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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft ein Nukleinsäureamplifizierungsverfahren.
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Hintergrund der Erfindung
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WO 01/06004 offenbart ein
Verfahren zum Erhöhen
der Anzahl von Polynukleotiden, welche Sequenzen, welche einer in
einer Probe vorhandenen mRNA-Spezies entsprechen, enthalten. Dieses
Verfahren umfasst 3 Schritte, d. h. Umkehrtranskription der mRNA-Spezies
unter Verwendung einer ersten Primerpopulation mit als „heel" bezeichnetem Sequenzüberhang,
um erste cDNA-Stränge
bereitzustellen; Synthese von zweiten cDNA-Strängen ausgehend von den ersten
unter Verwendung einer zweiten Primerpopulation mit als „heel" bezeichnetem Sequenzüberhang;
und Amplifizierung der ersten und zweiten cDNA-Stränge. Die
als „heel" bezeichnete Überhangsequenz
der Primer, die in dem ersten und/oder zweiten Schritt verwendet
werden, enthält eine
RNA-Polymerase-Promotorstelle. Die Primer, die bei der Amplifizierung
verwendet werden, umfassen mindestens einen Abschnitt der ersten
als „heel" bezeichneten Überhangsequenz
und einen Abschnitt der zweiten als „heel" bezeichneten Überhangsequenz. Eine oder jede
der als „heel" bezeichneten Überhangsequenzen
umfasst vorzugsweise die Nukleotidsequenz einer seltenen Restriktionsenzymspaltstelle;
die Polynukleotide, die hergestellt werden, können Konkatemere umfassen,
können
aber mit einem Mittel behandelt werden, das an dieser Spaltstelle
spaltet, ohne die gewünschten
Amplicons zu beeinträchtigen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die in
WO 01/06004 offenbarte Vorgehensweise
vereinfacht werden kann. Gemäß der Erfindung
umfasst ein Verfahren zum Erhöhen
der Anzahl von Polynukleotiden, welche Sequenzen, welche einer in
einer Probe vorhandenen mRNA-Spezies entsprechen, enthalten, die
Schritte:
- (i) in einem einzelnen Schritt, einer
Umkehrtranskription der mRNA-Spezies unter Verwendung eines 5'-Amplifizierungsprimers
mit als „heel" bezeichnetem Sequenzüberhang
und eines 3'-Amplifizierungsprimers
mit als „heel" bezeichnetem Sequenzüberhang,
wobei jeder Primer mit Sequenzüberhang
(„heeled primer”) eine Überhangsequenz
(„heel
sequence"), welche
eine einmalig vorkommende Sequenz umfasst, umfasst und wobei eine
oder jede der Überhangsequenzen
eine RNA-Polymerase-Promotorstelle umfasst und wobei der 5'-Amplifizierungsprimer
mit als „heel" bezeichnetem Sequenzüberhang
eine variable Sequenz umfasst und der 3'-Amplifizierungsprimer mit als „heel” bezeichnetem
Sequenzüberhang
an der 3'-polyA-Stelle in den Transkripten
seine Primerwirkung ausübt,
wobei die RNA revers transkribiert wird, um doppelsträngige cDNA
und dann eine Mehrzahl von cDNAs entsprechend der variablen Sequenz
herzustellen; und
- (ii) einer Amplifizierung der cDNA unter Verwendung von Primern,
die ausreichend identisch zu den einmalig vorkommenden Sequenzen
innerhalb der Überhangsequenzen
des 5'-Amplifizierungsprimers
mit als „heel" bezeichnetem Sequenzüberhang
und des 3'-Amplifizierungsprimers
mit als „heel" bezeichnetem Sequenzüberhang
sind.
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Es
wird offensichtlich sein, dass im Rahmen der Erfindung Umkehrtranskription
und die Erzeugung einer Mehrzahl von cDNAs in einem Schritt ausgeführt werden.
Obwohl die Erfindung mit dem bekannten Verfahren die Verwendung
einer Randomer-Sequenz (zufälligen
Sequenz) gemein hat, so dass die Verwendung von geeigneten Populationen
von variierten Sequenzen eine Mehrzahl von cDNAs ergibt, ist das
neue Verfahren einfacher. Die Umkehrtranskription erfolgt effizienter
und es werden weniger Amplifizierungszyklen benötigt.
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Des
Weiteren wird bei Vergleich mit dem bekannten Verfahren die Notwendigkeit
von seltenen Restriktionsstellen vermieden. Ein anderer Vorteil
besteht darin, dass die Produktion von komplexen Produkten minimiert
wird teilweise aufgrund der Verwendung von einmalig vorkommenden
Sequenzen in FAP und TAP, die in dem Genom, das untersucht wird,
nicht vorkommen. Während
das bekannte Verfahren einen einzelnen Primer verwendet, um die
Produkte nach RT (Umkehrtranskription) und Synthese des zweiten
Strangs zu amplifizieren, stellt die Erfindung darüber hinaus
den signifikanten Vorteil bereit, dass zwei separate Primer mit
einer einmalig vorkommenden Sequenz verwendet werden.
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Die
Erfindung ermöglicht
nicht nur eine stärkere
Amplifizierung, sondern auch eine größere Flexibilität bei der
Verwendung. Beispielsweise ermöglicht
sie leicht die Aufnahme von spezifischen Restriktionsstellen zur
Herstellung von normalisierten und angereicherten Subtraktions-cDNA-Bibliotheken.
Sie erlaubt auch die Aufnahme von spezifischen Restriktionsstellen
für eine
lambda-Klonierung zur Herstellung von Einzelzell-Bibliotheken. Auch
können
spezifische Restriktionsstellen für eine Fragmentierung, für eine Verwendung
als Sonden auf den Mikroarrays (Mikroanordnungen) und Filtern mit
aufgenommen werden. Das Verfahren kann leicht mit einem Protokoll
für eine „Laser
Capture Microdissection",
z. B. wie von Fend et al., Am. J. Pathol. (1999) 154(1): 61–6, beschrieben,
verknüpft
werden.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung umfasst einen dritten Schritt, d. h. (iii) eine in
vitro-Transkription, um
RNA-Run-off-Transkripte von einem der beiden Enden der Amplicons
herzustellen, z. B. unter Verwendung von T3-RNA-Polymerase oder
T7-RNA-Polymerase. Diese ist besonders geeignet für eine Verwendung,
wenn die Menge von Ausgangs-RNA gering ist oder die Anzahl von verfügbaren Zellen
gering ist.
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Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
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Die
Erfindung (die hier als „MEX" beschrieben wird)
ist eine Technologie für
die molekulare Analyse einer Genexpression in geringen Anzahlen
von Zellen sogar bis hinunter auf die Ebene einer einzelnen Zelle. MEX-Produkte
sind so gestaltet, dass sie direkt in ein ganzes Spektrum von nachgeschalteten
molekularen Technologien, einschließlich Einzelzell-PCR, die Konstruktion
und das Screening von Subtraktions-Expressionsbibliotheken, Mikroarray-Analyse
und Ziel-Validierung, integriert werden können und mit diesen verträglich sind.
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Ohne
auf eine Theorie festgelegt werden zu wollen, findet die MEX-Amplifizierung
in zwei Schritten statt: a) ein PCR (Polymerasekettenreaktions)-Schritt,
gefolgt, sofern erforderlich, von einem IVT (in vitro-Transkriptions)-Schritt.
Eine Zusammenfassung der Mechaniken, die der MEX zugrundeliegen,
ist in 1 gezeigt. Kurz zusammengefasst, zeigt diese Zeichnung
einen ersten Schritt, in welchem für eine Umkehrtranskription (RT)
spezifische Sequenzen in sowohl die 5'- als auch die 3'-Enden der zellulären cDNA-Population eingefügt werden.
Diese Sequenzen werden als Primerbindungs- bzw. Startstellen für MEX-PCR-Primer
(in 1 als Rahmen mit Diamanten-Muster bzw. mit punktförmigem Muster
gezeigt) bei der Amplifizierung des Schritts 1 verwendet. Nachfolgend
werden RNA-Polymerase-Promotoren (in 1 als Rahmen
mit gestreiftem bzw. kreuzschraffiertem Muster gezeigt), die innerhalb
der MEX-RT-Primer enthalten sind, für die Produktion von MEX-Produkten
des Schritts 2 verwendet. Diese sind strangspezifische RNA-Spezies,
die in einer Mehrzahl von nachgeschaltet erfolgenden molekularen
Anwendungen verwendet werden können.
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In
Schritt 1 der MEX wird das cDNA-Komplement einer Zellpopulation
sowohl an den 5'- als auch 3'-Enden mit beispielsweise
gesetzlich geschützten
Primersequenzen markiert („tagged"). Diese markierten Produkte
werden nachfolgend unter Verwendung von begrenzten Anzahlen von
PCR-Zyklen amplifiziert. Dies liefert ausreichend Material für eine nachgeschaltet
erfolgende Analyse von so wenig wie 1000 Zellen (10–1100 ng
Gesamt-RNA); diese werden hier als MEX-Schritt 1-Produkte bezeichnet.
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MEX-Schritt
1-Produkte sind abhängig
von dem Einfügen
von MEX-RT-Primerbindungs- bzw.
-Startstellen in den cDNA-Pool und weisen eine ähnliche Größe auf wie Transkripte in der
ursprünglichen
RNA-Population vor einer MEX. Dies veranschaulicht, dass bei MEX
Volllängen-cDNAs produziert
und amplifiziert werden. Zusätzlich
hat eine Bioinformatik-Analyse von klonierten MEX-Produkten gezeigt,
dass 100% der Produkte MEX-RT-Primer an geeigneten Stellen in dem
Transkript (n = 43) enthalten, d. h. der 3'-MEX-Primer entfaltet seine Primerwirkung
präzise
an der 3'-polyA-Stelle
in dem Transkript und der 5'-Primer
ist an dem 5'-Ende
des Transkripts enthalten.
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In
einer besonderen Ausführungsform
initiiert der 3'-Amplifizierungsprimer
mit Sequenzüberhang („heeled") eine Umkehrtranskription
und die cDNA-Synthese der ersten Runde durch Bindung einer (T)20-Sequenz, die in dem 3'-Terminus des Primers enthalten ist,
an polyA-Schwänze in der
mRNA-Population. Dieser Primer enthält eine als „heel" bezeichnete Überhangsequenz
für eine
nachfolgende PCR-Amplifizierung und eine ineinander geschachtelte
(„nested") RNA-Polymerase-Promotorstelle
(für T7-RNA-Polymerase)
für nachfolgende
in vitro- Transkriptionsreaktionen.
Ein zweiter Primer, der 5'-Amplifizierungsprimer
mit Sequenzüberhang
(„heeled"), wird ebenfalls
in die RT-Reaktion mit aufgenommen; dieser initiiert eine zweite
Runde von cDNA-Synthese durch Entfalten einer halb-zufälligen Primerwirkung
ausgehend von der erster Strang-cDNA über eine (N)15-Sequenz,
die am 3'-Terminus
des Primers eingefügt
ist. Dieser Primer enthält
auch eine Überhangsequenz
für eine
nachfolgende PCR-Amplifizierung (Anmerkung: diese Überhangsequenz
ist verschieden von jener in dem 3'-Primer) und eine ineinander geschachtelte
(„nested") RNA-Polymerase-Promotorstelle (für T3-RNA-Polymerase)
für nachfolgende
in vitro-Transkriptionsreaktionen. Die Überhangsequenzen sind einmalig
vorkommende Sequenzen, wie anhand ihres fehlenden Vorkommens in
den gegenwärtigen
Genom-Datenbanken definiert.
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Auf
diese Weise wird eine Population von mRNAs in doppelsträngige cDNAs
umgewandelt, die an ihren 3'-Termini
an dem TAP und an ihren 5'-Termini
an dem FAP verankert sind. Die cDNA-Population enthält dementsprechend
die folgenden Spezies von MEX-Fragmenten (wobei Gen X für ein jegliches
Gen, das revers transkribiert worden ist, steht): FAP-SEQUENZ-T3-RNA-POLYMERASE-SEQUENZ-(N)15-GEN X-(T)20-T7-RNA-POLYMERASE-TAP-SEQUENZ.
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Wenn
eine zusätzliche
Amplifizierung erforderlich ist, z. B. aufgrund der limitierenden
Natur der verfügbaren
RNA in der Ausgangsprobe, kann eine IVT-Reaktion an MEX-Produkten
des Schritts 1 ausgeführt werden,
um die Empfindlichkeit dieser Technologie zu erweitern. Dies wird
erzielt durch das Einfügen
einer RNA-Polymerase-Stelle in die gesetzlich geschützten MEX-RT-cDNA-Syntheseprimer
und erweitert das Nachweisspektrum bis hin auf die Ebene einer einzelnen
Zelle (~10–100
pg Gesamt-RNA). Diese Technik erlaubt auch die Herstellung von strangspezifischen
Sonden (sowohl Sinn als auch Antisinn) ausgehend von dem MEX-Amplicon-Pool durch
unterschiedliches Markieren („Tagging") des 5'-Primers mit einer
T3-Stelle und des 3'-Primers
mit einer T7-Stelle.
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Die
Leistungsfähigkeit
von MEX leitet sich ab aus dessen Fähigkeit, verlässlich,
einfach, reproduzierbar und in einer repräsentativen Weise geringe Mengen
von mRNA zu amplifizieren. Nichtsdestotrotz kann das wahre Potential
dieser Technologie am besten erfasst werden durch das Verknüpfen von
dieser mit einer Reihe von vorgeschaltet und nachgeschaltet ablaufenden
Anwendungen. Diese umfassen vorgeschaltet ablaufende Zellernte-Techniken,
wie „Laser
Capture Microdissection" (LCM)
und „Patch
Clamp Harvesting” (mittels
der Patch-Clamp-Technik erfolgende Materialgewinnung; PCH) und nachgeschaltet
ausführbare
molekulare Anwendungen, die die MEX-Produkte als Ausgangspunkte
verwenden.
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So
ist bekannt, dass die verstreute Lage von erkrankten Zellen in vielen
Geweben und die Schwierigkeit, diese Zellen bis zur Homogenität durch
herkömmliche
Techniken aufzureinigen, zu der Entwicklung von LCM geführt hat.
Durch Verwendung dieses Ansatzes ist es jetzt möglich, Zellen von Interesse
in moderaten Anzahlen mit einem hohen Grad an Genauigkeit visuell
zu identifizieren und zu ernten. Diese Zellen können weiter verarbeitet werden,
um die RNA zu isolieren, und diese kann unter Verwendung von MEX
amplifiziert werden.
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Ferner
können
MEX-Produkte so gestaltet werden, dass sie mit einem ganzen Spektrum
von mit hohem Durchsatz ausgeführten
molekularen Techniken verträglich
sind. Gestaltungsmerkmale in den MEX-Primern umfassen das Einfügen von
Vektor-kompatiblen Restriktionsstellen für die Konstruktion von PCR-Subtraktionsbibliotheken
und die Fähigkeit,
strangspezifische Sonden für
das Screenen von Mikroanordnungen (Mikroarrays) und Affymetrix-Chips
herzustellen.
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Wie
nachfolgend detaillierter gezeigt, ist MEX erfolgreich verwendet
worden, um PCR-Subtraktionsbibliotheken
herzustellen. Diese sind mit auf herkömmliche Weise hergestellten
Bibliotheken verglichen worden, und es ist gezeigt worden, dass
sie in der Zusammensetzung extrem ähnlich sind. Auf diese Weise
ist es möglich,
den RNA-Gehalt von zwei kleinen Populationen von Zellen zu amplifizieren,
eine Population von der anderen zu subtrahieren und Paradigmen-spezifische
Bibliotheken mit einem hohen Ausmaß an Anreicherung für unterschiedlich
exprimierte Gene herzustellen.
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Ein
effizientes Verfahren zum Screenen der Populationen von Produkten,
die innerhalb von MEX-Subtraktionsbibliotheken oder innerhalb der
Drohen MEX-Amplicon-Pools enthalten sind, erfolgt durch Klonieren von
diesen Produkten und Immobilisieren von diesen auf einem Substrat,
z. B. durch Koppeln von diesen auf Glas-Mikroanordnungen oder -arrays
als Sonden. Zusätzlich
und parallel dazu können
rohe Amplicons und Bibliotheken als markierte Ziele, um diese und
andere Mikroanordnungen bzw. -arrays zu screenen, verwendet werden.
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Eine
wichtige Facette einer jeglichen Amplifizierungstechnologie ist
das Erfordernis, dass nach einer Amplifizierung die Repräsentation
von RNA-Spezies jene in dem unamplifizierten Material Wiederspiegeln
sollte. Dies ermöglicht,
dass vergleichende Analysen zwischen Proben ausgeführt werden
können.
MEX bewahrt die Repräsentation
der ursprünglichen
Ausgangspopulation von RNA nach einer Amplifizierung. Dies trifft
zu unabhängig
davon, ob die Ausgangsproben ähnlich
oder unterschiedlich sind, und ist gut vergleichbar mit der Repräsentation
in den ursprünglichen
Voramplifizierungsproben. In gleicher Weise wird die Repräsentation
sogar bei geringen Konzentrationen von Ausgangsmaterial bewahrt.
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Obwohl
die entscheidenden Unterschiede zwischen der Erfindung und dem in
WO 01/06004 offenbarten
Verfahren im Gedächtnis
behalten werden, ist die Offenbarung des letztgenannten Dokuments
in vieler Hinsicht relevant. Beispielsweise offenbart jenes Dokument
bestimmte relevante Materialien und Verfahrensbedingungen und welche
leicht für
die Zwecke dieser Erfindung durch einen Fachmann auf diesem Gebiet
adaptiert werden können.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Wie oben, werden „FAP" und „TAP" als Abkürzungen
für 5'- bzw. 3'-Amplifizierungsprimer
verwendet.
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Beispiel 1: MEX-RT-Reaktion
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In
diesem Schritt wurden spezifische Primerbindungs- oder -initiierungsstellen
für eine
PCR-Amplifizierung in geeignete Enden der cDNA-Population gentechnologisch
eingebaut.
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10 μl Gesamt-RNA
(hergestellt entweder durch molekularbiologische Standardprotokolle
ausgehend von Zellen/Geweben/"Laser
Capture Microscopy"-Zellernten
oder ausgehend von direktem „Patch
clamp harvesting"),
gelöst
in Wasser, wurden zu 1 μl
von jeweils 5'-Amplifizierungsprimer
mit Sequenzüberhang
(„heeled") und 3'-Amplifizierungsprimer
mit Sequenzüberhang
(„heeled"), jeweils in einer
Konzentration von 10 μM, zugegeben.
Der 5'-Amplifizierungsprimer
mit Sequenzüberhang
(„heeled") ist ACT CCG GGA
ACC ATA GTG GCA CTC CTA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAG ATC GTAC (N)15, wovon die Basen 1-25 den Primer (FAP), die
Basen 26-46 den T3-RNA-Polymerase-Promotor, die Basen 48-51 (GATC)
eine Sau3A-Restriktionsstelle und die Basen 52-55 (GTAC) eine RsaI-Restriktionsstelle
bilden. Die Sequenz des 3'-Amplifizierungsprimers mit
Sequenzüberhang
(„heeled") ist CAA GCA TTC
AGT ATC TCG ACT GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA GAT CGT AC (T)20, von welcher die Basen 1-22 den Primer
(TAP), die Basen 22-45 den T7-RNA-Polymerase-Promotor und die Basen
46-53 die gleichen Restriktionsstellen bilden. Dies wurde 5 min
auf 70°C
erwärmt
vor dem schnellen Abkühlen
auf Eis für
2 min.
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4 μl 5× „Reverse
Transcription"-Puffer
(Superscript II-Kit, Invitrogen), 2 μl 0,1 M Dithiothreitol (DTT,
Superscript II-Kit, Invitrogen), 1 μl dNTPs (10 mM-Mischung von
jeweils dATP, dTTP, dGTP und dCTP) und 1 μl Superscript II-reverse Transkriptase-Enzym
(Superscript II in einer Konzentration von 200 E/μl, Invitrogen) wurden
zugegeben und die Reaktion bei 42°C
1 h inkubiert.
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MEX-Amplifizierungsreaktion
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In
diesem Schritt wurden die revers transkribierten MEX-RT-Produkte
für nachgeschaltet
erfolgende molekulare Anwendungen durch PCR amplifiziert.
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5 μl der RT-Reaktion
wurden in einer 100 μl-PCR
durch die Zugabe der folgenden Reagenzien amplifiziert: 10 μl Advantage
II PCR-Puffer (Clontech), 1 μl
dNTPs (10 mM-Mischung von jeweils dATP, dTTP, dGTP und dCTP), 1 μl FAP, d.
h. die Basen 1-25 des 5'-Amplifizierungsprimers
mit Sequenzüberhang
(„heeled"), der oben definiert
wurde, in einer Konzentration von 10 μM und 1 μl TAP, d. h. die Basen 1-22
des 3'-Amplifizierungsprimers
mit Sequenzüberhang
(„heeled"), der oben definiert
wurde, in einer Konzentration von 10 μM und 77 μl steriles Wasser.
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Die
Zyklus-Parameter waren, wie folgt: 95°C für 1 min für einen Zyklus, dann bis zu
24 Zyklen von 95°C
für 15
s, 65°C
für 30
s, 68°C
für 6 min.
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Beispiel 2 MEX ausgehend von Kontroll-RNAs
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Ungefähr 100 ng
Gesamt-Hirn-RNA wurden gemäß dem MEX
RT/Amplifizierungsprotokoll von Beispiel 1 revers transkribiert.
Davon wurde eine Reihenverdünnung
hergestellt und diese einer MEX-Amplifizierung für entweder 9 Zyklen oder 15
Zyklen unterworfen. Zusätzlich wurde
auch eine Kontrolle, wo keine Amplifizierung ausgeführt worden
war, mit aufgenommen. Eine PCR wurde ausgeführt, um das Amplifizierungsausmaß von Aktin-mRNA-Transkripten
in den cDNA- und MEX-amplifizierten Pools zu bestimmen.
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Aktin-Transkripte
konnten nur in unamplifizierten cDNAs in einer Konzentration von
50 ng Gesamt-RNA-Äquivalent
nachgewiesen werden. Transkripte konnten bei cDNA-Konzentrationen unter
5 pg nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnte Aktin in
den gleichen cDNA-Proben bei so geringen Konzentrationen wie 0,5
pg nach 9 Zyklen MEX-Amplifizierung
und 50 fg nach 15 Zyklen MEX-Amplifizierung nachgewiesen werden.
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Dieses
Experiment zeigt, dass eine MEX-Amplifizierung von cDNAs den Nachweisbereich
unter jenen, bei welchem ein Nachweis durch herkömmliche RT-PCR allein möglich ist,
ausdehnt.
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Beispiel 3 MEX ausgehend von „Laser
Capture"-Zellen
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Kultivierte
G1-Zellen wurden auf Glas-Mikroskopobjektträgern kultiviert und für eine „Laser
Capture Microdissection" (LCM)
weiterbehandelt. Definierte Anzahlen von Zellen wurden geerntet
und RNA unter Verwendung des „micro-RNA
extraction kit" von
Stratagene extrahiert. Diese RNA wurde unter Verwendung von MEX-RT-Primern
revers transkribiert und dann einer MEX-Amplifizierung für entweder
15 oder 21 Zyklen unterworfen. Ein Teil der cDNA wurde auch für eine Analyse
ohne MEX-Amplifizierung zurückbehalten.
Eine PCR wurde unter Verwendung von für Aktin spezifischen Primern
als abschließender
Assay der Effizienz der MEX-Amplifizierung
ausgeführt.
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Die
Aktin-Sequenz wurde nach 15 Zyklen MEX-Amplifizierung in so wenig
wie 50 Zellen und nach 21 Zyklen MEX-Amplifizierung in so wenig
wie 10 Zellen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu war die Aktin-Sequenz
in Proben, die keiner MEX-Voramplifizierung unterworfen worden waren,
nicht nachweisbar. Dies zeigt, dass MEX verwendet werden kann, um
molekulare Techniken mit LCM zu verknüpfen.
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Beispiel 4 MEX, verknüpft mit einer in vitro-Transkription
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Ungefähr 100 ng
Gesamt-RNA wurden unter Verwendung von MEX-Primern revers transkribiert,
dann wurden Reihenverdünnungen
erstellt und nachfolgend in drei, sechs oder neun Zyklen MEX-amplifiziert.
Diese Produkte wurden in vitro transkribiert (IVT) unter Verwendung
des Megascribe-Kits (Ambion) und ein zweites Mal unter Verwendung
eines herkömmlichen
(dT)18-Primers und von Superscripts II (Invitrogen)
revers transkribiert. Um die relative Effizienz der Amplifikationen
zu bewerten, wurden 30 Zyklen von Gen-spezifischer PCR für die Aktin-Sequenz
an diesen Produkten ausgeführt.
Die Kombination von drei MEX-Zyklen bei einer Verwendung in Verbindung
mit IVT war ausreichend, um die Identifizierung von Aktin-Transkripten in 5
pg Gesamt-RNA zu ermöglichen.
Die Anwendung von drei zusätzlichen
MEX-Zyklen vor der
IVT ermöglichte,
dieses Nachweisfenster auf 50 fg Gesamt-RNA zu erweitern.
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Zum
Vergleich wurden 15 MEX-Zyklen benötigt, um einen Nachweis von
Aktin in 50 fg RNA ohne die Verwendung von IVT zu ermöglichen.
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Als
Schlussfolgerung kann MEX in Verbindung mit IVT verwendet werden,
um die Empfindlichkeit des Nachweises zu erhöhen, während die Anzahl von Zyklen
minimiert wird. Dies kann wichtig sein, um die Amplicon-Ausbeute
aus einer MEX zu erhöhen,
während
Linearität
der Repräsentation
in dem Amplicon-Pool bewahrt bleibt. Zusätzlich erlaubt die Produktion
von RNA-run-off-Transkripten ausgehend von MEX-Produkten die Verwendung
von diesen Produkten als Sonden an Affymetrix- und anderen Mikroanordnungen
bzw. -arrays.
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Beispiel 5 MEX, welche bei einer Ziel-Identifizierung
verwendet wird
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Um
die Nützlichkeit
von MEX zu demonstrieren, wurden c-Fasern unter Verwendung von LCM
aus einem in vitro-Schmerz-Modell geerntet. Diese Modell basierte
auf primären
Kulturen von Gasser'-Ganglionzellen
von der Ratte, die mit pro-nozizeptiven Mitteln, wie Nervenwachstumsfaktor
(NGF), behandelt worden waren.
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50
Neuronen wurden ausgehend von Gasser'-Ganglion-Kulturen geerntet und RNA
wurde extrahiert und unter Verwendung von 24 MEX-Zyklen amplifiziert.
Gen-spezifische PCR-Primer
wurden verwendet, um eine Anzahl von Haushalts- und mit Schmerz
assoziierten Genen aus diesen Zellen zu identifizieren. Spezieller wurde
der Amplicon-Pool mit Primern für
Gene mit einer bekannten Assoziierung mit Nozizeption untersucht. Wenn
der Amplicon-Pool vor und nach einer MEX-Amplifizierung untersucht
wurde, konnte ein klarer Unterschied beobachtet werden. Während Kontrollgene,
wie Aktin und Cyclophilin (act und cyc) in dem Vor-MEX-Pool nachgewiesen
werden konnten, fehlten andere weniger reichlich vorkommende und
biologisch wichtigere Gene für
die nozizeptive Reaktion, d. h. TrkB-Rezeptor, PN3, Natriumkanal-β3-Untereinheit, mit dem
Calcitoningen in Zusammenhang stehendes Protein („calcitonin
generelated Protein"),
vasointestinales Peptid, Neuropeptid Y, Galanin und Tyrosinhydroxylase
(PN3, β3,
CGRP, VIP, NPY, Gal und TH). Dies stand in Gegensatz zu dem Amplicon-Pool
nach einer MEX-Amplifizierung, wo der größere Teil von diesen pro-nozizeptiven
Genen leicht nachweisbar war. Dies validierte auch das in vitro-Schmerz-Modell.
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Dementsprechend
ist MEX bei dem Nachweisen von Genen von Interesse in geringen Anzahlen
von pathologisch relevanten Zellen von Nutzen. Diese Gene können als
Ziele für
eine therapeutische Intervention verwendet werden.
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Beispiel 6 MEX, die bei der Konstruktion
von Bibliotheken eingesetzt wird.
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Die
MEX-Primer sind so gestaltet worden, dass sie mit vielen nachgeschaltet
ablaufenden Anwendungen verträglich
sind. Diese umfassen die Verwendung bei der Herstellung von PCR-Subtraktions-Bibliotheken.
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MEX-Produkte
von geringen Anzahlen von Zellen (100 ng Gesamt-RNA-Äquivalent)
wurden aus primären
Gasser'-Ganglion-Kulturen,
die mit oder ohne Nervenwachstumsfaktor behandelt worden waren,
amplifiziert und gereinigt, um das Ausgangsmaterial für die Herstel lung
von Subtraktions-Bibliotheken herzustellen. Diese wurden nach der
Größe selektiert,
um kleine Produkte und Primersequenzen (< 50 Basenpaare) zu entfernen. An diese
Produkte wurden Linkermoleküle
ligiert, um die Subtraktion zu vereinfachen (bezüglich diesen wurde eine Qualitätskontrolle
durch Verwendung von Kombinationen von Linker-basierten/Gen-basierten PCR-Primern
ausgeführt)
und es wurden zwei Runden von Suppressions-PCR-Subtraktion auf die
MEX-Amplicons angewendet. Dies erzeugte die endgültigen vorwärts- und rückwärtssubtrahierten Bibliotheks-Paare. Bezüglich der
Bibliotheken wurde eine Qualitätskontrolle
ausgeführt,
um sicherzustellen, dass „Haushalts"-Gene, die in beiden
Subtraktionspools vorhanden waren, während des Subtraktionsprozesses
entfernt worden waren. Dies wurde durch die Entfernung von Aktin-Transkripten
aus den Subtraktions-Bibliotheken gezeigt. Als eine abschließende Überprüfung des
Inhalts von diesen Bibliotheken wurden Produkte kloniert und hinsichtlich der
Größe untersucht.
Eine Anzahl von diesen Klonen wurde sequenziert und es wurde unterschiedliche
Expression identifiziert.
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Dementsprechend
kann MEX verwendet werden, um die Genexpression in geringen Anzahlen
von Zellen zu analysieren und um Gene zu identifizieren, die zwischen
zwei oder mehreren Zellarten oder Zellarten mit unterschiedlichen
Phänotypen
unterschiedlich exprimiert werden.
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Beispiel 7
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MEX
wurde verwendet, um eine Verdünnungsreihe
von cDNA aus revers MEX-transkribierter
Gesamt-RNA (2 ng–2 μg) unter
Verwendung eines Spektrums von PCR-Zyklen von 15 bis 25 Zyklen zu
amplifizieren. Parallel dazu wurde in ähnlicher Weise herkömmlich revers
transkribierte RNA von äquivalenter
Konzentration amplifiziert. PCR-Amplicons wurden nur nach der MEX-Amplifizierung
festgestellt. Die MEX-Amplifizierung war ab lediglich 20 ng Gesamt-RNA
bei Kombination mit 25 PCR-Zyklen erfolgreich (wie anhand des Vorhandenseins
von sichtbaren Produkten auf Agarosegelen bestimmt).
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Ferner
ist bei Vergleich von Amplicons nach einer MEX-Amplifizierung von
100 ng Gesamt-RNA mit 10 μg
unamplifizierter Gesamt-RNA das Größenspektrum von Produkten nach
der MEX-Amplifizierung ähnlich zu
jenem in der unamplifizierten Kontrollprobe. Zusätzlich ist die Menge von Produkt
in den MEX-Proben größer als
in dem amplifizierten Material, obwohl von 1% der Kontrollprobe
ausgegangen wurde.
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Beispiel 8
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Eine
Verdünnung
von RNA wurde mittels Schritt 1-MEX amplifiziert und Aliquots von
diesen MEX-Produkten wurden in einer IVT-Reaktion unter Verwendung
von T3-RNA-Polymerase als Matrizen verwendet. Bei Verwendung dieses
Ansatzes kann die Empfindlichkeit von MEX um 3 Größenordnungen,
von ~10 ng tRNA bis hinunter zu 2,5 pg RNA, erweitert werden. Unter
Verwendung dieser Technik können
strangspezifische Sonden hergestellt werden. T3- RNA-Polymerase kann verwendet werden,
um Sinnstrang-RNA herzustellen, während T7 verwendet werden kann,
um Antisinn-Transkripte zu synthetisieren.
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Die
Orientierung von diesen IVT-Produkten wurde durch Screenen von Mikroanordnungen
oder -arrays, welche strangspezifische Sonden enthielten, d. h.
mit Sinn- und Antisinn-Sonden,
die separat an unterschiedlichen Koordinaten des Glasobjektträgers angeheftet
waren, analysiert. Aufgrund der Tatsache, dass Aliquots aus der
gleichen Schritt 1-Reaktion als Matrize für diese Sinn- und Antisinn-Reaktionen
verwendet worden waren, würde
ein deutlicher Unterschied in den Hybridisierungsmustern der beiden
Zielpräparationen erwartet
werden, wenn wahre Sinn- und Antisinn-Sonden hergestellt worden
wären,
wie vorhergesagt.
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Spezieller
wurden Schritt 1-MEX-Produkte in vitro unter Verwendung von entweder
T3- oder T7-RNA-Polymerase
transkribiert und die RNA revers transkribiert und mit cy3(T7) oder
cy5(T3) vor der Hybridisierung mit einer strangspezifischen Mikroanordnung
markiert. Das Hybridisierungssignal ist nur vollständig „grün" (cy 3) oder nur „rot" (cy 5) mit einigen
wenigen, wenn überhaupt, „gelben" Flecken, die eine
unkorrekte Transkription von gemischten Sinn/Antisinn-Transkripten
anzeigen würden.
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Um
zu veranschaulichen, dass strangspezifische Transkripte ausgehend
von Schritt 1-MEX-Produkten
hergestellt worden waren, wurden T3- und T7-IVT-Run-off-Zieltranskripte
hergestellt und jeweils mit cy 3 und cy 5 markiert. Diese wurden
zusammen (T3 cy3 gegenüber
T3 cy5 und T7 cy3 gegenüber
T7 cy5) mit Mikroanordnungen, welche aus strangspezifischen Sonden
bestanden, hybridisiert. Die Hybridisierungsintensitäten an sowohl
Sinn- als auch Antisinn-Sonden
für Tubulin
wurden innerhalb von jeder Mikroanordnung verglichen. Die Ergebnisse
zeigten, dass T3-Ziele mit Sinnstrang-Sonden hybridisierten, was
ein stärker
fluoreszierendes Signal verglichen mit Antisinn-Sonden ergab. Dies
war umgekehrt, wenn T7-Ziele verwendet wurden. Dies veranschaulicht,
dass eine strangspezifische Hybridisierung auftritt. Der Intensitätsunterschied
zwischen den Sinn- und Antisinn-Sonden für Tubulin in dem T3-Experiment
war 103-fach und in dem T7-Experiment
104-fach.
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Beispiel 9
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Um
das während
einer MEX erzielte Amplifizierungsausmaß zu quantifizieren, wurde
die Menge von RNA, die im Rahmen einer typischen MEX-Reaktion produziert
wurde, gemessen. ~45 μg
polyA-RNA wurden ausgehend von < 5
ng eingesetzter Gesamt-RNA (~50 pg polyA-RNA) synthetisiert. Dementsprechend
war eine ungefähr
100000-fache Amplifizierung erzielt worden. Dies ergibt ein grobes
Maß für das mögliche Amplifizierungsausmaß, obwohl
dies wahrscheinlich eine Unterschätzung darstellt aufgrund der
Erschöpfung
von Schlüsselreaktions-Komponenten während des
Amplifizierungsverfahrens. Parallel dazu wurde die relative Anreicherung
von Genen innerhalb des Amplicon-Pools durch quantitative Realzeit-RT-PCR
sichergestellt.
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Spezieller
wurde eine quantitative Realzeit-PCR für zwei Gene, Aktin und den
hohe Affinität
aufweisenden NGF-Rezeptor trkA, an zwei ausgeglichenen cDNA-Proben
vor MEX, nach Schritt 1-MEX und nach Schritt 2-MEX ausgeführt. Die
beiden Graphen von 2 zeigen PCR-Start („take-off")-Punkte, wie durch
einen „Sybr
green"-Assay bestimmt.
Die beiden Proben bewahren ihre relativen Konzentrationen an diesen
beiden Transkripten durch den gesamten Amplifizierungsprozess hindurch,
obwohl die relative Zyklusanzahl, bei welcher diese auftreten, nach
links verschoben ist, was anzeigt, dass eine Amplifizierung des
cDNA-Pools aufgetreten ist, welche zu einer früheren Detektion der Transkripte
führt.
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Beispiel 10
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MEX-Produkt-Subtraktions-Bibliotheken
und auf herkömmliche
Weise hergestellte Bibliotheken wurden kloniert und für eine Verwendung
als Sonden an einer im Haus konstruierten Mikroanordnung amplifiziert. Diese
Mikroanordnung wurde unter Verwendung von paarweisen, durch MEX
produzierten Subtraktions-Bibliotheken gescreent. Es wurde in einer
graphischen Interpretation des Hybridisierungssignals, wo jede Sonde als
ein einzelner Datenpunkt dargestellt ist, wobei deren cy3-Fluoreszenzintensität entlang
der y-Achse und die cy5-Fluoreszenz entlang der x-Achse gezeigt
ist, eine im Wesentlichen lineare Beziehung festgestellt.
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Beispiel 11
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Zwei
unabhängig
revers transkribierte RNAs aus derselben RNA-Quelle wurden durch
MEX amplifiziert und unabhängig
mit entweder cy3 oder cy5 markiert. Diese Proben wurden gemischt
und mit einer Mikroanordnung hybridisiert. Die „gelbe” Natur aller Sonden nach der
Hybridisation ist ein Hinweis darauf, dass das Signal in jedem Kanal
gleich war. Dies wird gezeigt, wenn jede Sonde entsprechend ihrem
Signal in dem cy3 (y-Achse) und cy 5-(x-Achse)-Kanal graphisch aufgetragen wurde; die
Natur des Graphs als gerade Linie ist eine Demonstration, dass identische
RNA-Proben in separaten MEX-Reaktionen identisch amplifiziert werden. Dies
ist das vorhergesagte Ergebnis, da das in jeder Reaktion/in jedem
Kanal amplifizierte/markierte Ausgangsmaterial identisch war. Dies
veranschaulicht, dass MEX während
der Amplifizierung die RNA-Repräsentation
einer Probe bewahrt.
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Beispiel 12
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Es
wurden zwei unabhängig
revers transkribierte RNAs aus zwei separaten Quellen (Hirn-cy3
und Hoden-cy5) nach einer MEX-Amplifizierung oder Voramplifizierung
verglichen. Das Hybridisierungsmuster war, wenn diese Proben verglichen
wurden, nahezu identisch, was veranschaulicht, dass MEX das repräsentative Gleichgewicht
zwischen den beiden RNA-Quellen,
ob amplifiziert oder unamplifiziert, bewahrt hatte.
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Beispiel 13
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Mengen
von RNA aus unabhängigen
Umkehrtranskriptionen der gleichen RNA-Quelle zwischen 1 μg und 1 ng
wurden durch MEX- und IVT-Amplifizierungen amplifiziert und durch
entweder cy 3 oder cy 5 markiert. Mengen sind, wie folgt:
1
= 1 μg Ausgangs-Gesamt-Hirn-RNA-RT
250 ng MEX 25 ng MEX/IVT
2 = 10 ng Ausgangs-Gesamt-Hirn-RNA-RT
2,5 ng MEX 250 pg MEX/IVT
3 = 1 ng Ausgangs-Gesamt-Hirn-RNA-RT
250 pg MEX 25 pg MEX/IVT.
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Diese
Mengen betreffen die Menge von Original-Probe, die für das individuelle
Experiment verwendet wurde (d. h. ¼ der RT wurde in der MEX-Reaktion
und 1/10 der MEX-Reaktion in der IVT verwendet). Die geradlinigen
Beziehungen zwischen den Proben zeigen an, dass die Repräsentation
sogar bei extrem niedrigen Konzentrationen von eingesetzter RNA
beibehalten worden ist.
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