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DE10241938A1 - Verfahren zur Selektion von Nukleinsäureliganden - Google Patents

Verfahren zur Selektion von Nukleinsäureliganden Download PDF

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DE10241938A1
DE10241938A1 DE2002141938 DE10241938A DE10241938A1 DE 10241938 A1 DE10241938 A1 DE 10241938A1 DE 2002141938 DE2002141938 DE 2002141938 DE 10241938 A DE10241938 A DE 10241938A DE 10241938 A1 DE10241938 A1 DE 10241938A1
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Germany
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target molecule
nucleic acid
mixture
candidate
binding
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Ceased
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DE2002141938
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English (en)
Inventor
Dirk Dr. Eulberg
Sven Dr. Klussmann
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TME Pharma AG
Original Assignee
Noxxon Pharma AG
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Publication date
Application filed by Noxxon Pharma AG filed Critical Noxxon Pharma AG
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Priority to PCT/EP2003/010053 priority patent/WO2004024950A1/de
Priority to AU2003271598A priority patent/AU2003271598A1/en
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäureliganden an ein Zielmolekül binden können, umfassend die Schritte DOLLAR A a) Kontaktieren der Mischung mit dem immobilisierten Zielmolekül, DOLLAR A b) Abtrennen der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung, wobei die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) in einem Komplex mit dem Zielmolekül vorliegen, DOLLAR A c) Elution der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül und DOLLAR A d) optional Amplifizieren der mit höherer Affinität bindenden Nukleinsäure(n), wodurch ein angereichertes Nukleinsäureprodukt entsteht, DOLLAR A wobei das Zielmolekül an einer Oberfläche immobilisiert vorliegt und das Verfahren einen Ultrafiltrationsschritt umfasst.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden, die an ein Zielmolekül binden, die Verwendung von Filtersäulen in einem derartigen Verfahren sowie eine Vakuumkammer zur Verwendung in einem derartigen Verfahren.
  • Das Verständnis von der Bedeutung von Nukleinsäuren hat sich in den vergangenen Jahren grundlegend weiterentwickelt. Ging man zu Beginn der molekularbiologischen Forschung von Nukleinsäuren als Träger der genetischen Information einer Zelle aus, wurde schon bald verschiedenen Nukleinsäuremolekülen auch eine strukturelle Funktion zuerkannt. Dass dabei Nukleinsäuren grundsätzlich die Fähigkeit besitzen, mit anderen Molekülen spezifisch in Wechselwirkung zu treten, war in dem Umfang gesicherte Erkenntnis, als dass es nukleinsäurebindende Proteine des Transkriptions- und Translationskomplexes gab.
  • Die grundsätzliche Eignung von Nukleinsäuren, an ein jegliches Zielmolekül zu binden, wwde in der internationalen Patentanmeldung WO 91/19813 vom 10. Juni 1991 offenbart. Dort wird ein Verfahren zur Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäwen beschrieben. Unter Zugrundelegung der in WO 91/19813 dargelegten Überlegungen geht man davon aus, dass in einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren, d. h. einer Bibliothek von Nukleinsäuren, die sich in ihrer Primärsequenz und damit auch in ihrer Sekundär- und Tertiärstruktur, zumindest teilweise, unterscheiden, ein Nukleinsäureligand, d. h. eine an das Zielmolekül bindende Nukleinsäure enthalten sein wird, wenn die Bibliothek nur groß genug ist, um einen geeignet großen Raum von verschiedene Bindungstaschen ausbildenden Nukleinsäuren, die für die Bindung eines bestimmten Zielmoleküls erforderlich sind, abzudecken.
  • In der jüngsten Vergangenheit wurde unter Anwendung dieses in WO 91/19813 beschriebenen und auch als SELEX-Technologie bezeichneten Verfahrens eine Vielzahl von Nukleinsäureliganden identifiziert, die auch als Aptamere bezeichnet werden.
  • Weiterentwicklungen bzw. Anwendungen dieses Verfahrens sind Gegenstand weiterer Schutzrechtsanmeldungen, so z. B. die Herstellung von sogenannten Spiegelmeren, die unter anderem in der internationalen Patentanmeldung WO 98/08856 beschrieben sind. Spiegelmere werden dadurch erzeugt, dass Nukleinsäureliganden, die aus D-Nukleotiden bestehen, gegen das Enantiomer des eigentlichen Zielmoleküls, das typischerweise in der Natur als solches nicht vorkommt, unter Anwendung der SELEX-Technologie selektiert werden und nach Erhalt eines oder mehrerer entsprechender Nukleinsäureliganden dieser) unter Verwendung von L-Nukleotiden und nicht mehr von D-Nukleotiden, wie im Rahmen des eigentlichen Selektionsprozesses verwendet, synthetisiert werden mit der Folge, dass der oder die aus L-Nukleotiden bestehende(n) Nukleinsäureligand(en) an das eigentliche Zielmolekül und nicht mehr an das Enantiomer des Zielmoleküls bindet. Der Vorteil derartiger Spiegelmere ist darin zu sehen, dass infolge ihres Aufbaus aus L-Nukleotiden in biologischen Systemen sich keine enzymatische Aktivität findet, die diese Art von Nukleinsäure abzubauen in der Lage wäre.
  • Obwohl die Erzeugung entsprechender Nukleinsäureliganden nach wie vor mit experimentell zum Teil erheblichen Schwierigkeiten verbunden ist und insoweit die Vorhersagbarkeit, ob ein geeigneter Nukleinsäureligand tatsächlich isoliert werden kann, immer noch eine Frage des glücklichen Griffs zu sein scheint, ist das Verfahren zur Herstellung derartiger Nukleinsäureliganden grundsätzlich, zumindest in Teilbereichen, der Automatisierung zugänglich. Dies liegt darin begründet, dass in den verschiedenen Selektionsrunden, die gemeinhin erforderlich werden, um einen mit einer ausreichend hohen Affinität an ein Zielmolekül bindenden Nukleinsäureliganden zu isolieren, eine Anzahl von Schritten durchgeführt werden muss, die als solche der Automatisierung grundsätzlich zugänglich zu sein scheinen und in ihrer Gesamtheit in den verschiedenen Selektionsrunden wiederholt werden müssen.
  • Das Verfahren zur Selektion von Nukleinsäureliganden, die an ein spezielles Zielmolekül, das hierin auch als Target bezeichnet wird, binden, kann in verschiedenster Art und Weise ausgeprägt sein. Die verschiedenen Ausprägungen des Verfahrens liegen darin begründet, dass die Nukleinsäureliganden grundsätzlich entweder als doppelsträngige oder einzelsträngige Nukleinsäuren und genauer als einzel- oder doppelsträngige RNA oder einzeloder doppelsträngige DNA isoliert werden können. Von diesen Varianten ist die einzelsträngige RNA und die einzelsträngige DNA in der Regel bevorzugt. Weitere Varianten in der Ausführung des Verfahrens können begründet werden durch die Art des Zielmoleküls und insbesondere dessen Handhabung im Rahmen des Verfahrens zur Selektion von Nukleinsäureliganden. Dabei ist hinsichtlich der grundsätzlichen Verfahrensschritte allen Ausführungsformen des besagten Verfahrens gemein, dass man ausgehend von einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren diese mit dem Zielmolekül kontaktiert, die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren vom Rest der Kandidatenmischung abtrennt und die solchermaßen erhaltenen abgetrennten, mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäureliganden amplifiziert. Die Abtrennung der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren vom Rest der Kandidatenmischung erfolgt dabei typischerweise in der Form, dass der Komplex aus Zielmolekül und Nukleinsäureligand vom Rest der Kandidatenmischung abgetrennt wird. In einem nächsten Schritt wird die an das Zielmolekül bindende oder bindenden Nukleinsäureligand(en) aus dem Komplex gelöst und anschließend mittels molekularbiologischer Technik amplifiziert. Dabei wird im Falle der Erzeugung von Ribonukleinsäuren diese zuerst in eine Desoxyribonukleinsäure umgeschrieben und sodann die solchermaßen erhaltene Desoxyribonukleinsäure amplifiziert, wobei bevorzugterweise hierzu die Polymerase-Kettenreaktion verwendet wird. Diese Desoxyribonukleinsäure wird sodann wiederum in Ribonukleinsäure transkribiert. Die solchermaßen erhaltene Ribonukleinsäure kann in einer weiteren Selektionsrunde eingesetzt werden. Es ist dabei offensichtlich, dass der Anteil der an ein Zielmolekül spezifisch bindenden Nukleinsäureliganden an der Gesamtmischung sich mit jedem Durchgang des Verfahrens erhöht. Insoweit liefert jede Selektionsrunde ein hinsichtlich einer oder mehrerer Nukleinsäureliganden-Spezies angereichertes Nukleinsäure-Produkt. Aus dieser Mischung können sodann einzelne Nukleinsäuren vereinzelt, in ihrer Sequenz bestimmt und anschließend in größerem Maßstab chemisch synthetisiert oder unter Anwendung sonstiger geeigneter Techniken hergestellt werden.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, das SELEX-Verfahren so weiterzuentwickeln, dass infolge der immer wieder gleichen ablaufenden Verfahrensschritte dieses in automatisierter Form, d. h. unter Verwendung eines Roboters, bevorzugterweise eines computergesteuerten Roboters, durchgeführt werden kann.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zur Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäureliganden an ein Zielmolekül binden können, umfassend die Schritte
    • a) Kontaktieren der Mischung mit dem immobilisierten Zielmolekül,
    • b) Abtrennen der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung, wobei die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) in einem Komplex mit dem Zielmolekül vorliegen,
    • c) Elution der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül; und
    • d) optional Amplifizieren der mit höherer Affinität bindenden Nukleinsäure(n), wodurch ein angereichertes Nukleinsäureprodukt entsteht, wobei das Zielmolekül an einer Oberfläche immobilisiert vorliegt und das Verfahren einen Ultrafiltrationsschritt umfasst.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem zweiten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zur Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäureliganden an ein Zielmolekül binden können, umfassend die Schritte
    • a) Kontaktieren der Mischung mit dem Zielmolekül,
    • b) Immobilisieren des Zielmoleküls und/oder der Komplexe aus Zielmolekül und Kandidatennukleinsäure(n),
    • c) Abtrennen der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung, wobei die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) in einem Komplex mit dem Zielmolekül vorliegen,
    • d) Elution der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül, und
    • e) optional Amplifizieren der mit höherer Affinität bindenden Nukleinsäure(n), wodurch ein angereichertes Nukleinsäureprodukt entsteht, wobei das Zielmolekül an einer Oberfläche immobilisiert vorliegt und das Verfahren einen Ultrafiltrationsschritt umfasst.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass der Ultrafiltrationsschritt während oder nach der Elution erfolgt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass der Ultrafiltrationsschritt während oder nach der Amplifikation erfolgt.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem dritten Aspekte gelöst durch ein Verfahren zur Selektion eines oder mehrer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidatennukleinsäuren, wobei die Nukleinsäureliganden an ein Zielmolekül binden können, umfassend die Schritte
    • a) Kontaktieren der Mischung mit dem Zielmolekül, wobei
    • aa) das Zielmolekül immobilisiert ist, oder
    • ab) nach dem Kontaktieren der Mischung mit dem Zielmolekül das Zielmolekül und/oder Komplexe aus Zielmolekül und Kandidatennukleinsäure(n) immobilisiert werden,
    • b) Abtrennen der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung, wobei die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) in einem Komplex mit dem Zielmolekül vorliegen,
    • c) Elution der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül, und
    • d) optional Amplifizieren der mit höherer Affinität bindenden Nukleinsäure(n), wodurch ein angereichertes Nukleinsäureprodukt entsteht, wobei das Zielmolekül an einer Oberfläche immobilisiert vorliegt und das Abtrennen gemäß Schritt b) mittels einer Filtration, bevorzugterweise eine Mikrofiltration, erfolgt, wobei eine Vakuumkammer verwendet wird, umfassend ein Bodenteil (10) und ein Deckelteil (11), wobei das Bodenteil (10) und das Deckelteil (11) bevorzugterweise durch eine Dichtung voneinander getrennt sind, und das Deckelteil (11) mindestens eine vollständige durch das Deckelteil sich erstreckende Bohrung (13, 14) aufweist, wobei die Bohrung eine Mindestlänge aufweist, so dass beim Filtrationsschritt eine Kontamination zwischen zwei nebeneinander erfolgenden Filtrationen nicht auftritt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass es sich dabei um ein erfindungsgemäßes Verfahren handelt, insbesondere um ein solches gemäß dem ersten und/oder zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass das Abtrennen in Schritt b) mittels Mikrofiltration erfolgt.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass das Verfahren ein automatisiertes Verfahren ist.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass die Ultrafiltration an einer Ultrafiltrationsmembran mit einer molekularen Ausschlussgröße von etwa 1.000 bis 100.000, bevorzugterweise etwa 10.000 bis 50.000 Da erfolgt.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass die Mikrofiltration an einer Mikrofiltrationsmembran oder Fritte erfolgt mit einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 0,1 bis 100 μm, bevorzugterweise etwa 1 bis 35 μm und bevorzugtesterweise etwa 10 μm.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass die Oberfläche bereitgestellt wird durch Partikel, wobei bevorzugterweise die Partikel ausgewählt sind aus der Gruppe, die magnetische und nicht-magnetische Partikel umfasst.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass die Elution durch Verwenden von Wasser, denaturierenden Agenzien, durch Erhitzen des Reaktionsgemisches oder durch Verwendung von Kompetitoren erfolgt.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass das denaturierende Agens ausgewählt ist aus der Gruppe, die Harnstoff, EDTA, Guanidinium-HCL, Guanidinium-Isothiocyanat, Detergenz, Kombinationen von Harnstoff und EDTA umfasst.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass der Kompetitor ein Peptid oder ein Fragment des Zielmoleküls ist.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass der Ultrafilter und/oder der Mikrofilter in einer Filtersäule enthalten ist, wobei die Filtersäule aus einem Aufnahmestück und einem Auslassstück besteht, die beide durch ein konisches Zwischenstück miteinander verbunden sind und der Ultrafilter oder der Mikrofilter am Übergang zwischen dem konischen Zwischenstück und dem Auslassstück angeordnet ist.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass die Filtersäule in einer Vorrichtung gehalten wird bestehend aus einem Bodenteil und einem Deckelteil, wobei der Deckelteil ein oder mehrere Mittel zur Aufnahme der Filtersäule aufweist.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, dass das Mittel zur Aufnahme der Filtersäule eine Bohrung ist, wobei die Bohrung eine Mindestlänge aufweist.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem vierten Aspekt gelöst durch die Verwendung einer Filtersäule in einem Verfahren zur Selektion von Nukleinsäureliganden, wobei die Fritte ein erstes Aufnahmestück (1) umfasst, das in ein konisches Zwischenstück (2) übergeht und das konische Zwischenstück wiederum in ein Auslassstück (3) übergeht, wobei am Übergang zwischen dem Zwischenstück (2) und dem Auslassstück (3) ein Filter angebracht ist.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist vorgesehen, dass die Filtersäule in einem der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Filter ein Mikrofilter oder ein Ultrafilter ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Aufnahmestück (1) ein Befestigungsmittel aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Befestigungsmittel an dem entgegengesetzten Ende des Aufnahmestückes (1) angebracht ist, wo dieses in das konische Zwischenstück (2) übergeht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Filtersäule an der Außenwand, bevorzugterweise an der Außenwand des Aufnahmestückes, ein Verbreiterungsmittel aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Verbreiterungsmittel ausgebildet ist als ein an der Außenwand angebrachter Ring, wobei der Ring bevorzugterweise senkrecht zur Längsachse des Aufnahmestückes (1) und/oder des Auslassstückes (3) angeordnet ist.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem fünften Aspekt gelöst dwch eine Vakuumkammer zur Verwendung in einem Verfahren zur Selektion von Nukleinsäureliganden, umfassend ein Bodenteil (10) und ein Deckelteil (11), wobei das Deckelteil (11) mindestens eine vollständig durch das Deckelteil sich erstreckende Bohrung (12) aufweist, wobei die Bohrung eine Mindestlänge aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Vakuumkammer in einem der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem sechsten Aspekt gelöst durch eine Vakuumkammer zur Verwendung in einem Verfahren zur Selektion von Nukleinsäureliganden, umfassend ein Bodenteil (10) und ein Deckelteil (11), wobei das Deckelteil (11) mindestens zwei vollständig durch das Deckelteil sich erstreckende Bohrungen (12) aufweist, wobei die Bohrungen eine Mindestlänge aufweist, die gewährleistet, dass es zu keiner Kontamination des Filtrationsvorganges und/oder zu filtrierenden Lösung durch ein Filtrat der zweiten Filtration kommt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Vakuumkammer in einem der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vakuumkammer ist vorgesehen, dass diese eine erfindungsgemäße Filtersäule bzw. eine Filtersäule, wie sie hierin erfindungsgemäß verwendet wird, umfasst.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem siebten Aspekt gelöst durch eine Vorrichtung mit einer Ablaufsteuereinheit zum Steuern eines Aufnehmers für einen flüssigen und/oder festen Stoff, wobei der Aufnehmer geeignet ist, eine Abfolge umfassend ein Aufnehmen des Stoffes, ein Transportieren des Stoffes und ein Abgeben des Stoffes in einen Behälter durchzuführen, wobei der Aufnehmer so gesteuert ist,
    um in dem Behälter eine Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren mit einem Zielmolekül zu kontaktieren, an das die Nukleinsäureliganden binden können, und
    um die kontaktierte Kandidatenmischung in eine Trennvorrichtung zu transportieren, in der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung abtrennbar sind,
    um die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül zu eluieren, und
    um optional eine Amplifikation der mit höherer Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) durchzuführen, wobei während oder nach der Elution ein Ultrafiltrationsschritt durchgeführt wird.
  • In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass während oder nach der Amplifikation ein Ultrafiltrationsschritt durchgeführt wird.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem achten Aspekt gelöst durch eine Vorrichtung mit einer Ablaufsteuereinheit zum Steuern eines Aufnehmers für flüssige und/oder feste Stoffe, wobei der Aufnehmer geeignet ist, eine Abfolge von Aufnehmen des Stoffes, Transportieren des Stoffes und Abgeben des Stoffes in einen Behälter durchzuführen, wobei der Aufnehmer so gesteuert ist, um eines der erfindungsgemäßen Verfahren durch mehrfache Abfolgen durchzuführen.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem neunten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zum Steuern eines Aufnehmers zur Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden, wobei der Aufnehmer geeignet ist, eine Abfolge umfassend ein Aufnehmen eines flüssigen und/oder festen Stoffes, ein Transportieren des Stoffes und ein Abgeben des Stoffes in einen Behälter durchzuführen, wobei der Aufnehmer so gesteuert wird,
    um in dem Behälter eine Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren mit einem Zielmolekül zu kontaktieren, an das die Nukleinsäureliganden binden können,
    um die kontaktierte Kandidatenmischung in eine Trennvorrichtung zu transportieren, in der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung abtrennbar sind,
    um eine Elution der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül durchzuführen,
    um optional eine Amplifikation der mit höherer Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) durchzuführen, und
    um eine Ultrafiltration während oder nach der Elution und/oder während oder nach der Amplifikation durchzuführen.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem zehnten Aspekt gelöst durch eine Verwendung einer Vorrichtung mit einer Ablaufsteuereinheit zum Steuern eines Aufnehmers für einen flüssigen und/oder festen Stoff, wobei der Aufnehmer geeignet ist, eine Abfolge umfassend ein Aufnehmen des Stoffes, ein Transportieren des Stoffes und ein Abgeben des Stoffes in einen Behälter durchzuführen, für die Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren, insbesondere für eines der erfindungsgemäßen Verfahren.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass mit der Ultrafiltration ein leistungsfähiges Verfahren zur Verfügung steht, um niedermolekulare Verbindungen, wie beispielsweise Salze, EDTA, Puffer, NTPs, dNTPs, Peptide, DTT, Harnstoff, Detergenzien und dergleichen, wie sie im Rahmen des SELEX-Verfahrens in den verschiedenen Teilschritten verwendet werden, aus dem jeweiligen Reaktionsansatz zu entfernen, und durch die Ultrafiltration die Voraussetzung geschaffen wird, das SELEX-Verfahren der Automatisierung zugänglich zu machen bei gleichzeitiger uneingeschränkter Möglichkeit, die jeweils optimalen, hauptsächlich durch niedermolekulare Verbindungen vermittelten Reaktionsbedingungen zu realisieren. Die Ultrafiltration stellt somit hinsichtlich der Ausgestaltung der Verfahrensführung des SELEX-Verfahrens insbesondere in seiner automatisierten Ausführungsform neue Freiheitsgrade zw Verfügung, die mit den im Stand der Technik verwendeten Aufreinigungsverfahren, die insbesondere bei der manuellen Ausführung des SELEX-Verfahrens verwendet werden, wie beispielsweise Ethanol- bzw. Isopropanolfällungen, organische Extraktionen unter Verwendung von Phenol- und Chloroformextraktion sowie Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließender Elution aus dem Gel und Ethanolpräzipitation, praktisch nicht erreichbar sind.
  • Mit dem Bereitstellen eines Aufreinigungsschrittes in Form einer Ultrafiltration bieten die erfindungsgemäßen Ausführungsformen des SELEX-Verfahrens gegenüber den im Stand der Technik bekannten automatisierten SELEX-Prozesse, wie sie beispielsweise von Cox et al. (Cox et al. 1998, Biotechnol. Prog. 14 : 845 bis 850 oder von Cox & Ellington, 2000, Bioorg. Med. Chem. 9: 2525 bis 2531) beschrieben sind, eine ganze Reihe von Vorteilen. Zwar wird mit den im Stand der Technik bekannten automatisierten SELEX-Prozessen eine schnelle Durchführung des SELEX-Verfahrens möglich, jedoch wird die Automatisierung auf Kosten eines kontrollierten Einstellens der Reaktionsbedingungen realisiert, da bei diesen im Stand der Technik beschriebenen automatisierten SELEX-Prozessen auf eine Aufreinigung der im Rahmen der verschiedenen Teilschritte verwendeten Reaktionsansätze verzichtet wird. Das Einstellen von entsprechenden Reaktionsbedingungen für die verschiedenen Teilschritte des SELEX-Verfahrens ist jedoch besonders dann erforderlich, wenn das Selektionsergebnis solche an das jeweilige Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren zu Tage fördern soll, die unter spezifischen Bedingungen, wie beispielsweise physiologischen Bedingungen, eingesetzt werden sollen. Mit anderen Worten, die im Stand der Technik beschriebenen automatisierten Prozesse für das SELEX-Verfahren erlauben nicht oder zumindest nur in sehr beschränktem Masse die Selektion von unter physiologischen Bedingungen einsetzbaren Aptameren und damit letztlich nicht die Erzeugung von therapeutisch anwendbaren Aptameren. Gleichwohl wird anerkannt werden müssen, dass sie jedoch zumindest in bestimmtem Umfang geeignet sind, diagnostisch verwendbare Aptamere bereitzustellen, wobei die Reaktionsbedingungen, unter denen diese verwendet werden, im Wesentlichen jenen entsprechen, wie sie für die Selektion verwendet wurden. Dies stellt eine ganz erhebliche Einschränkung hinsichtlich des Anwendungsspektrums der solchermaßen erzeugten, an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren dar, die insbesondere bei deren therapeutischen Anwendung und bei Durchführung von an physiologischen Reaktionsbedingungen orientierten Nachweistests eine erhebliche Beschränkung darstellen kann.
  • Grundsätzlich ist die Verwendung eines Ultrafiltrationsschrittes nach einem jeden Teilschritt des SELEX-Verfahrens durchführbar, insbesondere dann, wenn es gilt, die Reaktionsparameter zu ändern, wobei es sich bei den Reaktionsparametern bevorzugterweise um die Zusammensetzung des jeweiligen Reaktionsansatzes, und dabei insbesondere die Beeinflussung des Reaktionsansatzes hinsichtlich der Art und des Umfanges der darin enthaltenen niedermolekularen Stoffe oder Verbindungen, wie oben genannt, handelt. Bevorzugterweise erfolgt ein Ultrafiltrationsschritt im Falle der Elution der an das Zielmolekül gebundenen Nukleinsäuren. Weiterhin ist bevorzugt, dass in Ergänzung oder alternativ zu der Verwendung der Ultrafiltration im Anschluss an den Elutionsschritt diese nach der Amplifikation durchgeführt wird, auch hier mit dem Ziel, die geeigneten Reaktionsbedingungen für den der Amplifikation nachfolgenden Reaktionsschritt bereitzustellen. In einem jeden Fall wird die im Reaktionsansatz vorhandene Nukleinsäure durch den Ultrafilter zurückgehalten, während die niedermolekularen Komponenten, d.h. die niedermolekularen Verbindungen, des Reaktionsansatzes aus diesem entfernt werden. Die Nukleinsäuren können dann von der Oberfläche des Ultrafilters beispielsweise durch Zugabe einer wässrigen Lösung wieder entfernt bzw. abgelöst werden. Dabei ist besonders bevorzugt, wenn es sich bei der Lösung um eine solche handelt, wie sie in dem sich der Ultrafiltration anschließenden Schritt als Reaktionsansatz verwendet wird, wobei bevorzugtererweise eine oder mehrere der Komponenten des letztlich verwendeten Reaktionsansatzes noch nicht enthalten sind. Derartige, noch nicht im Reaktionsansatz enthaltene Komponenten sind insbesondere jene, die nur eine geringe Stabilität aufweisen und/oder teuer in der Beschaffung sind. In besonders bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der Komponenten um die enzymatische Komponente des im Nachgang zur Ultrafiltration durchgeführten Teilschrittes des SELEX-Prozesses.
  • Mit der Verwendung eines Ultrafiltrationsschrittes im Rahmen des SELEX-Prozesses wird eine effektive Rückhaltung der von den Zielmolekülen eluierten Nukleinsäure gewährleistet und damit die im Stand der Technik beschriebene Verwendung von immobilisierten Oligonukleotidsequenzen, um die geeigneten bzw. erwünschten Nukleinsäureliganden aus der Kandidatenmischung zu erhalten, obsolet, die darüber hinaus auch nur unter großen Schwierigkeiten zu automatisieren wäre. Weiterhin geht die Verwendung von immobilisierten Nukleinsäuren zum Isolieren der eluierten, das Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren in der Regel mit sehr geringen Ausbeuten einher und ist daneben infolge der mit der Bereitstellung derartiger Materialien verbundenen Kosten auch aus diesem Grund für eine Automatisierung und zur Verwendung in einem Hochdurchsatzsystem weniger geeignet.
  • Die Verwendung eines Ultrafiltrationsschrittes ist auch gegenüber der Verwendung von Aufreinigungssystemen mit magnetischen Partikeln oder Chomatographiesäulen von Vorteil, unter anderem mit Blick auf die erhöhte Geschwindigkeit, mit der die Einzelselektionsrunde damit durchgeführt werden kann. Ein weiterer, für den Erfolg des SELEX-Verfahrens entscheidender Vorteil ist dabei das Vermeiden von Kreuzkontaminationen, wie sie ansonsten bei hochparallelen Ansätzen, nur schwer zu vermeiden ist, oder die gegenüber der Verwendung von magnetischen Partikeln erhöhte Ausbeute. Bei der Ultrafiltration verbleiben diejenigen Nukleinsäuren, die potentielle Binder an das Zielmolekül darstellen, am Filter und werden nicht in das Filtrat oder ein anderes Flüssigkeitsvolumen aufgenommen, das wiederum durch andere Flüssigkeitsvolumina kontaminiert werden könnte.
  • Infolge der durch die Ultrafiltration vermittelten Entfernung niedermolekularer Bestandteile der Reaktionsansätze der verschiedenen, im Rahmen des SELEX-Verfahrens durchzuführenden Reaktionen ist es möglich, den zyklischen SELEX-Prozess zwei oder mehrfach sukzessiv aufeinander folgend durchlaufen zu lassen, wodurch die verfahrenstechnische Voraussetzung für eine wirkungsvolle Automatisierung gegeben ist, da unter diesen Umständen ein weitestgehend problemloser Übergang der einzelnen Schritte ineinander gewährleistet wird, so zum Beispiel der Übergang von der Elution der an das Zielmolekül gebundenen Nukleinsäuren zur Amplifikation bzw. reversen Transkription und/oder der Übergang von der Amplifikation in den nächsten Anbindungsschritt der Amplifikate an das Zielmolekül.
  • Die Verwendung eines Ultrafiltrationsschrittes im Rahmen des SELEX-Prozesses und insbesondere im Nachgang oder Anschluss ist auch insoweit von Vorteil, als dass damit im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens die Elution der an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren aus dem Komplex aus Nukleinsäure(n) und Zielmolekül, insbesondere wenn das Zielmolekül an eine Oberfläche immobilisiert ist, auf verschiedene Art und Weise bewerkstelligt werden kann, die bisher zumindest bei einer automatisierten Form des SELEX-Prozesses nicht möglich waren.
  • Für die Entfernung oder Elution der Nukleinsäureliganden aus dem Komplex mit dem Zielmolekül können im Rahmen der Erfindung grundsätzlich denaturierende Agenzien oder Inhibitoren der Bindung zwischen Nukleinsäure(n) und Zielmolekül verwendet werden. Bei den Inhibitoren handelt es sich bevorzugt um das oder die Zielmoleküle oder Teile bzw. Fragmente davon. Ein Fragment kann beispielsweise eine Domäne oder ein Teil davon sein.
  • Die Auswahl der zu verwendenden denaturierenden Agenzien zur Elution der an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) ist dabei im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute auf dem Gebiet. Geeignete denaturierende Agenzien sind solche, die in der Lage sind, den Komplex aus Nukleinsäure und Zielmolekül aufzulösen, bevorzugt unter Denaturierung eines oder der beiden Bestandteile des Komplexes. Geeignete denaturierende Agenzien sind beispielsweise Harnstoff, EDTA, Mischungen aus Harnstoff und EDTA, Dimethylformamid, Guanidinium-HCI, Guanidinium-Isothiocyanat, verschiedene Salze, wie z.B. NaCl, in hoher Konzentration, und pH-Änderungen. Dadurch, dass die denaturierenden Agenzien durch die Ultrafiltration aus dem Reaktionsansatz entfernt werden, können letztlich alle geeigneten Agenzien verwendet werden, da diese nicht auf die Bedürfnisse der im Stand der Technik beschriebenen Eintopfreaktionen bei den automatisierten SELEX-Prozessen abgestimmt werden müssen.
  • Eine besondere Ausführungsform des SELEX-Verfahrens, die unter Verwendung eines Ultrafiltrationsschrittes, insbesondere im Anschluss an die Elution der an das Zielmolekül gebundenen Nukleinsäure(n) ausgeführt wird, ist jene, bei der als Elutionsprinzip Hitze angewendet wird. Zwar wird durch die Anwendung von Hitze in den Reaktionsansatz unmittelbar keine Verbindung eingebracht, die wie im Falle der Verwendung eines denaturierenden Agens oder eines Inhibitors, aus diesem wieder entfernt werden muss, damit die nachfolgenden Reaktionen ablaufen können, es wurde jedoch beobachtet, dass bei Anwendung von Hitze aus Komponenten des Reaktionsansatzes insbesondere von Matrices, an denen das Zielmolekül imobilisiert wird, unbekannte Stoffe freigesetzt werden können, die die nachfolgende(n) Reaktionen) nachteilig beeinflussen können. So wurde beispielsweise eine Störung der RT-PCR beobachtet, nachdem Eluate durch Abkochen von magnetischen Streptavidin-Partikeln, an die das Zielmolekül gebunden war, erhalten worden waren. Insoweit stellt der erfindungsgemäße SELEX-Prozess eine Möglichkeit dar, auch solche Matrices zu verwenden, die bei Hitze oder sonstiger Behandlung Verbindungen abgeben, die die nachfolgenden Reaktionsschritte des SELEX-Prozesses nachteilig beeinflussen könnten und somit in anderen als den erfindungsgemäßen SELEX-Prozessen nicht verwendet werden könnten. Die Elution unter Anwendung von Hitze erfolgt dabei in geeigneten Puffern, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Bevorzugte Puffer sind dabei jene, die in nachfolgenden Teilschritten des SELEX-Prozesses verwendet werden können.
  • Ein weiterer überraschender Vorteil der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, dass die Elution der Nukleinsäureliganden aus dem Nukleinsäureliganden-Zielmolekül-Komplex auch bewerkstelligt werden kann mit einem Überschuss an Zielmolekül oder einem Überschuss eines Teils des Zielmoleküls. Der Überschuss des Zielmoleküls bzw. der Überschuss des Teils des Zielmoleküls wird dabei als Inhibitor oder als Kompetitor eingesetzt mit dem Ziel, die an das Zielmolekül bindende Nukleinsäure von dem bevorzugterweise an einer Oberfläche immobilisierten Zielmolekül zu eluieren. Weitere Kompetitoren, um die an das Zielmolekül gebundenen Nukleinsäureliganden freizusetzen, können im Rahmen der Kenntnisse der Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet leicht ermittelt werden. Infolge der Verwendung eines Ultrafiltrationsschrittes stellt die Verwendung derartiger Kompetitoren fir nachfolgende Verfahrensschritte und insbesondere nachfolgende Selektionsrunden insoweit kein Problem dar, als dass diese infolge ihrer Größe durch den Ultrafiltrationsschritt aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden können, wobei lediglich die Nukleinsäureliganden im Reaktionsansatz verbleiben und sodann im Rahmen der weiteren Schritte bzw. Selektionsrunden verwendet werden. Die Auswahl der Größe des Kompetitors oder Inhibitors bestimmt sich aus der Größencharakteristik des verwendeten Ultrafilters, wobei diese wiederum maßgeblich von der Art der zurückzuhaltenden Nukleinsäure bestimmt wird. In einem jeden Fall ist es erforderlich, dass die als Inhibitor verwendete Verbindung im Rahmen der Ultrafiltration durch den Filter filtriert wird und die Nukleinsäure nicht durch den Filter filtriert wird.
  • Wie vorstehend ausgeführt kann die Ultrafiltration im Anschluss an die Elution der an das Zielmolekül gebundenen Nukleinsäure(n) durchgeführt werden. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass ein Ultrafitrationsschritt im Anschluss an den Amplifikationschritt des SELEX-Prozesse durchgeführt wird. Dabei kann, muss es aber nicht vorgesehen sein, dass im Nachgang zum Elutionsschritt ein Ultrafiltrationsschritt durchgeführt wird. Die Aufreinigung der Produkte der Amplifikationsreaktion, hierin auch als Amplifikationsprodukte bezeichnet, durch Ultrafiltration, insbesondere wenn diese durch Anlegen eines Vakuums erfolgt, ist auch insoweit von Vorteil, als dass die bei der im Stand der Technik ebenfalls beschriebenen Reinigung der Amplifikationsprodukte durch Bindung der potentiellen Nukleinsäureliganden an Zielmolekül tragende Oberflächen wie Partikel oder Kügelchen (engl. beads), insbesondere magnetische Partikel, unter oftmals Hochsalzbedingungen mit anschließendem Waschen und Eluieren mit wässrigen Lösungen, damit obsolet werden, mit der Folge, dass im Eluat keine Salzreste vorhanden sind und bei Verwendung des solchermaßen erhaltenen, hinsichtlich Nukleinsäureliganden angereicherten Reaktionsansatzes ein weiterer Eingriff in das Bindeverhalten der Nukleinsäureliganden und damit unter Umständen der Verlust spezifischer Klassen von Nukleinsäureliganden vermieden wird Der erfindungsgemäße SELEX-Prozess kann grundsätzlich eine jegliche Form der im Stand der Technik bekannten Amplifikationsreaktion umfassen. Die für die Amplifikation von RNA verwendete RT-PCR kann dabei als Zwei-Schritt (engl. two step) RT-PCR, als Ein-Schritt RT-PCR, aber auch als kontinuierliche oder isothermale Amplifikation durchgeführt werden.
  • Bei der Zwei-Schritt RT-PCR erfolgt die RT (reverse Transkription) in einem kleinen Volumen von ca. 20 μl, wobei lediglich RTase, Puffer, dNTPs, und Reverse Primer verwendet werden. Diesem ersten Schritt der reversen Transkription schließt sich der zweite Schritt bestehend in der Polymerase-Ketten-Reaktion, PCR, an, z. B. durchgeführt in 100 μl, d. h. die reverse Transkriptasereaktion wird um den Faktor 5 verdünnt. Dabei werden beide Primer und Taq-Polymerase verwendet. Die RTase wird bei den hohen Denaturierungstemperaturen inaktiviert für z.B. 2-10 min bei 95°C. Ein Aliquot der PCR wird in einer T7-Transkription, beispielsweise mit 20 μl (= 1/6 der RT-PCR) bei einem Gesamtreaktionsansatz von 120 μl 77-Reaktion, wobei die Spannbreite, in der der Reaktionsansatz variiert werden kann, bevorzugterweise zwischen 2 und 50 μ1 betragen soll, wieder zur RNA-Generierung eingesetzt, woraufhin die nächste Selektionsrunde beginnen kann.
  • Bei der Ein-Schritt (engt. one step) RT-PCR laufen RT und PCR in demselben Ansatz ab. Entsprechend sind alle für sowohl die RT als auch die PCR erforderlichen Reagenzien im Reaktionsansatz enthalten. Die Reaktionen sind also nicht räumlich, sondern nur zeitlich getrennt, da eine modifizierte thermostabile Polymerase verwendet wird, die erst nach längerer Inkubation bei 95°C aktiviert wird. Durch Steuerung der Aktivität der beteiligten Enzyme werden die Reaktionen komplett voneinander getrennt. Zunächst wird die RT bei 50°C durchgeführt, wobei dort die PCR-Polymerase noch nicht aktiv ist. Nach Erhitzen auf 95°C für 15 min wird die RTase inaktiviert und die PCR-Polymerase aktiviert. Im Rahmen des anschließenden Thermocyclings werden dabei die folgenden Profile verwendet: Zur Aktivierung der thermostabilen Polymerase und zur Inaktivierung der Rtasen: 20 min 50°, dann 10 min 60°, schliesslich 15 min 95°; typisches Thermoprofil für die PCR ist 30 s Denaturierung bei 95°, 30 s Annealing bei einer Temperatur von üblicherweise zwischen 50° und 72° in Abhängigkeit von den Primern, wie den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, und 30 s Polymerisierung bei 72°C. Anschließend wird, für den Fall, dass es sich bei den Nukleinsäureliganden um RNA handelt, ein Aliquot der solchermaßen durchgeführten RT-PCR zur T7-Transkription verwendet.
  • Die kontinuierliche oder isothermale Amplifikation, die auch als NASBA (engl. nucleic acid sequence based amplification) bezeichnet wird, stellt ein weiteres, im Rahmen der vorliegenden Erfindung grundsätzlich verwendbares Verfahren zur Amplifikation von RNA dar. Dabei erfolgt eine reverse Transkription mittels einer RTase, wobei die RNA in ein Hybrid aus RNA und DNA überführt wird. Weiterhin enthält der Reaktionsansatz eine RNaseH, die die RNA in diesem Hybrid abbaut und die RTase auch den zweiten Strang aus DNA synthetisiert. Anschließend transkribiert die T7-RNA-Polymerase die dsDNA zur RNA. Alle diese Prozesse laufen simultan, d. h. kontinuierlich bei einer Temperatur zwischen 37°C und 41°C ab und resultieren in einer Anhäufung von RNA.
  • Die Ultrafiltration wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugterweise als Vakuum-getriebene Ultrafiltration ausgebildet. Die nominelle Molekülgößen-Ausschlussgrenze kann dabei etwa von 3.000 bis 300.000, bevorzugterweise etwa von 10.000 bis 50.000 Da betragen. Als Materialien für den Ultrafilter werden dabei insbesondere solche verwendet, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die zum Beispiel Polyethersulfon- oder regenerierte Zellulosemembranen umfassen. Derartige Ultrafiltrationsmaterialien sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Separierung von Biomolekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen bekannt und können erfindungsgemäß verwendet werden.
  • Es ist in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass nach dem Kontaktieren der Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren mit dem bevorzugt immobilisierten Zielmolekül das Abtrennen der nicht an das Zielmolekül gebundenen Nukleinsäuren von dem Komplex aus Zielmolekül und Nukleinsäure(n), das sogenannte Partitionieren (engl. partitioning), durch einen Mikrofiltrationsschritt erfolgt. Dieser Mikrofiltrationsschritt kann dabei in einem jeglichen SELEX-Prozess gemäß dem Stand der Technik ebenso wie in einer jeglichen Ausführungsform der hierin offenbarten SELEX-Prozesse, die hierin auch als SELEX-Verfahren bezeichnet werden, durchgeführt werden. Die Auswahl der konkreten Filter, d. h. die Ausschlussgröße des verwendeten Filtermaterials, hängt dabei von der Art der Durchführung des Verfahrens ab. So werden in Abhängigkeit von den Oberflächen oder den Träger-Materialien, an die das Zielmolekül immobilisiert ist, die Filtermaterialien so ausgewählt, dass das jeweilige Trägermaterial zurückgehalten wird. Bevorzugte Porengrößen für die Mikrofiltration betragen etwa 0,1 bis 100 μm, bevorzugterweise etwa 1 bis 35 μm und am bevorzugtesten etwa 10 μm.
  • Bei den erfindungsgemäßen Verfahren kann hinsichtlich der apparatetechnischen Ausgestaltung so vorgegangen werden, dass die Vakuumkammer eine spezifische Deckelkonstruktion aufweist, die ausgestaltet ist, um handelsübliche Filtrationseinheiten beispielsweise für die Ultrafiltration und/oder die Mikrofiltration aufzunehmen. Die Deckelkonstruktion kann in einer Ausführungsform auch so ausgestaltet sein, dass sie eine oder mehrere der hierin beschriebenen Filtersäulen aufnimmt oder aufnehmen kann. Diese Ausgestaltung, die typischerweise in Form von Bohrungen in der Deckelkonstruktion vorliegt, ist dabei so ausgebildet, dass ein Schutz vor Kreuzkontamination während des jeweiligen Filtrationsvorganges, d. h. bei der Ultrafiltration und/oder Mikrofiltration, gegeben ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist beispielsweise die einzelne Bohrung, in die die Filtrationseinheiten in den Deckel der Vakuumkammer eingeführt werden, so lang, dass das Filtrat, welches aus dem Deckel in die Vakuumkammer tropft, praktisch nicht in Kontakt mit anderen Filtrationseinheiten bzw. dem daraus erhaltenen Eluat kommt. Die Kreuzkontaminationsfreiheit kann beispielsweise dadurch gewährleisten werden, dass sichergestellt wird, dass der einzelne Filter sich nur zusammen mit dem Deckel der Vakuumkammer bewegt, was insbesondere im Vakuumbetrieb bzw. nach dem Belüften der Vakuumkammer verhindert, dass sich zwischen den einzelnen Bohrungen der Deckelkonstruktion Flüssigkeitsbrücken bilden. So ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Filter fest in die Deckelkonstruktion eingefügt sind, beispielsweise dadurch, dass die Deckelkonstruktion und die Filter aus Plastik gespritzt sind. Eine weitere Ausgestaltung, um eine Kontaminationsfreiheit zu gewährleisten besteht darin, das für den Fall, dass die hierin beschriebenen Filtersäulen in die Deckelkonstruktion der Vakuumkammer eingebracht werden und zwischen der Bohrung in der Deckelkonstruktion und der einzelnen Filtersäule eine Dichtung, bevorzugterweise eine O-Ringdichtung angeordnet ist, so dass keine Kapillarkräfte entstehen, infolge derer Filtrat an den Filtern oder Filtersäulen vorbei in den Bereich der zu filtrierenden Flüssigkeit gelangt und somit eine Kreuzkontamination der verschiedenen Filtrationsansätze erfolgen würde.
  • Eine weitere apparatetechnische Ausführungsform, wie sie in dem erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden kann, besteht darin, dass die einzelnen Reaktionsgefäße, in denen die verschiedenen, im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Reaktionskomponenten aufbewahrt werden, wieder verschließbar sind. Auch dadurch wird die Gefahr einer Kreuzkontamination verringert und die Lagerung der Reagenzien erheblich verbessert, was u. a. darin begründet liegt, dass Enzyme gekühlt gelagert werden müssen, beispielsweise für eine mittelfristige Lagerung bis 48 h bei mindestens 10°C, bevorzugterweise 4°C. Bei offener Lagerung würde sich bereits nach wenigen Stunden Kondenswasser bilden, und die Reagenzien dadurch verwässert werden. Durch diese insbesondere automatisch wieder verschließbaren Gefäße würde auch ein Schutz vor Kreuzkontaminationen erreicht werden. Schließlich sind die besagten verschließbaren Gefäß auch insoweit von Vorteil, als dass damit ein Verdunstungsschutz erreicht wird, wodurch, zumindest theoretisch, die Reaktionsansätze beliebig lange inkubiert werden könnten.
  • Hinsichtlich des Formates, in welchem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, bestehen grundsätzlich keinerlei Bedenken oder Beschränkungen. Besonders geeignet sind die erfindungsgemäßen Verfahren für Hochdurchsatzformate (engt. high through-put), insbesondere wenn die erfindungsgemäßen Verfahren automatisiert, d. h. unter Verwendung eines Roboters oder Automaten durchgeführt werden. Dabei können die Verfahren beispielsweise unter Verwendung modifizierter Mikrotiterplatten mit beispielsweise 96 oder 384 Näpfen durchgeführt werden. Diese modifizierten Mikrotiterplatten weisen anstelle des festen Kunststoffbodens eine Filtermembran auf, wobei die Porengröße derjenigen entspricht, wie hierin allgemein im Zusammenhang mit der Mikrofiltration beschrieben. Die im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren typischerweise verwendeten Oberflächen zur Immobilisierung des Zielmoleküls, bevorzugterweise Partikel, werden dadurch zurückgehalten, während die nicht gebundenen Nukleinsäuremoleküle die Membran passieren. Diese Filtration stellt eine sehr effiziente Möglichkeit zum Abtrennen der Matrix und damit der an das an der Matrix gebundene Zielmolekül wiederum gebundenen Nukleinsäureliganden dar. Dabei ist besonders die Verwendung von nicht-magnetischen Partikeln bevorzugt. Die Verwendung eines Filtrationsschrittes zur Abtrennung der Matrix vom Reaktionsansatz, d. h. Abtrennen der nicht an das Zielmolekül und damit an die Matrix gebundenen Nukleinsäureliganden wird damit insoweit erleichtert, als dass im Falle der Verwendung von magnetischen Partikeln und entsprechend eines Magnetfeldes zur Separierung derselben an der Wand des Reaktionsgefäßes die einzige Möglichkeit, diese Partikel wieder zu resuspendieren und damit zu waschen darin besteht, dass die Partikel aufund abpipettiert werden. Die Verwendung eines Schüttlers und die dabei erfolgende Verwirbelung ist in der Regel zu schwach, um an der Wand klebende Partikel wieder zu resuspendieren. Dadurch entgeht häufig ein Großteil der Partikel der weiteren Verarbeitung.
  • Die vorstehende Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele erläutert. Dabei zeigt
  • 1 ein grundsätzliches Ablaufschema einer automatisierten RNA-Selektion mit den erforderlichen Arbeitsstationen,
  • 2 eine Anordnung der verschiedenen Stationen, die durch den Roboter im Rahmen der automatisierten RNA-Selektion benötigt und angefahren werden,
  • 3 ein grundsätzliches Ablaufschema bei automatisierter Filter-Selektion,
  • 4 ein grundsätzliches Ablaufschema einer automatisierten DNA-Selektion,
  • 5 ein grundsätzliches Ablaufschema einer automatisierten RNA-Selektion bei Verwendung denaturierender Elution;
  • 6 eine schematische Darstellung des für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Roboters;
  • 7 die erfindungsgemäß zu verwendende Filtersäule;
  • 8A eine Aufsicht der erfindungsgemäßen Vakuumkammer;
  • 8B einen Querschnitt der in 8A dargestellten Vakuumkammer;
  • 8C einen Querschnitt durch den Deckelteil der erfindungsgemäßen Vakuumkammer;
  • 9 das Schema der automatischen in vitro-Selektion gegen D-CGRP;
  • 10 das Ergebnis der Sequenzanalyse der im Rahmen der automatischen in vitro-Selektion gegen D-CGRP erhaltenen Klone;
  • 11 die prozentuale Anbindung der selektierten Klone bei verschiedenen D-CGRP-Konzentrationen;
  • 12 u. 13 mögliche Sekundärstrukturen der isolierten RNA-Spiegelmere von Klon H1, G2 und H1V;
  • 14 eine Übersicht verschiedener verkürzter an CGRP bindender RNA-Spiegelmere;
  • 15 das Ergebnis verschiedener Spiegelmere gegen CGRP in einem CGRP-Zellkultur-Assay, ausgedrückt als pmol cAMP / Napf; und
  • 16 eine Dosis-Wirkungskurve für das Spiegelmer H1 C.
  • Bei der in 1 dargestellten Selektion von an ein Zielmolekül bindenden RNA-Liganden werden in einem ersten Schritt die Puffer auf geeignete Reaktionsbedingungen eingestellt. Dabei werden diese aus einem Reagenzienständer, der typischerweise bei 4°C gehalten wird, entnommen und auf eine Arbeitsplattform gebracht und dort auf Raumtemperatur oder 37°C erwärmt. Neben den erforderlichen Puffern sowie Reagenzien wird auch die zur Selektion verwendete Nukleinsäure-Bibliothek solchermaßen vorbehandelt. Die im vorliegenden Falle aus RNA bestehende Nukleinsäurebibliothek wird sodann unter Verwendung eines Thermocyclers denaturiert. Dabei wird typischerweise eine Temperatur von 50-100°C, bevorzugterweise 60-90° für einen Zeitraum von 1-10 min, bevorzugterweise 2-7 min realisiert. In einem nächsten Schritt wird eine Vorsäule, um unspezifisch an das Trägermaterial, an dem das Zielmolekül immobilisiert ist oder immobilisiert werden soll, bindende Nukleinsäuren aus der Nukleinsäurebibliothek zu entfernen, vorgeschaltet und der Reaktionsansatz unter Verwendung eines Schüttlers bei Raumtemperatur oder 37°C auf der Arbeitsplattform behandelt. Die Matrix wird in den Wells der Mikrotiterplatte auf der 4°-Workstation vorgelegt. Überführung der Matrix geschieht durch Resuspension in der Nukleinsäurepräparation, die damit inkubiert werden soll; durch mehrmaliges auf- und abpipettieren sind alle Partikel in Suspension und können in neue Wells oder die Filtersäulchen überführt werden. Die Abtrennung der Partikel erfolgt durch Absedimentierenlassen und vorsichtiges Abpipettieren des Überstandes. Nach der Vorsäulenbehandlung wird der Überstand, der Nukleinsäure-Liganden enthält, die nicht unspezifisch mit dem Trägermaterial des Zielmoleküls wechselwirken, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und dort mit dem Zielmolekül inkubiert. Die Inkubation erfolgt dabei wiederum bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Das Zielmolekül kann in dem neuen Reaktionsgefäß entweder frei in Lösung vorliegen oder bereits an eine geeignete Oberfläche bzw. Trägermaterial gebunden vorliegen. In einem nächsten Schritt müssen die Komplexe aus Nukleinsäure-Ligand(en) und Zielmolekül an einer geeigneten Matrix immobilisiert werden Die Komplexe aus Matrix, Zielmolekül und Nukleinsäure-Ligand(en) werden unter Schütteln des Reaktionsansatzes wiederum bei 37°C oder Raumtemperatur auf der Arbeitsplattform hergestellt. Aus Gründen der Vereinfachung wird im folgenden nurmehr von Komplex aus Nukleinsäure und Zielmolekül gesprochen, wobei anerkannt wird, dass eine Vielzahl verschiedener Komplexe ausgebildet werden kann, die sich zum einen in den stöchiometrischen Verhältnissen, d.h. der Anzahl von gebundenen RNA-Molekülen pro Zielmolekül, unterscheiden können, und zum anderen in der Art der Nukleinsäuren, die an das Zielmolekül gebunden haben, was in der Tatsache begründet liegt, dass die im Rahmen des SELEX-Verfahrens üblicherweise verwendeten Nukleinsäurebibliotheken eine Anzahl typischerweise von 1012 bis 1016 verschiedenen Nukleinsäurespezies enthalten.
  • In einem darauffolgenden Schritt werden die nicht-gebundenen Nukleinsäuren, d.h. die nicht an das Zielmolekül gebundenen Nukleinsäuren der Bibliothek, von den Komplexen aus Nukleinsäure und Zielmolekül entfernt. Dies erfolgt typischerweise bei Raumtemperatur oder 37°C, indem der Reaktionsansatz einer Filtration unterzogen wird, bevorzugterweise einer Vakuum betriebenen Filtration unterzogen wird. In dem Falle, dass es sich bei der Obefläche bzw. dem Trägermaterial, an dem das Zielmolekül und damit auch die daran gebundenen Nukleinsäuren immobilisiert sind, um filtrierbare Oberflächen wie beispielsweise magnetische oder nicht-magnetische Partikel handelt, wird die Filtration und insbesondere die Auswahl des Filtermaterials und der Filterporendurchmesser durch die Größe der Partikel bestimmt, d.h. der Filter muss so ausgebildet sein, dass das Trägermaterial in dem Reaktionsgefäß zurückgehalten wird. Dabei ist es im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass die bisherige Inkubation der Nukleinsäure mit dem Zielmolekül bereits in der Filtrationseinheit durchgeführt wurde, mithin diese das Reaktionsgefäß darstellt, oder aber aus dem entsprechenden Reaktionsansatz der Reaktionsansatz oder ein Aliquot davon, zumindestens jedoch der das Zielmolekül und somit auch die daran gebundenen Nukleinsäure aufweisende Träger in die Filtrationseinheit überführt wird. Obwohl vorstehend insbesondere anhand einer Mikrofiltration beschrieben, können bei diesem Filtrationsschritt grundsätzlich all jene Filtrationstechniken verwendet werden, wie sie hierin offenbart werden.
  • Bei der Filtration ist dabei bevorzugt, dass die Filtrationssäule bzw. die Vakuumkammer, wie sie hierin beschrieben ist, verwendet wird. Die Vakuumkammer umfasst bevorzugterweise dabei mindestens zwei Bohrungen, in die bevorzugterweise die geeigneten Filtrationseinheiten eingeführt werden. Dabei wird durch die Ausgestaltung der Bohrurig in der Deckelplatte sowie gegebenenfalls die Relativentfernung zwischen Deckelplatte und Bodenteil gewährleistet, dass das Filtrat der Filtration, die in einer ersten Bohrung durchgeführt wird, nicht mit dem Filtrat einer Filtration in einer zweiten Bohrung in Kontakt gelangt, wobei die beiden Bohrungen typischerweise nebeneinander angeordnet sind, um zu vermeiden, dass hier eine Kontamination der verschiedenen Reaktionsansätze untereinander erfolgt. Die konkrete Ausgestaltung der Bohrungslänge hängt dabei von mehreren Faktoren ab, wie beispielsweise Ausgestaltung der Säule, die Menge der zu filtrierenden Flüssigkeit, die Menge des Filtrates, die Höhe des angelegten Vakuums und dergleichen mehr ab. Die entsprechenden Parameter können von den Fachleuten im Lichte der hierin gemachten Offenbarung durch Routinetests ermittelt werden.
  • Nach Entfernen der nichtgebundenen Nukleinsäure(n) wird die an das Zielmolekül. gebundene Nukleinsäure aus dem Komplex unter Anwendung geeigneter Elutionsbedingungen eluiert. Dabei kann die Elution wiederum in der Vakuumkammer erfolgen oder aber zuvor eine Überführung des Reaktionsansatzes, genauer des Anbindungsansatzes, in ein neues Reaktionsgefäß erfolgen. Die Elution erfolgt in der in 1 dargestellten Ausführungsform durch Erhitzen unter Verwendung des Thermocyclers. Dabei wird der Reaktionsansatz bevorzugterweise 3 Minuten bei 95°C inkubiert
  • In dem nachfolgenden Schritt beginnt die RT-PCR. Dabei werden die erforderlichen Reagenzien aus den bei 4°C gehaltenen Vorratsgefäßen dem Reaktionsansatz zugesetzt und bevorzugterweise bei 50°C inkubiert. Findet in einer Ausfiihrungsform die RT-PCR in Gegenwart der Matrix mit gebundenen Nukleinsäure-Molekülen statt, dann wird die Matrix im RT-PCR-Puffer in der Säule, die in der Vakuumkammer (Teil A) steckt, resuspendiert und dann in einen frischen Napf der 96-Napf Platte pipettiert. Danach wird in die resuspendierte Matrix zur Hitze-Elution der gebundenen Nukleinsäure beispielsweise 3 min auf 70-95°C erhitzt. Ist dies nicht, der Fall – wie bei der denaturierenden Elution – wird der Überstand von mit Denaturans inkubierter Matrix (der die eluierten Nukleinsäuren enthält) in ein Ultrafiltrationsröhrchen in der Vakuumkammer (Teil B) gebracht und dort vom Denaturans befreit. Die RT-Reaktion wird auf der 50°-Arbeitsstation heiss gestartet und dort 20 min inkubiert. Dann werden die Reaktionen in der Platte in den Thermocycler gestellt, dort wird noch 10 min bei 60°C inkubiert, bevor 15 min bei 95°C denaturiert wird und das Thermocycling-Programm beginnt (30 s 95°C; 30 s Annealing-Temperatur; 30 s 72°C). Das Ergebnis der PCR wird kontrolliert. Die Kontrolle kann dabei während der PCR und/oder nach deren Abschluss erfolgen. Die Kontrolle des Ergebnisses der PCR erfolgt dabei typischerweise durch Bestimmung der Fluoreszenz des Reaktionsansatzes mittels eines geeigneten Fluoreszenzfarbstoffes und eines Fluoreszenz-Auslesegerätes. In der 4°-Arbeitsplattform werden die RT-PCR-Reaktionen zwischengelagert, in denen bereits die erforderliche Menge an DNA während der PCR erzeugt worden ist und die daher schon zur Transkription bereit sind. In der 50°-Arbeitsstation wird die Platte, in der die PCR stattfindet, abgestellt, um die Proben für Fluoreszenzmessung zu entnehmen, da im Thermocycler selbst nicht pipettiert werden kann. Die Platte wird heiss gehalten, um die Gefahr eines Missprimings zu minimieren (die besonders gross ist, wenn der Ansatz stark abkühlt, bevor wieder aufgeheizt wird).
  • Die solchermaßen erhaltene DNA wird sodann als Template oder Matrize für eine Transkriptions-Reaktion verwendet. Die erforderlichen Reagenzien, wie Ribonukleotide und T7-RNA-Polymerase werden aus den entsprechenden, bei 4°C aufbewahrten Vorratsgefäßen entnommen zu dem auf der Arbeitsplattform befindlichen Reaktionsansatz hinzugegeben und bei 37°C 1 bis 24 h, bevorzugterweise 1,5 bis 4 h inkubiert. Die T7-Transkriptionsreaktion wird sodann nach Standardprotokoll, wie beispielsweise beschrieben in Cox et al., 1998. Biotechnol. Prog. 14: 845-850 durchgeführt und anschließend die erhaltene RNA durch vakuumgetriebene Ultrafiltration gereinigt. Neben T7-RNA-Polymerase können dabei auch andere RNA-Polymerasen verwendet werden, wie beispielsweise T3- oder SP6-RNA-Polymerase oder auch thermostabile RNA-Polymerasen wie die aus Thermus thermophilus.
  • Die Reinigung der RNA erfolgt bevorzugterweise unter Verwendung einer Ultrafiltration, wobei die Ultrafiltration eine vakuumgetriebene Ultrafiltration ist unter den Bedingungen wie sie hier offenbart sind. In dem konkreten, in 1 dargestellten Ablaufdiagramm ist dabei vorgesehen, dass der Reaktionsansatz, der im Rahmen der Transkriptionsreaktion die RNA bereitgestellt hat, in die Filtrationseinheit eingesetzt wird, dort genauer in die Kammer B, wobei die Kammer, die hierin auch als Reaktionskammer bezeichnet wird, eine Ultrafiltration erlaubt. Die Ausgestaltung der Ultrafiltrationsrichtung ist dabei bevorzugterweise wiederum so, dass eine Kontamination der Reaktionsansätze durch parallel oder sequenziell durchgeführte Filtrationsschritte vermieden wird. Die solchermaßen gereinigte RNA ist frei niedermolekularen Substanzen wie NTPs, DTT, Salzen, EDTA oder Detergenzien (d.h. alles, was unterhalb der Größenausschlussgrenze der verwendeten Ultrafiltrationseinheiten liegt), wie sie in typischen Transkriptionsansätzen z.T. in sehr hoher Konzentration vorliegen und die Einstellung der Konditionen der nächsten Selektionsrunde empfindlich stören würden, und enthält neben der RNA nur noch Makromoleküle (Proteine, die in den Amplifikationsreaktionen verwendet wurden; doppelsträngige DNA, die zur Transkription aus der RT-PCR als Template eingesetzt worden ist, wurde durch DNaseI-Verdau – nicht im Schema enthalten – abgebaut und der bei der T7-Transkription entstandene Niederschlag von Pyrophosphat wurde mittels EDTA-Zugabe aufgelöst). Die RNA kann dann als Ausgangsmaterial für eine weitere Selektionsrunde verwendet werden. Dabei ist die Anwesenheit von Proteinen nicht so kritisch wie diejenige von Puffersalzen oder EDTA, solange die Proteine nicht noch störende Aktivitäten aufweisen. Die Polymerasen aus RT, PCR und Transkription stören nicht (und werden auch grösstenteils bei der Weiterbehandlung inaktiviert). Problematisch sein kann dagegen die DNase, die aber dwch Hitze und EDTA inaktiviert werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können diese-Makromoleküle im wesentlichen nur beim Partitioning, also beim Waschvorgang, aus dem Reaktionsansatz entfernt werden.
  • 2 zeigt die Anordnung der verschiedenen Arbeitsstationen die von einem Roboter im Falle der Durchführung der in 1 beschriebenen Selektionsrunde angesteuert werden müssen.
  • In 3 ist eine weitere Ausführungsform der automatisierten RNA-Selektion beschrieben, wobei hier die Immobilisierung des Zielmoleküls nicht auf Partikeln als Trägeroberfläche erfolgt, sondern auf Membranen, wie beispielsweise einer Nitrozellulosemembran. Weitere geeignete Membranen sind gemischte Zelluloseestermembranen oder sonstige Membranen, sofern sie die Zielmoleküle binden und die Nukleinsäuren passieren lassen. Entsprechende Membranen sind den Fachleuten bekannt und könne hinsichtlich ihrer Eignung zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren im Rahmen von Routinetests getestet werden.
  • Bei dieser Ausführungsform erfolgen die Schritte der Einstellung der Pufferbedingungen sowie Denaturierung der Nukleinsäure, konkret der Ribonukleinsäure, in gleicher Weise wie für das in 1 beschriebene Verfahren. Die Vorsäule unterscheidet sich insoweit, als dass in das Reaktionsgefäß Membranteile eingebracht werden, um als Vorsäule zu dienen und die daran unspezifisch bindenden RNA-Moleküle aus der Nukeinsäure-Bibliothek entfernt werden. In ähnlicher Weise wie für das Verfahren gemäß 1 beschrieben erfolgt dann die Inkubation der Nukleinsäure mi t dem Zielmolekül. Das Gewinnen von Komplexen aus RNA und Zielmolekül erfolgt dabei auf einer Arbeitsstation bei Raumtemperatur oder bei 37°C und das Entfernen der Komplexe aus Zielmolekül und Nukleinsäuren auf der Filtrationseinheit und zwar auf einer ersten Station A, auf der eine Filtration und insbesondere eine Mikrofiltration vorgesehen Ist. Dabei sind anstelle der Filtereinsätze Einsätze aus der Nitrozellulosemembran oder eine andere der hierin zu diesem Zweck offenbarten Membranen enthalten. Daran schließt sich der übliche Waschschritt an, wobei die Nitrozellulosemembran die Zielmoleküle samt daran spezifisch gebundener Nukleinsäuremoleküle bindet.
  • Nachdem die nicht oder unter den Waschbedingungen nicht spezifisch bindenden RNA-Moleküle entfernt sind, kann die Elution der spezifisch an das Zielmolekül bindenden RNA-Moleküle erfolgen. Im vorliegenden Falle kann dies nicht durch Temperatur, da die Vakuumkammer mit den Ultrafiltrationseinsätzen nicht temperierbar ist, sondern durch Kompetitoren oder durch denaturierende Reagenzien geschehen. Die Elution erfolgt dabei bei der Umgebungstemperatur auf der Vakuumkammer. In dieser Ausführungsform ist bevorzugt, dass das Zielmolekül im wesentliehen nur an der Membranoberfläche bindet und das Zielmolekül mit einer Lösung, die dem Komplex aus Nukleinsäure und Zielmolekül auflösenden Agenzien, wie beispielsweise Harnstoff oder Guanidiniumsalz, enthält, von dieser Oberfläche gelöst wird. In der konkret dargestellten Ausführungsform erfolgt das Eluieren oder Denaturieren der RNA und damit das Freisetzen derselben von dem Zielmolekül bevorzugterweise nicht durch Erhitzen, sondern durch Verwendung der hierin grundsätzlich offenbarten Agenzien wie Kompetitoren oder denaturierende Agenzien.
  • Gegenüber den Schritten, wie sie im Zusammenhang mit dem in 1 beschriebenen Verfahren erforderlich sind, wird nun der Schritt des spezifischen Entfernens des denaturierend wirkenden Ager s vorgenommen. Hierzu wird auf der Vakuumstation an Position B eine Filtration durchgeführt, die bevorzugterweise als Ultrafiltration, wie sie hierin beschrieben ist, ausgeführt wird. Die Reaktion erfolgt dabei bei Raumtemperatur bzw. 37°C Dabei wird die Membran selbst nicht transferiert. Wie weiter oben beschrieben, sollen die Zielmoleküle an der Oberfläche der Membran binden, wo sie durch denaturierende Agenzien ablösbar sind. Der Überstand wird dann die entsprechenden Moleküle enthalten, der einfach abpipettiert und in die Ultrafiltrationseinheiten in der Station B transferiert wird.
  • Die weiteren Reaktionsschritte beginnen mit dem Start der RT-PCR und Abschluss der Runde bzw. Beginn einer neuen Runde sind identisch wie für das in 1 beschriebene Verfahren.
  • Bei der in 4 dargestellten automatisierten RNA-Selektion unter Verwendung einer denaturierenden Elution unterscheiden sich die Schritte gegenüber der in 1 dargestellten Abfolge von Schritten lediglich darin, dass die Elution bzw. Denaturierung der RNA nicht nur im Thermocycler erfolgen kann sondern auch auf der 50°C-Arbeitsplattform oder bei Umgebungstemperaturbedingungen . Die Elution erfolgt mit Harnstoff und EDTA bei 20 – 100°C, bevorzugterweise bei 37 – 95°C auf der 50°C-Arbeitsstation oder im Thermocycler. Infolge der Kombination aus erhöhter Temperatur und denaturierenden Agenzien können an das Zielmolekül gebundene Nukleinsäuren von diesem wieder eluiert werden. Bei dieser Ausführungsform wird anstelle der direkten Durchführung der Amplifikation auf der Matrix das denaturierende Agens wie beispielsweise Harnstoff/EDTA zur Matrix gegeben und der Reaktionsansatz bei erhöhter Temperatur inkubiert. Ähnlich dem Schritt der Reinigung der RNA wird sodann als zusätzlicher Schritt das denaturierende Agens unter Verwendung einer Ultrafiltration bei Raumtemperatur bzw. 37°C aus dem Reaktionsansatz entfernt. Hierzu wird das Harnstoff/EDTA-Eluat in Position B der Filtrationseinheit pipettiert. Das für die denaturierende Elution beschriebene Verfahren kann grundsätzlich auch in der Ausführungsform angewandt werden, bei der die Elution durch kompetitive Elution erfolgt. Hierbei würde statt des denaturierenden Agens eine hohe Konzentration an Kompetitor, wie er hierin beschrieben ist, zugegeben werden und dieser dann über Ultrafiltration abgetrennt werden. In diesem Falle würde die Elution jedoch nicht bei 50°C wie im Falle der denaturierenden Elution, sondern bei Raumtemperatur bzw. 37°C durchgeführt werden.
  • Bei der in 5 dargestellten automatisierten DNA-Selektion handelt es sich um eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dabei besteht der wesentliche Unterschied gegenüber dem in 1 dargestellten Verfahren darin, dass DNA-Liganden isoliert werden sollen und auch die Nukleinsäure-Bibliothek aus DNA und nicht aus RNA besteht. Bei der konkreten Ausführungsform entfällt somit die RT-PCR, die durch eine PCR ersetzt wird. Ebenfalls entfallen die Schritte der Transkription der DNA in RNA. Vielmehr kann nach der PCR-Reaktion direkt einzelsträngige DNA auf der Arbeitsplattform bei Raumtemperatur bzw. 37°C isoliert werden. Bei der Reinigung wird im vorliegenden Falle ein magnetischer Separator eingeführt, wobei die Trennung der DNA-Stränge mittels magnetischer Partikel bei hohem pH vorgenommen wird. Der nicht erwünschte (-)-Strang wurde während der PCR mit Biotin enthaltendem Oligonukleotid synthetisiert. Durch Versetzen der PCR-Reaktion mit NaOH (50 – 500 mM Endkonzentration) werden die beiden Stränge aufgeschmolzen. Nach kurzer Inkubation des alkalischen Ansatzes mit magnetischen Streptavidin-Partikeln liegen die unerwünschten (-)-Stränge an die Partikel gebunden vor. Der alkalische Überstand enthält die freien (+)-Stränge und kann nach magnetischem Abtrennen der Partikel abpipettiert und in ein neues Reaktionsgefäß überführt werden. Schließlich wird der Überstand durch Zugabe einer geeignet konzentrierten HCl-Lösung neutralisiert. Bei der Neutralisation entstehendes NaCl muss im nächsten Schritt sodann entfernt werden. Die Durchführung der Reinigung der einzelsträngigen DNA (ssDNA) erfolgt ansonsten in analoger Weise, wie dies für RNA in dem in 1 dargestellten Verfahren beschrieben ist.
  • 6 zeigt eine Vorrichtung zum automatischen Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Vorrichtung weist einen Arbeitsbereich (21) auf, auf dem verschiedene Module (22) angeordnet sind. Die Module können Behälter zum Durchführen von Reaktionen, Stoffvorratsbehälter und Abfallbehälter sein. Darüber hinaus können die Module Bearbeitungseinheiten zum physikalischen oder chemischen Bearbeiten des zugegebenen Stoffes aufweisen. So können die Module beheizbare Behälter sein, oder Behälter, die mit einer Schütteleinrichtung gekoppelt sind, um den zugegebenen Stoff in Bewegung zu halten. Darüber hinaus können die Module Filtereinrichtungen aufweisen, um den zugegebenen Stoff zu filtrieren. Die Module und deren mögliche Anordnung sind in 2 dargestellt.
  • Über dem Arbeitsbereich (21) ist ein beweglicher Arm (23) angeordnet, so dass er sich über den gesamten Arbeitsbereich erstreckt. Dieser Arm wird durch eine oder zwei Stützen (24) in gleicher Höhe über dem Arbeitsbereich (21) gehalten. Die Stützen (24) sind beweglich in Schienen (nicht gezeigt) gehalten, so dass der Arm (23) quer über den Arbeitsbereich (21) verfahren werden kann. Mindestens eine der Stützen (24) weist eine Antriebseinheit (25) auf, mit der der Arm (23) quer über den Arbeitsbereich (21) an eine bestimmte Position verfahren werden kann. Die Antriebseinheit (25) wird durch eine Steuereinheit (26) angesteuert.
  • An dem Arm (23) befindet sich ein in Längsrichtung des Arms (23) beweglicher Schlitten (27), der über eine weitere Antriebseinheit (nicht gezeigt) entlang des Arms verfahrbar ist, so dass gesteuert durch die Steuereinheit (26) mit dem Schlitten eine bestimmte Position entlang des Armes (23) angefahren werden kann. Der Schlitten (27) weist einen Aufnehmer für einen flüssigen und/oder festen Stoff auf, z. B. eine Pipette oder ähnliches, der gesenkt werden kann, um einen Stoff aufzunehmen oder abzugeben. Das Senken und Anheben des Aufnehmers wird ebenfalls durch die Steuereinheit (26) gesteuert.
  • Mit der gezeigten Vorrichtung ist es möglich das erfindungsgemäße Verfahren zur Selektion von Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidatennukleinsäuren durchzuführen. Dazu steuert die Steuereinheit (26) den Arm, den Schlitten und den Aufnehmer so, dass in einer vorgegebenen Reihenfolge zunächst mit dem Schlitten und dem Arm ein bestimmtes Modul angefahren wird, so dass sich der Aufnehmer (28) über dem Modul befindet und durch Senken des Aufnehmers ein Stoff aufgenommen oder abgegeben werden kann. Durch die geeignete Kombination von Aufnehmen und Abgeben von Stoffen in die dafür vorgesehenen Reaktionsbehälter, wie dies hierin offenbart ist, lasst sich das erfindungsgemäße Verfahren durchführen. Da nach jedem Kontakt mit einem der zur Verfügung gestellten Stoffe der Aufnehmer (28) mit dem jeweiligen Stoff kontaminiert ist, ist der Aufnehmer vorzugsweise so vorgesehen, dass der mit dem Stoff in Berührung kommende Teil abgestoßen werden kann und durch einen neuen, noch nicht benutzten Teil ersetzt werden kann. Dazu sind weitere Module vorgesehen, in denen einerseits neue Aufnehmerteile in entsprechender Anzahl zur Verfügung gestellt werden und ein weiteres Modul, in dem die bereits benutzten Teile der Aufnehmer abgegeben werden können, um sie zu entsorgen. Die verschiedenen hierin beschriebenen Module entsprechen dabei den verschiedenen Arbeitsstationen, wie sie im Rahmen der 1 bis 5 beschrieben sind.
  • Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden gesteuert durch die Steuereinheit (26) zunächst in einem Behälter eine Mischung von Kandidatennukleinsäuren mit einem Zielmolekül kontaktiert. Die Nukleinsäureliganden können dann an das Zielmolekül binden. Diese kontaktierte Kandidatenmischung wird ggf. mit einer Matrix, an der die Zielmoleküle immobilisiert werden, kontaktiert und anschließend in eine Trennvorrichtung, vorzugsweise eine Filtervorrichtung, transportiert, in der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende Nukleinsäure vom Rest der Kandidatenmischung abtrennbar sind, wobei es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist, dass die Zielmoleküle von vornherein an einer Matrix immobilisiert sind. Der Transport der Kandidatenmischung in die Trennvorrichtung wird vorzugsweise mit einer Pipette durchgeführt, die sich an dem Aufnehmer (28) befindet. Dazu wird der Schlitten über den Behälter mit der Kandidatenmischung gefahren, der Aufnehmer gesenkt, so dass die Pipette die Kandidatenmischung aufnehmen kann. Der Aufnehmer wird angehoben und der Schlitten über die entsprechende Mikrofiltrationseinrichtung verfahren. Dort wird der zuvor aufgenommene Stoff in die Mikrofiltrationseinrichtung abgegeben. Je nach benötigter Menge kann dieser Vorgang mehrfach hintereinander durchgeführt werden, so dass in der Mikrofiltrationseinrichtung eine ausreichend große Menge der zu filternden Kandidatenmischung zur Verfügung steht. Anschließend wird die mit höherer Affinität an das Zielmolekül bindende Nukleinsäure der Mikrofiltrationseinrichtung entnommen und durch geeignete bekannte Verfahren amplifiziert. Dies erfordert eine große Anzahl von sich wiederholenden Schritten, so dass die Verwendung einer automatisch gesteuerten Vorrichtung aus Gründen der Zuverlässigkeit sehr vorteilhaft ist.
  • Nach dem Amplifiziervorgang kann erfindungsgemäß eine Ultrafiltration zum Aufreinigen der bei dem Amplifiziervorgang gebildeten Amplifikationsprodukten durchgeführt werden. Dazu wird die als Ergebnis des Amplifiziervorgangs erhaltene Mischung einer Ultrafiltrationseinrichtung zugeführt.
  • Durch notwendige Mindestzeiten, in denen ein Bearbeitungsschritt auf einen Stoff einwirken muss bzw. in dem miteinander in Verbindung gebrachte Stoffe aufeinander einwirken müssen, kommt es zu Wartezeiten, in denen die Steuereinheit (26) den Aufnehmer nicht bewegt. Deshalb und um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, wird das erfindungsgemäße Verfahren parallel mehrmals durchgeführt. Dazu können in den Modulen jeweils mehrere Behälter vorgesehen sein, die durch den Aufnehmer, den Arm und den Schlitten gesteuert durch die Steuereinheit (26) getrennt angefahren werden können. Somit lassen sich durch Prozessschritte bedingte Wartezeiten überbrücken. Man hat gleichzeitig den Vorteil, vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.
  • Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Steuereinheit die verschiedenen durchzuführenden Reaktionen des erfindungsgemäßen Verfahrens steuert.
  • 7 zeigt die erfindungsgemäße Filtersäule, wobei die Säule ein erstes Aufnahmestück (1) umfasst, das in ein konisches Zwischenstück (2) übergeht und das konische Zwischenstück wiederum in ein Auslassstück (3) übergeht, wobei am Übergang zwischen dem Zwischenstück (2) und dem Auslassstück (3) ein Filter angebracht ist. Bei dem Filter kann es sich sowohl um einen Mikrofilter wie auch um einen Ultrafilter handeln, bevorzugt um solche, wie sie hierin offenbart sind. Eine derartig ausgebildete Fritte kann im Rahmen eines jeglichen Filtrationsschrittes, wie er im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie es beispielsweise in den 1 und 2 beschrieben ist, durchgeführt werden. Ähnliche Filtersäulen, die ebenfall im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise kommerziell als MicroCon Filter von Millipore erhältlich.
  • Das Aufnahmestück (1) kann weiterhin ein Befestigungsmittel aufweisen. Das Befestigungsmittel ist bevorzugterweise an der Außenwand des Aufnahmestückes angeordnet und erstreckt sich radial zur Längsachse der Filtersäule. Das Befestigungsmittel kann dabei an einer oder mehreren Stellen der Außenwand des Aufnahmestücks angeordnet sein. Bevorzugterweise ist das Befestigungsmittel als Ring ausgebildet, dessen Innendwchmesser dem Au.ßendwchmesser des Aufnahmestückes entspricht. Dabei ist besonders bevorzugt, dass das Befestigungsmittel an dem Ende des Aufnahmestückes (1) angeordnet ist, welches dem Ende des Aufnahmestückes (1) entgegengesetzt ist, das in das konische Zwischenstück (2) übergeht.
  • 8 zeigt eine Vakuumkammer wie sie in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann. Dabei zeigt 8A eine Aufsicht der Vakuumkammer, wie sie beispielsweise an der Vakuumstation, wie sie in den 1 und 3 bis 5 beschrieben ist, eingesetzt werden kann. Position A der in 8 dargestellten zweiteiligen Vakuumkammer entspricht dabei der Position A, Position B der Position B der Vakuumkammer, wie sie im Rahmen der in den 1 und 3 bis 5 beschriebenen Verfahren verwendet wird. Beide Teilkammern weisen eine Vielzahl von Bohrungen (13) bzw. (14) auf, in die beispielsweise die Fritte, hierin auch als Filtrationssäule bezeichent, gemäß 7 eingeführt werden kann. 8B zeigt einen Querschnitt durch die in 8A in Aufsicht dargestellte Vakuumkammer mit zwei Teilvakuumkammern. Dabei bezeichnet (10) den Bodenteil und (11) den Deckelteil der Vakuumkammer. Die Länge der Bohrung (14) ist ausgebildet als ein Vielfaches des Durchmessers der Bohrung. Durch dieses Verhältnis wird gewährleistet, dass die in benachbarten Bohrungen (13) durchgeführten Filtrationsschritte ohne wechselseitige Kontamination durchgeführt werden können. Eine Kontamination könnte beispielsweise dadurch auftreten, dass das Filtrat einer jeglichen in einer distinkten Bohrung (13) eingebrachten Filtrationseinheit mit dem Filtrat einer weiteren Filtrationseinheit in Kontakt gelangt und insoweit insbesondere durch Ausbildung einer Flüssigkeitsbrücke die eigentlich zu entfernenden Inhaltsstoffe des einen Filtrates wie beispielsweise Ionen, aber auch Nukleinsäwespezien, die unter den gewählten Bedingungen nicht an das Zielmolekül binden, in den Reaktionsansatz oder das Filtrat einer Filtrationseinheit, die in einer bevorzugterweise benachbarten Bohrung verwendet wird, gelangen. In 8 A ist eine weitere Detailansicht eines Teils der Deckelkonstruktion dargestellt. Dabei ist bei der einen von der Vielzahl der in der Deckelkonstruktion enthaltenen Bohrungen dargestellten Bohrungen, die der Aufnahme eines Filters bzw. einer Filtersäule dient, ein O-Ring als Dichtung vorgesehen, der zwischen der die Filtersäule aufnehmenden Bohrung und der Deckelkonstruktion angeσrdnet ist, so dass keine Flüssigkeitsbrücke, insbesondere nicht zwischen verschiedenen Filtrationsansätzen, die in der Deckelkonstruktion enthalten sind, ausgebildet wird.
  • 8 C zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vakuumkammer. Das mit Bohrungen (13) bzw. (14) versehene Deckelteil (11) der Kammer sitzt auf dem nicht dargestellten Bodenteil (10) der Vakuumkammer auf, wobei Deckelteil (11) und Bodenteil (10) durch eine Dichtung getrennt sind. In einer jeden Bohrung (13) bzw. (14) ist ein O-Ring (15) als Dichtung angebracht, der gewährleistet, dass die Filtrationssäule (1), die bevorzugt ausgebildet ist, wie in 7 dargestellt, in den Bohrungen fixiert wird und insbesondere, dass es zu keinerlei Kreuzkontaminationen zwischen den in den einzelnen Bohrungen durchgeführten Filtrationsansätzen kommt.
  • Beispiel 1: Automatische Herstellung von Aptameren
  • In diesem Beispiel wird die automatische Selektion von spezifisch Ratten-α-D-CGRP (calcitonin gene-related peptide; Amara et al., 1982, Nature 298, 240-244) bindenden RNA-Molekülen aus einem Startpool beschrieben.
  • A. Materialien
  • NTPs wurden von Larova, Berlin; dNTPs von Qiagen, Hilden bezogen. Die T7 RNA Polymerase stammte von Stratagene, Heidelberg; DNase I von Sigma-Aldrich, Taufkirchen; Taq Polymerase sowie RNase Out RNase-Inhibitor von Invitrogen. Zur RT-PCR wurde der OneStep RT-PCR Kit von Qiagen verwendet.
  • Ratten-α-D-CGRP wurde von BACHEM, Heidelberg synthetisiert. Das zur Selektion verwendete Peptid trägt eine Biotingruppe am Carboxylterminus, um die Trennung von ungebundenen Nukleinsäuren mittels der Biotin-NeutrAvidin-Wechselwirkung zu ermöglichen. Hierfür wurden NeutrAvidin-Agarose und NeutrAvidin-U1traLink von Pierce verwendet.
  • DNA-Pool
  • Die DNA für den Startpool wurde im Hause synthetisiert und basiert auf dem Pool DE.40 mit der Sequenz 5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG AGC TCA GAC TTC ACT CGT G-N40-CAC GTA CCA CTG TCG GTT CCA C-3' (SEQ.ID.Nr. 22).
  • Forward (T7)-Primer DE.40T7:
    5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG AGC TCA GAC TTC ACT CG-3' (SEQ.ID.Nr. 23)
    Reverse Primer DE.40R:
    5'-GTG GAA CCG ACA GTG GTA CG-3' (SEQ.ID.Nr. 24)
  • 2 nmol des einzelsträngigen DNA-Pools wurden in einer "fill-in" Reaktion unter Verwendung von T7-Primer in einem Volumen von 1 ml zu transkribierbarer dsDNA aufgefüllt. Schliesslich wurde mittels T7-RNA-Polymerase in 4 ml Volumen einzelsträngige RNA erzeugt, die als Ausgangspool für die in vitro-Selektion verwendet wurde.
  • B. Selektionsschritte
  • Denaturierung und Faltung der RNA
  • Alle nicht-enzymatischen Schritte der Selektion mit Ausnahme der Denaturierung der RNA vor dem Kontaktieren mit dem Zielmolekül Ratten-α-D-CGRP wurden in Selektionspuffer (HEPES-KOH, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM MgCl2; 1 mM CaCl2; 0.1% [w/vol] Tween-20) durchgeführt. Die Denaturierung erfolgte für 5 Minuten bei 95°C in Selektionspuffer ohne CaCl2 und MgCl2. Nach der Denaturierung wurde die RNA auf Raumtemperatur abgekühlt, MgCl2 und CaCl2 wurden zugegeben und weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Anbindung und Abtrennung von nicht-bindenden RNA-Spezies
  • Im Anschluss an die Faltung wurde die RNA zunächst bei Raumtemperatur für 15 Minuten ohne Peptid mit der Matrix (NeutrAvidin-Agarose oder NeutrAvidin-U1traLink) inkubiert. Diese sogenannte Präselektion diente der Entfernung von potentiellen Matrixbindern. Nach diesem Inkubationsschritt wurde die Matrix durch Sedimentierenlassen von der RNA abgetrennt, mit den aus 9 ersichtlichen Konzentrationen von biotinyliertem Ratten-α-D-CGRP versetzt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wurde dem Bindungsansatz die biotin-bindende Matrix zugesetzt und nochmals unter Schütteln für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Matrix gewaschen, um nicht-bindende RNA-Spezies von bindenden zu entfernen. Das hierbei verwendete Waschvolumen lag in den ersten Runden beim 5-fachen Volumen der Matrix (50 μl Matrix für Runde 1 und 2, 10 μl für Runden 3-9), in späteren Runden wurden bis zu 135-fache Waschvolumina benutzt.
  • Elution
  • Elution der gebundenen RNA erfolgte durch Resuspendieren der Matrixpartikel mit angebundener RNA in RT-PCR-Puffer und Erhitzen auf 95°C für 3 Minuten. Die Ansätze wurden dann mit Enzymen versetzt (Reverse Transkriptase und thermostabile DNA-Polymerase aus dem OneStep RT-PCR Kit [Qiagen]) und die Reverse Transkription sowie die nachfolgende PCR in Gegenwart der Matrix durchgeführt.
  • C. Amplifikation – Enzymatische Reaktionen
  • Fill-in Reaktion – Herstellung von transkribierbarer dsDNA
  • Um doppelsträngige, in vitro transkribierbare DNA zu erhalten, wurden 2 nmol synthetisierte ssDNA (Pool DE.40) mit dem passenden Primer DE.40T7 zu doppelsträngiger DNA enzymatisch aufgefüllt. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: ssDNA Pool, 2 μM; DE.40T7, 6 μM; dNTPs, 200 μM; Taq Polymerase, 200 U/ml; 1 x Reaktionspuffer wie vom Hersteller empfohlen mit 2.5 mM Mg2+. Das Reaktionsvolumen betrug 1 ml, die Inkubation wurde 30 Minuten bei 63°C durchgeführt.
  • Transkription – Herstellung von RNA für Verwendung in der Selektion
  • Transkriptionen wurden mit 100 U T7 RNA-Polymerase und 40 U RNase Out RNase-Inhibitor in T7-Reaktionspuffer (80 mM HEPES pH 7,5; 22 mM MgCl2; 1 mM Spermidin; 10 mM Dithiothreitol [DTT]; je 4 mM GTP, ATP, CTP und UTP; 80 μg/m1 BSA) in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt. Pro 100 μl-Reaktion wurden zwischen 10 und 30 μ1 RT-PCR Reaktion mit darin entstandener, doppelsträngiger DNA als Transkriptionstemplate eingesetzt. Die Reaktionen wurden 3-12 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend mit DNase I versetzt, um die Template-DNA zu verdauen. Die erzeugte RNA wurde daraufhin entweder unter denaturierenden Bedingungen über ein 8% Polyacrylamidgel mit 8 M Harnstoff oder aber nativ mittels Ultrafiltration mit Ultrafiltrationseinheiten von nicht eingebauten NTPs abgetrennt. Ultrafiltrationsgereinigte RNA wurde vom Filter gespült, gelgereinigte RNA aus den ausgeschnittenen Gelstückchen eluiert, mit Ethanol gefällt, getrocknet und in Wasser aufgenommen.
  • Reverse Transkription und PCR von selektierten RNAs
  • Die reverse Transkription von selektierten RNA-Molekülen wurde mit dem Qiagen OneStep RT-PCR Kit unter vom Hersteller empfohlenen Pufferbedingungen unter Anwesenheit der NeutrAvidin-Agarose bzw. -UltraLink-Matrix in 100 μl Volumen durchgeführt. Dazu wurden die Ansätze komplett mit Matrix, daran anhaftender RNA und RT-PCR-Reaktionspuffer für 3 Minuten auf 95°C erhitzt, dann 2 Minuten auf 50°C äquilibriert, bevor die Enzyme zugegeben wurden. Zur reversen Transkription wurden die Reaktionen 20 Minuten bei 50°C gehalten, dann 10 Minuten auf 60°C. Inaktivierung der RT-Enzyme sowie Aktivierung der thermostabilen Polymerase wurde durch 15-minütiges Erhitzen auf 95°C erreicht.
  • Die Parameter des Thermocyclings waren wie folgt: Denaturieren, 30 s bei 95°C; Annealing, 30 s bei 63°C; Polymerisierung, 30 s bei 72°C.
  • D. Kontrolle des PCR-Fortschritts
  • sDie Menge an während der PCR entstandener doppelsträngiger DNA wurde halbquantitativ verfolgt. Dies diente dem Zweck, die Anzahl an PCR-Zyklen möglichst klein zu halten. Dadurch werden nur so viele PCR-Zyklen durchgeführt, wie nötig sind, um genügend Template für die T7-Reaktion zu erhalten. Während der PCR wurden daher ab einer gewissen Zyklenzahl Aliquots aus den PCR-Ansätzen entnommen und zu 90 μl einer PicoGreen-Lösung (verdünnt 1:400 in TE [10 mM Tris-HCl, pH 8; 1 mM EDTA]) gegeben. PicoGreen ist ein Fluoreszenzfarbstoff der frei in Lösung kaum, an doppelsträngige DNA gebunden jedoch stark fluoresziert (Ex: 485 nm; Em: 520 nm). Messung der Fluoreszenz im Vergleich zu einer Kontrolle ohne thermostabile Polymerase erlaubt eine recht genaue Abschätzung des PCR-Fortschritts. Nach Erreichen des Schwellenwerts (Fluoreszenz gecycelt/Fluoreszenz ungecycelt > 2) kann ein Aliquot der RT-PCR-Reaktion als Template für die in vitro-Transkription dienen.
  • E. Automatische Manipulationen
  • Ab der dritten Runde wurden alle Manipulationen außer drei Gekeinigungsschritten auf einem Pipettierroboter vollautomatisch durchgeführt. Die Anordnung der einzelnen dabei verwendeten Module auf dem Arbeitsbereich des Roboters geht aus 2 hervor. Folgende Module wurden eingesetzt:
    • – Fluoreszenzleser zur Kontrolle des Amplifikationsfortschrittes während der PCR. Proben, in denen bereits ausreichend DNA erzeugt worden ist, werden vollautomatisch zwischengelagert und keinen weiteren Thermocyclen unterworfen.
    • – Doppelvakuumkammer mit Kammer A für die Trennung von an die Matrix gebundenen und ungebundenen RNA-Spezies und Kammer B für die Aufreinigung von Transkriptionsreaktionen.
    • – Halterungen für Pipettenspitzen.
    • – Thermocycler zur Durchführung der PCR-Programme sowie für diverse Inkubationsschritte.
    • – Schüttler zur Suspendierung von Matrix in Bindungs- oder Reaktionspuffer.
    • – 50°C Arbeitsstation, um enzymatische Reaktionen direkt bei dieser Temperatur starten zu können ("hot Start") bzw. um PCR-Reaktionen während der Probennahme zur Fluoreszenzkontrolle nicht zu sehr abkühlen zu lassen.
    • – 4°C Arbeitsstation zur Zwischenlagerung von PCR- bzw. Transkriptionsreaktionen.
    • – 4°C Reagenzienständer zur Aufbewahrung von wärmeempfindlichen Reagenzien wie Enzyme oder vorbereitete Reaktionsgemische.
    • – RT/37°C Reagenzienständer zur Aufbewahrung von Waschpuffern.
    • – RT/37°C Arbeitsstation zur Durchführung der meisten Manipulationen.
    • – Fluoroplatten Arbeitsstation zur Vorbereitung der Proben zur Fluoreszenzmessung.
    • – Hotel zur Lagerung von momentan nicht bearbeiteten Platten.
    • – Abfallposition für Deponieren von gebrauchten Pipettenspitzen.
  • Die Beteiligung der einzelnen Module am im Rahmen dieses Beispiels beschriebenen Selektionsprozess sowie die Reihenfolge ihrer Benutzung geht aus 1 hervor.
  • F. Ergebnisse
  • Selektionsverlauf
  • Der Verlauf der Selektion ist in 9 dargestellt. In jeder Selektionsrunde wurden drei unterschiedlich stringente Ansätze sowie eine Leersäule ohne D-CGRP als Zielmolekül gefahren. Die Stringenz wurde sowohl durch Variation des verwendeten Waschvolumens als auch durch Verwendung von geringeren D-CGRP-Konzentrationen erhöht.
  • Die Selektionsrunden 1 und 2 wurden manuell durchgeführt, weil die großen Mengen an Matrix, die für die Bindung des D-CGRP in den (notwendigermassen hohen) Konzentrationen dieser initialen Runden erforderlich sind, nicht mehr sicher von Pipettierautomaten bearbeitet werden können. Ab Runde 3 wurde vollautomatisch selektiert, wobei nach jeweils zwei automatischen Selektionrunden entschieden wurde, welcher Selektionsstrang fortzusetzen war.
  • In 9 ist derjenige Selektionsstrang durch dicke Balken hervorgehoben, der letztendlich auch die nachstehenden Sequenzen hervorbrachte. Generell wurde die selektierte RNA des stringentesten Stranges, d.h. der geringsten Peptidkonzentration bzw. des höchsten Waschvolumens, welche bei der Amplifikation noch ein signifikantes Signal über der Nullkontrolle ergab, in die nächste Runde eingesetzt. Als Maß für dieses Signal galt die Anzahl an Zyklen, die notwendig war, um den Schwellenwert (s. "Kontrolle des PCR-Fortschritts") zu erreichen. Insgesamt wurden 9 präparative Runden, davon sieben automatisch, und eine weitere, analytische Runde mit insgesamt sieben verschiedenen Peptidkonzentrationen durchgeführt.
  • Die Populationen an dsDNA-Molekülen aus Runde 9 mit 110 nM (Ansatz 110) bzw. Runde 9 mit 12 nM D-CGRP (Ansatz 12) wurden kloniert und es wurden insgesamt 96 Klone (je 48) sequenziert.
  • Sequenzen
  • Das Ergebnis der Sequenzanalyse ist in 10 dargestellt. Von den insgesamt 96 Klonen konnten in 85 Klonen beide Primer wiedergefunden werden. Für die verschiedenen Klone wurde die folgende Reihenfolge festgestellt:
    Figure 00390001
    Figure 00400001
  • Ranking der erhaltenen Klone bezüglich ihrer Bindungseigenschaften
  • Ein Vergleich der Bindungsstärke von 10 dieser Moleküle gegenüber dem Zielmolekül D-CGRP wurde nach radioaktiver Markierung der RNA-Moleküle angestellt. Untersucht wurden die Moleküle mit der Seq.ID.No. 1 bis 10. Dazu wurden jeweils 7 pool der markierten RNA für 3 Minuten bei 95°C in Selektionspuffer ohne Ca++ bzw. Mg++ denaturiert, durch Zugabe von jeweils 1 mM dieser Ionen bei Raumtemperatur gefaltet und dann für 1 Stunde mit biotinyliertem D-CGRP in Konzentrationen von 0, 100 bzw. 300 nM bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend wurde eine konstante Menge NeutrAvidin-Agarose-Partikel als Matrix zugegeben und der RNA:Peptid-Komplex für 10 Minuten unter Schütteln immobilisiert. Die Matrix wurde abgetrennt, der Überstand abgenommen und die Differenz der gebundenen/ungebundenen RNA ermittelt. Von den ermittelten Werten wurde die Kontrolle (0 nM D-CGRP) als Hintergrund abgezogen. Die prozentualen Anbindungen sind in 11 dargestellt.
  • Beispiel 2: Verkürzung eines Aptamers, das n-CGRP in Lösung bindet
  • Um Aptamere bzw. Spiegelmere wirtschaftlich produzieren zu können, ist es essentiell, dass die durch in vitro-Selektion erhaltenen Moleküle auf ihr minimales Bindungsmotiv verkürzt und möglichst noch in ihrem Bindungsverhalten optimiert werden. Ausgehend von den in Beispiel 1 beschriebenen D-CGRP-bindenden RNA-Aptameren und den hierzu korrespondierenden RNA-Spiegelmeren, die freies t-CGRP erkennen können, wurde versucht, die Länge der jeweiligen Aptamere bzw. Spiegelmere zu verlkürzen. Von den insgesamt 10 Klonen, deren Bindungsverhalten überprüft wurde, zeichneten sich die sehr ähnlichen und überdies häufigen Klone H1 und G2 durch gute D-CGRP-Bindung aus. Ihre mit dem Programm rnafold (I.L. Hofacker et al., 1994. Monatsh. Chem 125: 167-188) berechneten Sekundärstrukturen ließen überdies vermuten, dass die für alle Sequenzen konstanten Primerregionen nicht an der Ausbildung der für die Zielmolekülerkennung wichtigen Strukturen beteiligt sind (12).
  • Molekül H1 unterscheidet sich von G2 durch das Fehlen von zwei komplementären Basen, die Bestandteil einer intramolekularen Helix sind (G25 und C59 in Molekül G2). Da beide Moleküle vergleichbar gut ans Zielmolekül binden, wurde von der Sequenz des kürzeren Moleküls H1 (82-mer) ausgegangen. Ein entsprechendes ssDNA-Molekül zur in vitro-Transkription des Moleküls H1V (47-mer; Entfernung der Basen 1-17 sowie 65-82; Austausch von C 18 → G und G64 → C) wurde synthetisiert, zur dsDNA aufgefüllt und mittels T7-Polymerase das gewünschte, radioaktiv markierte Aptamer (SEQ.ID.No. 17) erzeugt. Die mit dem Programm rnafold berechnete Sekundärstruktur von H1V ist in 13 dargestellt.
  • Nach Aufreinigung wurden die Bindungseigenschaften von H1V, wie bereits in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Wie aus 11 ersichtlich, führt die Verkürzung von Klon H1 zu keiner verschlechterten Bindung an das Zielmolekül D-CGRP.
  • Beispiel 3: Hemmung der cAMP-Produktion durch Ratten-α-L-CGRP bindende Spiegelmere
  • Ausgehend von der Sequenz des Klons H1 wurden verschiedene verkürzte Spiegelmere (also aus L-Nukleotiden) mit Längen zwischen 47 und 39 nt im Hause synthetisiert (14). Die biologische Wirksamkeit dieser Moleküle (H1C [47-mer] (SEQ.ID.Nr. 18); H1C 1[43-mer] (SEQ.ID.Nr. 19); H1C 2[43-mer] (SEQ.1D.Nr. 20); H1C 1+2 [39-mer], (SEQ.ID.Nr. 21)) sollte in Zellkultur-Experimenten analysiert werden.
  • A. Zellkultivierung
  • Zur Zellkultivierung wurden Zellen der humanen Neuroblastoma-Linie SK-N-MC (DSMZ, Braunschweig) in einer Zahl von 4 × 104 pro Napf einer 96 Napf-Mikrotiterplatte ausgesät und bei 37°C und 5% CO2 in DMEM (1.000 mg/l Glucose) mit 10% hitzeinaktiviertem fötales Kälberserum (FCS), 4 mM L-Alanyl-L-Glutamin (GLUTAMAX), 50 units/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin kultiviert. 48 Stunden nach Aussaat waren die Zellen zu 80 – 90 % konfluent und wurden für die Versuche eingesetzt.
  • B. Vorbereitung, Stimulierung und Lyse der Zellen
  • Die Spiegelmere wurden zusammen mit 1 nM t-CGRP (Bachem) in Hank's balanced satt solution (HBSS) + 1 mg/ml BSA für 15 – 60 Minuten bei 37°C in einer 0,2 ml "low profile 96-tube"-Platte inkubiert. Kurz vor Zugabe zu den Zellen wurden 2 μl einer 50 mM IBMX-Lösung (3-Isobutyl-l-methylxanthin) zugegeben. Die Zellen wurden 20 Minuten vor Zugabe der L-CGRP/Spiegelmer-Ansätze mit 1 mM IBMX vorbehandelt.
  • Zur Stimulation wurde das Medium von den Zellen abgesaugt und die vorinkubierten Ansätze zugegeben. Nach Inkubation für 30 Minuten bei 37°C wurden die Überstände abgesaugt und die Zellen mit 50 μl/Napf Lysis-Puffer für 30 Minuten bei 37°C lysiert. Der Lysis-Puffer ist Bestandteil des "cAMP-Screen System"-kits (Applied Biosystems), mit dem der cAMP-Gehalt der Extrakte bestimmt wird. Jeweils 10 μl der Extrakte werden in den Test eingesetzt.
  • C. Testdurchführung
  • Die Durchführung des Tests erfolgte wie vom Hersteller beschrieben. In einer Assay-Platte (beschichtet mit Ziegen anti-Kaninchen IgG) wurden zu 50 μl des Lysis-Puffers 10 μl/Napf des Lysats gegeben und mit 30 μl/Napf des nach Herstellerangaben verdünnten CAMP-Alkalische Phosphatase-Konjugats vermischt. Danach wurden 60 μl/Napf des im Kit mitgelieferten cAMP-Antikörpers hinzugefügt und eine Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Lösungen aus den Näpfen entfernt und diese 6 mal mit dem mitgelieferten Waschpuffer gewaschen. Zur Detektion wurden 100 μl/Napf CSPD/Sapphire-II RTU Substrat zugegeben, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Lumineszenz in einem POLARstar Galaxy Multidetektions-Plattenlesegerät (BMG) gemessen.
  • D. Ergebnisse der Zellkultur-Experimente
  • Die biologische Wirksamkeit der Spiegelmere wurde zunächst grob abgeschätzt. Dazu wurden die Moleküle H1C, H1C 1, H1C 2 und H1C 1+2 nur in einer Konzentration (300 nM) eingesetzt, die Zellen stimuliert, lysiert und schließlich der cAMP-Gehalt der Extrakte wie beschrieben bestimmt. Es wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt und die gebildeten Mengen an cAMP als Prozentsatz der Kontrolle (kein Spiegelmer im Vorinkubationsansatz) + Standardabweichung aufgetragen.
  • Die Ergebnisse des Rankings sind in 15 dargestellt. H1C inhibierte die cAMP-Produktion der Zellen um 66%, H1C 1 um 37.8% sowie H1C 1+2 um 21,4%. Die für H1C 2 beobachtete Aktivierung der cAMP-Produktion ist höchstwahrscheinlich ein Artefakt.
  • Für das effektivste Molekül H1C wurde eine Dosis-Wirkungskurve für L-CGRP erstellt ([L-CGRP] = 1; 3; 10; 30; 100; 200; 300; 400; 1000 nM). Aus der Kurve lässt sich eine IC50– also die Konzentration an Spiegelmer, bei der nur noch 50% der in der Kontrolle vorhandenen cAMP-Menge gebildet wird – von ca. 150 nM abschätzen. Das Ergebnis ist in 16 dargestellt.
  • Die in der vorangehenden Beschreibung, dem Sequenzprotokoll, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00440001
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Claims (30)

  1. Verfahren zur Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäureliganden an ein Zielmolekül binden können, umfassend die Schritte a) Kontaktieren der Mischung mit dem immobilisierten Zielmolekül, b) Abtrennen der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung, wobei die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) in einem Komplex mit dem Zielmolekül vorliegen, c) Elution der mit einer höheren Affmität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül; und d) optional Amplifizieren der mit höherer Affinität bindenden Nukleinsäure(n), wodurch ein angereichertes Nukleinsäureprodukt entsteht, wobei das Zielmolekül an einer Oberfläche immobilisiert vorliegt und das Verfahren einen Ultrafiltrationsschritt umfasst.
  2. Verfahren zur Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäureliganden an ein Zielmolekül binden können, umfassend die Schritte a) Kontaktieren der Mischung mit dem Zielmolekül, b) Immobilisieren des Zielmoleküls und/oder der Komplexe aus Zielmolekül und Kandidatennukleinsäure(n), c) Abtrennen der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung, wobei die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) in einem Komplex mit dem Zielmolekül vorliegen, d) Elution der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül, und e) optional Amplifizieren der mit höherer Affinität bindenden Nukleinsäure(n), wodurch ein angereichertes Nukleinsäureprodukt entsteht, wobei das Zielmolekül an einer Oberfläche immobilisiert vorliegt und das Verfahren einen Ultrafiltrationsschritt umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Ultrafiltrationsschritt während oder nach der Elution erfolgt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Ultrafiltrationsschritt während oder nach der Amplifikation erfolgt.
  5. Verfahren zur Selektion eines oder mehrer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidatennukleinsäuren, wobei die Nukleinsäureliganden an ein Zielmolekül binden können, bevorzugterweise nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die Schritte a) Kontaktieren der Mischung mit dem Zielmolekül, wobei aa) das Zielmolekül immobilisiert ist, oder ab) nach dem Kontaktieren der Mischung mit dem Zielmolekül das Zielmolekül und/oder Komplexe aus Zielmolekül und Kandidatennukleinsäure(n) immobilisiert werden, b) Abtrennen der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung, wobei die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) in einem Komplex mit dem Zielmolekül vorliegen, c) Elution der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül, und d) optional Amplifizieren der mit höherer Affinität bindenden Nukleinsäure(n), wodurch ein angereichertes Nukleinsäureprodukt entsteht, wobei das Zielmolekül an einer Oberfläche immobilisiert vorliegt und das Abtrennen gemäß Schritt b) mittels einer Filtration, bevorzugterweise eine Mikrofiltration, erfolgt, wobei eine Vakuumkammer verwendet wird, umfassend ein Bodenteil (10) und ein Deckelteil (11), wobei das Bodenteil (10) und das Deckelteil (11) bevorzugterweise durch eine Dichtung voneinander getrennt sind, und das Deckelteil (11) mindestens eine vollständige durch das Deckelteil sich erstreckende Bohrung (13, 14) aufweist, wobei die Bohrung eine Mindestlänge aufweist, so dass beim Filtrationsschritt eine Kontamination zwischen zwei nebeneinander erfolgenden Filtrationen nicht auftritt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Abtrennen in Schritt b) mittels Mikrofiltration erfolgt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein automatisiertes Verfahren ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrafiltration an einer Ultrafiltrationsmembran mit einer molekularen Ausschlussgröße von etwa 1.000 bis 100.000, bevorzugterweise etwa 10.000 bis 50.000 Da erfolgt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrofiltration an einer Mikrofiltrationsmembran oder Fritte erfolgt mit einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 0,1 bis 100 μm, bevorzugterweise etwa 1 bis 35 μm und bevorzugtesterweise etwa 10 μm.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche bereitgestellt wird durch Partikel, wobei bevorzugterweise die Partikel ausgewählt sind aus der Gruppe, die magnetische und nicht-magnetische Partikel umfasst.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Elution durch Verwenden von Wasser, denaturierenden Agenzien, durch Erhitzen des Reaktionsgemisches oder durch Verwendung von Kompetitoren erfolgt.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das denaturierende Agens ausgewählt ist aus der Gruppe, die Harnstoff, EDTA, Guanidinium-HCL, Guanidinium-Isothiocyanat, Detergenz, Kombinationen von Harnstoff und EDTA umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Kompetitor ein Peptid oder ein Fragment des Zielmoleküls ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Ultrafilter und/oder der Mikrofilter in einer Filtersäule enthalten ist, wobei die Filtersäule aus einem Aufnahmestück und einem Auslassstück besteht, die beide durch ein konisches Zwischenstück miteinander verbunden sind und der Ultrafilter oder der Mikrofilter am Übergang zwischen dem konischen Zwischenstück und dem Auslassstück angeordnet ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtersäule in einer Vorrichtung gehalten wird bestehend aus einem Bodenteil und einem Deckelteil, wobei der Deckelteil ein oder mehrere Mittel zur Aufnahme der Filtersäule aufweist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Aufnahme der Filtersäule eine Bohrung ist, wobei die Bohrung eine Mindestlänge aufweist.
  17. Verwendung einer Filtersäule in einem Verfahren zur Selektion von Nukleinsäweliganden, insbesondere in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Fritte ein erstes Aufnahmestück (1) umfasst, das in ein konisches Zwischenstück (2) übergeht und das konische Zwischenstück wiederum in ein Auslassstück (3) übergeht, wobei am Übergang zwischen dem Zwischenstück (2) und dem Auslassstück (3) ein Filter angebracht ist.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter ein Mikrofilter oder ein Ultrafilter ist.
  19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufnahmestück (1) ein Befestigungsmittel aufweist.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Befestigungsmittel an dem entgegengesetzten Ende des Aufnahmestückes (1) angebracht ist, wo dieses in das konische Zwischenstück (2) übergeht.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtersäule an der Außenwand, bevorzugterweise an der Außenwand des Aufnahmestückes, ein Verbreiterungsmittel aufweist.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Verbreiterungsmittel ausgebildet ist als ein an der Außenwand angebrachter Ring, wobei der Ring bevorzugterweise senkrecht zur Längsachse des Aufnahmestückes (1) und/oder des Auslassstückes (3) angeordnet ist.
  23. Vakuumkammer zur Verwendung in einem Verfahren zur Selektion von Nukleinsäureliganden, insbesondere in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend ein Bodenteil (10) und ein Deckelteil (11), wobei das Deckelteil (11) mindestens eine vollständig durch das Deckelteil sich erstreckende Bohrung (12) aufweist, wobei die Bohrung eine Mindestlänge aufweist.
  24. Vakuumkammer zur Verwendung in einem Verfahren zur Selektion von Nukleinsäweliganden, insbesondere in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend ein Bodenteil (10) und ein Deckelteil (11), wobei das Deckelteil (11) mindestens zwei vollständig durch das Deckelteil sich erstreckende Bohrungen (12) aufweist, wobei die Bohrungen eine Mindestlänge aufweist, die gewährleistet, dass es zu keiner Kontamination des Filtrationsvorganges und/oder zu filtrierenden Lösung durch ein Filtrat der zweiten Filtration kommt.
  25. Vakuumkammer nach einem der Ansprüche 23 bis 24 umfassend eine Filtersäule wie beschrieben nach einem der Ansprüche 15 bis 20.
  26. Vorrichtung mit einer Ablaufsteuereinheit zum Steuern eines Aufnehmers für einen flüssigen und/oder festen Stoff, wobei der Aufnehmer geeignet ist, eine Abfolge umfassend ein Aufnehmen des Stoffes, ein Transportieren des Stoffes und ein Abgeben des Stoffes in einen Behälter durchzuführen, wobei der Aufnehmer so gesteuert ist, um in dem Behälter eine Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren mit einem Zielmolekül zu kontaktieren, an das die Nukleinsäureliganden binden können, und um die kontaktierte Kandidatenmischung in eine Trennvorrichtung zu transportieren, in der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung abtrennbar sind, um die mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül zu eluieren, und um optional eine Amplifikation der mit höherer Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) durchzuführen, wobei während oder nach der Elution ein Ultrafiltrationsschritt durchgeführt wird.
  27. Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass während oder nach der Amplifikation ein Ultrafiltrationsschritt durchgeführt wird.
  28. Vorrichtung mit einer Ablaufsteuereinheit zum Steuern eines Aufnehmers für flüssige und/oder feste Stoffe, wobei der Aufnehmer geeignet ist, eine Abfolge von Aufnehmen des Stoffes, Transportieren des Stoffes und Abgeben des Stoffes in einen Behälter durchzuführen, wobei der Aufnehmer so gesteuert ist, um das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 durch mehrfache Abfolgen durchzuführen.
  29. Verfahren zum Steuern eines Aufnehmers zur Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden, wobei der Aufnehmer geeignet ist, eine Abfolge umfassend ein Aufnehmen eines flüssigen und/oder festen Stoffes, ein Transportieren des Stoffes und ein Abgeben des Stoffes in einen Behälter durchzuführen, wobei der Aufnehmer so gesteuert wird, um in dem Behälter eine Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren mit einem Zielmolekül zu kontaktieren, an das die Nukleinsäureliganden binden können, um die kontaktierte Kandidatenmischung in eine Trennvorrichtung zu transportieren, in der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) vom Rest der Kandidatenmischung abtrennbar sind, um eine Elution der mit einer höheren Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäure(n) von dem Zielmolekül durchzuführen, um optional eine Amplifikation der mit höherer Affinität an das Zielmolekül bindende(n) Nukleinsäure(n) durchzuführen, und um eine Ultrafiltration während oder nach der Elution und/oder während oder nach der Amplifikation durchzuführen.
  30. Verwendung einer Vorrichtung mit einer Ablaufsteuereinheit zum Steuern eines Aufnehmers für einen flüssigen und/oder festen Stoff, wobei der Aufnehmer geeignet ist, eine Abfolge umfassend ein Aufnehmen des Stoffes, ein Transportieren des Stoffes und ein Abgeben des Stoffes in einen Behälter durchzuführen, für die Selektion eines oder mehrerer Nukleinsäureliganden aus einer Mischung von Kandidaten-Nukleinsäuren, insbesondere für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
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