DE10220188A1

DE10220188A1 - CGRP bindende Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE10220188A1
Application number: DE2002120188
Authority: DE
Inventors: Christian Maasch; Bernd Eschgfaeller; Thorsten Ruppert; Florian Jarosch; Axel Vater; Sandra Stark; Steffen Helmling; Elisabeth Moyroud; Sven Klusmann
Original assignee: Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 2002-05-06
Filing date: 2002-05-06
Publication date: 2003-11-20

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Antagonisten von CGRP, wobei der Antagonist eine Nukleinsäure ist und bevorzugterweise die Nukleinsäure an CGRP bindet. Dabei ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure bevorzugterweise ein L-Nukleotid umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Antagonisten von CGRP, Antagonisten des CGRP1- Rezeptors, CGRP bindende Nukleinsäuren, die Verwendung solcher Nukleinsäuren als Antagonisten von CGRP und/oder des CGRP1-Rezeptorsystems, die Verwendung einer der genannten Nukleinsäuren für die Herstellung eines Medikamentes, eine Zusammensetzung, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend besagte Nukleinsäure(n), einen Komplex umfassend CGRP und eine der besagten Nukleinsäuren, die Verwendung der besagten Nukleinsäuren zum Nachweis von CGRP sowie ein Verfahren zum Screenen von CGRP-Antagonisten und einen Kit für den Nachweis von CGRP.

Schon Hippokrates beschrieb die visuellen Symptome von Migräne, und auch der ägyptischen Medizin waren diese Kopfschmerzen, wie Papyrusfunde bezeugen, nicht unbekannt. Während des 17. Jahrhunderts wurde erkannt, daß die Gefäße des Körpers eine bedeutende Rolle beim Migränekopfschmerz spielen. Es war schon damals bekannt, daß Migräne, neben der Schwere der Attacken, benigne und erblich ist, und von den Jahreszeiten, vom Luftdruck und vom Verzehr bestimmter Nahrungsmittel abhängt (Willis, T., Cerebri anatome, Martin Allestry, London, 1664). Nach Willis (Willis, T., Cerebri anatome, Martin Allestry, London, 1664) wird Kopfschmerz durch einen sich langsam entwickelnden Vasospasmus, der in der Peripherie des Gefäßsystems beginnt, ausgelöst. Ein weiterer wichtiger Aspekt der Migräne- Pathophysiologie tauchte im 19. Jahrhundert auf. Liveing (Liveing, E., Churchill, London, 1873, 1-512) ordnete Migräne einer Dysfunktion des Gehirns zu, die durch "nerve storms" innerhalb des Gehirns entsteht. Er glaubte, daß eine Beziehung zwischen Migräne und Epilepsie bestehe, da beide durch Entladungen des Zentralen Nervensystems bedingt sind. Die Studien von Ray und Wolff (Ray, B. S. et al., 1940, Arch. Surg., 41, 813-856) demonstrieren, daß nur die großen cerebralen Arterien der Schädelbasis und die meningealen (duralen) Arterien und Venen sensitiv für schädliche Stimuli sind. Das lenkte das Interesse zu den intercranialen Gefäßwänden als putative Schmerzquelle bei Kopfschmerzen.

Nach der IHS-Klassifikation von 1998 gibt es hauptsächlich zwei Gruppen von Migräne: Migräne mit und Migräne ohne Aura. Die frühere Einteilung in einfache, klassische und komplizierte Migräne wurde aufgegeben.

Migräne wird heute verstanden als eine neurovaskuläre Funktionsstörung, von der etwa 10% der erwachsenen Bevölkerung betroffen sind. Charakterisiert ist diese Erkrankung durch Attacken intensiver wiederkehrender Kopfschmerzen (Doods, H., 2001, Current opinion in investigational Drugs 2(9), 1261-1268), Übelkeit und übertriebene Sensitivität gegenüber externen Stimuli wie Licht und Geräuschen. Die oftmals halbseitigen Kopfschmerzen (Hemikranie) sind pulsierend und pochend und treten in der Regel einseitig auf. Häufig wechselt die Seite der Kopfschmerzen von einem Migräneanfall zum anderen oder sogar während einer Attacke. Die Attacke wird oft von weiteren Symptomen begleitet. Die Betroffenen klagen über Appetitlosigkeit, Übelkeit und Erbrechen. Sie sind besonders licht- und lärmempfindlich und reagieren extrem sensibel auf Gerüche und zeigen Nerven- und Sehstörungen. Zwischen den Migräneattacken verschwinden die Kopfschmerzen. Vor und nach den Attacken können sich Stimmung und Appetit, der Flüssigkeitshaushalt und die Darmfunktion verändern.

Die Pathophysiologie der Migräne steht immer noch unter Diskussion. Die vorherrschende derzeitige Meinung ist, daß Migräne eine neurovaskuläre Erkrankung ist, deren Auslösemechanismus möglicherweise im ZNS lokalisiert ist. Diese Auslösung führt letztendlich zur Vasodilatation mit einer nachfolgenden Aktivierung trigeminaler afferenter senorischer Neurone und zentraler "nociceptiver" Neurone in höheren Schmerzzentren (Hargreaves, R. J. et al., 1999, Can. J. Neurol. Sci. 26, 512-519). Es gibt einige Belege und Hinweise, die die Beteiligung von CGRP bei Migräne bestätigen. CGRP ist abundant in trigeminalen sensorischen Nerven und einer der potentesten bekannten Vasodilatatoren. Des weiteren ist der CGRP1 Rezeptor auf endothelialen Zellen der meningealen Arterien exprimiert. Es wird angenommen, daß CGRP eine Schlüsselrolle als Mediator der meningealen Vasodilatation einnimmt. Neben diesen physiologischen Betrachtungen gibt es einige Tierstudien, die eine Beteiligung des CGRP1-Rezeptors in der Migräne stützen. Die Stimulation des trigeminalen Ganglions in anästhesierten Ratten führt zur meningealen Vasodilatation, welche durch den αCGRP-Antagonisten CGRP8-37 inhibiert werden kann (Kurosawa, M. et al., 1995, Br. J. Pharmacol. 114, 1397-1402). Dieses Experiment impliziert einen erhöhten CGRP-Level nach trigeminaler Stimulation, was bereits 1993 von Goadsby und Edvinsson beschrieben wurde (Goadsby, P. et al., 1993, Ann. Neurol., 33, 48-56).

Die Analyse von CGRP-Plasmakonzentrationen in humanen Probanden ergab, daß die Konzentration von CGRP im Plasma ein wichtiger Parameter in der Migränediagnostik ist. Es wurden erhöhte Plasmakonzentrationen in Patienten mit akuter Migräne, in Patienten mit Cluster-Kopfschmerz (engl. cluster headache) und in Menschen nach trigeminaler Stimulation (Edvinsson, L. et al., 1994, Cephalalgia 14, 320-327) gefunden. In Übereinstimmung mit den gerade beschriebenen Tierstudien können die erhöhten CGRP- Konzentrationen, die in Migränepatienten beschrieben werden, durch Sumatriptan oder Dihydroergotamin reduziert werden (Goadsby, P. et al., 1993, Ann. Neurol. 33, 48-56).

Im Rahmen der Therapie von Migräne, insbesondere akuter Migräne und vor Ausbildung des Vollbilds des Migräne-Kopfschmerzes, gilt als Mittel der Wahl immer noch die Einnahme von 1-1,5 g Acetylsalicylsäure (z. B. Aspirin). Zusätzlich können zu Acetylsalicylsäure noch 1 bis 1,5 g Paracetamol gegeben werden. Alternativen zu Acetylsalicylsäure stellen NSAIDs, d. h. nicht-steroidale anti-inflammatorische Wirkstoffe, und nicht-steroidale Antirheumatika, wie z. B. Naproxen, Diclofenac oder Ibuprofen dar.

Als besonders wirksam haben sich bei der Behandlung von Migräne die sog. Triptane erwiesen, die derzeit die wohl potentesten Therapeutika zur Akutbehandlung mittelschwerer bis schwerer Migräneattacken darstellen (Tepper, S. J. et al., 1999, CNS Drugs 12, 403-417; Doods, H., 2001, Current opinion in investigational Drugs 2(9), 1261-1268).

Aufgrund ihrer hohen Spezifität für 5HT_1B/D-Rezeptoren ermöglichen sie auch bei Langzeitanwendung eine sehr effektive und unter Beachtung der Kontraindikationen insgesamt auch nebenwirkungsarme, sichere Therapie akuter Migräneattacken. Betrachtet man die Risiken und sekundären Kosten durch die z. T. gravierenden Ergotamin- Nebenwirkungen bzw. insuffizient behandelten Migräneattacken, erscheint der Einsatz dieser zur Zeit zwar teuersten, aber auch potentesten Migräneakuttherapeutika in vielen Fällen gerechtfertigt. Im für Migräne so bedeutsamen trigeminovaskulären System hemmen die Triptane auch die Freisetzung der vasoaktiven und algogenen Neuropeptide (CGRP, Neurokinine) aus nociceptiven trigeminalen Nervenendigungen und verhindern dadurch die Initiierung bzw. Aufrechterhaltung der neurogenen Entzündung perivaskulär, im besonderen der Dura-Arterien, dem vermutlichen Entstehungsort des Migräne-Kopfschmerzes. Nach der erfolgreichen Einführung von Sumatriptan wurden einige neue Triptane entwickelt und am Markt zugelassen. Diese unterscheiden sich hauptsächlich im Beginn der Wirkung und der oralen Bioverfügbarkeit. Obwohl die Triptane wirksam sind und gut toleriert werden, gibt es Limitationen für diese Substanzklasse. Das Auftreten von Brustdruck, Enge/Anspannung und Angst deuten oft auf Angina pectoris in bis zu 15% der Patienten hin (Doods, H., 2001, Current opinion in investigational Drugs 2(9), 1261-1268; Brown, E. G. et al. Eur. Neurol., 31, 339-344). Der Gebrauch von Sumatriptan wird auch mit Myokardinfarkt (Ottervanger, J. P. et al., 1993, Lancet, 341, 861-862) und Herzstillstand in cardiovaskulären Risikopatienten (Kelly, K. M., 1995, Neurology, 45, 1211-1213) in Verbindung gebracht. Außerdem wurde beobachtet, daß die Gabe von Sumatriptan, Rizatriptan (Merck & Co. Inc.) und Zolmitriptan (Glaxo Wellcome plc/AstraZeneca plc) eine geringfügige Blutdruckerhöhung induziert (De Hoon, J. N. J. M. et al., 2000, Clin. Pharmacol. Ther., 68, 418-426). Die vasokonstriktorische Wirksamkeit der Triptane auf das Koronarsystem konnte in vitro und in vivo deutlich gezeigt werden, obwohl es den Anschein hat, daß die Triptane selektiv auf cerebrale Gefäße wirken (Doods, H., 2001, Current opinion in investigational Drugs 2(9), 1261-1268).

Eine weitere Gruppe von grundsätzlich zu verwendenden Wirkstoffen sind die Ergotamine.

Die Freisetzung von CGRP bei primären Kopfschmerzen, die Pharmakologie des trigeminovaskularen Systems, das Konzept der neurogenen Entzündung (Moskowitz, M. A. et al., 1993, Brain Metab. Rev. 5, 159-177) und die Antwort auf Triptane (Humphrey, P. P. A. et al., 1991, Trends Pharmacol. Sci., 12, 444-446) sind Schlüsselelemente in der Pathologie der Migräne (Edvinsson, L., 2001, Pharmacology & Toxicology 89, 65-73). Entsprechend hat sich die neueste pharmakologische Forschung auf dieses Neuropeptid konzentriert.

Das 37 Aminosäuren lange Neuropeptid αCGRP, calcitonin gene-related peptide, wurde 1982 als extrem potenter Vasodilator identifiziert (Amara et al., 1982, Nature 298, 240-244). CGRP entsteht durch alternatives splicing des CGRP-Gens. Neben dem αCGRP gibt es ein zweites CGRP, βCGRP, das eine hohe Sequenzhomologie zum erst genannten aufweist, jedoch von einem anderen Gen transkribiert wird. Beide Peptide zeigen ähnliche biologische Effekte wie Vasodilatation, erhöhter Blutdruck, Hypotonie und Tachycardie. αCGRP und Calcitonin entstehen durch alternatives Splicing des Calcitonin-Genes (Amara, G. S. et al., 1982, Nature 298, 240-244). Die Struktur für hCGRP wurde zum Teil durch ¹H-NMR bestimmt. Das Peptid besteht aus einer definierten N-terminalen Schleife, die aus den Aminosäuren 2 bis 7 durch Verknüpfung von zwei Cysteinen über eine Disulfidbrücke gebildet wird, an der sich etwa drei Windungen einer α-Helix anschließen. Richtung C- Terminus schließt sich ein schlecht definierter Knick an, der wiederum in eine instabile Struktur am C-Terminus selbst mündet (Breeze, A. L. et al., 1991, Biochemistry, 30, 575-582). Des weiteren liegt das C-terminale Phenylalanin in amidierter Form vor.

Ergotaminpräparate sind klassische Pharmaka zur Kupierung eines Migräneanfalls, die wegen der möglichen Nebenwirkungen jedoch nicht ganz unproblematisch sind. Die Gefahr einer Gewöhnung und Auslösung eines zusätzlichen Dauerkopfschmerzes steigt mit zunehmender Einnahmehäufigkeit. Aus diesem Grunde sollten pro Woche nicht mehr als 6 mg Ergotamintartrat und pro Migräneattacke nicht mehr als 4 mg eingenommen werden. Grundsätzlich gilt auch hier, daß beim Migränekopfschmerz die Verwendung von Mischpräparaten (z. B. Ergotamintartrat mit Koffein oder Prophyphenazon, Codein, Paracetamol usw.) strikt vermieden werden soll. Auf dieser Therapiestufe kann auch 1-1,5 mg Dihydroergotamin (Hydergin®) i. m. oder ganz langsam i. v. versucht werden. Besonders bei ausgeprägten vegetativen Migräne-Begleiterscheinungen hat sich die zusätzliche Gabe von 1-2 mg Flunitrazepam (Rohypnol®, ein Schlafmittel) sehr bewährt. Vor allem auch unter dem Aspekt, Schmerzmittel einzusparen, zumal die Patienten in dieser Situation ohnehin das Bedürfnis haben, sich hinzulegen. Werden die Migränekopfschmerzen von Übelkeit und Erbrechen begleitet (evtl. auch schon vor dem erwarteten Auftreten dieser Symptome), ist die Verabreichung von Metoclopramid (Paspertin®) sehr wirksam. Es ist vorteilhaft, diese Substanz vor einem Analgetikum einzunehmen, weil Metoclopramid die Darmtätigkeit steigert und somit die Resorption weiterer verabreichter Substanzen fördert. Alternativ kann auch der Dopamin-Antagonist Domperidon (Motilium®) verwendet werden.

Im Stand der Technik sind eine Reihe von CGRP-Antagonisten sowie davon abgeleitete Derivaten bekannt. So ist beispielsweise ein Quinine-Analogon als CGRP-Antagonist in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 97/09046 beschrieben. Diese Verbindungen zeigen jedoch nur eine schwache Affinität für den humanen CGRP-Rezeptor im mikromolaren Bereich und sind deshalb nicht von großer Wichtigkeit.

Ein erster potenter nicht-peptidischer CGRP-Rezeptorantagonist ist die Verbindung BIBN- 4096BS, wie beschrieben in DE 199 11 039. Diese Substanz ist ein Lys-Tyr-Dipeptidderivat und weist eine hohe Affinität für den humanen CGRP1-Rezeptor auf (K_i = 14,4 pM). In Untersuchungen an cerebralen Gefäßen konnte BIBN-4096BS die CGRP-vermittelte Vasodilatation umkehren (Doods, H. et al., 2000, Br. J. Pharmacol., 129, 420-423). Obwohl hohe Dosen von CGRP cardioprotektiv sind, hatte der α-CGRP-Antagonist BIBN-4096BS keinen negativen Effekt auf Myokardinfarkte oder die Freisetzung von Creatinphosphatkinase.

Basierend auf der Struktur von BIBN-4096BS wurde ein Cyclopropyl-Derivat entwickelt, bei welchem der Dipeptidkern durch einen Cyclopropylring ersetzt wurde. Diese Verbindung ist Gegenstand der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 01/32648. Weitere CGRP-Rezeptor-Antagonisten sind Gegenstand der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 01/32649, die Naphthalene, Piperidine, Imidazole und Quinazoline als CGRP-Rezeptor-Antagonisten beschreiben.

Weitere Strukturklassen, die Gegenstand von Untersuchungen sind, sie als CGRP-Rezeptor- Antagonisten einzusetzen, sind 3,4-Dinitrobenzamine, wie beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 98/09630 beschrieben, sowie 4-Sulfinylbenzanilide, wie in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 98/56779 beschrieben. Ausführliche Bindungsanalysen zeigen jedoch, daß diese Substanzen irreversible Bindungseigenschaften besitzen. Darüber hinaus weisen sie, insbesondere einige Vertreter der 4-Sulfinylbenzanilide, Einschränkungen dergestalt auf, daß sie eine vergleichsweise geringe Löslichkeit und orale Verfügbarkeit sowie eine kurze Halbwertszeit von ca. 10 Minuten haben, was eine intensive in vivo- Charakterisierung ausschließt.

Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, welches zur Behandlung von Migräne und den damit im Zusammenhang stehenden Formenkreis weiterer Erkrankungen geeignet ist. Eine weitere der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist die Bereitstellung eines Antagonisten für CGRP sowie das CGRP1-Rezeptorsystem. Schließlich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem CGRP-Antagonisten, insbesondere im Rahmen eines Screening-Verfahrens, bereitgestellt werden können.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt gelöst durch einen Antagonisten von CGRP, wobei der Antagonist eine Nukleinsäure ist und bevorzugterweise die Nukleinsäure an CGRP bindet.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das CGRP α-CGRP ist.

In einer alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass das CGRP β-CGRP ist.

In einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Antagonist des CGRP1-Rezeptors, wobei der Antagonist eine Nukleinsäure ist und wobei bevorzugterweise die Nukleinsäure an einen Liganden des Rezeptors bindet und wobei bevorzugtererweise der Ligand CGRP ist.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Ligand α-CGRP ist.

In einer alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Ligand β-CGRP ist.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure wenigstens ein L- Nukleotid umfasst.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Antagonist eine L- Nukleinsäure ist.

In einem dritten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure, die an CGRP bindet.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das CGRP α-CGRP ist.

In einem vierten Aspekt wird die Aufgabe erfinidungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 244.

In einer Ausführungsform des dritten und vierten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure wenigstens ein L-Nukleotid umfasst.

In einer Ausführungsform des dritten und vierten Aspektes ist vorgesehen dass die Nukleinsäure eine L-Nukleinsäure ist.

In einer weiteren Ausführungsform des dritten und vierten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend DNA, RNA und Kombinationen davon.

In einer noch weiteren Ausführungsform des dritten und vierten Aspektes ist vorgesehen dass die Affinität der Nukleinsäure weniger als 0,5 µM, bevorzugterweise weniger als 0,1 µM, bevorzugtererweise weniger als 0,05 µM und am bevorzugtesten weniger als 0,01 µM ist.

In einer noch weiteren Ausführungsform des dritten und vierten Aspektes ist vorgesehen, dass die Affinität der Nukleinsäure mehr als 250 nM, bevorzugterweise mehr als 100 nM, bevorzugtererweise mehr als 50 nM und am bevorzugtesten mehr als 10 nM ist.

In einer Ausführungsform des dritten und vierten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure ein minimales Bindungsmotiv umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform des dritten und vierten Aspektes ist vorgesehen dass sie eine Länge aufweist, wobei die Länge ausgewählt ist aus der Gruppe, die Längen von 15 bis 150 Nukleotiden, 20 bis 120 Nukleotiden, 30 bis 120 Nukleotiden, 40 bis 100 Nukleotiden, 40 bis 70 Nukleotiden und 50 bis 70 Nukleotiden, 30 bis 50 und am meisten bevorzugt 25 bis 45 Nukleotiden umfaßt.

In einer noch weiteren Ausführungsform des dritten und vierten Aspektes ist vorgesehen dass die Nukleinsäure eine zwei-, drei- oder mehrteilige Struktur aufweist.

In einem fünften Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäure als ein Antagonist von CGRP und/oder des CGRP1-Rezeptorsystems.

In einem sechsten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäure für die Herstellung eines Medikaments.

In einem siebten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antagonisten für die Herstellung eines Medikaments.

In einer Ausführungsform der Verwendungen gemäß den beiden vorstehenden Aspekten ist vorgesehen, dass das Medikament für die Behandlung einer Erkrankung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Migräne, Cluster-Kopfschmerzen, Appetitlosigkeit, Übelkeit, Erbrechen, neurogene Entzündung, insbesondere neurogene Entzündung, die mit anderen Neuropeptiden vermittelt wird, Vasodilatation, erhöhter Blutdruck, Hypotonie, Tachikadie, Erkrankungen, die auf eine Aktivierung trigeminaler afferenter sensorischer Neurone und zentraler "nociceptiver" Neuronen, insbesondere höheren Schmerzzentren, zurückgehen, und chronisch entzündliche Schmerzen, umfasst und/oder zur Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronische Schmerzen, akute Schmerzen, entzündliche Schmerzen, visceraler Schmerzen und neuropathischer Schmerzen.

In einem achten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Zusammensetzung umfassend eine erfindungsgemäße und bevorzugterweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

In einem neunten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch Zusammensetzung umfassend einen erfindungsgemäßen Antagonisten und bevorzugterweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

In einem zehnten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch Komplex umfassend CGRP und eine erfindungsgemäße Nukleinsäure.

In einem elften Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zum Nachweis von CGRP, bevorzugterweise α- CGRP oder β-CGRP und am bevorzugtesten menschliches α-CGRP oder β-CGRP.

In einem zwölften Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch Verfahren zum Screenen von CGRP-Antagonisten umfassend die folgenden Schritte:

- Bereitstellen eines Kandidaten-CGRP-Antagonisten,
- Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuren,
- Vorsehen eines Testsystems, welches ein Signal in Gegenwart eines CGRP- Antagonisten ergibt, und
- Bestimmen, ob der Kandidaten-CGRP-Antagonist ein CGRP-Antagonist ist.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das CGRP α-CGRP und/oder β-CGRP ist, bevorzugtererweise menschliches α-CGRP und/oder β-CGRP.

In einem dreizehnten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch Verfahren zum Screenen von CGRP-Agonisten umfassend die folgenden Schritte:

- Bereitstellen von CGRP, bevorzugt immobilisiertem CGRP,
- Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, bevorzugterweise einer markierten erfindungsgemäßen Nukleinsäure,
- Zugabe eines Kandidaten-CGRP-Agonsiten, und
- Bestimmen, ob der Kandidaten-CGRP-Agonist ein CGRP-Agonist ist.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Bestimmen dadurch erfolgt, dass festgestellt wird, ob die Nukleinsäure durch den Kandidaten-CGRP-Agonisten verdrängt wird.

In einem vierzehnten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Kit für den Nachweis von CGRP, bevorzugterweise α-CGRP oder β-CGRP, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß es möglich ist, spezifisch an CGRP bindende Nukleinsäuren zu erzeugen. Nachdem umfangreiche Belege dafür vorliegen, daß CGRP im Schmerzgeschehen und an der Ausbildung von Migräne in ihren verschiedenen Ausbildungsformen beteiligt ist, ergibt sich somit, daß derartige Nukleinsäuren als Antagonisten für CGRP bzw. das CGRP1-Rezeptorsystem verwendet werden können und insoweit auch als pharmazeutische Wirkstoffe bei der Behandlung von Erkrankungen des Formenkreises der Migräne. Dabei ist besonders bemerkenswert, daß es sich bei CGRP um ein vergleichsweise kleines Peptid handelt, gegen welches bindende Nukleinsäuren nur schwer erzeugt werden können. Die Aminosäuresequenz von humanem αCGRP und βCGRP unterscheiden sich in drei Aminosäuren, die Aminosäuresequenz von αCGRP und βCGRP und der Ratte unterscheiden sich in einer Aminosäure. Die verschiedenen Sequenzen sind beschrieben in Hakala und Vihinen (Hakala J. M. L. und Vihinen M., 1994, Protein Engineering 7(9), 1069-1075. (Accession numbers: human αCGRP P06881, human βCGRP P10092, rat αCGRP P01256, rat βCGRP P10093.

Diese Anwendung stützt sich dabei im wesentlichen auf die Beobachtung, daß CGRP in neuralem Gewebe und insbesondere in somatischen Sinneszellen reichlich vorhanden ist und häufig mit anderen Neuropeptiden, wie beispielsweise Substanz P co-exprimiert wird, und die weiteren im folgenden geschilderten Ergebnisse der Schmerz- und Migräneforschung.

Immunocytochemische Studien zeigen, daß Substanz P fast immer mit CGRP in kleinen DRG-Neuronen (dorsal root ganglion) assoziiert ist, wohingegen CGRP auch ohne Substanz P beobachtet wird (Wiesenfeld-Hallin, Z. et al., 1984, Neurosci. Lett. 52, 199-203). Die Freisetzung von CGRP in der Peripherie führt zu einer Vasodilatation und zusammen mit anderen Neuropeptiden, wie Substanz P, zur neurogenen Entzündung. CGRP wird auch im Dorsalhorn des Rückenmarks als Antwort auf schädliche Stimulationen in der Peripherie freigesetzt und stellt somit einen Applikations- und Untersuchungsort zur Anwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Antagonisten und Mittel dar.

Der CGRP1 Antagonist CGRP8-37 wurde in unterschiedlichen Schmerzmodellen getestet. Um endogenes CGRP zu antagonisieren, wurde ein anti-CGRP-Antiserum in verschiedenen Schmerzmodellen nach intrathekaler Gabe getestet. Die Erzeugung von αCGRP-defizienten Mäusen und Verhaltensexperimente dazu schließen das Bild. Der anti-nociceptive Effekt von CGRP8-37 konnte in verschiedenen Schmerzmodellen wie Phenylquinone-induziertes (PQ) Writhing (Saxen, M. A. et al., 1994, Life Sciences 55, 1665-1674), Essigsäure-induziertes Writhing (Friese, N. et al., 1997, Regulatory Peptides 70, 1-7), viszeraler Schmerz (colorectales Distensions-Modell, Plourde, V. et al., 1997, Am. J. Physiol, 35, G191-G196), Brandschmerz (Hitzeinduzierte Hyperalgesie, Lofgren, O. et al., 1997, Neuropeptides 31, 601-607), und neuropathischen Schmerz (spinale Hemisektion, Bennett, A. D. et al., 2000, Pain 86, 163-175). Im Maus tail-flick, einem Modell für den Akutschmerz, konnte kein Effekt beobachtet werden.

Um den Effekt des spinal freigesetzten CGRP's zu blockieren wurde ein Antiserum in verschiedenen Modellen für chronischen Schmerz getestet. In chronisch entzündlichen Schmerzmodellen wie beispielsweise Adjuvant-induzierter Arthritis (Kuraishi, Y. et al., 1988, Neurosci. Lett. 92, 325-329) oder Carrageenin-induzierter Hyperalgesie (Kawamura, M. et al., 1989, Brain Res. 497, 199-203) zeigte das anti-CGRP-Antiserum anti-nociceptive Wirkung. Dieses Antiserum kann auch in Ratten eine wiederholte Stress-induzierte Hyperalgesie verhindern (Satoh, M. et al., 1992, Pain 49, 273-278).

Die anti-nociceptiven Effekte, die sowohl mit dem trunkierten Peptid CGRP8-37 und als auch mit dem Antiserum beobachtet werden, passen gut mit der in αCGRP-defizienten Knockout- Mäusen beobachteten Hyperalgesie zusammen (Salmon, A.-M. et al., 1999, Neuroreport 10, 849-954). CGRP^-/- Mäuse zeigen im Vergleich zu den CGRP^+/+-Mäusen reduzierte Hyperalgesie bei chronisch entzündlichem Schmerz der durch Formalin- oder Capsaicin- Injektionen in die Hinterpfote ausgelöst wurde (Salmon, A.-M. et al., 2001, Nature 56, 357-358). Eine zweite αCGRP-defiziente Maus wurde erzeugt, um die Rolle des Calcitonins zu untersuchen. Die CGRP^-/--Mäuse werden normal geboren, sind fertil und leben ein normales Leben. Diese Mäuse entwickeln in einem chronischen Arthritis-Modell (Kaolin-Carragenin- Mix wurde ins Kniegelenk injiziert) im Vergleich zum Wildtyp, keine sekundäre Hyperalgesie (Zhang, L. et al., 2001, Pain 89, 265-273).

Infolge dieser Ergebnisse können α-CGRP-Antagonisten wie die hierin offenbarte CGRP- Antagonisten bzw. die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch effektiv für die Behandlung von chronisch entzündlichem und viszeralem Schmerz eingesetzt werden.

Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung sollen auch solche Nukleinsäuren umfassen, die im wesentlichen homolog zu den spezifisch hierin offenbarten Sequenzen sind. Der Begriff im wesentlichen homolog soll hierin so verstanden werden, daß die Homologie wenigstens 75%, bevorzugterweise 85%, bevorzugtererweise 90% und am bevorzugtesten mehr als 95, 96, 97, 98 oder 99% beträgt.

Der Begriff erfindungsgemäße Nukleinsäure oder Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung soll auch jene Nukleinsäuren umfassen, die einen Teil der hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen bzw. Nukleinsäuren umfassen, bevorzugterweise in dem Umfang umfassen, daß die besagten Teile bei der Bindung von CGRP beteiligt sind. Diese Art von Nukleinsäuren können von den hierin offenbarten abgeleitet werden, beispielsweise durch Verkürzung oder Trunkierung. Die Verkürzung soll sich entweder auf eines oder beide Enden der hierin offenbarten Nukleinsäuren beziehen. Die Verkürzung kann sich auch auf eine Nukleotidsequenz innerhalb der jeweiligen Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuresequenz beziehen, d. h. sie kann sich beziehen auf ein oder mehrere Nukleotide zwischen dem 5'- bzw. dem 3'- terminalen Nukleotid. Im Zusammenhang damit soll Verkürzung die Deletion von so wenig wie einem einzelnen Nukleotid von der Sequenz der hierin offenbarten Nukleinsäuren umfassen. Verkürzung kann auch mehr als einen Bereich der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n) betreffen. Beispiele für die Verkürzung der Nukleinsäuren werden in dem Beispielsteil der vorliegenden Beschreibung gelehrt.

Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können entweder D-Nukleinsäuren oder L-Nukleinsäuren sein. Bevorzugterweise sind die Nukleinsäuren L-Nukleinsäuren. Zusätzlich ist es möglich, daß ein oder mehrere Teile der Nukleinsäure als D-Nukleinsäure(n) ausgebildet sind, oder wenigstens ein oder mehrere Teile der Nukleinsäure als L-Nukleinsäure ausgebildet sind. Der Begriff "Teil" der Nukleinsäure soll so wenig wie ein Nukleotid bezeichnen. Derartige Nukleinsäuren werden im allgemeinen hierin als D- bzw. L- Nukleinsäure bezeichnet.

Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren Teil einer längeren Nukleinsäure sind, wobei diese längere Nukleinsäure mehrere Teile umfaßt, wobei wenigstens ein Teil eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon ist. Der andere Teil oder die anderen Teile dieser längeren Nukleinsäuren können entweder eine D-Nukleinsäure oder eine L-Nukleinsäure sein. Eine jegliche Kombination kann in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Dieser andere Teil bzw. diese anderen Teile der längeren Nukleinsäure können eine Funktion aufweisen, die vom Binden und insbesondere vom Binden an CGRP, verschieden ist. Eine mögliche Funktion besteht darin, eine Wechselwirkung mit anderen Molekülen, z. B. zu Zwecken der Immobilisierung, Kreuzvernetzung, Nachweis oder Amplifikation zu erlauben.

Die L-Nukleinsäuren sind somit Nukleinsäuren, die aus L-Nukleotiden bestehen, bevorzugterweise vollständig aus L-Nukleotiden bestehen.

D-Nukleinsäuren sind somit solche Nukleinsäuren, die aus D-Nukleotiden bestehen, bevorzugterweise vollständig aus D-Nukleotiden bestehen.

Unabhängig davon, ob die erfindungsgemäße Nukleinsäure aus D-Nukleotiden, L- Nukleotiden oder einer Kombination beider besteht, wobei die Kombination z. B. eine zufällige Kombination oder eine definierte Sequenz von Abfolgen von Nukleotiden ist, die aus wenigstens einem L-Nukleotid bzw. einem D-Nukleotid besteht, kann die Nukleinsäure aus einem oder mehreren Desoxyribonukleotid(en), Ribonukleotid(en) oder Kombinationen davon bestehen.

Die Ausbildung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als L-Nukleinsäure ist aus einer Reihe von Gründen mit Vorteilen verbunden. Die L-Nukleinsäuren sind Enantiomere der natürlicherweise auftretenden Nukleinsäuren. Die D-Nukleinsäuren sind jedoch in wäßrigen Lösungen und insbesondere in biologischen Systemen oder biologischen Proben nicht sehr stabil infolge der weiten Verbreitung von Nukleasen. Natürlicherweise auftretende Nukleasen, insbesondere Nukleasen von tierischen Zellen oder Geweben oder Zell- oder Körperflüssigkeiten, sind nicht in der Lage, L-Nukleinsäuren abzubauen. Infolge dessen ist die biologische Halbwertszeit der L-Nukleinsäure in derartigen Systemen, einschließlich des menschlichen und tierischen Körpers, wesentlich verlängert. Bedingt durch das Fehlen einer Abbaubarkeit von L-Nukleinsäuren werden keine Nuklease-Abbauprodukte erzeugt und es werden insoweit keine darauf zurückgehende Nebenwirkungen beobachtet. Dieser Aspekt unterscheidet die L-Nukleinsäure von all jenen anderen Verbindungen, die bei der Therapie von Erkrankungen, die auf die Anwesenheit von CGRP abstellen, verwendet werden.

Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, unabhängig davon, ob sie als D-Nukleinsäuren, L-Nukleinsäuren oder D,L- Nukleinsäuren vorliegen, oder ob sie als DNA oder RNA vorliegen, als einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäuren vorhanden sein können. Typischerweise sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren einzelsträngige Nukleinsäuren, die eine definierte Sekundärstruktur infolge der Primärsequenz aufweisen und auch Tertiärstrukturen ausbilden können. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können jedoch auch als doppelsträngig in dem Sinne vorliegen, daß zwei zueinander komplementäre Stränge infolge Hybridisierung miteinander gepaart vorliegen. Dies verleiht der Nukleinsäure eine Stabilität, die von Vorteil ist, wenn die Nukleinsäure in der natürlicherweise vorkommenden D-Form anstelle der L- Form vorliegt.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch modifiziert sein. Eine besonders vorteilhafte Modifikation im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung stellt dabei die Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n) dar, bei der mindestens ein, bevorzugterweise mehrere und am bevorzugtesten alle die Nukleinsäure ausbildenden Pyrimidinnukleotide an der 2'-Position des Riboseteils der jeweiligen Nukleotide eine 2- Fluorogruppe aufweisen.

Weitere Beispiele für eine Modifizierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können solche Modifikationen sein, die ein einzelnes Nukleotid der Nukleinsäure betreffen und im Stand der Technik sehr gut bekannt sind. Entsprechende Beispiele sind, unter anderem, beschrieben in Kusser, W. (2000) J Biotechnol 74, 27-38; Aurup, H. et al., 1994, Nucleic Acids Res 22, 20-4; Cummins, L. L. et al. 1995, Nucleic Acids Res 23, 2019-24; Eaton, B. E. et al., 1995, Chem Biol 2, 633-8; Green, L. S. et al., 1995, Chem Biol 2, 683-95; Kawasaki, A. M. et al., 1993, J Med Chem 36, 831-41; Lesnik, E. A. et al., 1993, Biochemistry 32, 7832-8; Miller, L. E. et al., 1993, J Physiol 469, 213-43.

Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können als einteilige, zwei-, drei oder mehrteilige Form ausgebildet sein. Von den mehrteiligen Form ist besonders die zweiteilige oder bipartite Form bevorzugt. Eine mehrteilige Form einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist hierin insbesondere eine solche, die aus wenigstens zwei Nukleinsäuresträngen besteht. Diese beiden Nukleinsäurestränge bilden eine funktionale Einheit, wobei die funktionale Einheit ein Ligand oder bindendes Molekül für ein Zielmolekül ist. Die wenigstens zwei Stränge können von einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren abgeleitet sein oder werden durch entweder Spaltung einer an das Zielmolekül bindenden erfindungsgemäßen Nukleinsäure, um zwei oder mehrere Stränge zu bilden, oder durch Synthese einer Nukleinsäure, die einem ersten Teil der erfindungsgemäßen vollständigen Nukleinsäure entspricht und einer weiteren Nukleinsäure, die einem zweiten Teil der erfindungsgemäßen vollständigen Nukleinsäure entspricht. Es ist anzuerkennen, daß sowohl die Spaltung als auch die Synthese angewandt werden kann, um eine mehrteilige Nukleinsäure herzustellen, die aus mehr als den beiden vorstehend beispielhaft beschriebenen Strängen besteht. Im übrigen ist betreffend die mehrteiligen Formen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure festzuhalten, daß wenigstens zwei Nukleinsäurestränge typischerweise verschieden sind von zwei Strängen, die zueinander komplementär sind und miteinander hybridisieren, obgleich ein gewisser Grad an Komplementarität zwischen den verschiedenen Nukleinsäure(teilen) existieren kann.

Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung weisen typischerweise eine hohe Affinität zum Zielmolekül auf. Eine Möglichkeit, die Affinität, ausgedrückt als Bindungskonstante, der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zu bestimmen, ist die Verwendung der sog. Biacore-Vorrichtung, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben ist in Jönsson, U. et al., 1991, Biotechniques, 11(5), 620. Die Affinitäten wurden auch gemessen durch isothermale Titrationskalorimetrie (ITC), wie in den Beispielen und in Haq, I. & Ladburg, J., 2000, J. Mol. Recognit. 13(4): 188 beschrieben. Insoweit sind die hierin beschriebenen Affinitätswerte als durch isothermale Titrationskalorimetrie gemessen zu verstehen, wobei die Temperatur für die einzelne Messung 25°C betrug, sofern keine gegenteiligen Angaben gemacht werden. Eine weitere verwendete Methode wird manuell angewendet; es handelt sich um einen sogenannten Bead- Assay. Hierbei werden konstante Konzentrationen an radioaktiv markierter Nukleinsäure mit verschiedenen Konzentration an biotinyliertem Zielmolekül wie beispielsweise einem Target- Peptid zusammengegeben. Nach definierter Zeit werden die gebildeten Komplexe über die Zugabe von mit Streptavidin-beladenen Beads aus der Lösung entfernt und die jeweilige Menge an Radioaktivität wird bestimmt. Aus den erhaltenen Werten lassen sich über entsprechende Auftragung in Graphen die Bindungskonstanten bestimmen. Dieser Bead- Assay ist ausführlicher u. a. in Beispiel 3 beschrieben. Sofern hierin auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäure Bezug genommen wird, sollen damit grundsätzlich alle erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. alle hierin offenbarten Nukleinsäuren verstanden werden, sofern keine gegenteiligen Angaben gemacht werden.

Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die erfindungsgemäßen Sequenzen entweder vollständig oder teilweise aus dem randomisierten Teil der Mitglieder einer Nukleinsäurebibliothek entstammen, die als Ausgangsmaterial für den Selektionsprozeß verwendet werden. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die erfindungsgemäßen Sequenzen entweder vollständig oder teilweise aus dem nicht- randomisierten Teil der Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek, die als Ausgangsmaterial für den Selektionsprozeß dient, entstammen. Ein derartiger nicht-randomisierter Teil ist beispielsweise der Teil, der als Bindungsstelle für den Amplifikations-Primer verwendet wird.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können verwendet werden für die Erzeugung oder Herstellung eines Medikaments. Ein derartiges Medikament enthält wenigstens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, optional zusammen mit weiteren pharmazeutisch aktiven Verbindungen, wobei die erfindungsgemäße(n) Nukleinsäure(n) bevorzugterweise selbst als pharmazeutisch aktive Verbindung fungiert. Beispielsweise könnte eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einem weiteren Wirkstoff kombiniert werden, der die Konzentration von CGRP beeinflusst. Generell scheint die Kombination der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit dem weiteren Wirkstoff besonders dann von Vorteil zu sein, wenn beide Komponenten an CGRP und dessen Freisetzung über unterschiedliche Wirkmechanismen angreifen. Eine in diesem Sinne vorteilhafte Kombination könnte beispielsweise aus einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sowie einem Triptan, wie beispielsweise Sumatriptan bestehen, da beide Substanzen unterschiedliche Wirkmechanismen ansprechen. Bei einer Migräneattacke könnte man sich ein Kombi- Präparat und dessen Wirkung wie folgt vorstellen: im Plasma vorkommendes CGRP wird durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure weggefangen und gleichzeitig werden durch Triptane die CGRP-Freisetzung reduziert/verhindert. Derartige Medikamente umfassen in bevorzugten Ausführungsformen wenigstens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Derartige Träger können z. B. Wasser, Puffer, Stärke, Zucker, Gelatine und dergleichen sein. Derartige Träger sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.

Die Erkrankungen, für die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und die unter ihrer Verwendung identifizierten CGRP-Antagonisten verwendet werden können, sind im wesentlichen solche, die zum Formenkreis der Migräne gehören insbesondere Migräne mit und ohne Aura, einfache Migräne, klassische Migräne und komplizierte Migräne. Dazu gehören unter anderem Kopfschmerzen, insbesondere wiederkehrende Kopfschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, übertriebene Sensitivität gegenüber externen Stimuli wie Licht und Geräuschen, Appetitlosigkeit und Störungen des Flüssigkeitshaushaltes. Der Kopfschmerz ist dabei besonders ein solcher, der bei den Patienten als pulsierend und pochend auftritt. Typischerweise treten diese Kopfschmerzen einseitig auf. Weitere Erkrankungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und der auf der Grundlage deren Verwendung identifizierten Kandidaten-CGRP-Antagonisten identifiziert werden können, sind Vasodilatation, erhöhter Blutdruck, Hypotonie und Tachykardie, insbesondere jene Formen der vorstehend genannten Erkrankungen, die im Zusammenhang mit Migräne, insbesondere einem Migräneanfall, zu beobachten sind. Weitere Erkrankungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. der unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Kandidaten-CGRP-Antagonisten bereitgestellt werden können, sind solche Erkrankungen, die mit einer Aktivierung trigeminaler afferenter sensorischer Neurone, mit der Aktivierung zentraler nociceptiver Neuronen und Kombinationen der Aktivierung beider Neuronenklassen einhergehen oder verbunden sind. Insbesondere handelt es sich bei den Neuronen um solche, die höheren Schmerzzentren zugeordnet sind. Weitere Erkrankungen im vorstehend genannten Sinne sind neben Akutschmerz solche Erkrankungen, die mit chronisch entzündlichen Schmerzen verbunden sind. Zu derartigen chronisch entzündlichen Schmerzen gehören insbesondere jene, die von CGRP zusammen mit anderen Neuropeptiden verursacht werden, wie beispielsweise Substanz P.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können weiterhin als Ausgangsmaterial für das Design von pharmazeutischen Wirkstoffen (engl. drug design) verwendet werden. Grundsätzlich gibt es hierzu zwei mögliche Ansätze. Ein Ansatz besteht in dem Screening von Bibliotheken von Verbindungen, wobei derartige Bibliotheken von Verbindungen bevorzugterweise Bibliotheken von niedermolekularen Verbindungen (engl. low oder small molecules) sind. Derartige Bibliotheken sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Alternativ können gemäß der vorliegenden Erfindung die Nukleinsäuren für das rationale Design von Wirkstoffen verwendet werden.

Das rationale Design von Wirkstoffen kann dabei seinen Ausgangspunkt von irgendeiner der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung nehmen und umfaßt eine Struktur, insbesondere eine dreidimensionale Struktur, die ähnlich der Struktur der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n) ist oder identisch ist zu dem Teil der Struktur der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n), die die Bindung an CGRP vermittelt. In einem jeden Fall zeigt eine derartige Struktur noch das gleiche oder ein zumindest ähnliches Bindungsverhalten, wie die erfindungsgemäße Nukleinsäure(n). In entweder einem weiteren Schritt oder als ein alternativer Schritt werden bei dem rationalen Design von Wirkstoffen die bevorzugterweise dreidimensionale Struktur jener Teile der an CGRP bindenden Nukleinsäuren durch chemische Gruppen nachgeahmt, die bevorzugterweise verschieden sind von Nukleotiden und Nukleinsäuren. Durch dieses Nachahmen, auch als Mimikri bezeichnet, kann eine Verbindung konstruiert werden, die von der Nukleinsäure bzw. den Nukleinsäuren verschieden ist, die als Ausgangsmaterialien für das rationale Design des Wirkstoffes verwendet wurde. Eine derartige Verbindung oder Wirkstoff ist bevorzugterweise ein kleines Molekül (engl. small molecule) oder ein Peptid.

Im Falle des Screenings von Verbindungsbibliotheken, wie bei Verwendung eines kompetitiven Tests, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, können geeignete CGRP-Analoga, CGRP-Agonisten oder CGRP-Antagonisten gefunden werden. Derartige kompetitive Assays können wie folgt aufgebaut sein. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure, bevorzugterweise ein Spiegelmer, das als Zielmolekül bindende L-Nukleinsäure ausgebildet ist, wird an eine feste Phase gekoppelt. Um CGRP-Analoga zu identifizieren, werden mit einer Markierung versehene Neuropeptide zu dem Testsystem hinzugegeben. Ein potentielles Analogon würde mit den CGRP-Molekülen, die an das Spiegelmer binden, kompetitieren, was mit einer Abnahme des Signals, das von der entsprechenden Markierung erhalten wird, einhergehen würde. Das Screenen auf Agonisten oder Antagonisten kann die Verwendung eines Zellkultur-Testsystems umfassen, das den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist.

In einem weiteren Aspekt können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren für die Targetvalidierung verwendet werden infolge ihres charakteristischen Bindungsverhaltens an CGRP. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einem ex vivo-Organmodell verwendet werden, um die Funktion von CGRP zu studieren. Grundsätzlich existieren zwei ex vivo Modelle, in denen CGRP Agonisten/Antagonisten getestet werden können. Im Meerschweinchen-Atrium können Antagonisten für den CGRP2-Rezeptor getestet werden, im Ratten Vas deferens-Modell können Antagonisten hinsichtlich ihrer Spezifität für den CGRP1-Rezeptor überprüft werden.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung betrifft diese einen Komplex umfassend CGRP und wenigstens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Es ist überraschenderweise festgestellt worden, daß die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren relativ starr sind und eine genau definierte Struktur einnehmen und insoweit auch dem Zielmolekül, d. h. dem CGRP selbst, eine vergleichsweise starre Struktur aufprägen, wobei das CGRP infolge seiner Länge allgemein als vergleichsweise flexibel verstanden wird.

Der Kit gemäß der vorliegenden Erfindung kann wenigstens eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfassen. Zusätzlich kann der Kit wenigstens eine oder mehrere Positiv- oder Negativkontrollen umfassen. Als Positivkontrollen kann z. B. CGRP verwendet werden, gegen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure selektiert wurde, oder an die diese bindet, bevorzugterweise in flüssiger Form. Als Negativkontrolle kann unter anderem ein Peptid verwendet werden, welches sich hinsichtlich seiner biophysikalischen Eigenschaften ähnlich wie CGRP verhält, welches jedoch nicht durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren erkannt wird oder ein Peptid mit gleicher Aminosäurezusammensetzung aber von CGRP verschiedener Sequenz.

Weiterhin kann der Kit einen oder mehrere Puffer umfassen. Die verschiedenen Bestandteile können in dem Kit in trockener oder lyophilisierter Form, oder gelöst in einer Flüssigkeit vorliegen. Der Kit kann eine oder mehrere Behältnisse umfassen, die wiederum ein oder mehrere der Bestandteile des Kits enthalten können. Bevorzugterweise enthalten die Gefäße Reaktionsansätze, wie sie für eine einmalige Durchführung eines Experimentes unter Verwendung einer oder mehrere Bestandteile des Kits erforderlich sind.

Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Figuren und Beispiele erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile ergeben. Dabei zeigt
Fig. 1 das Prinzip der einer RNA-Selektion von an CGRP bindenden Nukleinsäuren umfassend einen Anbindungsschritt mit den Teilschritten Denaturierung und Faltung sowie Anbindung-Waschen-Elution und den Amplifizierungsschritt umfassend den Schritt der reversen Transkription-PCR sowie T7-Transkription und Aufreinigung;
Fig. 2 den Verlauf einer Selektion von 2'-Fluoro-modifizierten, an CGRP bindenden Nukleinsäuren, wobei insbesondere
Fig. 2A die in einer jeden Selektionsrunde verwendete CGRP-Konzentration und die dazugehörige prozentuale Anbindung des F-RNA-Pools und
Fig. 2B eine graphische Darstellung der in Fig. 2A angegebenen Werte;
Fig. 3 das Ergebnis einer Sequenzanalyse der im Rahmen von Beispiel 1 erhaltenen CGRP bindenden Nukleinsäuren;
Fig. 4-11 die Sekundärstruktur von verschiedenen an CGRP bindenden Nukleinsäuren, wie sie im Rahmen von Beispiel 2 erzeugt wurden;
Fig. 12 den Verlauf der Vorsäulen während der Selektion von an CGRP bindenden Nukleinsäuren;
Fig. 13 den Verlauf der CGRP bindenden 2'-F-RNA und der Peptidkonzentration des Selektionsansatzes NA unter Verwendung von Neutravidin als Selektionsmatrix;
Fig. 14 den Verlauf der an CGRP bindenden 2'-F-RNA und der Peptidkonzentration des Selektionsansatzes SA-1 und SA-0,1 unter Verwendung Streptavidin derivatisierten magnetischen Beads als Selektionsmatrix;
Fig. 15 das Reaktionsschema zur Synthese von 5'-DMT-2'-fluoro-L-Uridin- Phosphoramidit;
Fig. 16 die Darstellung von 2'-Fluoro-L-Cytidin-Phosphoramidit ausgehend von 2'- Fluoro-L-Uridin;
Fig. 17 die Synthese von 2'-Fluoro-L-Cytidin ausgehend von 2'-Fluoro-L-Uridin;
Fig. 18 die Sequenzen der Ausgangssequenzen und der verkürzten Sequenzen der CGRP bindenden Nukleinsäuren von Beispiel 2;
Fig. 19 die prozentuale Bindung verschiedener CGRP erkennender Nukleinsäuren, wie in Beispiel 3 näher beschrieben; NA-A bedeutet hier NeutrAvidin-Agarose mit Affinitätselution, NA-D bedeutet NeutrAvidin-Agarose mit denaturierender Elution, SA-1 bedeutet Streptavidin Beads mit 1 nM Peptid- und SA 0,1 nM Peptidkonzentration
Fig. 20 das Ergebnis einer Kompetitionsanalyse verschiedener gemäß Beispiel 3 selektierter CGRP bindender Nukleinsäuren;
Fig. 21 eine Darstellung von Versuchen zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten verschiedener CGRP bindender Nukleinsäuren;
Fig. 22 eine weitere Darstellung von Versuchen zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten verschiedener CGRP bindender Nukleinsäuren;
Fig. 23 die Hemmung der cAMP-Produktion durch humanes CGRP bindende Spiegelmere;
Fig. 24 die Hemmung der cAMP-Produktion durch Ratten-CGRP bindende Spiegelmere,
Fig. 25 Bindungsstudien mit den verschieden gereinigten Spiegelmeren 732_045 (55mer) und 732_096 (59mer) im [³⁵S]GTPγS-Assay,
Fig. 26-27 die Sekundärstruktur von verschiedenen an CGRP bindenden Nukleinsäuren, wie sie im Rahmen von Beispiel 2 erzeugt wurden und die aus mehr als einem Nukleinsäurestrang zusammengesetzt sind,
Fig. 28, 30, 32, 34, 36 graphisch den Verlauf der Bedingungen verschiedener Selektionsrunden,
Fig. 29, 31, 33, 35, 37 tabellarisch den Verlauf der Bedingungen verschiedener Selektionsrunden,
Fig. 38 die Dosis-Wirkungskurve für CGRP,
Fig. 39 bis 42 den Verlauf der kalorimetrischen Bestimmung der Bindungskonstanten verschiedener CGRP bindender Nukleinsäuren;
Fig. 43 bis 47 die Sequenzen verschiedener, im Rahmen von Beispiel 4 erhaltenen CGRP bindenden Nukleinsäuren, und
Fig. 48 und 49 die Sequenzen verschiedener, im Rahmen von Beispiel 3 erhaltenen CGRP bindenden Nukleinsäuren.

Beispiel 1

Herstellung von 2'-Fluoro-modifizierten Spiegelmeren

Ausgehend von dem Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäuren, insbesondere D- Nukleinsäuren, die an ein Zielmolekül binden, wie beispielsweise dargestellt in Fig. 1, wurden 2'-Fluoro-modifizierte Spiegelmere unter Verwendung von 2'-fluorierten RNA- Molekülen verwendet.
Die in dem Selektionsprozeß benutzten Fluoro-modifizierten Nukleinsäuren (F-RNA) unterscheiden sich von biologisch vorkommender RNA durch das Vorhandensein einer Fluoro-Gruppe am 2'-Kohlenstoff der Ribose. Fluor ersetzt hier die natürliche Hydroxylgruppe der Ribose. Diese Modifikation wurde hier auf Pyrimidinnukleotide begrenzt. Die Erstellung solcher künstlicher Nukleinsäuren erfolgt enzymatisch mit einer mutierten T7-Polymerase (Epicentre, Madison, WI, USA), die toleranter gegen modifizierte Nukleotide ist, unter Verwendung von 2'-Fluoro-UDP und 2'-Fluoro-CTP. Die Mutation der T7-Polymerase ermöglicht den effizienten Einbau von Fluoro-modifizierten Nukleosidtriphosphaten.

A. Materialien

GTP, ATP, und dNTPs wurden von Larova, Berlin; Fluoro-dUTP und Fluoro-dCTP von TriLink, San Diego, USA bezogen. Die T7 DNA/RNA Polymerase für die Herstellung fluorierter RNA wurde von Epicentre, USA bezogen. Die Enzyme Taq DNA Polymerase und Superscript II Reverse Transkriptase stammten von Life Technologies, der Kit für die Reverse Transkriptase/Taq Polymerase war von Qiagen. Radioaktives ³²[P]-α-GTP zur Markierung der F-RNA wurde von Hartmann, Braunschweig, bezogen.
D-CGRP wurde zunächst von JERINI AG, Berlin, und später von Bachem, Heidelberg synthetisiert. Das zur Selektion verwendete Peptid trägt eine Biotingruppe am Carboxylterminus, um die Trennung von ungebundenen Nukleinsäuren mittels der Biotin- Streptavidin oder Biotin-NeutrAvidin Wechselwirkung zu ermöglichen. Hierfür wurden NeutrAvidin-Agarose von Pierce und Streptavidin Paramagnetic Particles von Roche verwendet. Unbiotinyliertes Peptid (ebenfalls von JERINI, Berlin, und Bachem, Bubendorf, Schweiz) wurde in den ersten sieben Runden zur Affinitätselution benutzt.

DNA-Pool

Die DNA für den Startpool wurde im Hause synthetisiert und basiert auf dem beschriebenem Pool PB40 mit der Sequenz 5'-GGA GCT CAG CCT TCA CTG C-N₄₀-GGC ACC ACG GTC GGA TCC AC-3' (Burgstaller & Famulok, 1994, Angew. Chem. Int. Ed. 33, 1084).
Die 5'- und 3'-Primer hatten die Sequenz
PB40-R-For: 5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG AGC TCA GCC TTC ACT GC-3' und
PB40-R-Rev: 5'-GTG GAT CCG ACC GTG GTG CC-3'.
Die einzelsträngige DNA wurde auf ihre Amplifizierbarkeit mit radioaktiven Primern überprüf; daraus wurde eine Komplexität von 1,41 × 10¹⁴ Moleküle/nmol DNA abgeleitet. Mittels PCR wurde die einzelsträngige DNA in einem Gesamtvolumen von 8 ml zu doppelsträngiger DNA aufgearbeitet.

B. Selektionsschritte

Denaturierung und Faltung der fluorierten RNA

Alle nicht-enzymatischen Schritte der Selektion mit Ausnahme der Denaturierung wurden in Selektionspuffer (HEPES-KOH, pH 7,5; 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ und 0,1% Tween 20) durchgeführt. Die Denaturierung erfolgte für 3 Minuten bei 94°C in Selektionspuffer ohne Tween 20, MgCl₂ und CaCl₂. Nach der Denaturierung wurde die enzymatisch hergestellte F-RNA in Selektionspuffer zunächst für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, MgCl₂ und CaCl₂ wurden zugesetzt und die Faltung nochmals bei 37°C für 30 Minuten fortgesetzt.

Anbindung

Im Anschluß an die Faltung wurde die F-RNA zunächst bei 37°C für 15 Minuten ohne Peptid mit der Matrix (NeutrAvidin-Agarose oder Streptavidinparamagnetische Partikel) inkubiert. Diese sogenannte Prä-Selektion diente der Vorisolierung von potentiellen Matrixbindern. Nach diesem Inkubationsschritt wurde die F-RNA von der Matrix getrennt, mit den aus Fig. 2A ersichtlichen Konzentrationen von biotinyliertem CGRP versetzt und für mindestens 3 Stunden bei 37°C belassen. Daraufhin wurde dem Bindungsansatz die Biotin-bindende Matrix zugesetzt und nochmals 5-10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Matrix wurde von der Lösung getrennt und mit Selektionspuffer gewaschen. Das hierbei verwendete Waschvolumen lag in den ersten Runden bei der 5-10-fachen Menge der Matrix, in späteren Runden wurden bis zu 60-fache Waschvolumina benutzt. Die nach dem Waschen an der Matrix verbleibende Menge an F-RNA wurde durch Szintillationszählung detektiert und quantifiziert. Der Anbindungswert wurde als Prozentsatz der eingesetzten F-RNA ausgedrückt.

Elution

In den Runden 1-9 wurde die bindende F-RNA in drei Schritten mit nicht-biotinyliertem Peptid eluiert. Hierbei wurde in der Regel ein 10-facher Überschuß des nicht-biotinyliertem gegenüber des biotinylierten CGRP eingesetzt und erst eine, dann drei Stunden und letztlich über Nacht bei 37°C eluiert. Die eluierte F-RNA wurde mit Phenol-Chloroform- Isoamylalkohol extrahiert, mit Ethanol gefällt und in Wasser resuspendiert. Die nach diesen Affinitätselutionsschritten auf der Matrix verbleibende RNA wurde nicht eluiert sondern direkt auf der Matrix amplifiziert (siehe unten).
Ab Runde 10 wurde nur noch in einem Schritt unter denaturierenden Bedingungen eluiert. Hierzu wurde die nach dem Waschen auf der Matrix verbliebene F-RNA in zwei Schritten mit jeweils 100 µl 8 M Harnstoff für 5 Minuten bei 65°C inkubiert. Die eluierte F-RNA wurde mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol extrahiert, mit Ethanol gefällt und in Wasser aufgenommen.

C. Amplifikation - Enzymatische Reaktionen

Transkription - Erstellung fluorierter RNA für Verwendung in der Selektion

Transkriptionen wurden mit 150 U T7 RNA/NA Polymerase und dem vom Hersteller mitgelieferten Puffer (40 mM Tris-HCl pH 7,5; 10 mM NaCl; 6 mM MgCl₂; 2 mM Spermidin; 10 mM DTT) in einem Gesamtvolumen von 100 µl durchgeführt. Den Reaktionen wurde generell MgCl₂ auf eine Endkonzentration von 11 mM zugesetzt. Die Endkonzentrationen von ATP und GTP betrugen jeweils 1 mM während der ganzen Selektion; 2'-Fluoro-UTP und 2'-Fluoro-CTP wurden bis in die 9. Runde mit einer Konzentration von jeweils 3 mM verwendet, ab der 9. Runde nur noch mit 1,5 mM. Pro Reaktion von 100 µl wurden zwischen 20 und 50 µmol Template eingesetzt, d. h. doppelsträngige DNA Template in der ersten Runde und in allen Folgerunden auf doppelsträngige DNA, welche durch enzymatische Aufarbeitung der im vorausgehenden Zyklus selektierten F-RNA erstellt. Für die radioaktive Markierung der fluorierten RNA wurde ³²[P]-α-GTP benutzt. Die Reaktionen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und mit DNase I versetzt, um das Template zu verdauen. Die erzeugte F-RNA wurde daraufhin unter denaturierenden Bedingungen über ein 8% Polyacrylamidgel mit 8 M Harnstoff von nicht eingebauten NTPs getrennt. Die transkribierte F-RNA wurde aus dem Gel eluiert, mit Ethanol gefällt, getrocknet und in reinem Wasser aufgenommen.

Reverse Transkription - Erstellung von cDNA von selektierten F-RNAs

Die reverse Transkription eluierter Fluoro-RNA wurde mit Superscript II und den Pufferbedingungen des Herstellers in einem Volumen von 20 µl mit 200 units Enzym und einer dNTP Konzentration von jeweils 1 mM durchgeführt. In der Regel wurden bis zu 8 µmol der eluierten F-RNA in 10 µl Wasser gelöst und mit 2 µl einer 100 µM Lösung des reversen Primers vermischt. Dieses Template-Primer-Gemisch wurde für 2 Minuten bei 94°C denaturiert, auf Eis überführt und dann im Thermocycler auf eine Temperatur von 50°C eingestellt. Nach 2 Minuten bei 50° C wurden 8 µl eines Gemischs aus Puffer, dNTPs und Enzym zugesetzt und die Probe für 15 Minuten bei 50°C, weitere 15 Minuten bei 55°C und letztlich 10 Minuten bei 68°C inkubiert.
In den Runden 1-9 wurde die nach der Affinitätselution auf der Matrix verbliebene F-RNA auch direkt auf dem Träger revers transkribiert und mit Hilfe der PCR amplifiziert. Hierfür wurde der RT-PCR Kit von Qiagen benutzt.

PCR - Erstellung des doppelsträngigen DNA Templates

Die in der reversen Transkription erzeugte cDNA wurde direkt in die PCR eingesetzt. Dabei dienten 6,66 µl des 20 µl RT-Ansatzes als Template für eine 100 µl Reaktion mit 5 units Taq DNA Polymerase. Die Konzentration der Primer belief sich auf 2,5 µm. Die DNA wurde zunächst für 2 Minuten bei 94°C denaturiert und dann mit einem PCR-Profil von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 30 Sekunden bei 72°C amplifiziert. Die Anzahl der Zyklen wurde generell so gering wie möglich gehalten und belief sich in der Regel auf etwa 5-10 Zyklen.

Resultate

Der Verlauf der Selektion ist in Fig. 2 dargestellt. Die in Fig. 2A angegebenen Werte stellen die in der jeweiligen Runde verwendeten CGRP-Konzentrationen und die dazugehörige prozentuale Anbindung des F-RNA Pools dar.
Abgebildet ist dabei nur der Strang, der letztendlich auch die nachstehenden Sequenzen hervorbrachte. In den meisten Runden wurde die Anbindung mit unterschiedlichen Peptidkonzentrationen sowie einer Kontrollselektion ohne Peptid durchgeführt (nicht dargestellt). Generell wurde die selektierte F-RNA des stringentesten Stranges, d. h. der geringsten Peptidkonzentration, welche noch ein signifikantes Signal über der Nullkontrolle ergab, als Template für die nächste Runde aufgearbeitet. Fig. 2B ist eine graphische Darstellung dieser Daten.
Die erste Selektionsrunde wurde mit 2,5 nmol F-RNA-Molekülen durchgeführt, die Komplexität hatte eine Größenordnung von etwa 2,82 × 10¹⁴ unterschiedlichen Sequenzen. Da unter diesen Bedingungen jede Sequenz nur etwa fünf mal vertreten war, wurde in der ersten Runde ein relative hoher Prozentsatz selektierter Sequenzen in die 2. Selektionsrunde überführt. Van der 2. bis zur 5. Runde wurden zwischen 0,36% und 2,65% der eingesetzten F-RNA in die jeweilige Folgerunde eingesetzt. Während diesen fünf Runden wurde die Stringenz durch eine Verringerung des zur Bindung angebotenen biotinyliertes D-CGRP von 33 µM auf 3,33 µM angezogen. In der 6. Runde war ein leichter Anstieg in der Anbindung zu verzeichnen, der sich mit einem Wert von 12.8% der eingesetzten F-RNA in der 7. Runde fortsetzte.
Durch kontinuierliche Verringerung der CGRP-Konzentration in den Folgerunden wurde die Stringenz zunehmend verschärft, was zu einem Einbruch der Anbindung der eingesetzten F-RNA an das Peptid führte. Eine kontinuierliche Zunahme der Anbindungswerte in Runde 8 und 9 bis auf 5,14% in Runde 10 korrelierte mit einem Anstieg in der Prä-Selektion (nicht dargestellt) und war somit nicht auf peptidvermittelte Bindung zurückzuführen. Aus diesem Grund wurde in Runde 11 die Matrix von NeutrAvidin-Agarose auf Streptavidinparamagnetische Partikel gewechselt. Dies spiegelte sich in einem Rückgang der prozentualen Anbindung auf nunmehr 1,23% wider. Ein peptidvermittelter Anstieg auf 5,74% war jedoch in Runde 13 zu verzeichnen. Über die nächsten drei Runden stellte sich ein Wert von etwa 3,5% Anbindung bei einer CGRP Konzentration von 125 nM ein. Da dieser Wert trotz gleichbleibender Stringenz in den Runden 15, 16 und 17 (Runde 17 nicht abgebildet) nicht weiter anstieg, wurden die Runden 17 und 18 als sogenannte Doppelrunde durchgeführt. Die Überlegung für diesen methodischen Ansatz beruht auf der Annahme, daß eine Stagnation der prozentualen Anbindung bei gleichbleibender Peptidkonzentration die Folge einer Art Gleichgewicht zwischen der eigentlichen Anbindung und der darauffolgenden Amplifizierung ist. Um dieses Gleichgewicht zu Gunsten der Bindung zu verschieben, wurde die F-RNA einem zweifachen Bindungsprozeß unterworfen: Die F-RNA wurde zunächst bei der weniger stringenten CGRP-Konzentration von 1,25 µM angebunden, daraufhin eluiert und gereinigt. Die auf diese Weise gesammelte F-RNA wurde nun nicht wie üblicherweise durch enzymatische Amplifizierung aufgearbeitet, sondern neu gefaltet und direkt in eine weitere Selektionsrunde unter stringenteren Bedingungen eingesetzt. Wie aus Fig. 2A und B ersichtlich, konnten durch diese Methode in Runde 18 bei Peptidkonzentrationen von 1 und 10 nM noch jeweils 4,89% und 31,51% Anbindung der eingesetzten F-RNA (wie aus Fig. 2A ersichtlich) erzielt werden. Diese F-RNA wurde revers transkribiert und durch PCR amplifiziert. Die DNA wurde kloniert, und es wurden insgesamt 192 Klone sequenziert.

Sequenzen

Das Ergebnis der Sequenzanalyse ist in Fig. 3 dargestellt. Dabei ist die kursiv dargestellte Sequenz (dritte Sequenz von oben) diejenige des Klons 732. Mutationen sind in Fettdruck dargestellt, der Beitrag der Primerbindungsstelle ist durch Unterstreichung markiert. Für die verschiedenen Klone wurde die folgende Reihenfolge festgestellt:
Von den 192 Klonen konnten in 180 Klonen beide Primer gefunden werden. Von diesen 180 Sequenzen war eine Sequenz mit 168 Exemplaren deutlich am häufigsten vertreten. Die übrigen zwölf Sequenzen unterschieden sich von der Hauptsequenz nur durch Punktmutationen und Basendeletionen: Eine Punktmutation kam dabei fünfmal, fünf weitere je einmal vor. Eine Deletion von zwei Nukleotiden kam zweimal vor.
Ein Vergleich der Bindungsstärke dieser Sequenzen wurde unter Verwendung der Biacore- Vorrichtung angestellt und ergab, daß sieben von den acht Sequenzen dieselbe Affinität für das Targetmolekül zeigen. Der K_D des um zwei Nukleotide verkürzten Klons wurde mit ca. 10 nM vermessen. Die Bindungskonstante lag bei 37°C um den Faktor zwei höher. Bindungskonstanten wurden sowohl mit der Biacore-Vorrichtung, als auch mit Isothermaler Kalorimetrie (ITC) bestimmt. Die Kalorimetrie-Experimente wurden bei 37°C in entgastem Selektionspuffer mit einer Rührgeschwindigkeit von 300 U/min durchgeführt. Die Messzelle wurde mit einer 10 µM Lösung des jeweiligen 2'F-Spiegelmers gefüllt. Die Injektionsspritze enthielt eine 25 µM Lösung CGRP, die nach einer initialen 5 µl Injektion in 7,5 µl Fraktionen in die Messzelle eingespritzt wurde. Der Injektionsvorgang dauerte jeweils 10 s, das Zeitintervall zwischen zwei Injektionen betrug 300 s.
Die Biacore-Experimente wurden bei 37°C in entgastem Selektionspuffer durchgeführt. Auf dem Streptavidin-Chip war biotinyliertes CGRP immobilisiert (Blank - 140 RU - 640 RU - 900 RU). Spiegelmer-Lösung in einer Konzentration von 500 ergab ein typisches Bindungssignal, das mit Standard-Biacore-Software (1 : 1 Bindungsmodell) ausgewertet wurde.

Beispiel 2

Verkürzung von 2'-F-RNA-Aptameren, die freies D-CGRP binden

Ausgehend von den in Beispiel 1 beschriebenen D-CGRP bindenden 2'-F-RNA-Aptameren und den hierzu korrespondierenden 2'-F-RNA-Spiegelmeren, die freies L-CGRP erkennen können, wurde versucht, die Länge der jeweiligen Aptamere bzw. Spiegelmere zu verkürzen. Von den insgesamt acht Klonen, wie in Beispiel 1 dargestellt, zeichneten sich sieben Klone durch ähnliche Bindungskonstanten von 10 bis 50 nM aus. Der Klon 670 erkannte D-CGRP deutlich schlechter. Wie erwartet, erkannten die selektierten Aptamere, die D- Oligonukleotide, die von entsprechend aus der Klonierung und Sequenzierung erhaltenen Plasmiden über einen zwischengeschalteten PCR-Schritt exprimiert wurden, natürliches L- CGRP nicht, wie Messungen am Biacore ergeben haben.
Die Sekundärstruktur einiger der in Beispiel 1 beschriebenen Aptamere und Spiegelmere wurde mit dem Programm rnafold (LL. Hofacker, et al., 1994, Monatsh. Chem 125, 167-188) bestimmt. Im besonderen werden die Sekundärstrukturmodelle der Aptamers 666 und 732 sowie der Spiegelmere 732-029, 732-026, 732-100 und 732-108 gezeigt. Die Ergebnisse sind in Figs. 4 und 5 sowie für die Spiegelmere in den Figs. 6, 7, 8 und 9 dargestellt. Die Sekundärstrukturmodelle stimmten gut mit den Ergebnissen von enzymatischen Probing- Experimenten überein (Ehresmann, C., et al., 1987, Nucleic Acids Res 15(22): p. 9109-28).
Die Sekundärstrukturen bestehen jeweils aus einem Stamm, zwei Haarnadelschleifen und einer 15- oder 16-nt langen Auswölbung und bilden damit eine Kleeblatt-ähnliche Struktur. Die Auswölbungen im Strukturkern, geformt von C(10)-C(11)-U(12) und C(54)-U(55)-C(56), und die Haarnadelschleife U(13) bis A(26) scheinen essentiell für die Erkennung des Zielmoleküls CGRP zu sein. Für CGRP bindende Aptamere bzw. L-CGRP bindende Spiegelmere kann somit ein minimales Bindungsmotiv festgehalten werden, welches eine Kleeblatt-ähnliche Struktur aufweist. Ein alternatives minimales Bindungsmotiv ist die Ausbildung eines Stammes mit zwei Haarnadelschleifen und einer 15 oder 16 Nukleotide umfassenden Auswölbung. Bevorzugterweise wird die Auswölbung im Strukturkern gebildet durch die Nukleotidabfolge C(10)-C(11)-U(12) und C(54)-U(55)-C(56)und die Haarnadelschleife durch die Nukleotidabfolge U(13) bis A(26), wie in den Figs. 4 bis 9 dargestellt.
Aufgrund der gemessen Bindungsaffinität zum Zielmolekül CGRP mit einem K_d von 10 nM wurde Klon 666 als Ausgangsklon für die Verkürzung und Optimierung von 2'-F-RNA Aptameren und Spiegelmeren ausgewählt. Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde Klon 666 aus einem N40 Pool, d. h. einem Pool dessen randomisierte Sequenz eine Länge von 40 Nukleotiden aufweist, isoliert und bestand aus einer 79-nt langen Sequenz. Die Sequenz hat einen besonders auffälligen Ureichen Bereich zwischen den Nukleotidposition 41-50, in dem 7 von 10 Nukleobasen Uracile sind. Die Sekundärstruktur des Klons 666 wurde mit dem Programm rnafold I. L. Hofacker, et al., 1994, Monatsh. Chem. 125, 167-188 vorhergesagt und ist in Fig. 4 dargestellt. Die Sekundärstruktvorhersage stimmte auch in diesem Fall gut mit den Ergebnissen enzymatischer Probing-Experimente überein (Ehresmann, C. et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15(22), 9109-28). Das Aptamer bildet eine charakteristische Kleeblatt-ähnliche Struktur, bestehend aus einem Stamm mit mehreren kleinen Auswölbungen, zwei Haarnadelschleifen (I und III) und einer scheinbar unstrukturierten 16-nt Auswölbung (II), die die beiden Haarnadelschleifen verbindet. Alle vier Strukturelemente haben ihren Ursprung in zwei gegenüberliegenden Auswölbungen bestehend aus jeweils drei Basen. Die Primerbindungsstellen, vor allem die 5'-Primerbindungsstelle, sind im Stamm integriert.
Für die Synthese von 2'-F-RNA Spiegelmeren war es notwendig, die Sequenz von Klon 666 soweit zu verkürzen und zu optimieren, daß das resultierende minimale Bindungsmotiv eine chemische Synthese mit vertretbarem Aufwand erlaubt bei gleichzeitigem Erhalt der hohen Affinität zum Zielmolekül.
Ein minimales Bindungsmotiv wurde unter Verwendung von direkten Nukleotidpunktmutationen und -deletionen identifiziert. Eine Serie von Deletionen mit Tetranukleotidblöcken ergab eine erste Übersicht über Regionen, die für die Bindung des Zielmoleküls essentiell sind. Deletionen in allen drei Doppelhelixregionen waren möglich und führten nicht zu einer signifikanten Verringerung der Bindungsaffinität, allerdings nur solange, wie eine Stammbildung noch möglich war. Sobald zu viele Deletionen zum Verlust der Stammbildung führten, war keine Bindung an das Zielmolekül CGRP mehr zu beobachten. Dies war zu beobachten, wenn der schließende Stamm des Nukleinsäurebinders entweder auf weniger als fünf Basenpaare oder die Haarnadelschleifen I und III auf weniger als 3 Basenpaare verkürzt wurden.
Deletionen in den drei Schleifen führte zu unterschiedlichen Ergebnissen.
Eine jeder der im Folgenden beschriebenen Ausführungsformen der folgenden Sequenzen stellt eine erfindungsgemäße Nukleinsäure dar. Das Ausschneiden der Nukleotide G(20)- A(21) in Haarnadelschleife I (in Analogie zu Klon 732) führte zu einem Nukleinsäurebinder der weiterhin hochaffin war (K_d = 20 nM), jede weitere getestete Deletion oder Mutation in Schleife 1 führte jedoch zu einem kompletten Bindungsverlust. In Schleife III konnten die Nukleotide A(46) und U(47) ohne Bindungsverlust herausgenommen werden. Wie zu erwarten, führte die Deletion einer der Basen U(48), U(49) oder U(50) in Kombination mit A(46) zum gleichen Ergebnis. Verschiedene Verkürzungen waren ebenfalls in Schleife II möglich, im speziellen wurde das Herausnehmen der Basen G(28), U(29), A(30), U(31), A(33) und A(35) toleriert, allerdings führte es zu verschieden starken Veränderungen in der Bindungsaffinität. Eine Kombination dieser Deletionen war ausschließlich im Fall der Co- Deletion von U(29)-A(30) möglich. Der Stamm der Haarnadelschleife I erlaubte eine weitere Verkürzung der Stammlänge auf drei Basenpaare bei der Deletion des Basenpaares A(15) und U(24) (die Stammlänge wird bereits bei der Deletion der Nukleotide G(20)-A(21) in der Schleife I von 5 Basenpaare auf 4 Basenpaare verkürzt (Klon 732, Fig. 5)). Die Auswölbung C(10) bis U(12) und C(54) bis C(56) scheinen essentiell für die Erkennung des Zielmoleküls bzw. für die hierzu benötigte Tertiärstruktur zu sein, da bereits die Deletion eines dieser Nukleotide zum vollständigen Verlust der Erkennung des Zielmoleküls CGRP führt.
Zusammenfassend läßt sich somit feststellen, daß insbesondere die Schleife der Haarnadelschleife I und die zentrale Auswölbung der Kleeblattstruktur essentiell für die Bindung des Zielmoleküls sind. Die Haarnadelschleife III, die kleineren Auswölbungen im Zentrum der Kleeblattstruktur und der daran anschließende Stamm dienen wahrscheinlich der Stabilisierung einer speziellen Tertiärstruktur.
Weitere Verkürzungen konnten mit dem fast vollständigen Herausnehmen der 3'- Primerbindungsstelle C(64) bis C(79) und dem Herausnehmen des Dinukleotides A(3)-G(4), einem kleinen Teil der 5'-Primerbindungsstelle aus dem abschließenden Stamm des Nukleinsäurebinders, erzielt werden. Eine derartige Verkürzung stellt der Klon 732_029 dar. Diese Verkürzung ging einher mit einem nur geringfügigen Affinitätsverlust (K_d = 30 nM). Der abschließende Stamm konnte weiter durch die Deletionen der Basenpaare C(5):G(61) und U(6):G(60) auf fünf Basenpaare verkürzt werden (K_d = 30 nM, wie dies auch in Fig. 7 beschrieben ist).
Das Austesten verschiedener Kombinationen dieser unterschiedlichen Deletionen führte zu Klon 732_100 (Länge 51 nt, K_d = 75 nM, Fig. 8). Hierbei wurden die Deletionen A(3)-G(4), C(5):G(61), U(6):G(60), G(20)-A(21), A(15):U(24), A(46)-U(47) und C(64) bis C(79) miteinander kombiniert. Dieses 51mer bindet mit einem K_d von 75 nM an das Zielmolekül CGRP. Eine Analyse der mittels des Programms rnafold vorhergesagten Struktur zeigt allerdings eine potentielle Alternativfaltung, die durch eine Mutation des Basenpaares C(14):G(25) zu G(14):C(25) (Klon 732_103) bzw. des Basenpaares C(44):G(52) nach G(44):C(52) (Klon 732_104) verhindert werden kann. In der Tat zeigen diese beiden Klone auch eine erhöhte Affinität zu CGRP mit einem K_d von 20 bzw. 40 nM. Klon 732_104 läßt sich weiter mit der Deletion G(32) kombinieren, wodurch man Klon 732_108 erhält, ein 50mer mit einem K_d von 35 nM (Fig. 9).
Die Sequenzen 732_026 und 732_029 wurden für die Herstellung von Spiegelmeren zur Bestimmung ihrer biologischen Aktivitäten ausgewählt. Da kein Festphasenmaterial mit L-2'- F-modifiziertem C zur Verfügung stand, wurde zunächst getestet, ob eine Mutation des jeweils endständigen GC-Basenpaares in ein CG-Basenpaar entsprechend den Klonen 732_045 bzw. 732_096 (Fig. 10 und Fig. 11) ohne meßbaren Verlust der Bindungsaffinität möglich war. Da nahezu identische K_d-Werte für 732_045 bzw. 732_096 im Vergleich zu 732_026 bzw. 732_029 erhalten wurden, wurden diese für die Produktion von Spiegelmeren zur Bestimmung ihrer biologischen Aktivitäten ausgewählt.
Eine weitere Methode, um ein minimales Bindungsmotiv zu finden, wurde verfolgt, als Klon 666 oder verkürzte Formen davon aus zwei unabhängig voneinander synthetisierten Fragmenten kombiniert wurden. In zwei Vorversuchen wurde eine Fragmentierung in jeweils einer der beiden Haarnadelschleifen I und III getestet. Zum einen G(1) bis C(19) und A(22) bis C(79) (dargestellt mit Klon 732_070a und 732_070b, Fig. 26) und zum anderen G(1) bis A(46) + AG und C + U(49) bis C(79) (dargestellt mit Klon 732_071a und 732_071b, Fig. 27).
Das zusammengesetzte System 732_070ab zeigte keine meßbare Bindungsaffinität zu CGRP. Dieses Ergebnis verstärkt die Vermutung, daß die Haarnadelschleife I in den Bindungsprozeß mit CGRP involviert ist, wie auch Daten des enzymatischen Probing-Experimenten nahelegen. Die Fragmente 732_071a + 732_071b dagegen bilden einen Nukleinsäurebinder, der mit einem K_d von 100 nM an das Zielmolekül CGRP bindet. Weitere Experimente zeigten, daß der Stamm der ehemaligen Haarnadelschleife III mindestens fünf Basenpaare lang sein muß, um ein meßbares Bindungsereignis zu erhalten. Das Zusammensetzen eines Nukleinsäurebinders aus zwei Fragmenten ist eine effiziente Alternative, um ein minimales Bindungsmotiv zu erhalten. Es gestattet die Synthese und Produktion von relativ langen Nukleinsäurebindern in einem großen Syntheseumfang unter vertretbarem wissenschaftlichen und auch wirtschaftlichen Aufwand. Für die Generierung von zusammengesetzten CGRP- bindenden Nukleinsäurestrukturen gelten die gleichen Grundlagen wie für einteilige Nukleinsäurebinder. Die Affinität und Bioaktivität des resultierenden erfindungsgemäßen Nukleinsäurebinders 732_071ab war vergleichbar mit denen der einteiligen Nukleinsäurebindern 732_108, 732_096 und 732_045 in den gemessenen Bereichen in den verwendeten Assays (732_071ab, K_d = 100 nM), 732_108 K_d = 35 nM, 732_096 K_d = 30 nM und 732_045 K_d = 30 nM).
Die Spiegelmer/L-CGRP- und Aptamer/D-CGRP-Komplexe ergaben innerhalb der experimentellen Fehlerabweichung übereinstimmende Gleichgewichtsbindungskonstanten.
Die Nukleinsäurebinder 732_045, 732_096 und 732_071ab wurden ausgewählt für weiterführende biologische Studien und in den entsprechenden enantiomeren Formen synthetisiert.

Die verschiedenen, im Rahmen dieses Beispiels erzeugten und verwendeten Sequenzen sind in Fig. 18 dargestellt. Den in Fig. 18 dargestellten Sequenzen kann dabei die jeweils folgende SEQ. ID. No. zugeordnet werden:

Sequenz	SEQ. ID. No.
666	9
732	10
732_026	11
732_029	12
732_045	13
732_096	14
732_100	15
732_103	16
732_104	17
732_108	18
732_070a	19
732_070b	20
732_071a	21
732_071b	22

Beispiel 3

Selektion von 2'-F-RNA-Aptameren

Es wurde eine weitere Selektion durchgeführt mit dem Ziel, 2'-F-RNA-Aptamere gegen D- CGRP zu identifizieren. Die dabei angewandten Reaktionsbedingungen sind die folgenden:
Bei dem verwendeten Zielmolekül handelt es sich um CGRP aus Ratten. Sequenz und Bereitstellung erfolgte analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise.

Selektionspool, Erstellung des Startpools

Der Selektionspool SK60 besteht aus einem randomisierten Bereich von 60 Nukleotiden, welcher von dem T7-Primer (37 Nukleotide) vom 5'-Ende und vom reverse-Primer (20 Nukleotide) am 3'-Ende flankiert wird. Der T7 Primer beinhaltet einen Transkriptionsinitiierenden und einen Forward-Primerbereich. Der Forward-Primer fängt zur Verbesserung der Transkriptionseffizienz mit einen Guanosintriplett an.
SK60 Pool: 5'-GGG AAT TCG AGC TCG GTA CC-N₆₀-CTG CAG GCA TGC AAG CTT GG-3'
SK.60T7: 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CGA GCT CGG TAC C-3'
SK.60F: 5'-GGG AAT TCG AGC TCG GTA CC-3'
SK.60R: 5'-CCA AGC TTG CAT GCC TGC AG-3'
Die Annealing-Temperatur für die Primer wurde theoretisch berechnet und im berechneten Rahmen anschließend experimentell optimiert.

T_m = Schmelztemperatur, T_p = 22 + 1.46 × [2 × (#GC) + (#AT)] = optimale Annealing- Temperatur mit optimaler Amplifikation, nach Wu et al., 1991, DNA and Cell Biology 10, 233; ohne T7-Promotor-Region.
Der Pool wurde synthetisch hergestellt, die Basenzusammensetzung bestimmt und eine Komplexität von 1 × 10¹⁵ Molekülen entsprechend 1,78 nmol ssDNA über Polymerase- Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction [PCR]) amplifiziert. 1,78 nmol der doppelsträngigen DNA wurden in der in vitro Transkription mit fluorierten Pyrimidin- Nukleotiden (TriLink BioTechnologies, San Diego, CA92121) in 2'-fluoroierte RNA nach Protokoll 1 umgeschrieben. Der so hergestellte 2'-F-SK60 RNA Startpool wurde in die erste Selektionsrunde eingesetzt. Protokoll 1 Ansatz der in vitro Transkription für die 1. Runde

Selektionspuffer

Der Selektionspuffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂ und 1 mM CaCl₂) ist an physiologische Bedingungen des menschlichen Bluts angelehnt und während der ganzen Selektion verwendet. Der pH Wert von 7,4 wurde bei 37°C eingestellt.

Selektionsstränge und Stringenzen

Es wurden 2 verschiedene Selektionsansätze zur Identifizierung einer CGRP bindenden 2'- Fluoro-RNA durchgeführt, deren Charakteristika in der folgenden Tabelle zusammengefaßt sind. Tab. Charakteristika der Selektionsansätze gegen rCGRP-1
Der erste Ansatz wurde unter Verwendung von Neutravidin-Agarose (Pierce) als Matrix zur Immobilisierung des 2'-F-RNA/Peptidkomplexes durchgeführt. Die gebundene 2'-Fluoro- RNA wurde in 2 Schritten von der Matrix eluiert. Zunächst wurden die Binder über Affinitätselution durch Kompetition mit einem Überschuß an nicht-biotinyliertem CGRP eluiert. Anschließend erfolgte eine Elution mit 8 M Harnstoff durch Denaturierung des 2'- Fluoro-RNA-Peptidkomplexes. Die Eluate wurden getrennt in der Amplifikation aufgearbeitet, um einen Selektionsdruck seitens der enzymatischen Reaktionen zu limitieren.
Der zweite Selektionsansatz wurde auf Steptavidin-derivatisierten magnetischen Partikeln als Matrix zur Immobilisierung des 2'-Fluoro-RNA-Peptidkomplexes durchgeführt. Die Elution erfolgte ebenfalls mit 8 M Harnstoff durch Denaturierung des RNA/Peptidkomplexes.

Faltung der 2'Fluoro-RNA

Um eine Mg²⁺- und Ca²⁺-Ionen unabhängige Faltung der 2'-Fluoro RNA zu erhalten, wurde die Denaturierung und Renaturierung (Faltung) in Selektionspuffer ohne Ca²⁺- und Mg²⁺- Ionen durchgeführt. Die 2'-Fluoro-RNA wurde in Selektionspuffer ohne Mg²⁺/Ca²⁺ für 5 Minuten bei 95°C denaturiert und anschließend für 30 Minuten auf 37°C gefaltet. Danach erfolgte die Zugabe der Ionen und eine weitere Faltung für 10 Minuten bei 37°C. Der Ansatz wurde direkt auf eine Vorsäule gegeben.

Vorsäulen

Die Vorsäule wurde zur Gegenselektion (counter-Selektion) von potentiell Matrix-bindenden 2'F-RNA Molekülen durchgeführt und dient somit generell der Abreicherung Matrix- bindender 2'-F-RNA innerhalb des Selektionsprozesses. Unter einer Vorsäule versteht man eine unbeladene Säule, welcher der eigentlichen Peptidsäule innerhalb einer Selektionsrunde vorgeschaltet ist. Die Vorsäule wurde gleich der Hauptsäule dimensioniert. Die 2'-F-RNA wurde für 30 Minuten bei 37°C mit der Matrix inkubiert, und anschließend wurde die 2'-F- RNA mit einem Säulenvolumen Selektionspuffer von der Matrix gewaschen. Die an der Matrix verbleibende markierte RNA wurde bestimmt und als Vorsäule dokumentiert. Die eluierte 2'-F-RNA wurde für den Selektionsprozeß weiter verwendet.
Der Verlauf der Vorsäulen während der Selektion, d. h. der an der Matrix verbleibende Anteil markierter RNA, ist in Fig. 12 dargestellt. Dabei ist beachtlich, daß ab der Runde 13 die Selektion SA in zwei Selektionsstränge aufgeteilt wurde, nämlich Selektionsstrang SA-1 und SA-0,1, die sich in der Peptidkonzentration unterschieden. Im Falle von SA-1 betrug die Peptidkonzentration in Runde 13 10 nM und in den Runden 14 bis 16 1 nM, wohingegen im Selektionsansatz SA-0,1 die Konzentration an Peptid in der 13. Runde 10 nM und anschließend in den Runden 14 bis 16 nur 0,1 nM betrug.

Anbindung und Immobilisierung

Zu der 2'F-RNA in Lösung wurde direkt das biotinylierte D-CGRP zugegeben. Die Konzentration des biotinylierten Peptids im Bindungsansatz wurde im Laufe des Selektionsprozesses, wie in der nachfolgenden Tabelle dargestellt, sukzessive verringert. Tab. Verringerung der Peptidkonzentration
Die Anbindung des biotinylierten rCGRP-2'-F-RNA Ansatzes an die Neutravidin- bzw. Steptavidin-derivatisierte Matrix erfolgte durch direkte Zugabe des Bindungsansatzes auf die Matrix. Die Bindung erfolgte im Thermoschüttler (Eppendorf) für 10 Minuten bei 37°C mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 800 UpM.

Waschen

Der an der Matrix immobilisierte bio-CGRP-2'F-RNA Komplex wurde mit Selektionspuffer gewaschen, um nicht gebundene 2'F-RNA in einzelnen Waschschritten von der Säule zu entfernen. CGRP-1 bindende 2'F-RNA verbleibt dabei auf der Matrix. Ein Waschvolumen betrug 100 µl Selektionspuffer. Während der Selektion wurde die Stringenz der Selektion über die Erhöhung der Waschschritte angezogen, wie dies auch aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich ist. Tab. Verlauf der Waschschritte

Elution der gebundenen 2'-Fluoro-RNA

Selektionsansatz NA-A

Die Elution der an der Matrix über das Peptid gebundenen 2'-F- RNA erfolgte zunächst über Kompetition mit nicht-biotinyliertem CGRP in einem 10-fachen Überschuß über dem immobilisiertem bio-CGRP. Die Inkubation erfolgte für 12 Stunden bei 37°C im Überkopfschüttler. Anschließend erfolgte eine Elution der verbleibenden 2-F-RNA durch Denaturierung des 2'-F-RNA/Peptidkomplexes durch Zugabe von 8 M Harnstoff. Die Inkubation erfolgte bei 65°C für 20 Minuten im Thermoschüttler bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 1200 UpM.

Selektionsansatz SA-1/0,1

Die Elution erfolgte durch Denaturierung des 2'-F-RNA/Peptidkomplexes durch Zugabe von 8 M Harnstoff. Die Inkubation erfolgte bei 65°C für 20 Minuten in einem Thermoschüttler bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 1200 UpM.
Der Verlauf der eluierten 2'-F-RNA und der Peptidkonzentration des Selektionsansatzes NA- A ist in Fig. 13 dargestellt. Es konnte eine Anreicherung bindender 2-F-RNA in der sechsten Selektionsrunde bei 1 µM Peptidkonzentration gezeigt werden. Die Peptidkonzentration wurde kontinuierlich bis auf 10 nM reduziert. Eine Reduktion der Peptidkonzentration erfolgte jeweils nur nach erneuter Anreicherung bindender 2'-F-RNA bei gegebener Peptidkonzentration, wie dies in den Runden 6, 8, 10 und 13 dargestellt ist. Die Selektion wurde ab Runde 13 bis 16 bei 10 nM Peptid in Plateau geführt, und die angereicherten Nukleinsäuren wurden kloniert und sequenziert.
Der Verlauf der eluierten 2'F-RNA und der Peptidkonzentration der Selektionsstränge SA-1 und SA-0,1 ist in Abb. 14 A/B dargestellt. Die Selektionen SA-1 und SA-0,1 wurden bis zur 13. Runde gemeinsam als ein Selektionsstrang geführt und dann in die unterschiedlichen Selektionsstränge SA-1 und SA-0,1 mit unterschiedlicher Fortführung der Peptidkonzentration bis zur Runde 16 geführt, kloniert und sequenziert. Eine Reduktion der Peptidkonzentration erfolgte dabei jeweils nur nach erneuter Anreicherung bindender 2'-F- RNA bei gegebener Peptidkonzentration, wie dies in den Runden 8, 11 und 13 dargestellt ist.

Amplifikation

Extraktion und Fällung

Die eluierte 2'-F-RNA wurde mittels Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt und anschließend mit Glycogen als Carrier, 0,3 M Natriumacetat pH 5,5 und 3 Volumina 50 : 50 (v/v) Ethanol-Isopropanol für 30 Minuten bei -80°C gefällt.

Reverse Transkription (RT)

Die gefällte 2'-F-RNA wurde mittels reverser Transkription in einzelsträngige DNA (ssDNA) umgeschrieben. Es werden < 5 pmol 2'-F-RNA-Templat pro 40 µl Ansatz eingesetzt.
Zunächst wurden der 10 µM SK60-reverse Primer nach Denaturierung (5 Minuten 95°C) des 2'-F-RNA Templates in der Anwesenheit von 0,8 M Betain durch direktes Abkühlen der Probe auf Eis (sogenanntes. snap cooling) annealed. Anschließend wird der first strand Puffer (250 mM Tris/HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂), 10 mM DTT und Desoxyribonukleinsäure zugegeben. Die Pufferbedingungen entsprechen denen für das Enzym Superscript II (Standardbedingungen des Herstellers). Der Ansatz wird für 2 Minuten auf 48°C erwärmt, und 5 Units der Reversen Transkriptase werden hinzugegeben. Die Inkubation erfolgte über einen Temperaturstufengradienten (48°C 30 Minuten, 50°C 20 Minuten, 55°C 10 Minuten, 70°C 15 Minuten) in einem PCR Thermocycler.

Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase-chain reaction)

Jeweils 10 µl des RT-Ansatzes wurden als Template für die PCR eingesetzt, was einer Template-Menge von 1-5 µmol/100 µl PCR Ansatz entspricht. Die Nukleotidsequenzen der Primer sind:
SK.60T7: 5-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CGA GCT CGG TAC C-3'
SK.60R: 5'-CCA AGC TTG CAT GCC TGC AG-3'
Der PCR-Ansatz wurde wie folgt zusammen gegeben und bis zu einer Ausbeute an dsDNA von ca. 1 pmol/µl Ansatz bei 1 Minute 94°C Denaturierung, 1 Minute 72°C Annealing und 1 Minute 72°C Elongation gefahren. Die Reaktion wurde auf einem denaturierenden 8%- igen Polyacrylamidgel analysiert. Protokoll 2 PCR-Reaktion während der Selektion
Die PCR Ansätze wurden mit Ethanol gefällt, in Wasser resuspendiert, und 50-100 pmol Material wurden für die in vitro Transkription eingesetzt.

2'-Fluoro Transkription

50 pmol dsDNA wurden als Template für die Transkription mit Fluoro- Pyrimidinnukleosidtriphosphaten eingesetzt. Das Verhältnis der 2'-Fluroro- Pyrimidinnucleosidtriphosphaten zu den nicht-modifizierten Purinnukleosidtriphosphaten ist 3 : 1. Die Inkubation wurde über Nacht bei 37°C in einem Thermoblock durchgeführt.

4. Ergebnisse

Verlauf der Selektionen

Die Selektionen wurden in der ersten Runde als Sammelrunde angelegt, um möglichst keine bindenden F-RNA-Moleküle zu verlieren. In den folgenden Runden wurde über die Intensivierung der Waschschritte, die Verringerung der Peptidkonzentration, sowie die Erhöhung des RNA : Peptid-Verhältnisses die Stringenz hinsichtlich der Selektion hochaffiner bindender 2'-F-RNA kontinuierlich angezogen.
Es konnte für den Selektionsstrang NA eine erste Anreicherung an CGRP-bindender 2-F- RNA in den Runden 6 und 8 gezeigt werden. Nach Erhöhung der Stringenzfaktoren und anschließendem Einbruch des Signals konnte jeweils ein erneuter Anstieg an bindender 2'-F- RNA beobachtet werden. Die Selektion wurde schließlich bei einer Peptidkonzentration von 10 nM hinsichtlich des Signals in ein Plateau geführt, und die Eluate (Affinitätselution und denaturierende Elution) wurden getrennt amplifiziert, kloniert und sequenziert. NA-A bezeichnet die Sequenzen der Eluate der Affinitätselution und NA-D die Eluate der anschließenden denaturierenden Elution.
Der Selektionsstrang SA zeigte in Runde 8 eine Anreicherung an CGRP bindender 2'-F-RNA. Eine Reduktion der Peptidkonzentration führte immer zunächst zu einem Einbruch des Signals mit anschließender erneuter Anreicherung (Runden 11 und 13). Nach der Runde 13 wurde der Selektionsstrang in die beiden Stränge SA-1 und SA-0,1 gespalten. SA-1 wurde bei einer Peptidkonzentration von 1 nM, SA-0,1 bei einer Peptidkonzentration von 100 pM in ein Signalplateau gebracht; beide Strängen wurden dann getrennt amplifiziert, kloniert und sequenziert.

Sequenzen

Im Rahmen der Selektion wurden die folgenden Sequenzen erhalten: Familien

Tab x.
Die vorstehend genannten Sequenzen entsprechen dabei den folgenden SEQ. ID. No.:

Sequenz SEQ. ID. No.

1 23

2 24

3 25

4 26

5 27

6 28

7 29

8 30

9 31

10 32

Ranking

Ein Ranking der Klone wurde über Bindungsversuche gegen 1 µM D-CGRP in Lösung ermittelt. Die gefaltete, radioaktiv markierte RNA wurde 2 Stunden bei 37°C mit dem Peptid inkubiert, über Neutravidin-Agarose immobilisiert, gewaschen, und die prozentuale Anbindung der 2'-F-RNA an CGRP wurde ermittelt. Die Klone D7, El, G10 und E3 zeigten die höchste prozentuale Anbindung. Das Ergebnis ist auch in Fig. 19 dargestellt. Die Zuordnung der Herkunft der Klone aus den jeweiligen Selektionssträngen NA-A (Affinitätselution), NA-D (denaturierende Elution), SA-1 und SA-0,1 ist unter der x-Achse dargestellt.

Kompetition

Zur weiteren Charakterisierung der Klone C5, E1, F1 D7, B3 und F10 wurden Kompetitionstests durchgeführt. Das Ergebnis ist in Fig. 20 dargestellt. Die Kompetition durch nicht-biotinyliertes D-CGRP wurde durch Inkubation des biotinylierten D-CGRP (1 µM) und des freien CGRP (10 µM) bei 37°C mit radioaktiv markierter 2-F-RNA für 2 Stunden bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß die Klone C5, E1 und D7 durch freies CGRP kompetierbar sind, wohin gegen die Klone F1, B3 und F10 das nicht-biotinylierte CGRP nicht erkennen.

Bead-Assay zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten

Jeweils 50 µmol der markierten 2'-F-RNA der Klone E1, D7 und 732 (Referenz, Ursprung der 2'-F-RNA-Selektion mit Pool PB40) wurden gefaltet und für 3 Stunden mit unterschiedlichen bio-CGRP-Konzentrationen in Lösung bei 37°C im Thermoschüttler inkubiert. Anschließend wurde eine konstante Menge magnetischer Steptavidin-Beads (Roche) als Matrix zugegeben und der 2'-F-RNA/Peptid-Komplex für 10 Minuten bei 37°C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 800 UpM immobilisiert. Die magnetische Partikelmatrix wurde mittels eines Magnetseparators getrennt, der Überstand abgenommen und die Differenz der gebundenen/ungebundenen 2'-F-RNA ermittelt. Von den ermittelten Werten wurde die Kontrolle (0 µM bio-CGRP) als Background abgezogen. Die ermittelten Werte wurden in das Software-Programm GraphFit (Erithacus Software Ltd.) eingegeben und die Dissoziationskonstante bestimmt.
Die abgeschätzte Dissoziationskonstante ist danach 196 nM für E1 und 42 nM für D7. Der Referenzklon 732 (siehe Anwendungsbeispiel 1) aus der Selektion mit dem Startpool PB40 als interner Kontrolle für den hier verwendeten Bead-Assay ergab eine Dissoziationskonstante von 23 nM. Das Ergebnis ist in den Figs. 21 und 22 dargestellt. Weitere erhaltene Sequenzen sind in den Figs. 48 und 49 dargestellt.

Beispiel 4

Verwendung von Nukleinsäuren ohne Primer-Bindungsstellen für die Selektion von D-CGRP bindenden Nukleinsäuren

Für die hierin beschriebenen Untersuchungen wurden die folgenden Materialien verwendet, wobei die Angaben zu den Herstellern der folgend aufgeführten Substanzen, Lösungen und Enzyme bei den entsprechenden Textpassagen aufgeführt wurden. In allen Fällen wurde LiChromosolv Wasser von Merck verwendet.
Ratten α-D-CGRP wurde von Bachem, Heidelberg synthetisiert. Das zur Selektion verwendete Peptid trägt eine Biotingruppe am Carboxylterminus um die Trennung von ungebundenen Nukleinsäuren mittels der Biotin-Streptavidin oder Biotin-Neutravidin Anbindung zu ermöglichen. Hierfür wurde als Matrix Neutravidin-Agarose und Ultralink Plus Immobilized Streptavidin Gel (beides von Pierce) verwendet.
Die verwendeten Oligonukleotide, d. h. RNA- und DNA-Nukleotide, wie Primer, Startpool, Ligationskonstrukte und dergleichen wurden alle bei der NOXXON Pharma AG mit Standard-Phosphoramiditchemie synthetisiert. Die Sequenzen finden sich in der folgenden Übersicht.

Verwendete und getestete Oligonukleotide

STAR-1 Oligonukleotide

Für die hierin offenbarten Sequenzen gilt hinsichtlich der Schreibweise folgendes:
Angaben in kursiv Schrift bezeichnen Nukleotide der Ligationsmatrizen, die mit der Bibliothek hybridisieren.
Der unterstrichene Bereich einer Sequenz bedeutet, dass dieser Bereich dem T7 RNA- Polymerase-Promotor entspricht.
N_OH bezeichnet allgemein ein Ribo-Nukleotid.
C_Ome bezeichnet ein 2'-OMethyl-modifiziertes Cytosin.
P bezeichnet ein 5'-Phosphat Übersicht der verschiedenen Sequenzen

Bibliothek

Forward

Reverse
STAR-1 Reverse Matrix entspricht STAR-1 Reverse Primer Reverse Ligate

Herstellung des Startpools

Für eine Komplexität von 1 × 10¹⁵ Molekülen wurden 1,67 nmol Startpool in die Selektion eingebracht. Entsprechend wurde 33,4 Transkriptionen mit 50 µmol "STAR-1 initialer Pool, Reverse Strang" (5' C_OMeC_OMeT GTC-(dN)₄₀-GTC CTA TAG TGA GTC GTA TTA GTA GTG CGA AG) als Templat einer 100 µl Reaktion verwendet. Zur Bewerkstelligung eines DNA-Doppelstranges im Bereich des T7 Promotors wurde "STAR-1 Forward Primer" im 1,5fachen Überschuß zu "STAR-1 initialer Pool, Reverse Strang" dem Reaktionsansatz zugefügt. Die RNA wurde im Anschluß gelgereinigt und gefällt (Transkription und Gelreinigung siehe unten).

Selektionsschritte

Denaturierung und Faltung der RNA

Alle nicht-enzymatischen Schritte der Selektion - mit Ausnahme der Denaturierung - wurden in Selektionspuffer (10 mM Hepes-KOH pH 7,5 (Biochrom AG); 150 mM NaCl; 4 mM KCl; 1 mM MgCl₂; 1 mM CaCl₂ (alle Ambion) und 0,05% Tween-20 (Sigma)) durchgeführt. Die Denaturierung erfolgte für 5 Minuten bei 95°C in Selektionspuffer ohne Tween-20, MgCl₂und CaCl₂. Nach der Denaturierung wurde die RNA zunächst für 15 Minuten bei 37°C (oder Raumtemperatur) auf 37°C (oder Raumtemperatur) abgekühlt. Tween-20, MgCl₂ und CaCl₂ wurden zugesetzt und die Faltung nochmals bei 37°C (oder Raumtemperatur) für 15 Minuten fortgesetzt.

Anbindung

Im Anschluss an die Faltung wurde die RNA zunächst bei 37°C (oder Raumtemperatur) für 30 Minuten ohne Peptid entweder mit der Matrix Neutravidin-Agarose oder mit Ultralink Plus Immobilized Streptavidin Gel inkubiert. Diese sogenannte Vorselektion diente der Abtrennung von potentiellen Matrixbindern. Nach diesem Inkubationsschritt wurde die ungebundene RNA von der Matrix mittels Filtration durch MobiTec-Säulchen getrennt, mit verschiedenen Konzentrationen von biotinyliertem CGRP versetzt und für mindestens 2 Stunden - bei niedrigen Peptidkonzentrationen gegebenenfalls auch über Nacht - bei 37°C (oder Raumtemperatur) belassen. Daraufhin wurde dem Bindungsansatz die biotinbindende Matrix zugesetzt. Die Matrix mit der daran gebundenen RNA wurde nach 30 min von der Lösung durch Zentrifugation getrennt und mit Selektionspuffer gewaschen. Das hierbei verwendete Waschvolumen lag in den ersten Runden bei der 5-10fachen Menge der Matrix, in späteren Selektionsrunden bei 25fachem Waschvolumen.

Elution der bindenden RNA-Moleküle

Hierzu wurde die nach dem Waschen auf der Matrix verbliebene RNA zweimal mit jeweils 400 µl 8 M Harnstoff mit 10 mM EDTA (beide von Ambion) für 15 Minuten bei 65°C vom Matrixmaterial eluiert. Die eluierte RNA wurde mit 400 µl Phenol/(Chloroform/Isoamylalkohol)-Gemisch (1 : (1 : 1/24)) (Applichem) versetzt, 5 min bei 13000 rpm bei Raumtemperatur zentrifugiert, die wässrige Phase (Überstand) abgenommen, die phenolische Phase einmal mit 100 µl Wasser re-extrahiert, die wässrigen Phasen vereinigt und mit 500 µl Chloroform-Isoamylyalkohol-Gemisch (24 : 1) (Applichem) geschüttelt, 5 min bei 13000 rpm auf Raumtemperatur zentrifugiert und die obere wässrige Phase abgenommen.
Die wässrige Phase wurde daraufhin mit 2,5 fachen Volumen 100% Ethanol (Fluka), 0,3 M Natriumacetat (Ambion) und 1 µl Glycogen (Roche) für 30 min bei -80°C gefällt und für 30 min bei 14.000 rpm (4°C) zentrifugiert. Das Pellet wurde einmal mit eiskaltem 70%igem Ethanol (Fluka) gewaschen.

Ligation und Amplifikation

Vorbereitung für die Ligation

Entscheidend für eine erfolgreiche Ligation war die Ermittlung der zu ligierenden RNA- Menge. Die eluierte RNA-Menge wurde über die Radioaktivität und - wenn möglich - über die OD bestimmt. Die OD-Bestimmung hat den Nachteil, dass ein Minimalvolumen von 50 µl nötig ist. Für den Ligationsansatz durfte die RNA aber nicht in zu großem Volumen aufgenommen werden.
Deshalb wurde zu Beginn einer jeden Selektionsrunde die spezifische Aktivität [cpm/pmol] bestimmt. Damit ließ sich die Menge der eluierten RNA gut abschätzen.

Abschätzung der H₂O-Menge zur Lösung des Pellets

Da die Ligationsansätze für Templat-Mengen von bis 5 pmol Templat beziehungsweise ab 5 pmol Templat optimiert wurden, wurde für die folgende Berechnung der H₂O-Menge das entsprechendene Protokoll gewählt. Mit Hilfe des Ligationsprotokolls wurde die maximale Menge H₂O bestimmt und das Pellet entsprechend gelöst.

Ligation

Für die Ligation wurden in Vorversuchen 2 Ansätze mit unterschiedlichen (Templatmenge)/(Reaktionsvolumen + Enzymmenge)-Verhältnissen bestimmt. Die Ansätze variieren zudem, wenn statt der hier aufgeführten "Simultan-Ligation" die "Parallele-2- Schritt-Ligation" durchgeführt wurde (siehe unten). Ansätze bis 5 pmol: "Simultan Ligation" Volumen des Ansatzes: 14 µl pro 1 pmol RNA-Templat

"Parallele-2-Schritt-Ligation"

In diesem Fall wurde die gelöste RNA in zwei Ansätze geteilt. Der erste Ansatz wurde zunächst am 5'-Ende ligiert, während der zweite Ansatz zunächst am 3'-Ende ligiert wurde. Dementsprechend wurden zunächst jeweils nur die entsprechende Menge "ds F- oder R-Adapter" in den Ansatz gegeben. Nach dem ersten Ligationschritt wurden entsprechend dann die jeweils noch fehlenden "ds F- oder R- Adapter" zugesetzt, 5 min. auf 50°C erhitzt und danach erneut RNAse-out und Ligase dazugegeben. Ansätze ab 5 pmol: "Simultan Ligation" Volumen des Ansatzes: 14 µl pro 5 pmol RNA-Templat

"Parallele-2-Schritt-Ligation"

(wie oben beschrieben)

Ligation nach der ersten Runde

Im Gegensatz zu dem oben beschriebenen Protokoll, ist nach der 1. Runde die Zugabe von ds R-Adapter 2 (für n + 1 Transkripte) nicht notwendig, da die Transkription vor der 1. Runde durch Einsatz von zwei terminalen 2'-O-Methyl-Nukleotiden sauber terminiert wurde. Deshalb wurd im Anschluß an die erste Runde nur ds R-Adapter 1 (Rev Ligat/ Rev Primer) im 20 × Überschuß zur eluierten RNA eingesetzt.

Reverse Transkription

Die Reverse Transkription fand - direkt im Anschluss an die Ligation - mit bis zu 15 µmol ligierter RNA in einem Volumen von bis zu 100 µl statt. Bei größeren Stoffmengen müssen mehrere Parallelansätze gemacht werden. Die Größe des rT-Ansatzes ist durch die unterschiedlich konzentrierten Ligationsansätze bestimmt (Simultan-Ligation/Parallele-2- Schritt Ligation bis bzw. ab 5 µmol).
Eckpunkte für die RT waren:
Die Temperaturbedingungen waren: 20 min auf 51°C + 10 min auf 54°C; dann 4°C

PCR

PCR wurde mit maximal 1 µmol Template pro 100-µl-PCR durchgeführt. Wenn eine größere Stoffmenge RNA eluiert wurde, mussten mehrere PCRs parallel angesetzt werden. Wenn man bedenkt, dass vor Beginn eines Anstieges häufig nur 1 µmol eluiert werden und somit die Kompexität nicht größer als die Anzahl der Moleküle in einem pmol sein kann, kann man ohne Zweifel auch nur einen Teil (> 1 µmol) der cDNA PCR-amplifizieren (man muss nicht die gesamte cDNA in PCR einsetzen). Dies wurde ab Runde 5 so gehandhabt.
Grund für den Einsatz von maximal 1 µmol Ligationstemplat in die PCR ist die Ligationsmatrix für die n + 1-Transkripte (3'-Mikroheterogenitäten in der Transkription). Die genutzte Ligationsmatrix mit der "universal"-Base (2'-Desoxyinosin) wird in die PCR verschleppt und kann dort auch zwangsläufig als Reverse Primer primen. So entsteht ein nicht spaltbares PCR-Produkt. Je mehr Templat in die PCR gebracht wird, desto mehr Ligationsadapter werden verschleppt und desto mehr unspaltbares PCR-Produkt entsteht. Deshalb sollte nie mehr als 1 µmol Templat in die PCR eingesetzt werden.
Wird dagegen Inosin als "universal base" für die Ligationsmatrix verwendet, kann bis zu 5 pmol (oder mehr, nicht getestet) Templat in die PCR eingesetzt werden. In diesem Fall sind auch die durch die Ligationsmatrize geprimten PCR-Produkte alkalisch verdaubar (Wurde in dieser Selektion nicht verwendet). Wie bei der Ligation und reversen Transkription gab es zwei verschiedene PCR-Protokolle für Simultan-Ligation/Parallele-2-Schritt Ligation bis bzw. ab 5 pmol.
Eckpunkte für die PCR waren:
In der Regel wurden 13-15 PCR-Zyklen gefahren.

Alkalische Spaltung des Reverse-Strange und Testgel

Zunächst wurden 10 µl PCR-Produkt testweise alkalisch gespalten. Das Standardrezept für die analytische alkalische Spaltung des Reverse-Stranges sah wie folgt aus:
Im Anschluss wurde der pH-Wert mittels Indikatorpapier überprüft. Der pH-Wert sollte in etwa bei pH 5-6 liegen.
Das gespaltene PCR Produkt wurde mittels eines ssDNA-Standards (Länge 78 nt, zur Probe wurde 3,55 µmol NaCl (Ambion) zugegeben, um Salzeffekt auszugleichen) auf einem 10% denaturierenden PAGE quantifiziert, um zu bestimmen, welches Volumen alkalisch gespaltenes PCR-Produkt in die folgende in vitro-Transkription (Ziel-Menge: 50 µmol PCR- Produkt pro 100-µl-Ansatz) eingesetzt werden muss. In der Regel wurden 100 µmol PCR- Produkt alkalisch verdaut (für zwei 100 µl in vitro-Transkriptionen).

Ethanolfällung mit Natriumacetat

Die Ethanolfällung mit Natriumacetat (Ambion) diente an dieser Stelle hauptsächlich zum Entsalzen der Proben.
Es wurde 1/10 Volumen der PCR an 3 M NaOAc (pH 5,3), 2,5fache PCR-Volumen an 100% Ethanol und 1-2 µl Glycogen (20 µg/ml) hinzugefügt. Der Ansatz wurde 30 min bei -80°C gefällt, 30 min bei 13.000-14.000 rpm bei 4°C zentrifugiert, das Pellet einmal mit 500 µl 70%igem Ethanol gewaschen und 5 min bei 13.000-14.000 rpm abzentrifugiert. Das Pellet wurde in Wasser (1/10 des ursprünglichen PCR-Volumens) resuspendiert oder der T7- Transkriptionsansatz direkt auf das Pellet pipettiert (und dann resuspendiert).

T7-Transkription

Während der T7-Transkription wurde radioaktives alpha-³²P-GTP (Hartmann) eingebaut. In die in vitro Transkription wurden 50 µmol Templat (pro 100 µl Ansatz) eingebracht. Als Besonderheit gegenüber anderen Transkriptionen wurde ein 8-facher Überschuss an Guanosin-5'-Monohosphat (8 × GMP) über GTP zugegeben, so dass die meisten Transkripte ein 5'-Monophosphat getragen haben dürften.
Eckpunkte für die in vitro Transkription waren:
Der 10 × Txn-Puffer (SK) enthält 800 mM Hepes/KOH (Biochrom), 220 mM MgCl₂ (Ambion), 10 mM Spermidin (Fluka), pH 7,5.
Die in vitro-Transkription wurde für 8-16 Stunden bei 37°C durchgeführt. Im Anschluß wurde die verbliebene DNA mit ca. 10 units DNAse I (Sigma) verdaut (20 min bei 37°C). Der Verdau wurde durch Zugabe von EDTA (Ambion) gestoppt (Endkonzentration 25 mM).

Geireinigung der transkribierten RNA

Den 100-µl-Transkriptionsansätzen wurde je 50 µl konzentrierte Harnstoff-Lösung (Roth) mit Blaumarker (7,2 M urea, 10% Bromphemolblau (Merck)) zugesetzt, 5 min bei 95°C denaturiert und auf ein präparatives denaturierendes 10% PAA-Gel gegeben (Laufzeit etwa 1 Stunde bei 50 Watt). Als Größenstandards wurden zusätzlich ein RNA-(50mer) und DNA- (78mer)-Größenstandard (je 250 µmol) aufgetragen. Die Banden wurden mittels "UV- Shadowing" (bei 256 nm) sichtbar gemacht.
Die ausgeschnittene Gel-Bande wurde mittels "Crush & Soak" eluiert. Dazu wurden die Gelstücke in 360 µl H₂O und 140 µl 5 M Ammoniumacetat (Endkonzentration ca. 2 M) aufgenommen. Die Crush-and-soak-Elution lief 2 × 1,5 Stunden bei 68°C auf dem Thermoschüttler (1000 rpm). Die Überstände wurden durch Ultrafree MC-Säulchen (Millipore) in der Tischzentrifuge in 2 ml Eppis gefiltert. Dem Crush-and-Soak Filtrat (500 µl) wurden 1-2 µl Glycogen (20 µg/ml) und 1250 µl 100% Ethanol zugegben, die RNA 30 min bei Raumtemperatur gefällt, für 30 min bei 13.000-14.000 rpm abzentrifugiert, das Pellet einmal mit 400 µl eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen und letztendlich für 5 min bei 13.000-14.000 rpm abzentrifugiert. Das getrocknete Pellet wurde in 100 µl Wasser aufgenommen und die RNA-Konzentration bei 260 nm photometrisch bestimmt.

Ergebnisse

Simultane 5'- und 3'-Ligation: STAR-R02

Selektion STAR-R02 wurde in Runde 6 in zwei Stränge geteilt. Der erste Strang wurde mit einer Peptidkonzentration von 10 µM und einem 2-fachem Peptid-Überschuss ins Plateau geführt. Runde 10 wurde kloniert und sequenziert. Das Ergebnis ist graphisch in Fig. 28 und tabellarisch in Fig. 29 dargestellt.

Sequenzierung von Selektionsrunde STAR-R02-10

Es wurden von 82 auswertbaren Sequenzen 62 verschiedene Sequenzen erhalten. Davon tragen 19 das charakteristische Kern-Motiv 1 (CATACGGTGAAAGAAACGAT), jedoch mit mit leichten Abwandlungen als in späteren Selektionsrunden. Sieben Klone zeigen ein über den gesamten randomisierten Bereich gespanntes Motiv 1/1, das nur an drei aufeinanderfolgenden Positionen beliebige Variabilität zulässt. Es enthält im Zentrum das Motiv 1. (ggacGACATGTTC NNN GAACATACGGTGAAAGAAACGATTGTCGgacagg). Darüber hinaus tauchen zwei Klone in der Sequenzierung von STAR-R02-12MW wieder auf. Ein weiterer findet sich in STAR-R02-15d.

Selektion mit höherer Stringenz

Selektionsrunde 6 wurde wiederholt, wobei mehrere Parallelansätze selektiert wurden. Diese unterschieden sich lediglich in einer fallenden Peptidkonzentration. In den folgenden Runden wurde die Peptidkonzentration immer weiter verringert. Die Wahl der Peptidkonzentrationen geschah wie folgt: Die höchste Peptidkonzentration entsprach der Konzentration bei der in der vorangegangenen Runde noch erfolgreich hatte selektiert werden können (Signal > 1%, mindestens 3-fach über Leerselektion). Zusätzlich wurden um den Faktor 3,16 und den Faktor 10 verringerte Peptidkonzentrationen eingesetzt. Als Kontrolle diente eine Leerselektion ganz ohne Peptid. Die Runden 11-14 wurden mit einem verringerten RNA : Peptid-Verhältnis von 5 : 1 selektiert, Runde 15 als Doppelrunde (2x Selektion mit Verzicht auf Amplifikation) Das Ergebnis ist graphisch in Fig. 30 und tabellarisch in Fig. 31 dargestellt.

Sequenzierung von Selektionsrunde STAR-R02-15d

Es wurden von 41 auswertbaren Sequenzen 22 verschiedene Sequenzen erhalten, die alle das charakteristisches Motiv 1 (CATACGGTGAAAGAAACGAT) aufwiesen. 14 davon zeigten das erweiterte Motiv 1/1. 20 der 41 Klone treten auch in Selektion STAR-RNA-03-11 mit paralleler 2-Schritt-Ligation auf. 17 zum Teil überschneidende finden sich in STAR-R02- 12MW wieder, 3 in der 37°C-Selektion STAR-R02-15xx. Eine einzige Sequenz findet sich in Selektion STAR-R02-10.

Matrixwechsel

Ab Runde 8 wurde ausgehend von Runde 75 (1 µM) ein weiterer, paralleler Seletionsstrang eröffnet. Dieser zeichnet sich gegenüber den vorher genannten Seletionssträngen durch den wiederholten Wechsel der Selektionsmatrix (Festphase) aus. Es wurde zwischen Streptavidin ultra-link Plus (Pierce/Perbio) und Neutravidin-Agarose (Pierce/Perbio) gewechselt. Das Ergebnis ist graphisch in Fig. 32 und tabellarisch in Fig. 33 dargestellt.

Sequenzierung von Selektionsrunde STAR-R02-12MW

Es wurden von 35 auswertbaren Sequenzen 22 verschiedene Sequenzen erhalten (1 davon hat ein N). 20 der 22 (19 ohne N der 22) Sequenzen tragen das charakteristische Motiv 1, das auch schon in Selektion STAR-R02-15d beobachtet wurde (CATACGGTGAAAGAAACGAT). 11 Klone bestehen aus dem erweiterten Motiv 1/1. 2 der 35 Klone sind aus Selektion STAR-R02-10 bekannt, 21 aus STAR-R02-15d. 2 treten auch in STAR-R02-15xx und 15 Klone in STAR-R03-11 auf.

Selektion bei 37°C

Ab Runde 10 wurde aus der Matrixwechsel-Selektion (RNA 02MW) ein weiterer Strang abgezweigt und bei 37°C weiterselektiert. Runden 13xx, 14xx, 15xx wurden als Doppelrunden selektiert. Das Ergebnis ist graphisch in Fig. 34 und tabellarisch in Fig. 35 dargestellt.

Sequenzierung von Selektionsrunde STAR-R02-15xx

Klonierung und Sequenzierung lieferten 40 auswertbare Klone mit 17 verschiedenen Sequenzen (3 davon tragen ein N). 6 Sequenzen (5 ohne eine Seq. mit N) tragen das typische Motiv 1 (CATACGGTGAAAGAAACGAT). 4 (3 ohne N) Sequenzen tragen ein Teilmotiv von dem oben genannten: (GAAAG) und sind beinahe identisch. Ein Klon zeigt das charakteristische Motiv 1/1. 7 Klone (davon 6 identisch) tragen das Motiv 1/1 jedoch mit vier aufeinander folgenden variablen Positionen (ggacGACATGTTC NNNN GAACATACGGTGAAAGAAACGATTGTCGgacagg).
Aus diesem Selektionsstrang ging Klon R02-15xx-A11 hervor, der in den Beispielen 9 und 11 in der Zellkultur und in Beispiel 12 im Micro-Kalorimeter charakterisiert wurde.
6 (5 ohne eine mit N) Sequenzen tragen mit leichten Variationen ein neu identifiziertes Motiv 2 (GATGGCGCGGTCTNAAAAAACGCCGNNNGGGNGAGGG). Eine weitere ein sehr ähnliches mit einer Abwandlung (6 nt) im Zentrum des Motivs. Von den 40 Klonen waren bereits drei identische in Selektion STAR-R02-10 zu finden. Zwei traten in STAR- R02-15d auf. Einer davon auch in STAR-R02-12MW. 7 Klone waren in Selektion R03-11 zu finden.

Parallele 2-Schritt-Ligation: Selektion STAR-R03

Die Selektion, deren Eluate zunächst geteilt und dann erst 5' und dann 3' bzw. erst 3' und dann 5' ligiert wurden, wurde mit steigender Stringenz bis in Runde 11 geführt. Das Ergebnis ist graphisch in Fig. 36 und tabellarisch in Fig. 37 dargestellt.

Sequenzierung von Selektionsrunde STAR-R03-11

Die Klonierung und Sequenzierung lieferte von 47 Klonen 29 verschiedene Sequenzen. 26 davon enthielten das charakteristische Motiv (CATACGGTGAAAGAAACGAT). Einer Sequenz fehlt davon das 5°C (→ A). Eine Sequenz zeigt das verkürzte Motiv (GAAAG, siehe STAR-R02-15xx). 14 der 26 zeigten das erweiterte Motiv 1/1. Zwei weitere das Motiv 1/1 mit vier aufeinanderfolgenden variablen Nukleotiden, das auch in Selektion STAR-R02- 15xx auftrat. Eine Sequenz ist offensichtlich ein Orphan.
Es gibt keine Sequenzüberschneidungen mit STAR-R02-10. 20 Klone fanden sich auch in Selektion STAR-R02-15d, 19 Klone in Selektion STAR-R02-12MW und 7 Klone in STAR- R02-15xx.
Insgesamt ist also auf Sequenzebene aufgrund der großen Überschneidung kein Unterschied zwischen gleichzeitiger und paralleler 2-Schritt-Ligation festzustellen. Von zwei Klonen wurden bereits abgewandelte Moleküle synthetisiert (verkürzt und terminaler Stem stabilisiert). Dies sind: STAR-R03-11-F10-45-001 und STAR-R03-11-C12-48-001.
Aus dieser Selektion ging der Klon R03-11-F10 hervor, der in Beispiel 12 im Mikrokalorimeter näher charakterisiert wurde.
Die verschiedenen erhaltenen Sequenzen sind in Figs. 43-47 dargestellt.

Beispiel 5

Selektion eines an biotinyliertes CGRP bindenden Aptamers unter Anwendung nicht-modifizierter RNA

In diesem Beispiel wird die Selektion von Aptameren beschrieben, die gegen CGRP, genauer biotinyliertes CGRP von der Ratte binden. Das CGRP wurde erworben von Jerini AG und weist 37 Aminosäuren bei einem pI gemäß SWISS PROT-Datenbankeintrag von 7,8 auf. Als Matrix wurde Neutravidin-Agarose verwendet, nach Runde 9 wurde auf magnetische Streptavidin-Beads entsprechend den in Beispiel 3 verwendeten Materialien gewechselt. Die Immobilisierung für die Selektion mit prä-immobilisiertem CGRP erfolgte auf NeutrAvidin- Agarose unter Verwendung des folgenden Puffers, der auch als Selektionspuffer verwendet wurde: 10 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 4 mM KCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20.
Die Komplexbildung erfolgte auf der Matrix, nach Runde 9 in Lösung. Die Elution erfolgte durch Affinitätselution für das prä-immobilisierte Target, mit 8 M Harnstoff für die Streptavidin-Beads. Die Selektionstemperatur war 37°C und als Pool wurde der RNA-Pool verwendet, wie er im Zusammenhang mit Beispiel 1 verwendet wurde, mit der Ausnahme, daß hier keine 2'-Fluor-modifizierten Pyrimidinnukleotide verwendet wurden.

Charakteristika der Selektion

Die Selektionen wurden bei einer konstanten Konzentration des Zielmoleküls von 50 µM bis zur Runde 9 durchgeführt. Ab Runde 9 wurde diese Konzentration schrittweise auf 10 nM abgesenkt, um die Stringenz der Selektion langsam zu erhöhen. Im Verlauf der Selektion wurden ausgehend von einen 2,5-fachen Waschvolumen der Waschanteil auf ein 5-faches (Runden 3-6) bzw. 10-faches (ab Runde 7) Waschvolumen erhöht. Das Zielmolekül war in den Runden 1-8 prä-immobilisiert auf NeutrAvidin-Agarose. In den folgenden Runden (ab Runde 9) erfolgte die Komplexbildung in Lösung an magnetischen Streptavidin Beads. Als Elutionsmethode wurde jeweils 5 Minuten mit 7 M Harnstoff bei 65°C eluiert.

Verlauf der Selektion

Im Verlauf der Selektion konnte ein erster Anstieg in der Runde 4 beobachtet werden. Dieser Anstieg konnte sich jedoch erst in Runde 9 mit 17% Anbindung durchsetzten. Da in dieser Runde auch ein Anstieg auf der Vorsäule zu beobachten war, erfolgte in dieser Runde der oben erwähnte Umstieg auf die magnetischen Streptavidin Beads, wobei noch ca. 10% der RNA eine Anbindung zeigten. Durch die Steigerung der Stringenz der Selektion wurde versucht, die Qualität der bindenden Moleküle hinsichtlich einer höheren Bindungskonstante zu verbessern. In Runde 15 wurden bei einer Konzentration von 500 nM des Zielmoleküls eine Anbindungsrate von 16% erreicht und der Pool wurde kloniert und sequenziert. Die Sequenzierung ergab 4 Sequenzfamilien, die mit 14 bis 32 Klone stark vertreten waren, weitere 13 Sequenzen waren 2 bis 7 mal im Pool vorhanden. Weiterhin wurden 36 Einzelsequenzen gefunden. Die Bestimmung von Bindungskonstanten unter Verwendung der Biacore-Vorrichtung ergaben Affinitäten, die von der Zielaffinität von K_D < 30 nM noch zu weit entfernt waren. Die beste Bindungskonstante wurde für die Einzelsequenz G12 ermittelt. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde die Selektion bei weiterer Erhöhung der Stringenz bis in Runde 19 (Konzentration an Zielmolekül 10 nM) weitergeführt. In Runde 18 erfolgte als Kontrollexperiment eine Anbindung bei einer Konzentration des Zielmoleküls von 5 µM und einem Verhältnis RNA zu Zielmolekül von 1 : 1, dabei wurde eine 50%ige Anbindung erreicht. Nach Abschluß der Runde 19 bei 10 nM und einer Anbindungsrate von 8,5% wurde der erhaltene Pool sequenziert. Aus dem Ergebnis der Sequenzierung konnte eine Sequenzfamilie identifiziert werden, die über 60% des Pools ausmacht. Dieses Sequenzfamilie entsprach dem Klon G12, dem besten Binder aus der Sequenzierung nach Runde 15 (wobei G12 dort eine Einzelsequenz war). Für den Klon G12 wurde eine K_D von 100-200 nM bei 25°C bestimmt.
Die Ergebnisse der Biacore-Versuche legen ein bivalentes Bindeverhalten des Klons nahe. Dies konnte in Versuchen mit nicht-biotinyliertem CGRP gezeigt werden. Auch zeigt die Wiederholung der Runde 19 mit Affinitätselution, bei der die Elution der an biotinyliertem CGRP gebundenen RNA mit freiem, nicht-biotinyliertem CGRP erfolgt, nur einen geringen Anteil an eluierbarer RNA. Diese Runde 19 mit Affinitätselution wurde nicht sequenziert. Weiterhin wurde in der Sequenzierung der Runde 19 mit denaturierender Elution neben dem dominanten G12 Klon eine weitere Motivfamilie mit 14 Vertretern, sowie 30 neue Einzelsequenzen gefunden. Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten unter Verwendung der Biacore-Vorrichtung ergab, daß alle diese neuen Sequenzen eine geringere Affinität und damit eine schlechtere Dissoziationskonstante als der Klon G12 aufwiesen.
Der Verlauf der Selektion ist in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben.
Die bevorzugten Einzelsequenzen können wie folgt dargestellt werden.

G12 - Gruppe 12

+ Mutationen

wobei die K_D-Werte nur in einem sehr schmalem Band variierten. H08 - Gruppe 6
Die bindenden Nukleinsäuren dieser Gruppe zeigen K_D-Werte schlechter als die Nukleinsäure gemäß Klon G 12. H03 - Gruppe 6
Die bindende Nukleinsäuren dieser Gruppe zeigt einen K_D-Wert schlechter als die Nukleinsäure gemäß Klon G12.

Beispiel 6

Synthese von L-2'-Fluoro-phosphoramiditen

Die Synthese von 5'-DMT-2'-fluoro-L-uridin und 5'-DMT-2'-Fluoro-N(Ac)-L-cytidin phosphoramidites (3 and 5) ist in Figs. 15 bis 17 veranschaulicht:
2'-Fluoro-L-uridine 2 wurde gemäß Codington, J. F., Doerr, I. L., & Fox, J. J. (1964) J. Org. Chem. 29, 558, aus L-Arabinose 1 synthetisiert. Anschließend wurde sie zu 5'-DMT-2'- fluoro-L-uridine konvertiert und phosphityliert (Fig. 15), um das Phosphoramidit zu erhalten (Fig. 17).
Die Bezüge gemäß Fig. 15 bedeuten dabei:
a) Cyanamid, MeOH, NH₄OH; b) Methylpropiolat, EtOHaq; c) HF, Dioxan, Autoklav 120°C; d) DMTCl, DMAP, Pyr; e) Cl-P(OCH₂CH₂CN)N(iPr)₂, DIPEA, DMAP, THF.
Für die Konversion von D-Uridin-Derivaten in D-Cytidin-Derivate sind in der Literatur (Sung W. L. (1982) J. Org. Chem. 47, 3623; Reese C. B., Ubasawa A. (1980) Tetrahedron Lett., 2265; Sung W. L. (1981) J. Chem. Soc. B, 1089; Krug A., Schmidt S., Lekschas J., Lemke K., Cech D. (1989) Journal f. prakt. Chemie, 331(5), 835) viele Synthesewege beschrieben. Diese Synthesen nutzen als Ausgangsgruppe 1,2,4-Triazol (Sung W. L. (1982) J. Org. Chem. 47, 3623) oder 1-Tetrazol (Reese C. B., Ubasawa A. (1980) Tetrahedron Lett., 2265; Sung W. L. (1981) J. Chem,. Soc. B, 1089; Krug A., Schmidt S., Lekschas J., Lemke K., Cech D. (1989) Journal f. prakt. Chemie, 331(5), 835). Die Synthese von 2'-Fluoro-L-cytidin 4 wurde mit der 1,2,4-Triazol-Chemie (Krug A., Schmidt S., Lekschas J., Lemke K., Cech D. (1989) Journal f. prakt. Chemie, 331(5), 835) durchgeführt. Das hierdurch gewonnene 2'-Fluoro-L-cytidin 4 wurde anschließend aminoacetyliert, trityliert und phosphoryliert (Fig. 16) um 5 zu erzielen.
Die Bezüge gemäß Fig. 16 bedeuten dabei:
a) BzCl, Pyr; b) 1,2,4-Triazol, 4-Chlorophenylphosphordichloridate, Pyr; c) NH₃ (28% in Wasser)/Dioxan; d) Ac₂O, DMF; e) DMTCI, DMAP, Pyr; f) Cl-P(OCH₂CH₂CN)N(iPr)₂, DIPEA, DMAP, THF.
Die Details der Konversion von 2'-Fluoro-L-uridin 2 in 2'-Fluoro-L-Cytidin 4 werden in der folgenden Abbildung beschrieben (Fig. 17):
Die Bezüge gemäß Fig. 17 bedeuten dabei:
a) BzCl, Pyr; 1b) 1,2,4-Triazol, 4-Chlorophenylphosphordichloridat, Pyr; c) NH₃ (28% in Wasser)/Dioxan; oder NH₃ (28% in Wasser)/Dioxan und MeO/NH₃ sat.
2'-Fluoro-L-uridin 2 wurde zuerst benzoyliert um 6 zu erzielen. Die Substanz 6 wurde ohne Aufreinigung direkt weiter mit 1,2,4-Triazol und 4-Chlorophenylphosphordichloridat umgesetzt um 7 zu ergeben. Nach der Behandlung mit Ammoniak/Dioxan kann 2'-Fluoro-L- cytidin direkt aus der ungereinigten Substanz als beige-braunes Kristallisationsprodukt erhalten werden.
Von besonderem Interesse bei dieser Syntheseart ist, daß keine Aufreinigung der Zwischensubstanzen notwendig ist. Die Endsubstanz kann von der Rohsubstanz mit hoher Ausbeute von etwa 70% erhalten werden.

Versuchsaufbau

2'-Fluoro-L-uridine 2 (22,35 g, 57% Reinheit, 90 mmol) wurde dreimal mit trockenem Pyridin (3 × 40 ml) coevaporiert. Die Rohsubstanz wurde in trockenes Pyridin eingebracht (150 ml, mit Molekularsieb) und auf 0°C gekühlt. Benzoylchlorid wurde tropfenweise hinzugegeben, und die Reaktion wurde 1 h bei 0°C umgerührt und über Nacht bei Zimmertemperatur gelagert (TLC (Hex/EE 1/2): Rf: 0,5). Die Reaktion wurde mit Methanol gestoppt (5 ml) und bis zur Trockene eingeengt. Die Restsubstanz wurde in DCM (250 ml) aufgelöst und mit NaHCO₃ (50%, 150 ml, dreimal) verdünnt. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet und eingeengt.
Die Rohsubstanz wurde in trockenem Pyridin (300 ml) aufgelöst. Die Mischung wurde mit Molekularsieb bei 0°C unter N₂ 30 Minuten lang umgerührt. 1,2,4-Triazol (4,0 eq, 360 mmol, 29,9 g) wurde dann hinzugefügt. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang umgerührt. Danach wurde langsam 4-Chlorophenyl-phosphodichloridat (2,0 eq, 180 mmol, 29,3 ml) der Mischung zugeführt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion exotherm.
Die Mischung wurde 2 h bei 0°C umgerührt und über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt. Das ungereinigte Produkt lief in auf der Dünnschichtplatte in einem Fleck (TLC, Hexan/Essigsäureethylester 1/2): Rf: 0,34). Die Restsubstanz wurde in DCM (250 ml) aufgelöst und die organische Phase mit verdünntem NaHCO₃ (50%, 300 ml) (exotherm) gewaschen. Die organischen Phasen wurden über Na₂SO₄ getrocknet und evaporiert.
Die Rohsubstanz wurde in Dioxan (600 ml) und NH₃ (600 ml, 28% in Wasser) aufgelöst, dann 72 h bei Raumtemperatur umgerührt. Nach der TLC Kontrolle (DCM/MeOH 9/1, Rf: 0,34) wurde die Mischung bis zur Trockene eingeengt (bräunliches Öl) und mit Methanol (zweimal 50 ml) coevaporiert. Die bräunliche Restsubstanz wurde in einer Mischung aus Wasser (200 ml) und DCM (200 ml) aufgelöst. Die wäßrige Phase wurde anschließend dreimal mit DCM (150 ml) gewaschen und soweit konzentriert, bis ein minimales Volumen (50 ml) erreicht wurde. Nach einer Nacht im Kühlschrank wurde die Substanz filtriert, mit DCM (zweimal 25 ml) sowie Et₂O (2 × 25 ml) (beige-braune Kristalle, 6,1 g (50% Ausbeute) gewaschen. Ein zweiter Ertrag (3,0 g, 23% Ausbeute) wurde nach einer kurzen Chromatographie von der Originalsubstanz (Lagerung auf Silica Gel, Verlauf von MeOH in DCM (5-30%)) und einer zweiten Kristallisierung aus Wasser (Totalausbeute 73%) erzielt.
Eine alternative Methode könnte sich aus der Suspension der Rohsubstanz in Dioxan (300 ml) und NH₃ (300 ml, 28% in Wasser) ergeben. Die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur umgerührt. Nach der TLC Kontrolle (DCM/MeOH 9/1) wurde die Mischung zur Trockne (bräunliches Öl) evaporiert und mit Methanol (zweimal 50 ml) coevaporiert. Die Rohsubstanz wurde in Methanol (ca. 5 ml) aufgelöst, und gesättigter methanolischer Ammoniak (200 ml) wurde zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht umgerührt.

Beispiel 7

Bestimmung der Zytotoxizität von an CGRP bindenden selektierten L- Nukleinsäuren

Auf der Grundlage der in Beispiel 2 selektierten L-Nukleinsäuren wurde eine der Verbindungen, nämlich 732_096, verwendet, um die Toxizität der L-Nukleinsäure zu bestimmen. Als zelluläres Testsystem wurde dabei die Neuroblastom-Zellinie SK-N-MC mit der Accession Nummer ACC 203 (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) verwendet

AlamarBlue Test

Der AlamarBlue Test ist ein Assay zu Erfassung von Zellwachstum und Zytotoxizität. AlamarBlue ist ein Indikatorfarbstoff zur quantitativen Messung der Proliferation von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen. AlamarBlue ist ein ungiftiger, wasserlöslicher Oxidations-Reduktions-Indikator, der bei erfolgter chemischer Reduktion sowohl seine Fluoreszenz- als auch seine colorimetrischen Eigenschaften ändert. Chemische Reduktion des Indikators findet in lebenden Zellen proportional zum zellulären Metabolismus und zur intrazellulären Enzymaktivität statt und ist daher ein Maß für die Zytotoxizität getesteter Substanzen (Ahmend et al., 1994, J. Immunol. Methods 170, 211-224, Page et al., 1993, Int. J. Oncology 3, 473-476,. Die Absorption kann mit einem Mikrotiterplattenphotometer bei 570 nm (Excitation) (600 nm Emission; Referenz) gemessen werden.
Zur Durchführung wird AlamarBlue in Kulturmedium zu 5% verdünnt, mit 100 µl/Napf eine Mikrotiterplatte (96-er Format) auf die vorher mit den Testsubstanzen (Spiegelmere) 30 Minuten inkubierten Zellen gegeben und für eine bestimmte Zeit im Brutschrank inkubiert.
Die Inkubationszeit richtet sich nach Zellart und Zellzahl. Als Richtwert gelten für die verwendeten SK-N-MC-Zellen (Neuroblastom Zellinie) 2 h. Nach Ende der Inkubationszeit erfolgt die photometrische Messung.
Als Maß für die Zytotoxizität wird die prozentuale Veränderung der behandelten Näpfe gegen die jeweiligen Kontrollen ermittelt. Hemmungen größer 20% werden als cytotoxische Effekte betrachtet.
Das Ergebnis ist tabellarisch in der nachfolgenden Tabelle angegeben.

Beispiel 8

Hemmung der cAMP-Produktion durch humanes CGRP bindende Spiegelmere

Die Analyse der biologischen Wirksamkeit von CGRP-bindenden L-Nukleinsäuren, d. h. von Spiegelmeren wurde wie folgt vorgenommen.
Zellen der humanen Neuroblastoma-Linie SK-N-MC mit der Accession Nummer ACC 203 (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) werden in einer Zahl von 4 × 10⁴ pro Napf einer 96 Napf-Mikrotiterplatte ausgesät und bei 37°C und 5% CO₂ in DMEM (1,000 mg/L Glucose), das zusätzlich 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS), 4 mM L-Alanyl-L-Glutamin (GLUTAMAX), 50 units/ml Penicillin, 50 µg/ml Streptomycin enthält, kultiviert. 48 h nach Aussaat sind die Zellen zu 80- 90% konfluent und werden für die Versuche eingesetzt.
Die Spiegelmere werden zusammen mit 1 nM humanem oder Ratten-CGRP (Bachem) in Hank's balanced salt solution (HBSS) + 1 mg/ml BSA für 15-60 min bei RT oder 37°C in einer 0,2 ml "low profile 96-tube"-Platte inkubiert. Kurz vor Zugabe zu den Zellen werden 2 µl einer 50 mM IBMX-Lösung zugegeben. Die Zellen werden 20 min vor Zugabe der CGRP/Spiegelmer-Ansätze mit 1 mM IBMX vorbehandelt.
Zur Stimulation wird das Medium von den Zellen abgesaugt, und die vorinkubierten Ansätze werden zugegeben. Nach Inkubation für 30 min bei 37°C werden die Zellüberstände abgesaugt und die Zellen mit 50 µl/Napf Lysis-Puffer für 30 min bei 37°C lysiert. Der Lysis- Puffer ist Bestandteil des "cAMP-Screen™ System"-kits (Applied Biosystems), mit dem der cAMP-Gehalt der Extrakte bestimmt wird. Jeweils 10 µl der Extrakte werden in den Test eingesetzt. Die Durchführung des Tests erfolgt wie vom Hersteller beschrieben:
In einer Assay-Platte (beschichtet mit Ziegen anti-Kaninchen-IgG) werden zu 50 µl des Lysis- Puffers 10 µl/Napf des Lysats gegeben und mit 30 µl/Napf des nach Herstellerangaben verdünnten cAMP-Alkalische Phosphatase-Konjugats vermischt. Danach werden 60 µl/Napf des im Kit mitgelieferten cAMP-Antikörpers hinzugefügt. Es folgt eine Inkubationszeit von 1 h unter Schütteln bei Raumtemperatur. Danach werden die Lösungen aus den Näpfen entfernt und diese sechsmal mit dem mitgelieferten Waschpuffer gewaschen. Zur Detektion werden 100 µl/Napf CSPD/Sapphire-II RTU Substrat zugegeben, 30 min bei RT inkubiert und die Lumineszenz in einem POLARstar Galaxy Multidetektions-Plattenlesegerät (BMG) gemessen.
In diesem Testsystem wurde zwei im Rahmen von Beispiel 2 hierin beschriebenen L- Nukleinsäuren getestet. Dabei handelt es sich um die Sequenzen 732_096 und 732_045 entsprechend den SEQ. ID. No 14 und 13.
Die Spiegelmere 732_045 und 732_096 wurden vor Zugabe zu den Zellen zusammen mit 1 nM humanem CGRP in Medium (M199) ohne Serum für 15 min vorinkubiert. Nach 30 min bei 37°C erfolgte die Lyse der Zellen. Die Extrakte aus jeweils zwei gleich behandelten "Näpfen" wurden vereinigt und die Mengen an cAMP wie beschrieben bestimmt.
Das Ergebnis ist in Fig. 23 dargestellt. Aufgetragen wurden die gebildeten Mengen an cAMP als Prozentsatz der Kontrolle. Die graphische Auswertung ergibt als Konzentration an Spiegelmer, bei der nur noch 50% der in der Kontrolle vorhandenen cAMP-Menge gebildet wird (IC50), einen Wert von ca. 60 nM für 732_096 (59mer) und von ca. 22 nM für 732_045 (55mer). Diese sehr guten IC50 Werte, die auch mit den Dissoziationskonstanten korrelieren, zeigen deutlich, daß die identifizierten Fluoro-Spiegelmere extrem potent sind, potenter als die mit gleichen Methoden bisher selektierten unmodifizierten RNA-Moleküle.

Beispiel 9

Hemmung der cAMP-Produktion durch Ratten-CGRP bindende Spiegelmere

Der Versuch wurde wie im Zusammenhang mit Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Das Spiegelmer L 501L, das im Rahmen von Beispiel 4 selektiert worden war, wurde vor Zugabe zu den Zellen zusammen mit 1 nM Ratten-CGRP in Hank's balanced salt solution (HBSS) + 1 mg/ml BSA für 60 min bei 37°C vorinkubiert. Nach 30 min Stimulationsdauer erfolgte die Lyse der Zellen und die Bestimmung der cAMP-Mengen in den Lysaten wie beschrieben. Es wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt und die gebildeten Mengen an cAMP als Prozentsatz der Kontrolle (kein Spiegelmer im Vorinkubationsansatz) ± Standardabweichung aufgetragen in Fig. 24. Die graphische Auswertung ergibt als Konzentration an Spiegelmer, bei der nur noch 50% der in der Kontrolle vorhandenen cAMP-Menge gebildet wird, einen Wert von ca. 60 nM.
Mit einer halbmaximalen stimulierenden Konzentration durch CGRP von ca. 1 nM, wie in Beispiel 11 bestimmt, ergibt sich daraus ein K_i-Wert von ca. 30 nM.

Beispiel 10

Bindungsstudien an zellulärem CGRP-Rezeptor

Membranen von CHO-K1 Zellen, die mit humanem calcitonin-receptor related receptor (CRLR, Genbank: U17473) und humanem receptor-associated modifying protein type 1 (RAMP1, Genbank: AJ001014) transfiziert sind (Fa. Euroscreen, Brussels, Belgium), werden zügig aufgetaut, in 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA pH 7.4 verdünnt und durch Homogenisieren resuspendiert. Für jeden Testansatz werden 2 µg Membranprotein in 20 mM HEPES pH 7.4, 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 µM GDP und den Spiegelmeren in einem Volumen von 150 µl inkubiert. Nach 30- minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden 50 µl 2 nM [³⁵S]GTPγS (Fa. Amersham) hinzugefügt und für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden 25 µg WGA-PVT-Kügelchen (Weizenkeimagglutinin-beladene Polyethyleneimine-behandelt) (Amersham) in 50 µl hinzupipettiert, für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Assay-Platte für 10 min bei 3200 rpm zentrifugiert. Die gebundene Aktivität wurde mit einem Wallac1450 MicroBeta™ scintillation counter (Wallac) bestimmt.
Auswertung. Die Daten werden durch nicht-lineare Regression analysiert (GraphPad Prism, Vers. 3.02, Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA).
Die Bindungsstudien wurden mit den beiden Spiegelmeren 732_045 und 732_096 durchgeführt, die im Rahmen von Beispiels 2 selektiert wurden. Das Ergebnis ist in Fig. 25 dargestellt.
Beide Spiegelmere hemmen effizient die Bindung des Liganden an den Rezeptor. Das bedeutet, daß das Spiegelmer spezifisch das CGRP erkennt, wegfängt und deshalb keine Rezeptorbindung und Rezeptoraktivierung erfolgt. Folglich kann auch kein [³⁵S]GTPγS eingebaut werden.
732_045 und 732_096 wurden jeweils mittels HPLC oder Gel gereinigt. Fig. 25 zeigt, daß die Reinigungsmethode im Rahmen des Fehlers nur einen unwesentlichen Einfluß auf die biologische Aktivität der Fluoro-modifzierten RNA-Spiegelmere hat.

Beispiel 11

Zellkulturexperimente - Dosis-Wirkungskurve für CGRP

SK-N-MC-Zellen wurden wie in Beispiel 8 beschrieben in 96-well-Platten kultiviert. 20 min vor Stimulation mit Ratten α-CGRP wurde das Medium durch jeweils 100 µl Hank's balanced salt solution (HBSS) + 1 mg/ml BSA ersetzt und mit 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) versetzt. Die Stimulation mit CGRP erfolgte durch Zugabe aus 100- bzw 30 fach konzentrierten Stammlösungen von in PBS gelöstem Ratten-α-L-CGRP (Bachem). Nach 30 min bei 37°C wurde der Überstand abgesaugt und die Zellen mit 50 µl Lysis-Puffer lysiert. Der cAMP-Gehalt der Extrakte wurde bestimmt wie in Beispiel 8 beschrieben. Die Auftragung der gebildeten cAMP-Mengen gegen die zur Stimulation verwendete CGRP- Konzentration, wie dargestellt in Fig. 38 ergab eine halbmaximale Aktivierung von ca. 1 nM.

Beispiel 12

Kalorimetrische Bestimmung der Bindungskonstanten und der Aktivität

Durchführung

Die Bindung von Spiegelmeren an Ratten alpha-CGRP wurde auch über das Verfahren der Isothermen Titrations-Kalorimetrie (ITC) mit dem VP ITC (Microcal) bestimmt.
Dazu wurden 1,465 ml einer 10 µM Lösung der Spiegelmere in die adiabate Messzelle des Gerätes vorgelegt. Die bei Zugabe von 7,5 µl einer 70 µM Ratten α-L-CGRP-Lösung frei werdende Bindungsenthalpie wird von dem Gerät registriert. Durch wiederholte Zugabe des Peptides und Messung der jeweils frei werdenden Bindungsenthalpien können Bindungskonstanten und Aktivitäten der Moleküle bestimmt werden.
Das Spiegelmer STAR-R02-15xx-A11 wurde bei 37°C vermessen. Das Ergebnis ist in den Figs. 39 und 40 dargestellt.
Das Spiegelmer STAR-R03-F10 wurde bei 25°C gemessen. Das Ergebnis ist in den Figs. 41 und 42 dargestellt.

Ergebnisse der ITC-Messung

Die Bindungskonstante oder Dissoziationskonstante K_D ist der Kehrwert der Assoziationskonstante K_A (K im Enthalpiediagramm) und ergab sich für das Spiegelmer STAR-R02-15xx- A11 zu 65 nM. Die Aktivität war 42%. Dies ist etwas schlechter als die Daten der Zellkultur, aber in der gleichen Größenordnung.
Spiegelmer STAR-R03-11-F10 zeigte bei 25°C eine Bindungskonstante von 28 nM und eine Aktivität von 83%.
Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Ein Antagonist von CGRP, wobei der Antagonist eine Nukleinsäure ist und bevorzugterweise die Nukleinsäure an CGRP bindet.

2. Der Antagonist von CGRP nach Anspruch 1, wobei das CGRP α-CGRP ist.

3. Der Antagonist nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das CGRP β-CGRP ist.

4. Ein Antagonist des CGRP1-Rezeptors, wobei der Antagonist eine Nukleinsäure ist und
wobei bevorzugterweise die Nukleinsäure an einen Liganden des Rezeptors bindet und
wobei bevorzugtererweise der Ligand CGRP ist.

5. Der Antagonist nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand α-CGRP ist.

6. Der Antagonist nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand β-CGRP ist.

7. Der Antagonist nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure wenigstens ein L-Nukleotid umfasst.

8. Der Antagonist nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Antagonist eine L- Nukleinsäure ist.

9. Eine Nukleinsäure, die an CGRP bindet.

10. Die Nukleinsäure nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das CGRP α-CGRP ist.

11. Die Nukleinsäure nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das CGRP β-CGRP ist.

12. Eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 bis SEQ ID. No. 244.

13. Die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure wenigstens ein L-Nukleotid umfasst.

14. Die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine L-Nukleinsäure ist.

15. Die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend DNA, RNA und Kombinationen davon.

16. Die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinität der Nukleinsäure weniger als 0,5 µM, bevorzugterweise weniger als 0,1 µM, bevorzugtererweise weniger als 0,05 µM und am bevorzugtesten weniger als 0,01 µM ist.

17. Die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinität der Nukleinsäure mehr als 250 nM, bevorzugterweise mehr als 100 nM, bevorzugtererweise mehr als 50 nM und am bevorzugtesten mehr als 10 nM ist.

18. Die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein minimales Bindungsmotiv umfasst.

19. Die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Länge aufweist, wobei die Länge ausgewählt ist aus der Gruppe, die Längen von 15 bis 150 Nukleotiden, 20 bis 120 Nukleotiden, 30 bis 120 Nukleotiden, 40 bis 100 Nukleotiden, 40 bis 70 Nukleotiden und 50 bis 70 Nukleotiden, 30 bis 50 und am meisten bevorzugt 25 bis 45 Nukleotiden umfaßt.

20. Die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine zwei-, drei- oder mehrteilige Struktur aufweist.

21. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 20 als ein Antagonist von CGRP und/oder des CGRP1-Rezeptorsystems.

22. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 20 für die Herstellung eines Medikaments.

23. Verwendung eines Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Herstellung eines Medikaments.

24. Verwendung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament für die Behandlung einer Erkrankung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Migräne, Cluster-Kopfschmerzen, Appetitlosigkeit, Übelkeit, Erbrechen, neurogene Entzündung, insbesondere neurogene Entzündung, die mit anderen Neuropeptiden vermittelt wird, Vasodilatation, erhöhter Blutdruck, Hypotonie, Tachikadie, Erkrankungen, die auf eine Aktivierung trigeminaler afferenter sensorischer Neurone und zentraler "nociceptiver" Neuronen, insbesondere höheren Schmerzzentren, zurückgehen, und chronisch entzündliche Schmerzen, umfasst und/oder zur Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronische Schmerzen, akute Schmerzen, entzündliche Schmerzen, visceraler Schmerzen und neuropathischer Schmerzen.

25. Zusammensetzung umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 20 und bevorzugterweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

26. Zusammensetzung umfassend einen Antagonisten nach einem der vorangehenden Ansprüche und bevorzugterweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

27. Komplex umfassend CGRP und eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 20.

28. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 20 zum Nachweis von CGRP, bevorzugterweise α-CGRP oder β-CGRP und am bevorzugtesten menschliches α-CGRP oder β-CGRP.

29. Verfahren zum Screenen von CGRP-Antagonisten umfassend die folgenden Schritte:

- Bereitstellen eines Kandidaten-CGRP-Antagonisten,

- Bereitstellen einer Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 9 bis 20,

- Vorsehen eines Testsystems, welches ein Signal in Gegenwart eines CGRP- Antagonisten ergibt, und

- Bestimmen, ob der Kandidaten-CGRP-Antagonist ein CGRP-Antagonist ist.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das CGRP α-CGRP und/oder β-CGRP ist, bevorzugtererweise menschliches α-CGRP und/oder β-CGRP.

31. Verfahren zum Screenen von CGRP-Agonisten umfassend die folgenden Schritte:

- Bereitstellen von CGRP,

- Bereitstellen einer Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 9 bis 20, bevorzugterweise einer markierten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 20,

- Zugabe eines Kandidaten-CGRP-Agonsiten, und

- Bestimmen, ob der Kandidaten-CGRP-Agonist ein CGRP-Agonist ist.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen dadurch erfolgt, dass festgestellt wird, ob die Nukleinsäure durch den Kandidaten-CGRP-Agonisten verdrängt wird.

33. Kit für den Nachweis von CGRP, bevorzugterweise α-CGRP oder β-CGRP, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 20.