulturkammer ist derart dimensioniert, dass die Zellen zwischen dem Eintritt der Nährlösung in die Kulturkammer und dem Austritt der Nährlösung aus der Kulturkammer wachsen.
• Den im Stand der Technik bekannten Bauweisen von Bioreaktoren haften unterschiedlichste Nachteile an.
• Die Bioreaktoren mit Kapillarmembranbündeln haben den Nachteil, dass der Wirkungsgrad der Stoffübertragung von der Nährlösung in den Zellkulturraum sehr schnell abnimmt und die Zellen immer schlechter ernährt werden. Zudem kann die Konzentration der Zellen im Zellkulturraum nicht gemessen werden. Die Zellen siedeln sich verstärkt um die Kapillarmembran herum an und können nur schwierig und unvollständig entnommen werden, wodurch der Wirkungsgrad des Bioreaktors sehr ungünstig ist.
• Festbettreaktoren haben den Nachteil, dass zum einen nur adherente Zellen vermehrbar sind und zum anderen die Zellen nicht in einem abgeschlossenen Raum gehalten werden.
• Zellen, die nicht adherieren, werden aus dem System ausgeschwämmt und gehen somit der Zellausbeute verloren.
• Weiterhin sind die auf den Partikeln adherent gewordenen Zellen nur schwer und unvollständig aus dem Bioreaktor und der Partikelschüttung entnehmbar, was zu einer relativ geringen Zellausbeute beim Betrieb dieses Typs von Bioreaktor führt.
• Den angeführten Bioreaktoren und Systemen haftet der gemeinsame Nachteil an, dass die Zellkultur während des Wachstums nicht beobachtbar ist und dass das Ergebnis immer erst nach einer Betriebszeit bzw. Kulturlaufzeit erkennbar ist.
• Eine unmittelbare Einwirkung, beispielsweise über die Wachstumsbedingungen, durch Zusammensetzung der Nährlösung oder des Gasgehalts im Zellkulturraum ist damit nicht möglich.
• Aufgabe der Erfindung ist es, einen Bioreaktor zu schaffen, bei welchem die Zellkultur während der Kulturlaufzeit beobachtbar ist und der weiterhin eine hohe Ausbeute an Zellen gewährleistet.
• Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch einen Bioreaktor mit modularem Aufbau gelöst, wobei übereinander eine durchsichtige Temperierkammer, eine mit dieser in thermischem Kontakt stehende Zellkulturkammer und eine mit der Zellkulturkammer über eine Membran in stofflichem Kontakt stehende Nährlösungskammer angeordnet sind und dass in der Zellkulturkammer eine funktionalisierte Schicht mit biologischem Material über ein Inversmikroskop von unten beobachtbar angeordnet ist.
• Nach der Konzeption der Erfindung ist der Bioreaktor aus einzelnen Modulen aufgebaut. Der Temperierboden ist dabei erfindungswesentlich aus zwei durchsichtigen Begrenzungen aufgebaut, die einen Zwischenraum aufweisen, durch den das Temperiermedium gepumpt wird. Die obere Begrenzung der Temperierkammer begrenzt dabei gleichzeitig nach einer vorteilhaften Ausführungsform mit ihrer Oberseite den Zellkulturraum nach unten.
• Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die Temperierkammer von einer Bodenplatte und einer Deckelplatte gebildet, wobei die funktionalisierte Schicht zur Aufnahme und Vermehrung des biologischen Materials bzw. der Zellen direkt auf der Oberseite der Deckelplatte der Temperierkammer angeordnet ist und somit die untere Begrenzung der Zellkulturkammer darstellt.
• Dabei ist es erfindungsgemäß von Vorteil, wenn die Bodenplatte und die Deckelplatte aus Glas oder aus einem ähnlich transparenten Kunststoff ausgeführt werden.
• Dabei ist es weiterhin vorteilhaft, die Kammern horizontal durch parallele Begrenzungsflächen auszubilden; gleichfalls erfindungsgemäß möglich ist es, die Kammer aus verschiedenen Segmenten eines Zylinders auszubilden.
• Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die obere Begrenzung der Zellkulturkammer zur Nährlösungskammer von einer lichtdurchlässigen Flachmembran gebildet.
• Die Flachmembran wird entweder als Diffusionsmembran oder als Perfusionsmembran ausgebildet. Im Falle der Ausbildung der Flachmembran als Perfusionsmembran ist die Nährlösungskammer in einen Zuflussbereich für die Nährlösung und einen Abflussbereich der verbrauchten Nährlösung unterteilt.
• Als Flachmembranen werden erfindungsgemäß kernspurgeätzte Polyestermembranen oder hydrophile Polymermembranen, wie beispielsweise Polyethersulfon oder Acrylpolymer, eingesetzt.
• Nach einer weiteren Ausbildung der Erfindung wird der Zellkulturraum mit einer dreidimensionale Textilstruktur aus Polyethylenterephthalat (PET) ausgefüllt.
• Die Ausbildung der funktionalisierten Schicht wird nach einer weiteren Ausbildung der Erfindung als immobilisierte Schicht von Proteinen der extrazellulären Matrix, beispielsweise Collagen, erfolgen.
• Die Ausbildung der funktionalisierten Schicht durch Textilien bzw. durch Textilstrukturen ist insbesondere dadurch vorteilhaft, dass die Oberflächeneigenschaften für eine optimale Ansiedlung und Vermehrung von Zellen durch die gezielte Wahl der Textilien bzw. der Fasern in Verbindung mit den entsprechenden Textilstrukturen mit einer unterschiedlichen Maschenweite und Anordnung entsprechend der verschiedenen Oberflächenbeschichtungen gewählt werden können.
• Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen. Es zeigen:
• 1: Bioreaktor mit Diffusionsmembran und
• 2: Bioreaktor mit Perfusionsmembran.
• Ein erfindungsgemäßer Bioreaktor 1 ist folgendermaßen aufgebaut:
  In 1 ist ein rechteckiger Grundrahmen 9.1 aus Edelstahl dargestellt, der eine rechteckige, zentrisch angeordnete Aussparung aufweist. Diese Aussparung ist etwas kleiner als ein Objektträgerglas für die Lichtmikroskopie ausgebildet, so dass ein solches nach unten hin in dem Grundrahmen 9.1 Aufnahme findet. Durch die Aussparung im Grundrahmen 9.1 ist die Bodenplatte 8 der Temperierkammer 2 von unten sichtbar.
• Nach oben hin ist die Aussparung etwas größer als ein Objektträgerglas ausgeführt, so dass dieses vom Grundrahmen 9.1 aufgenommen werden kann.
• In den Ecken des Grundrahmens 9.1 sind vier Rundstäbe 10 aus Edelstahl in diesen eingeschraubt.
• Die Bodenplatte 8 der Temperierkammer 2 wird von oben in den Grundrahmen 9.1 eingelegt und besteht aus durchsichtigem Glas oder Polymer, vorzugsweise Polykarbonat, und weist zwei Bohrungen mit Anschlüssen an den diagonal gegenüberliegenden Ecken zum Ein- und Auslass des Temperiermediums auf.
• Das Temperiermedium besteht nach einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung aus einem Gemisch von 50 % Ethanol und 50 % Wasser.
• Die Bestandteile des Bioreaktors 1 sind aus sterilisierbaren Materialien und vorzugsweise aus autoklavierbaren Materialien, wie Edelstahl oder hitzebeständigen Kunststoffen ausgeführt.
• Mit einem Abstandshalter, welcher als 2 mm Rundring, der über einen rechteckigen Rahmen gespannt ist, ausgebildet wird, ist die Deckelplatte 5 der Temperierkammer 2 über der Bodenplatte 8 im Abstand des Abstandshalters von ca. 2 mm angeordnet.
• Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht die Deckelplatte 5 der Temperierkammer 2 aus einem Objektträgerglas, welches von dem Grundrahmen 9.1 aufgenommen wird. Diese bevorzugt als Objektträgerglas aufgebildete Deckelplatte 5 wird nach einer Ausgestaltung der Erfindung auf der Oberseite funktionalisiert und mit Protein, beispielsweise Collagen oder Fibronectin, beschichtet und bildet den Boden der Zellkulturkammer 3. Die Zellkulturkammer 3 wird seitlich durch ein Rahmenelement der Zellkulturkammer 9.2 aus Polyetheretherketon (PEEK) über einen Rundring aus Ethylen-Propylen-Dien-Kautschuk (EPDM) gedichtet aufgesetzt.
• Die seitliche Begrenzung der Zellkulturkammer 3, das Rahmenelement 9.2, weist dabei weiterhin eine geeigneten Zu- und Abführung für das Zellkulturmedium auf.
• Bevorzugt wird nach außen ein Luer-Konus zum Aufsetzen einer Spritze vorgesehen. In die Zu- und Abführung ist ein Eckventil eingebaut, dessen Kolben im geschlossenen Zustand mit der Innenwand bündig abschließt. Auf das Rahmenelement 9.2 der Zellkulturkammer 3 wird die Diffusionsmembran 7 über Rundringe gedichtet aufgelegt und begrenzt die Zellkulturkammer 3 nach oben.
• Es schließt sich, gedichtet wiederum über einen Rundring, das Rahmenelement 9.3 der Nährlösungskammer 4 mit Anschlüssen für den Zu- und Abfluss der Nährlösung an. Die Nährlösungskammer 4 wird nach oben durch eine Glasplatte 15 abgeschlossen, welche bevorzugt als Objektträgerglas ausgeführt ist.
• Die Rundstäbe 10 führen die Rahmenelemente 9.2 und 9.3. Um die Rahmenelemente 9.2 und 9.3 vertikal mit dem nötigen Dichtdruck zu beaufschlagen, befinden sich an den oberen Enden der Rundstäbe 10 Gewinde, in welche Druckschrauben 11 eingreifen, die über eine Druckplatte 12 die vertikalen Kräfte gleichmäßig auf die Rundringe in den verschiedenen Ebenen des modularen Bioreaktors 1 verteilen.
• Die Druckplatte 12 weist dabei erfindungsgemäß eine Ausnehmung auf, so dass Licht von oben über die Glasplatte 15 und die lichtdurchlässige Membran 7 auf die funktionalisierte Schicht 6 gelangt. Der Bioreaktor 1 wird auf dem Objekttisch eines Inversmikroskopes montiert, wobei er von oben beleuchtet wird und von unten in den Zellkulturraum 3 mit Long-Distance-Objektiven eingesehen wird. Hierdurch ist es möglich, die Zellkultur während der Wachstums- und Entwicklungsphase ständig zu beobachten.
• In 2 ist ein Bioreaktor in der Ausführung mit einer Perfusionsmembran dargestellt. Im Wesentlichen unterscheidet sich der Aufbau dieses erfindungsgemäßen Bioreaktors 1 durch die besondere Ausgestaltung der Nährlösungskammer 4 und der Zellkulturkammer 3 im Vergleich zur Ausführung nach 1.
• Das Rahmenelement der Nährlösungskammer 9.3 weist dabei einen Mittelsteg 16 auf, welcher die Nährlösungskammer 4 in einem Zuflussbereich 13 und einem Abflussbereich 14 für die Nährlösung trennt.
• Die Zellkulturkammer 3 weist unter dem Mittelsteg 16 des Rahmenelementes 9.3 der Nährlösungskammer 4 eine Dichtleiste 17 auf.
• Die Nährlösung durchströmt dann beim Betrieb des Bioreaktors 1 zunächst den Zuflussbereich 13, gelangt über die Perfusionsmembran 7 in die Zellkulturkammer 3 und aus der Zellkulturkammer 3 wiederum über die Perfusionsmembran 7 in den Abflussbereich 14. Durch die entsprechenden Anschlüsse für den Zu- und Abfluss im Rahmenelement 9.3 der Nährlösungskammer 4 strömt die Nährlösung dem System zu und ab.
• Als Perfusionsmembran 7 dient nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung eine kernspurgeätzte Polyestermembran mit einer Porenweite von ein bis zwei Mikrometern oder eine hydrophile Polymermembran mit einer Porenweite von 0,8 bis 1,2 Mikrometern, beispielsweise aus Polyethersulfon.
• Von besonderem Vorteil dieser Konstruktion ist, dass die Zellkulturkammer mit der funktionalisierten Schicht 6 während der gesamten Zeit des Wachstums der Zellen beobachtbar ist. Dabei wird als Beobachtungsebene im Mikroskop die funktionalisierte Schicht 6 über ein Inversmikroskop von unten beobachtet und durch den Bioreaktor hindurch beleuchtet. Durch die konzeptionelle Ausgestaltung des Bioreaktors 1 auf Lichtdurchlässigkeit von oben und Beobachtbarkeit von unten kann das Wachstum der Zellkultur jederzeit überwacht werden.
• Als funktionalisierte Schichten 6 finden insbesondere immobilisierte Proteine, wie zum Beispiel Collagen, Anwendung.
• Weiterhin vorteilhaft ausgebildet wird die Erfindung dadurch, dass als Träger der funktionalisierte Schicht 6 eine textile dreidimensionale Struktur in der Zellkulturkammer 3 angeordnet wird.
• Die Zellkulturkammer 3 ist erfindungsgemäß durch das Rahmenelement 9.2 der Zellkulturkammer 3 während des Betriebes und die Membran 7 sowie die Deckelplatte 5 der Temperierkammer 2 für Partikel, die größer als die Porenweite der verwendeten Membranen 7 sind, ein geschlossenes System, so dass gewachsene Zellen oder anderes biologisches Material nicht aus dem System gelangen können.

1

Bioreaktor

2

Temperierkammer

3

Zellkulturkammer

4

Nährlösungskammer

5

Deckelplatte der Temperierkammer

6

funktionalisierte Schicht

7

Flachmembran

8

Bodenplatte

9.1

Grundrahmen

9.2

Rahmenelement Zellkulturkammer

9.3

Rahmenelement Nährlösungskammer

10

Rundstäbe

11

Druckschrauben

12

Druckplatte

13

Zuflussbereich

14

Abflussbereich

15

Glasplatte

16

Mittelsteg

17

Dichtleiste

Claims (11)

1. Bioreaktor (1) mit modularem Aufbau, insbesondere zur ex-vivo Zellvermehrung, wobei übereinander eine durchsichtige Temperierkammer (2), eine mit dieser in thermischem Kontakt stehende Zellkulturkammer (3) und eine mit der Zellkulturkammer (3) über eine Membran in stofflichem Kontakt stehende Nährlösungskammer (4) angeordnet sind und dass in der Zellkulturkammer (3) eine funktionalisierte Schicht (6) mit biologischem Material über ein Inversmikroskop von unten beobachtbar angeordnet ist.
2. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperierkammer (2) von einer Bodenplatte (8) und einer Deckelplatte (5) gebildet wird, wobei die funktionalisierte Schicht (6) direkt auf der Oberseite der Deckelplatte (5) angeordnet ist und somit die untere Begrenzung der Zellkulturkammer (3) darstellt.
3. Bioreaktor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenplatte (8) und die Deckelplatte (5) aus Glas ausgeführt werden.
4. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die obere Begrenzung der Zellkulturkammer (3) zur Nährlösungskammer (4) von einer lichtdurchlässigen Flachmembran (7) gebildet wird und dass die obere Begrenzung der Nährlösungskammer (4) von einer lichtdurchlässigen Begrenzung derart ausgebildet wird, dass Licht von oben durch die Nährlösungskammer (4) bis zur funktionaliserten Schicht (6) der Zellkulturkammer einfallen kann.
5. Bioreaktor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Flachmembran (7) als Diffusionsmembran ausgebildet ist.
6. Bioreaktor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Flachmembran (7) als Perfusionsmembran ausgebildet ist und dass weiterhin die Nährlösungskammer (4) in einen Zuflussbereich (13) und einen den Abflussbereich (14) der Nährlösung unterteilt ist.
7. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Flachmembran (7) als kernspurgeätzte Membran oder als hydrophile Polymermembran ausgeführt ist.
8. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierte Schicht (6) auf eine dreidimensionale Textilstruktur aufgebracht ist und diese sich im Zellkulturraum befindet.
9. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufbau aus einer Rahmenkonstruktion besteht, welche im Wesentlichen aus einem Grundrahmen (9.1) zur Aufnahme der Temperierkammer (2), dem Rahmenelement (9.2) der Zellkulturkammer (3) und dem Rahmenelement (9.3) der Nährlösungskammer (4) besteht, welche die seitlichen Begrenzungen der Kammern (2, 3, 4) bilden und aus einem autoklavierbarem Material ausgeführt sind und dass zwischen den Bestandteilen der Rahmenkostruktion und den Membranen (7) und den Platten (5, 8) autoklavierbare Rundringe dichtend angeordnet sind.
10. Bioreaktor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Rahmenelemente (9.2, 9.3) durch Rundstäbe (10) geführt werden und mittels Druckschrauben (11) und Druckplatte (12) dichtend miteinander verbindbar ausgeführt sind.
11. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor auf dem Objektträgertisch eines Inversmikroskopes montierbar ausgebildet ist und dass der Schärfebereich von Long-Distance-Objektiven in den Zellkulturraum hineinreicht.