DE10234126A1

DE10234126A1 - Verfahren zur Biotransformation von Carotinoiden

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Publication number: DE10234126A1
Application number: DE10234126A
Authority: DE
Inventors: Markus Dr. Matuscheck; Bernhard Dr. Hauer; Rolf Prof. Dr. Schmid; Isabelle Melanie Dr. Kauffmann; Francesca Blasco; Claudia Dr. Shoreview Schmidt-Dannert
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2004-02-05
Also published as: CA2493935A1; WO2004013345A1; AU2003253323A1; CN1671857A; JP2006500922A; US20060063226A1; CN100447251C; EP1527191A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biotransformation von Carotinoiden unter Verwendung von Enzymen mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität; insbesondere Monooxygenasen aus thermophilen Bakterien, insbesondere der Gattung Thermus sp...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biotransformation von Carotinoiden unter Verwendung von Enzymen mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität; insbesondere Monooxygenasen aus thermophilen Bakterien, insbesondere der Gattung Thermus sp. sowie die für derartige Verfahren brauchbaren Mikroorganismen und Expressionskonstrukte.
Stand der Technik
Xanthophylle, wie Zeaxanthin und Cryptoxanthin, sind sauerstoffhaltige Carotinoide und stellen als Pigmentierungsstoffe oder Vorstufen für Vitamin A-Derivate wichtige Zusatzstoffe für die Human- oder Tierernährung dar. Xanthophyllen wird auch eine gesundheitsfördernde Wirkung zugeschrieben. Sie verstärken die Immunantwort und besitzen aufgrund ihrer antioxidativen Eigenschaften krebsvorbeugende Wirkung, was sie als Nutriaceuticals interessant macht.

Cytochrom P450 Monooxygenasen besitzen die Fähigkeit technisch interessante Oxygenierungsreaktionen zu katalysieren und werden daher seit einiger Zeit intensiv untersucht. So wurde beispielsweise die Cytochrom P450 Monooxygenase BM-3 aus Bacillus megaterium isoliert und charakterisiert und ist mittlerweile auf rekombinantem Weg zugänglich (vgl. z.B. DE-A-199 35 115).

Diese Cytochrom P450-Monooxygenase katalysiert gewöhnlich die subterminale Hydroxylierung langkettiger, gesättigter Säuren und der entsprechenden Amide und Alkohole davon oder die Epoxydation ungesättigter langkettiger Fettsäuren oder gesättigter Fettsäuren mit mittlerer Kettenlänge. Die optimale Kettenlänge gesättigter Fettsäuren beträgt 14 bis 16 Kohlenstoffatome.

Die Struktur der Häm-Domäne von P450 BM-3 wurde durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Die Substratbindungsstelle liegt in Form einer langen tunnelartigen Öffnung vor, welche von der Moleküloberfläche bis hin zum Häm-Molekül reicht und wird fast ausschließlich von hydrophoben Aminosäureresten begrenzt. Die einzigen geladenen Reste an der Oberfläche der Häm-Domäne sind die Reste Arg47 und Tyr51. Man nimmt an, daß diese an der Bindung der Carboxylatgruppe des Substrates durch Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung beteiligt sind. Durch gezielte Einführung von Punktmutationen ist es zwischenzeitlich gelungen, das Substratspektrum dieses Enzyms zu erweitern. So können nunmehr auch kürzer- als auch längerkettige Carbonsäuren, Alkane, Alkene, Cycloalkane, Cycloalkene und verschiedenste Aromaten durch dieses Enzym oxidiert werden (vgl. DE-A-199 35 115, 199 55 605, 100 11 723 und 100 14 085).

Aus der WO-A-02/33057 sind Cytochrom P450-Monooxygenasen aus thermophilen Bakterien bekannt, welche zur Biotransformation verschiedener organischer Substrate geeignet sind. Carotinoide, wie z.B. ß-Carotin ist darin nicht als potentielles Substrat der Cytochrom P450-Monooxygenasen genannt.

Die DE-A-199 16 140 beschreibt eine Carotinhydroxylase aus der Grünalge Haematococcus pluvialis welche unter anderem die Umsetzung von β-Carotin zu Zeaxanthin und Crypotxanthin katalysiert. Es findet sich kein Hinweis auf die mögliche Brauchbarkeit von Cytochrom P450-Monooxygenasen bei der Biotransformation von β-Carotin.

Um die industrielle Anwendbarkeit der Enzymklasse der Cytochrom P450-Monooxygenasen weiter zu verbessern, wäre es daher wünschenswert neue Anwendungsgebiete für diese zu finden.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung neuer Anwendungsgebiete für Cytochrom P450-Monooxygenasen.

Obige Aufgabe wurde gelöst durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Oxidation von Carotinoiden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Carotinoid in Gegenwart eines Enzyms mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität, das außerdem zur Carotinoid-Oxidation befähigt ist, umsetzt und das Oxidationsprodukt isoliert Ein Enzym mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität, das außerdem zur Carotinoid-Oxidation befähigt ist, bewirkt erfindungsgemäß, dass am Kohlenstoff in Position 3 eines βlononringes oder dass am Kohlenstoff in Position 3 eines 4-Keto-β-iononringes eine Hydroxylgruppe eingeführt wird.

Beispiele für geeignete Carotinoide sind ß,ß-Carotin (im folgenden bezeichnet ß-Carotin), β,ε-Carotin oder Canthaxanthin.

Eine Carotin-Oxidation im Sinne der Erfindung umfasst die einfache oder mehrfache Hydroxylierung von des Carotins.

Erfindungsgemäß anfallende Oxidationsprodukte umfassen vorzugsweise Zeaxanthin, Cryptoxanthin, Adonirubin, Astaxanthin, Lutein oder Gemische davon.

Detaillierte Beschreibung

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf beiliegenden Figuren näher erläutert. Dabei zeigt

1 einen Sequenzvergleich von P450 aus Thermus thermophilus mit der Häm-Domäne von P450 BM3 aus Bacillus megaterium. Doppelt unterstrichen ist dabei die Häm-Bindungsstelle gezeigt (Cys400 in P450 BM3 ist der Cysteinrest, der mit dem Eisenatom der prosthetischen Gruppe koordiniert). Einfach unterstrichen ist die Region die in Kontakt steht mit dem ω-Ende der Fettsäurekette. Die Grad der Übereinstimmung ist durch verschiedenen Symbole gekennzeichnet("*" = identische Reste; ":" und "." = ähnliche Reste).

2 zeigt das Ergebnis eines Vergleichstests zur Bestimmung der Thermostabilität von P450 BM3 und P450 aus Thermus sp. Die Thermostabilität wurde spektrometrisch im Wellenlängenbereich zwischen 400 und 500 nm über den Häm-Gruppen-Gehalt bestimmt.

3 zeigt ein Reaktionsschema für die erfindungsgemäße Biotransformation von β-Carotin zu Cryptoxanthin und Zeaxanthin.

4 zeigt das HPLC-Elutionsprofil von Standardproben, enthaltend ß-Carotin, Zeaxanthin bzw. Cryptoxanthin.

5 veranschaulicht die Ergebnisse von Biotransformationsexperimenten mit rekombinanten E. coli-Stämmen, welche neben den Carotinogenen Gene crtE, crtB, crtI und crtY (5A) mit einem erfindungsgemäßen Konstrukt pKK_CYP transformiert sind ( 5B); in Gegenwart von pKK_CYP beobachtet man eine signifikante Produktion von Zeaxanthin und Cryptoxanthin.

a) Verfahren zur Carotinoid-Oxidation

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Oxidation von Carotinoiden , wie z.B. von ß-Carotin, wobei man

a1) einen rekombinanten Mikroorganismus, welcher ein Enzym mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität produziert, in einem Kulturmedium in Gegenwart von exogenem oder intermediär gebildetem Carotinoid kultiviert; oder
a2) ein Carotinoid-haltiges Reaktionsmedium mit einem Enzym mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität inkubiert; und
b) das gebildete Oxidationsprodukt oder ein Folgeprodukt davon aus dem Medium isoliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Bedingungen durchgeführt, welche die Oxidation von Carotinoiden, wie β-Carotin, vorzugsweise fördern, zumindest aber nicht behindern oder gar inhibieren. Bevorzugt erfolgt die Oxidation durch Kultivierung des rekombinanten Mikroorganismus in Gegenwart von Sauerstoff bei einer Kultivierungstemperatur von mindestens etwa 20°C, wie z.B. 20 bis 40°C, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9.

Bevorzugt verwendet man solche Mikroorganismen, die durch heterologe Komplementierung zur Carotinoidproduktion, wie z.B. zur β-Carotinproduktion, befähigt sind und außerdem ein Enzym mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität exprimieren. Heterolog komplementierte E. coli-Stämme und weitere Mikroorganismen in welche in analoger Weise eine erfindungsgemäße P450-Monooxygenase-Aktivität (mit Carotinoid-oxidierender Aktivität) eingebaut werden kann, werden z.B. in der oben genannten DE-A-199 16 140 beschrieben, worauf hiermit ausdrücklich bezug genommen wird.

Nach einer anderen bevorzugten Variante wird Carotinoid, wie z.B. ß-Carotin, als exogenes Substrat einem Medium zugesetzt und die Oxidation durch enzymatische Umsetzung des substrathaltiges Mediums in Gegenwart von Sauerstoff bei einer Temperatur von mindestens etwa 20°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 durchgeführt, wobei das substrathaltige Medium außerdem bezogen auf das Substrat einen etwa 10- bis 100-fachen molaren Überschuss an Reduktionsäquivalenten enthalten kann.

Obige Verfahren können bevorzugt in Bioreaktoren durchgeführt werden. Gegenstand der Erfindung sind daher solche Bioreaktoren, umfassend wenigstens eine erfindungsgemäße Monooxygenase oder wenigstens einen erfindungsgemäßen rekombinanten Mikroorganismus, gegebenenfalls jeweils in immobilisierter Form.

Wird die Umsetzung mit einem rekombinanten Mikroorganismus durchgeführt, so erfolgt vorzugsweise zunächst die Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und in einem Komplexmedium, wie z.B. TB- oder LB- Medium bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 20 °C oder mehr, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9, bis eine ausreichende Zelldichte erreicht ist. Um die Oxidationsreaktion besser steuern zu können, bevorzugt man die Verwendung eines induzierbaren Promotors. Die Kultivierung wird nach Induktion der Monooxygenaseproduktion in Gegenwart von Sauerstoff, z.B. 12 Stunden bis 3 Tage, fortgesetzt.

Wird die erfindungsgemäße Umsetzung dagegen mit gereinigtem oder angereichertem Enzym durchgeführt so löst oder solubilisiert man das erfindungsgemäße Enzym in einem exogenes Substrat enthaltenden Medium (etwa 0,01 bis 10 mM, oder 0,05 bis 5 mM), und führt die Umsetzung, vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff, bei einer Temperatur von etwa 10 °C oder mehr, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 (wie z.B. eingestellt mit 100 bis 200 mM Phosphat- oder Tris-Puffer), sowie in Gegenwart eines Reduktionsmittels durch, wobei das Substrat-haltige Medium außerdem bezogen auf das zu oxidierende Substrat einen etwa 10- bis 100-fachen molaren Überschuß an Reduktionsäquivalenten (Elektronendonor) enthält. Bevorzugtes Reduktionsmittel ist NADPH.

Beim erfindungsgemäßen Substratoxidationsprozess wird im Reaktionsmedium enthaltener oder zugesetzter Sauerstoff reduktiv enzymatisch gespalten. Die erforderlichen Reduktionsäquivalente werden von dem zugesetzten Reduktionsmittel (Elektronendonor) zur Verfügung gestellt.

Das gebildete Oxidationsprodukt kann dann in herkömmlicher Weise, wie z.B. durch Extraktion und/oder Chromatographie, vom Medium abgetrennt und gereinigt werden. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und bedürfen daher keiner besonderen Erläuterung.

Besonders bevorzugt sind Verfahren bei denen die eingesetzte Cytochrom P450 Monooxygenase eine Aminosäuresequenz aufweist, welche eine Teilsequenz von Aminosäurerest Pro328 bis Glu345 gemäß SEQ ID NO:2 umfasst; und gegebenenfalls außerdem eine Teilsequenz von Aminosäurerest Val216 bis Ala227 gemäß SEQ ID NO:2 umfasst.

Besonders bevorzugt sind Verfahren unter Verwendung einer Monooxygenase, die eine Aminosäuresequenz aufweist, welche wenigstens eine weitere Teilsequenz umfasst, die ausgewählt ist unter Teilsequenzen von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus den durch die Aminosäurereste Met1 bis Phe327 und Gly346 bis Ala389 gemäß SEQ ID NO:2 vorgegebenen Sequenzbereichen; und insbesondere Verfahren unter Verwendung einer Monooxygenase, die eine Aminosäuresequenz aufweist, welche im wesentlichen SEQ ID NO: 2 entspricht.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe von Mikroorganismen durchgeführt, so kultiviert man einen rekombinanten Mikroorganismus, der ein Expressionskonstrukt trägt, welches unter der Kontrolle regulativer Nukleotidsequenzen die kodierende Sequenz für eine Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß obiger Definition umfasst.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß obiger Definition oder einer dafür kodierenden Nukleotidsequenz zur mikrobiologischen Oxidation von Carotinoiden, wie z.B. β-Carotin.

b) Rekombinante Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens

Gegenstand der Erfindung sind außerdem rekombinante Mikroorganismen, welcher durch heterologe Komplementierung zur Carotinoidproduktion, wie z.B. zur ß-Carotinproduktion, befähigt sind und außerdem ein Enzym mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität exprimieren. Solche Mikroorganismen sind vorzugsweise mit carotinogenen Genen, wie z.B. crtE, crtB, crtΙ und crtY, heterolog komplementiert. Sie sind insbesondere abgeleitet von Bakterien der Gattung Escherichia sp, wie E. coli, insbesondere E. coli JM 109.

Erfindungsgemäße Mikroorganismus sind insbesondere transformiert mit einem Expressionsvektor, der unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleotidsequenzen die kodierende Sequenz für eine Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß obiger Definition umfasst.

Ein bevorzugter Expressionsvektor, umfassend die kodierende Sequenz für eine Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß obiger Definition enthält stromaufwärts davon den starken tac-Promotor und stromabwärts den starken rrnB ribosomalen Terminator in operativer Verknüpfung.

Weitere brauchbare Mikroorganismen und deren Herstellung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind z.B. aus der DE-A-199 16 140 bekannt, worauf hiermit Bezug genommen wird.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen P450- Enzyme mit Carotinoid- insbesondere β-Carotin-oxidierender Aktivität zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen, insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Ferner betrifft die Erfindung entsprechend genetisch veränderte Organismen, wobei die genetische Veränderung die Genexpression der erfindungsgemäßen Carotinoid- insbesondere β-Carotin-oxidierenden Aktivität gegenüber einem Wildtyp für den Fall, dass der Ausgangsorganismus das erfindungsgemäß verwendete Gen enthält, erhöht oder für den Fall, dass der Ausgangsorganismus das erfindungsgemäß verwendete Gen nicht enthält, verursacht.

Unter einem genetisch veränderten Organismus wird ein Organismus verstanden, in dem die erfingsgemäßen P450 Gen oder Nukleinsäurekonstrukte, vorzugsweise nach einer der hierin beschriebenen Methoden, insertiert wurden.

Der genetisch veränderte Organismus enthält mindestens ein erfindungsgemäßes Carotinoid-, insbesondere β-Carotin-oxidierendes-Gen oder mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt. Je nach Ausgangsorganismus kann die Nukleinsäure chromosomal oder extrachromosomal vorliegen.

Vorzugsweise weisen die genetisch veränderten Organismen verglichen mit dem Wildtyp einen veränderten Carotinoid-Stoffwechsel auf.

Als genetisch veränderte Organismen eignen sich prinzipiell alle Organismen, die in der Lage sind, Carotinoide oder Xanthophylle zu synthetisieren.

Bevorzugt sind Ausgangsorganismen, die natürlicherweise Xanthophylle synthetisieren können. Aber auch Ausgangsorganismen, die aufgrund des Einbringens von Genen der Carotinoidbiosynthese in der Lage sind, Xanthophylle zu synthetisieren, sind geeignet.

Unter Ausgangsorganismen werden prokaryontische oder eukaryontische Organismen wie beispielsweise Mikroorganismen oder Pflanzen verstanden. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.

Als Bakterien können sowohl Bakterien verwendet werden, die aufgrund des Einbringens von Genen der Carotinoidbiosynthese eines Carotinoid-produzierenden Organismus in der Lage sind. Xanthophylle zu synthetisieren, wie beispielsweise Bakterien der Gattung Escherichia, die beispielsweise crt-Gene aus Erwinia enthalten, als auch Bakterien, die von sich aus in der Lage sind, Xanthophylle zu synthetisieren wie beispielsweise Bakterien der Gattung Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien der Gattung Synechocystis. Bevorzugte Bakterien sind Escherichia coli, Erwinia herbicola, Erwinia uredovora, Agrobacterium aurantiacum, Alcaligenes sp. PC-1, Flavobacterium sp. strain R1534, das Cyanobacterium synechocystis sp. PCC6803, Paracoccus marcusu, oder Paracoccus carotinifaciens.

Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.

Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Blakeslea, Phycomyces, Fusarium oder weitere in Indian Chem. Engr. Section B. Vol. 37, No. 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze.

Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Besonders bevorzugte Algen sind Haematococcus puvialis oder Dunaliella bardawil.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Pflanzen als Ausgangsorganismen und dementsprechend auch als genetisch veränderte Organismen verwendet. Bevorzugte Pflanzen sind beispielsweise Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte, Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Hafer, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Brassicacaen, wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, oder Holzgewächse wie beispielsweise Espe oder Eibe.

Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Tagetes erecta, Raps, Canola, Kartoffeln sowie Ölsaaten und typische Carotinoidproduzenten, wie Soja, Sonnenblume, Paprika, Karotte, Pfeffer oder Mais.

c) Enzyme, Polynukleotide und Konstrukte

Erfindungsgemäß brauchbare Cytochrom P450 Monooxygenasen sind insbesondere aus thermophilen Bakterien, vorzugsweise der Gattung Thermus sp., wie z.B. der Spezies Thermus thermophilus, Stamm HB27 (hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM7039) isolierbar. „Thermophile" Bakterien erfüllen erfindungsgemäß die Temperaturtoleranzkriterien nach H.G. Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag Stuttgart, 5. Auflage , Seite 173, für thermophile und extrem thermophile Organismen (d.h. Wachstumsoptimum bei über 40 °C).

Die erfindungsgemäß bevorzugt verwendeten Monooxygenasen sind vorzugsweise durch eine erhöhte Temperaturstabilität gekennzeichnet. Diese drückt sich in einem in Vergleich zum P450 BM-3 aus Bacillus megaterium geringeren Aktivitätsverlust bei erhöhter Temperatur (z.B. in einem Bereich von 30 bis 60 °C, pH 7,5, 25 mM Tris/HCl) aus.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird erfindungsgemäß eine Cytochrom P450 Monooxygenase aus dem thermophilen Bakterium T. thermophilus verwendet. Das Protein besitzt ein Molekulargewicht von etwa 44 kDa (bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese), ist löslich und zeigt im reduzierten Zustand, oxidierten Zustand und als Carbonyl-Addukt ein Absorbtionsspektrum analog zu dem anderer P450 Enzyme. Aus Sequenzvergleichen dieses erfindungsgemäßen Enzyms aus T. thermophylus und anderen bekannten P450 Enzymen konnten folgende Identitäten bestimmt werden: P450 BM3, 32% Identität; CYP119, 29% Identität; P450eryF, 31% Identität. Das erfindungsgemäße Enzym zeigt eine außerordentliche Thermostabilität, veranschaulicht durch eine Schmelztemperatur von etwa 85°C, welcher Wert um 30°C über demjenigen für P450cam liegt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung von Polynukleotiden, welche für eine Cytochrom P450 Monooxygenase kodieren, insbesondere eine Cytochrom P450 Monooxygenase aus der Gattung Thermus sp. in Verfahren zur Oxidation von β-Carotin.

Bevorzugte Polynukleotide sind solche, die im wesentlichen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 besitzen, sowie die dazu komplementären und davon abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung von Expressionskassetten oder von rekombinanten Vektoren zur Herstellung von rekombinanten Mikroorganismen, welche zu den erfindungsgemäßen Umsetzungen brauchbar sind.

Erfindungsgemäß mit umfasst ist ebenfalls die Verwendung „funktionaler Äquivalente" der konkret offenbarten neuen P450 Monooxygenasen zu den erfindungsgemäßen Umsetzungen.

„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Monooxygenasen sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Enzyme, welche weiterhin die ge wünschte Substratspezifität im Rahmen der oben bezeichneten Oxidationsreaktion besitzen und/oder im Vergleich zu P450 BM3 eine erhöhte Thermostabilität, z.B. bei Temperaturen im Bereich von etwa 30 bis 60 °C und gegebenenfalls höheren Temperaturen nach 30-minütiger Behandlung in 25 mM Tris/HCI, besitzen.

Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten Oxidationsreaktionen katalysieren. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere, wie z.B. 1 bis 30 oder 1 bis 20 oder 1 bis 10, Aminosäure-Additionen, -Substituenten, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Enzym qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeitumgesetzt werden.

Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" weisen eine von SEQ ID NO:2 in mindestens einer Position abweichende Aminosäuresequenz auf, wobei die Veränderung in der Sequenz die Monooxygenase Aktivität vorzugsweise nur unwesentlich, das heißt um nicht mehr als etwa ± 90%, insbesondere ± 50% oder nicht mehr als ± 30% verändert. Diese Veränderung kann unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie zum Beispiel ß-Carotin, unter standardisierten Bedingungen (zum Beispiel 0,1 bis 0,5 M Substrat, pH-Bereich 6 bis 8, insbesondere 7; T = 30 bis 70°C) bestimmt werden.

„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch Präkursoren der beschriebenen Polypeptide sowie funktionale Derivate und Salze der Polypeptide. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxasäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.

Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444–2448.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins.

Homologe des erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (Z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch P450-Monooxygenasen, welche aus anderen Organismen, z.B. aus anderen als den hierin konkret genannten Bakterien, zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen), kodierend für eine der obigen Monooxygenasen und deren funktionale Äquivalente zur Durchführung obiger Verfahren. Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO:1 und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für eine Monooxygenase mit der gewünschten Eigenschaftsprofil.

Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896–897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.

Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Bibliotheken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.

Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide „hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70–100%, vorzugsweise zu 90–100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50–70 °C, vorzugsweise 60–65 °C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1x SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20x SSC: 3M NaCl, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden.

Diese Nukleinsäuren sind vorzugsweise in Expressionskonstrukte eingebaut, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Enzym kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen.

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, Iac-, Ipp-Iac-, Iaclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-,I-PR- oder im I-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, not oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der P,P,-Promotor.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und die Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Monooxygenase-Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.

Als Beispiele für geeignete Expressionsvektoren können genannt werden: Übliche Fusionsexpressionsvektoren, wie pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose Ebindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.

Nicht-Fusionsprotein-Expressionsvektoren wie pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301–315) und pET 11 d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60–89).

Hefe-Expressionsvektor zur Expression in der Hefe S. cerevisiae , wie pYepSec1 (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113–123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge.

Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156–2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31–39).

Pflanzen-Expressionsvektoren, wie solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border" , Plant Mol. Biol. 20:1195–1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.

Säugetier-Expressionsvektoren, wie pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187–195).

Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryotische Zellen sind in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte bzw. Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Enzyme und/oder zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, beschrieben.

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, Blakeslea, Phycomyces, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen.

Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mit tels automatischer Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen (z.B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.

Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter-System, die Phagen λ oder μ oder andere temperente Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff "Expressionssystem" die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen.

Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie transgenen Tieren, wie insbesondere Mäusen oder Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren Monooxygenasen können auch rekombinant hergestellt werden, wobei man einen Monooxygenase-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Monooxygenase induziert und die Monooxygenase aus der Kultur isoliert. Die Monooxygenase kann so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Monooxygenase nicht in das Kulturmedium sezerniert wird, aufgeschlossen und das Enzym nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Monooxygenase kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die DNA um bestimmte Nucleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.

Folgende nichtlimitierende Beispiele beschreiben spezielle Ausführungsformen der Erfindung.

Beispiele

Allgemeine experimentelle Angaben

a) Allgemeine Klonierungsverfahren

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) a.a.O. beschrieben durchgeführt.

b) Polymerasekettenreaktion (PCR)

PCR wurde nach Standardprotokoll mit folgendem Standardansatz durchgeführt:
8 μl dNTP-Mix (200 μM), 10 μl Taq-Polymerase-Puffer (10 x) ohne MgCl₂, 8 μl MgCl₂ (25 mM), je 1 μl Primer (0,1 μM), 1 μl zu amplifizierende DNA, 2,5 U Taq-Polymerase (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen), ad 100 μl demineralisiertes Wasser.

c) Kultivierung von E.coli

Die Kultivierung von rekombinanten E. coli-Stämme DH5α wurde in LB-Amp Medium (Trypton 10,0 g, NaCl 5,0 g, Hefeextrakt 5,0 g, Ampicillin 100 g/ml N₂O ad 1000 ml) bei 37°C kultiviert. Dazu wurde jeweils eine Kolonie mittels Impföse von einer Agarplatte in 5 ml LB-Amp überführt. Nach ca. 18 h Stunden Kultivierung bei einer Schüttelfrequenz von 220 Upm wurden 400 ml Medium in einem 2-l-Kolben mit 4 ml Kultur inokuliert. Die Induktion der P450-Expression in E. coli erfolgte nach Erreichen eines OD578-Wertes zwischen 0,8 und 1,0 durch eine drei- bis vierstündige Hitzeschockinduktion bei 42 °C.

d) Zellaufschluß

Zellpellets mit einer Biofeuchtmasse von bis zu 15 g E. coli DH5a wurden auf Eis aufgetaut und in 25 ml Kaliumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7,5, 1 mM EDTA) oder Tris/HCI Puffer (50 mM, pH 7,5, 1 mM EDTA) suspendiert. Mittels dreiminütiger Ultraschallbehandlung (Branson Sonifier W250, (Dietzenbach, Deutschland), Leistungsabgabe 80 W, Arbeitsintervall 20%) wurde die auf Eis gekühlte E. coli-Zellsuspension aufgeschlossen. Vor der Proteinreinigung wurde die Zellsuspension für 20 min bei 32 500 g zentrifugiert und durch einen 0,22 mm Sterivex-GP-Filter (Millipore) filtriert, wobei man einen Rohextrakt erhält.

Beispiel 1

Klonierung und Expression von P450 aus Thermus thermouhilus HB27 und den His-taa-Derivaten davon

1. Klonierung von P450 aus Thermus thermophilus HB27

Ein die kodierende P450-Sequenz (im folgenden auch als CYP175A1-Gen ezeichnet) umfassender Klon (TTHB66) wurde aus einer Thermus Genbank gewonnen. Die kodierende P450-Sequenz (blunt ended) wurde in die Hincll-Schnittstelle des Plasmids pTZ19R (MBI Fermentas) einkloniert. Aus dem so erhaltenen Plasmid TTHB66 wurde die kodierende P450-Sequenz mit Hilfe der PCR amplifiziert. Dazu wurden folgende Primer verwendet:

a) 30-mer sense-Oligonucleotid, enthaltend die Ndel-Schnittstelle (kursiv gedruckt) als Teil des P450-ATG-Startcodons: 5'-CGAAGCTCATATGAAGCGCCTTTCCCTGAG (SEQ ID NO:7).
b) 30-mer antisense-Oligonucleotid, enthaltend die EcoRI-Schnittstelle (kursiv gedruckt) als Teil des TGA-Stopcodons: 5'-GCGAATTCACGCCCGCACCTCCTCCCTAGG (SEQ ID NO:8).

Das resultierende Fragment wurde in die Ndel-Schnittstellen des Vektors pCYTEXP1 (Plasmid mit dem temperaturinduzierbaren P_RP_L-Promotorsystem des Bakteriophagen λ (Belev T.N., et al., Plasmid (1991) 26:147)) kloniert und in E. coli DN-5a (Clontech, Heidelberg) transformiert.

E. coli DH-5a, enthaltend das interessierende Plasmid wurde in LB-Medium in Gegenwart von Ampicillin inokuliert und die Kultur wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert. Ein Teil der Probe wurde in frisches LB-Medium (in Gegenwart von Ampicillin) inokuliert und die resultierende Kultur wurde bei 37 °C bis zu OD = 0,9 kultiviert. Die Induktion erfolgte durch Erhöhung der Temperatur auf 42 °C über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die Veränderung des P450-Gehaltes während der Expression wurde anhand von Messungen des CO-Differenzspektrums bestimmt.

2. Klonierung von P450 aus Thermus thermophilus HB27 mit N-terminalem His-tag

Die kodierende P450-Sequenz wurde durch PCR aus dem Plasmid TTHB66 unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:

(a) 50-mer sense-Oligonucleotid, enthaltend die Ndel-Schnittstelle (kursiv gedruckt) als Teil des P450 ATG-Startcodons und die tag-kodierenden Codons (unterstrichen): 5-CGAAGCTCATATGCATCACCATCATCATCACAAGCGCCTTTC (SEQ ID NO:9);
(b) 30-mer antisense-Oligonucleotid, enthaltend die EcoRI-Schnittstelle (kursiv gedruckt) als Teil des TGA-Stop-Codons 5'-GCGAATTCACGCCCGCACCTCCTCCCTAGG (SEQ ID NO:8).

Das resultierende Fragment wurde in die Ndel- und EcoRI-Schnittstellen des Vektors p-CYTEXP1 kloniert und in E. coli DH-5α exprimiert.

E. coli DN-5a, enthaltend das interessierende Plasmid, wurde in LB-Medium in Gegenwart von Ampicillin inokuliert und die Kultur wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert. Ein Teil der Probe wurde in frisches LB-Medium (in Gegenwart von Ampicillin) inokuliert und die resultierende Kultur wurde bei 37 °C bis zu ΟD = 0,9 kultiviert. Die Induktion erfolgte durch Erhöhung der Temperatur auf 42 °C über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die Veränderung des P450-Gehaltes während der Expression wurde anhand von Messungen des CO-Differenzspektrums bestimmt.

3. Klonierung von P450 aus Thermus thermophilus HB27 mit C-terminalem His-tag

Die kodierende P450-Sequenz wurde durch PCR aus dem Plasmid TTHB66 unter Verςendung der folgenden Primer amplifiziert:

(a) 30-mer sense-Oligonucleotid, enthaltend die Ndel-Schnittstelle (kursiv gedruckt) als Teil des P450 ATG-Start-Codons: 5'-CGAAGCTCATATGAAGCGCCTTTCCCTGAG (SEQ ΙD NO:7)
(b) 47-mer antisense-Oligonucleotid, enthaltend die EcoR?-Schnittstelle (kursiv gedruckt) als Teil des TGA-Stop-Codons sowie die unterstrichene tag-kodierende Teilsequenz: 5-CGGAATTCAGTGATGATGATGGTGATGCGCCCGCACCTCCTC (SEQ ?D NO:10).

Das resultierende Fragment wurde in die Ndel- und EcoRΙ-Schnittstellen des Vektors p-CYTEXP1 cloniert und in E. coli DH-5α exprimiert.

Beispiel 2

Bestimmung der Thermostabilität von P450 aus Thermus thermophilus im Vergleich zu P450 BM3

Die beiden Enzyme wurden jeweils 30 Minuten in Tris/HCl-Puffer pH 7,5, 25 mM bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Die Ansätze wurden anschließend abgekühlt und die P450 Konzentration wurde spektrometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefaßt und in 2 graphisch dargestellt.

Wie man den Versuchsergebnissen entnimmt, besitzt das erfindungsgemäße Enzym nach 30-minütiger Inkubation bei allen Temperaturen eine signifikant höherer Temperaturstabilität.

Beispiel 3

Herstellung eines Expressionsvektors für Cytochrom P450 Monooxygenase aus T. thermophilus HB 27

Es wurde von Plasmid-DNA (Klon TTHB66), enthaltend die kodierende Sequenz der Cytochrom P450 Monooxygenase (CYP175A1-Gen) ausgegangen. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden Restriktionsschnittstellen EcoRI und PstI in das CYP175A1-Gen eingeführt. Mit Hilfe der folgenden Primer wurde das Gen amplifiziert:
5'-CCGGAATTCATGAAGCGCCTTTCCCTGAGG; (SEQ ID NO: 11)
5-CCAATGCATTGGTTCTGCAGTCAGGCCCGCACCTCCTCCCTAGG (SEQ ID NO:12)

Die neuen Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen dargestellt. Das Reaktionsgemisch für die PCR bestand aus Template-DNA (100 ng, 2,5 U pfu DNA Polymerase (Stratagene), 5 μl Reaktionspuffer, 5 μl DMSO, 0,4 μmol jedes Oligonukleotids, 400 μmol dNTPs und H₂O ad 50 μl. Folgende PCR Zyklusparameter wurden eingestellt: 95 °C, 1 Minute; (95 °C, 1 Minute; 53 °C, 1 Minute 30 Sekunden; 68 °C, 1 Minute 30 Sekunden) 30 Zyklen; 68 °C, 4 Minuten. Die CYP175A1-Gensequenz wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft.

Nach Restriktionsverdau des PCR-Produktes wurde das CYP175A1-Gen in die EcoRI und PstI-Schnittstellen des Plasmids pKK 223-3 (Amersham Pharmacia) kloniert. pKK 223-3 enthält den starken tac-Promotor stromaufwärts einer Mehrfach-Klonierungsstelle und den starken rrnB ribosomalen Terminator stromabwärts davon zur Kontrolle der Protein-Expression. Das erhaltene Plasmid trägt die Bezeichnung pKK CYP.

Beispiel 4

Biotransformation von β-Carotin in rekombinanten Ε.coli-Stämmen

Zur β-Carotin-Biotransformation wurden rekombinante E.coli-Stämme hergestellt, welche durch heterologe Komplementation zur β-Carotin-Produktion befähigt waren.

Stämme von E.coli JM109 wurden als Wirtszellen für die Komplementations-Experimente mit den Plasmiden pACYC_Y und pKK_CYP (hergestellt gemäß Beispiel 3) verwendet. Das Plasmid pACYC_Y trägt die Carotinogenen Gene crtE, crtB, crtIC14 und crtY, isoliert aus E. uredovora. Die genannten Gene wurden jeweils mit einem eigenen Iac-Promoter einkloniert, um die Expression zu ermöglichen. Die Herstellung dieses Plamids ist beschrieben in der Dissertation von I. Kauffmann, Erhöhung mikrobieller Diversität von Carotinoiden, Juni 2002, Institut für Technische Biologie, Universität Stuttgart. Das die Carotinogenen Gene crtE, crtB, crtIC14 enthaltende Vorläuferkonstrukt ist beschrieben in Schmidt-Dannert (2000), Curr. Opin. Biotechnol. 11, 255–261.

Weitere Details zur heterologen Komplementation sind beispielsweise auch beschrieben in Ruther, A. Appl. Mikrobiol. Biotechnol. (1997) 48: 162–167; Sandmann, G., Trends in Plant Science (2001) 6: 1, 14–17 und Sandmann, G. et al., TIBTECH (1999), 17: 233–237.

Auf die Offenbarung der oben genannten Druckschriften wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.

Kulturen von E.coli JM109 wurden in an sich bekannter Weise mit den Plasmiden pACYC_Y und pKK_CYP transformiert und in LB-Medium bei 30 °C bzw. 37 °C zwei Tage kultiviert. Ampicillin (1 μg/ml) Chloramphenicol (50 μg/ml) und Isopropyl-β-thiogalactosid (1 mmol) wurden in üblicher Weise zugegeben. Als Vergleichsprobe wurde ein E.coli-Stamm JM109 lediglich mit dem Plasmid pACYC_Y transformiert und in gleicher Weise kultiviert.

Zur Isolierung der Carotinoide aus den rekombinanten E.coli-Stämmen wurden die Zellen mit Aceton und anschließend mit Hexan extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser partitioniert. Die organische Phase wurde isoliert, zur Trockne eingedampft und über eine DXSIL C8-Säule mit Wasser/Acetonitril (5:95) mit Hilfe der HPLC aufgetrennt. Folgende Verfahrensbedingungen wurden eingestellt:
Trennsäule: DXSIL C8, 3μm, 120A, 2.1 × 100mm
Flussrate: 0,35 mL/min
Eluenten: isokratisch Wasser/Acetonitril 5/95
Detektion:
UV_VIS_1.Wellenlänge = 453nm
UV_VIS_1.Bandbreite = 4nm
3DFIELD.Max. Wellenlänge = 600nm
3DFIELD.Min. Wellenlänge = 190nm
3DFIELD.Ref. Wellenlänge = 399nm
3DFIELD.Ref. Bandbreite = 40nm

Die Spektren wurden direkt aus den Elutionspeaks unter Verwendung eines Diodenarray-Detektors bestimmt. Die isolierten Substanzen wurden über ihre Absorptionsspektren und ihre Retentionszeiten im Vergleich zu Standardproben identifiziert.

Chromatogramme der Standards für ß-Carotin, Zeaxanthin und Cryptoxanthin sind in den beiliegenden 4A bis 4C dargestellt. 5 A zeigt die chromatograpische Analyse einer Probe erhalten aus dem mit dem Plasmid pACYC_Y transformierten E.coli-Stamm. Es zeigt sich, dass dieser aufgrund der heterologen Komplementation zur Bildung von ß-Carotin befähigt ist. 5 B zeigt das Chromatogramm eines erfindungsgemäß hergestellten, zusätzlich mit dem Plasmid pKK_CYP transformierten, heterolog komplementierten E.coli-Stammes. Überraschenderweise zeigt sich hier, dass neben ß-Carotin signifikante Mengen der korrespondierenden Hydroxilierungsprodukte Zeaxanthin und Cryptoxantin nachweisbar sind. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Oxidation von Carotinoiden, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Carotinoid in Gegenwart eines Enzyms mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität umsetzt und das Oxidationsprodukt isoliert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man a1) einen rekombinanten Mikroorganismus, welcher ein Enzym mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität produziert, in einem Kulturmedium in Gegenwart von exogenem oder intermediär gebildetem ß-Carotin kultiviert; oder a2) ein ß-Carotin-haltiges Reaktionsmedium mit einem Enzym mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität inkubiert; und b) das gebildete Oxidationsprodukt oder ein Folgeprodukt davon aus dem Medium isoliert.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Oxidationsprodukt Zeaxanthin, Cryptoxanthin, Adonirubin, Astaxanthin, Lutein oder Gemische davon umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oxidation durch Kultivierung des Mikroorganismus in Gegenwart von Sauerstoff bei einer Kultivierungstemperatur von mindestens etwa 20°C und einem pN-Wert von etwa 6 bis 9 durchführt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus durch heterologe Komplementierung zur Carotinoidproduktion befähigt ist und außerdem ein Enzym mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität exprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Carotinoid als exogenes Substrat einem Medium zusetzt und die Oxidation durch enzymatische Umsetzung des substrathaltiges Mediums in Gegenwart von Sauerstoff bei einer Temperatur von mindestens etwa 20°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9 durchführt, wobei das substrathaltige Medium außerdem bezogen auf das Substrat einen etwa 10-bis 100-fachen molaren Überschuss an Reduktionsäquivalenten enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Cytochrom P450 Monooxygenase eine Aminosäuresequenz aufweist, welche eine Teilsequenz von Aminosäurerest Pro328 bis Glu345 gemäß SEQ ID N0:2 umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Monooxygenase eine Aminosäuresequenz aufweist, welche außerdem eine Teilsequenz von Aminosäurerest Val216 bis Ala227 gemäß SEQ ID NO:2 umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Monooxygenase eine Aminosäuresequenz aufweist, welche wenigstens eine weitere Teilsequenz umfasst, die ausgewählt ist unter Teilsequenzen von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus den durch die Aminosäurereste Met1 bis Phe327 und Gly346 bis Ala389 gemäß SEQ ID NO:2 vorgegebenen Sequenzbereichen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Monooxygenase eine Aminosäuresequenz aufweist, welche im wesentlichen SEQ ID NO: 2 entspricht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Cytochrom P450 Monooxygenase aus Bakterien der Gattung Thermus sp. verwendet.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Cytochrom P450 Monooxygenase aus einer Bakterium der Spezies Thermus thermophilus verwendet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche wobei man einen rekombinanten Mikroorganismus kultiviert, der ein Expressionskonstrukt trägt, welches unter der Kontrolle regulativer Nukleotidsequenzen die kodierende Sequenz für eine Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß der Definition in einem der Ansprüche 7 bis 12 umfasst.
Verwendung einer Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß der Definition in einem der Ansprüche 7 bis 12 oder einer dafür kodierenden Nukleotidsequenz zur mikrobiologischen Oxidation von Carotinoiden.
Rekombinanter Mikroorganismus, welcher durch heterologe Komplementierung zur β-Carotinproduktion befähigt ist und außerdem ein Enzym mit Cytochrom P450 Monooxygenase Aktivität exprimiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 15, welcher mit carotinogenen Genen heterolog komplementiert ist.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 15 und 16, abgeleitet von Bakterien der Gattung Escherichia sp.
Mikroorganismus nach Anspruch 17, abgeleitet von E. coli, insbesondere E. coli JM 109.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 15 bis 18, transformiert mit einem Expressionsvektor, der unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleotidsequenzen die kodierende Sequenz für eine Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß der Definition in einem der Ansprüche 7 bis 12 umfasst.
Expressionsvektor, umfassend die kodierende Sequenz für eine Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß der Definition in einem der Ansprüche 7 bis 12 welche stromaufwärts mit dem starken tac-Promotor und stromabwärts mit dem starken rrnB ribosomalen Terminator operativ verknüpft ist.