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DE10154291A1 - Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes - Google Patents

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes

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DE10154291A1
DE10154291A1 DE10154291A DE10154291A DE10154291A1 DE 10154291 A1 DE10154291 A1 DE 10154291A1 DE 10154291 A DE10154291 A DE 10154291A DE 10154291 A DE10154291 A DE 10154291A DE 10154291 A1 DE10154291 A1 DE 10154291A1
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nucleic acid
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zone
specific nucleic
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Michael Weizenegger
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Hain Lifescience GmbH
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Nukleinsäuren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein hoch sensitives Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes; der Trockenschnelltest, enthaltend ein chromatographisches Material, umfassend DOLLAR A - eine Probenaufnahmezone, DOLLAR A - eine Trennzone mit Bindungsbereich, in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind und DOLLAR A - eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß DOLLAR A die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt: DOLLAR A i) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert, DOLLAR A ii) die nachzuweisende Nukleinsäure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen, DOLLAR A iii) die nachzuweisende Nukleinsäure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone, DOLLAR A iv) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der sequenzspezifischen Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde DOLLAR A v) die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der ...

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Nukleinsäuren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein hoch sensitives Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes; der Trockenschnelltest enthaltend ein chromatographisches Material umfassend
    • - eine Probenaufnahmezone,
    • - eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind und
    • - eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone,
    dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
    • a) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert,
    • b) die nachzuweisende Nukleinsäure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen,
    • c) die nachzuweisende Nukleinsäure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone,
    • d) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der sequenzspezifischen Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde
    • e) die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsäure angebracht ist oder über eine Markierung des Nukleinsäuredoppelstranges. Als Markierung gilt somit beispielsweise auch die Detektion mit einem Antikörperkonjugat gegen einen DNS-Doppelstrang oder einen DNS/RNS- Doppelstrang (letzteres z. B. im Falle, daß die Sonde oder die Zielsequenz RNS ist.)
  • Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Der Nachweis von Nukleinsäuren mit Sonden ist im Stand der Technik beschrieben.
  • Methoden für einen schnellen und einfachen Nachweis von Nukleinsäuren gewinnen in den Bereichen Medizin, Umwelt, Lebensmittel und der Forensik zunehmend an Bedeutung. Aufgrund der hohen Spezifität und Sensitivität nukleinsäurebasierender Verfahren kommt diesen Testen für die Identifizierung und Differenzierung von Krankheitserregern, kontaminierenden Organismen oder auch für die Subtypisierung von Bakterien oder Viren und der Untersuchung genetischer Polymorphismen ein hoher Stellenwert zu.
  • Liegt die nachzuweisende Nukleinsäure nur in geringen Mengen in der Probe vor, wird die nachzuweisende Nukleinsäure amplifiziert. Als Nukleinsäureamplifikationsreaktion können verschiedene Reaktionen eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Die verschiedenen Ausgestaltungen der PCR-Technik sind dem Fachmann bekannt, siehe z. B. Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48(8), 579-582. Weitere Amplifikationstechniken, die zur Anwendung kommen können, sind die Nukleinsäurestrang basierende Amplifikation (NASBA), die Transkriptase vermittelte Amplifikation (TMA),), Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), Q-beta Replicase Amplifikation (β-Q-Replicase) und die Einzelstrangverdrängungs Amplifikation (SDA). NASBA und andere Transkriptions-basierte Amplifikationsmethoden werden in Chan und Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185-196 erläutert.
  • In der einfachsten Form der Detektion der nachzuweisenden Nukleinsäure wird das Amplifikat z. B. durch Verdau mit einem Restriktionsenzym spezifisch geschnitten und die entstandenen ethidiumbromidgefärbten Fragmente auf einem Agarosegel analysiert. Weit verbreitet sind auch Hybridisierungsysteme. Die Hybridisierung findet üblicherweise so statt, daß entweder die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, oder die Sonde auf einer festen Phase immobilisiert wird und mit dem jeweils anderen Hybridisierungspartner in Kontakt gebracht wird. Als feste Phasen sind verschiedenste Materialien vorstellbar, beispielsweise Nylon, Nitrozellulose, Polystyrol, silikatische Materialien usw. Es ist auch denkbar, daß als feste Phase eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird. Die Zielsequenz kann dabei auch in Lösung zuvor mit einer Fangsonde hybridisieren und danach wird die Fangsonde an eine feste Phase gebunden.
  • In der Regel ist wenigstens eine Sonde oder wenigstens ein Primer bei der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z. B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin. Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC (Fluorisothiocyanat), Cyaninfarbstoffe usw. Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen nachgewiesen werden. Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt.
  • Alle diese Verfahren sind arbeitsaufwendig und benötigen in der Regel mehrere Stunden. Eine Automatisierung dieser Verfahren kann den manuellen Aufwand und die Analysezeit drastisch verkürzen, benötigt aber Geräte mit einem hohen Preis für Anschaffung und Unterhalt, die nur bei hohen Probenzahlen und in spezialisierten Laboratorien zum Einsatz kommen. Dies steht vor allem bei den Anforderungen einer "point of care" Diagnostik im Wege, wo schnell und möglichst ohne für Nukleinsäuretechniken speziell geschultes Personal nukleinsäurebasierende Diagnostik auch als Einzelnachweis betrieben werden soll.
  • Ein einfaches Verfahren zum Nachweis von nicht denaturierten Nukleinsäuren ist in U.S. 6,037,127 beschrieben. Dieser Test wird in Form eines Trockenschnelltestes durchgeführt, bei dem in einer Ausführungsform Nukleinsäuresonden auf dem chromatographischen Material des Teststreifens immobilisiert sind. Die hier beschriebenen Testverfahren sind jedoch nicht hoch sensitiv.
  • Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine hoch sensitives Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren zu entwickeln, welches als Schnelltest einfach durchzuführen ist und welches eine sequenzspezifische Identifizierung, Differenzierung und Charakterisierung von Nukleinsäuren ermöglicht.
  • Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein hoch sensitives Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes; der Trockenschnelltest enthaltend ein chromatographisches Material umfassend
    • - eine Probenaufnahmezone,
    • - eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind und
    • - eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone,
    dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
    • a) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert,
    • b) die nachzuweisende Nukleinsäure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen,
    • c) die nachzuweisende Nukleinsäure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone,
    • d) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der sequenzspezifischen Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde
    • e) die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsäure angebracht ist oder über eine Markierung des Nukleinsäuredoppelstranges. Als Markierung gilt somit beispielsweise auch die Detektion mit einem Antikörperkonjugat gegen einen DNS-Doppelstrang oder einen DNS/RNS- Doppelstrang (letzteres z. B. im Falle, daß die Sonde oder die Zielsequenz RNS ist.)
  • Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid bezieht sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf Primer, Proben, Sonden und Oligomerfragmente, welche detektiert werden. Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid ist weiterhin generisch zu Polydesoxyribonukleotiden (enthaltend 2-Deoxy-D-Ribose) und zu Polyribonukleotiden (enthaltend D-Ribose) oder zu jedem weiteren Typ von Polynukleotid, das ein N-Glykosid einer Purinbase oder einer Pyrimidinbase ist, beziehungsweise einer modifizierten Purinbase oder einer modifizierten Pyrimidinbase. Eingeschlossen sind somit erfindungsgemäß auch PNA's, d. h. Polyamide mit Purin-/Pyrimidin-Basen. Die Begriffe Nukleinsäure und Oligonukleotid werden im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als verschieden angesehen, insbesondere soll die Verwendung der Begriffe keine Unterscheidung in Bezug auf die Länge bedeuten. Diese Begriffe schließen sowohl doppel- beziehungsweise einzelsträngige DNA, als auch doppel- beziehungsweise einzelsträngige RNA ein.
  • Unter Trockenschnelltest im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zu verstehen, welche eine chromatographische Auftrennnung des zu analysierenden Produkts ermöglicht. Besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines chromatographischen Materials mit einer Porengröße von 4 µm und größer, am meisten bevorzugt größer als 8 µm. Der Analyt wird durch Kapillarkräfte des chromatographischen Materials zu den Reaktionszonen wie z. B. die Trennzone gebracht.
  • Da der Analyt hauptsächlich hydrophiler Natur ist, sind hydrophile Eigenschaften des chromatographischen Materials des Teststreifens wichtig für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das chromatographische Material kann umfassen anorganische Puder wie silikatische Materialien, Magnesiumsulfat und Aluminium, kann weiterhin umfassen synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere wie Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Zellulose, Polyvinylchlorid oder -acetat, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat u. s. w., kann weiterhin umfassen beschichtete Werkstoffe wie keramische Materialien und Glas. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von Nitrozellulose als chromatographisches Material. Zusätzlich kann die Einführung von positiv geladenen Ionengruppen in z. B. Nitrozellulose oder Nylonmembranen die hydrophilen Eigenschaften des chromatographischen Materials verbessern.
  • Der Trockenschnelltest umfaßt eine Probenaufnahmezone, eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind und eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone. Der Trockenschnelltest kann mehrere Trennzonen aufweisen. Der Trockenschnelltest kann zusätzlich Zonen umfassen, die markierende Substanzen enthalten, welche an den Analyten beim Passieren dieser Zone binden. Üblich ist zum Beispiel eine Zone enthaltend ein Goldkonjugat zum Markieren des passierenden Analyten. Der Trockenschnelltest kann insbesondere die Form eines Teststreifens aufweisen.
  • Weitere gebräuchliche Varianten den Trockenschnelltest betreffend sowie das chromatographische Material betreffend, sind im Stand der Technik, insbesondere in US 6,103,127 beschrieben.
  • Das chromatographische Material kann in einem Gehäuse oder ähnlichem montiert sein. Dieses Gehäuse ist in der Regel Wasser unlöslich, rigid und kann aus einer Vielzahl von organischen und anorganischen Materialien bestehen. Wichtig ist, daß das Gehäuse nicht mit den kapillaren Eigenschaften des chromatographischen Materials interferiert, daß das Gehäuse nicht Testkomponenten unspezifisch bindet, und daß das Gehäuse nicht mit dem Detektionssystem interferiert.
  • Erfindungsgemäß bevorzugt ist, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül mehr als 30 nm beträgt.
  • Die Länge des Linkers ist von entscheidender Bedeutung, um eine hohe Sensitivität der immobilisierten Sonde zu erreichen. Der Linker fungiert als Abstandshalter der Sonde zur Membran. Dies sind im vorliegenden Falle meist Polymere, die den zur Zielsequenz komplementären, Teil der Sonde am 5'- oder 3'-Ende verlängern, aber selbst nicht kodierend sind. Dies können Basenabfolgen einer nichtkodierender Nukleinsäuresäurestruktur sein oder andere Polymereinheiten wie z. B. Polyether, Polyester u. ä. Der Linker muß so beschaffen sein, daß er die Hybridisierungseigenschaften der Sonde nicht oder nur schwach negativ beeinflußt wird. Dies kann dadurch vermieden werden, daß keine selbstkomplementären Strukturen vorhanden sind. Auch müssen die chemischen Voraussetzungen für die irreversible Kopplung der Sonde an das Trägermaterial gegeben sein. Eine entscheidende Voraussetzung für ein gutes Funktionieren der Sonde über ihre Eigenschaften ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz zu bilden hinaus, ist die Chemie der Kopplung an die Oberfläche. Es müssen chemische Gruppen vorhanden sein, die bei den verwendeten Immobilisierungstechniken eine irreversible Bindung ermöglichen. Dies können Amine-, Thiolgruppen, Carboimide, Succinimide u. ä. sein. Bevorzugt ist, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül mehr als 30 nm beträgt, insbesondere bevorzugt mehr als 40 nm. Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß der Linker Polythymidin ist.
  • Die Länge synthetischer Linker ist oft limitiert. Bei der chemischen Synthese von Oligonukleotiden als Linker nach der Phosphoramidit-Methode beispielsweise werden Ausbeute und Produktqualität nach einer Anzahl von Syntheseschritten so stark reduziert, daß die Länge des Oligonukleotids auf ca. 100 Monomere beschränkt ist. Dies entspricht je nach Monomer in etwa einer Länge von ca. 30-40 nm. Bei enzymatischen Methoden der Oligonukleotidverlängerung z. B. durch eine terminale Transferase, ergibt sich immer ein Gemisch aus langen (bis mehreren hundert Monomeren) und sehr kurzen Oligonukleotiden.
  • Die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsäuresonden an die Membran bzw. das chromatographische Material erfolgt bevorzugt über einen Polymerlinker, der mit einem Verankerungsmolekül verbunden ist. Am meisten bevorzugt ist, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist. Psoralen bietet als Crosslinkingreagenz die Möglichkeit, sehr lange Linker aus vollsynthetischen Oligonukleotiden zu bilden. Psoralen ist eine polyzyklische Verbindung, die in der Lage ist, bei UV-Licht einer Wellenlänge von ca. 360 nm photochemisch mit Pyrimidinresten zu koppeln. Besonders gut ist die Reaktion mit Thymidinresten. Durch die Kopplung von Sonden, die beispielsweise 5'endig eine Psoralen-haltige Polythymidinverlängerung besitzen, können durch Einwirkung von UV-Licht mittels Quervernetzung der Moleküle Verlängerungen der Abstandshalter bzw. Linker entstehen. Durch eine Mischung von reinem Polythymidin ohne Verankerungsmolekül und Polythymidin mit Psoralenmodifikation als Verankerungsmolekül am Ende des Polythymidin-Linkers können Netzwerkstrukturen aufgebaut werden, die sich für die Hybridisierungseffizienz und die Sensitivität der Sonden als vorteilhaft erweisen. Des weiteren kann die DNS mit Psoralen-markierten Oligonukleotiden gemischt und photo-vernetzt werden. Dies verbessert die Anheftung der Sonde an die Oberfläche. Als Verankerungsmolekül können erfindungsgemäß auch weitere Moleküle eingesetzt werden, wie z. B. Derivate des Psoralen, wie z. B. Bis(PIP) Cn-Psoralen oder andere dem Fachmann bekannte photoreaktive Vernetzungs- und Markierungsreagenzien, wie z. B. einfache Aryl-Azid-Vernetzer, fluorinierte Aryl-Azid-Vernetzer oder auf Benzophenon basierende Vernetzer.
  • Dem Fachmann sind jedoch auch andere Möglichkeiten bekannt, Abstandshalter beziehungsweise Linker zwischen der Sonde und der Membran zu schaffen. Sondenoligonukleotide können beispielsweise über Proteine an die Membranoberfläche gebunden werden. Die mit der Sonde beladenen Proteine können dann nach Standardverfahren an die poröse Membran gebunden werden. Standardverfahren sind zum Beispiel die Kopplung über homobifunktionelle Kopplungsreagenzien oder heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien. Bei homobifunktionellen sind die reaktiven Gruppen gleich. Typischerweise sind dies Amine und/oder Thiole. Thiole können synthetisch direkt an Oligonukleotide gekoppelt werden und unter oxidativen Bedingungen mit z. B. Cysteinresten zu Disulfidbrücken reagieren. Für die Kopplung Amin- Amin können Amine als homobifunktionelle Kopplungsreagenzien direkt synthetisch an Oligonukleotide gekoppelt werden und über Imidoester oder Succinimidester an die Oberfläche oder das Protein gebunden werden. Bei heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien sind die reaktiven Gruppen unterschiedlich und erlauben die Kopplung von verschiedenen funktionellen Gruppen. Bevorzugt ist die Ausbildung von Amino-Thiol-Kopplungen. Mit einem heterobifunktionellen Kopplungsreagenz, welches sowohl eine Succinimidester-Maleimid oder Iodacetimid beinhaltet, können thiolierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Ein weiteres wichtiges Kopplungsagenz sind die Carbodiimide, die Carbinylreste an Amine koppeln. Wichtigster Vertreter ist hier das 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodümid (EDAC). Hier können an Membranen mit Carbonylresten aminmodifizierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Bei dieser Chemie wird das Kopplungsreagenz nicht in die Verbindung eingebaut.
  • Erfindungsgemäß werden die Nukleinsäuresonden auf der festen Phase immobilisiert, und anschließend wird diese feste Phase mit der Zusammensetzung, welche die nachzuweisenden markierten Nukleinsäuren oder einen Teil davon enthält, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise werden wenigstens zwei Sonden auf der festen Phase immobilisiert, bevorzugter wenigstens fünf Sonden, noch bevorzugter wenigstens zehn Sonden. Verschiedene Sonden können in verschiedenen Zonen immobilisiert sein.
  • Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren ist die nachzuweisende Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z. B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin.
  • Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC, Cyaninfarbstoffe, Rhodamine, Rhodamin600R-phycoerythrin, Texas Red usw.
  • Vorstellbar ist auch eine radioaktive Markierung, wie z. B. 125I 35S, 32P, 35P.
  • Vorstellbar ist auch eine Partikelmarkierung wie z. B. mit Latex. Solche Partikel sind üblicherweise trocken, im Micron-Bereich und uniform.
  • Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung beispielsweise direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen oder Konjugatspartnern nachgewiesen werden. Andere Bindungspartner als beispielsweise Biotin/Streptavidin sind Antigen/Antibody-Systeme, Hapten/Anti-Hapten-Systeme, Biotin/Avidin, Folsäure/Folat-bindende Proteine, Komplementäre Nukleinsäuren, Proteine A, G und Immunoglobulin usw. (M: N: Bobrov, et al. J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989). Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt. Mögliche Enzyme für diesen Verwendungszweck sind Hydrolasen, Lyasen, Oxido-Reduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Weitere Beispiele sind Peroxidasen, Glukoseoxidasen, Phosphatasen, Esterasen, und Glykosidasen. Derartige Verfahren sind dem Fachmann an sich bekannt (Wetmur JG. Crit Rev Biochem Mol Biol 1991; (3-4): 227-59; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun; 5(3): 223-32). Bei manchen Methoden, bei denen Enzyme als Konjugatspartner fungieren, müssen farbändernde Substanzen anwesend sein (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. R. H. Burton and P. H. von Knippenberg (1998).
  • Ein weiteres bevorzugtes Konjugat umfaßt ein Enzym, welches an einen Antikörper gekoppelt wird (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984). Weiterhin ist üblich die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit einem Gold Streptavidin Konjugat, wobei dann ein Biotin-markiertes Zielnukleotid nachgewiesen werden kann. Vorstellbar sind jedoch auch Bindungspartner, die kovalente Bindungen miteinander eingehen, wie z. B. Sulfhydrylreaktive Gruppen wie Maleimide und Haloacetyl-Derivate und Amin-reaktive Gruppen wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalide.
  • Im Falle der Markierung mit Konjugaten, kann das detektierbare Konjugat auf eine Zone des Trockenschnelltestes aufgetragen werden, die von der nachzuweisenden Nukleinsäure passiert wird, wobei in diese nachzuweisende Nukleinsäure der Konjugatspartner eingebracht wurde. Werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren markiert, dann sind die Sonden in der Regel nicht markiert. Die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt somit im wesentlichen nach im Stand der Technik beschriebenen Methoden (siehe auch US 6,037,127).
  • Das Einbringen der Markierung in die nachzuweisende Nukleinsäure kann durch chemische oder enzymatische Methoden erfolgen, oder durch direkte Inkorporation von markierten Basen in die nachzuweisende Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nachzuweisende Sequenzen, die Markierungen inkorporiert haben, durch markierte Basen oder markierte Primer während der PCR hergestellt. Markierte Primer können hergestellt werden durch chemische Synthese z. B. mittels der Phosphoramidit-Methode durch die Substitution von Basen des Primers durch markierte Phosphoramiditbasen während der Primer- Synthese. Alternativ dazu können Primer hergestellt werden mit modifizierten Basen, an welche nach der Primer-Synthese Markierungen chemisch gebunden werden.
  • Denkbar sind auch Verfahren ohne daß die zu detektierende Nukleinsäure amplifiziert oder mit einer Modifikation versehen wird. Beispielsweise können ribosomale RNS Spezies mit einer DNS-Sonde spezifisch hybridisieren und mit einem RNS/DNS-spezifischen Antikörper als RNS/DNS-Hybrid nachgewiesen werden.
  • Eine andere Möglichkeit ist das Einbringen von Markierungen mit Hilfe der T4 Polynucleotide-Kinase oder eines terminalen Transferase-Enzyms. Vorstellbar sind so das Einbringen von radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen (Sambrook et. al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).
  • Markierungen können in eines oder in beide Enden der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. Markierungen können auch innerhalb der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. In eine nachzuweisende Nukleinsäure können mehrere Markierungen eingebracht werden.
  • Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß die Denaturierung gemäß Verfahrensschritt i) mit NaOH erfolgt und die Neutralisierung gemäß Verfahrensschritt i) mit einem Phosphatpuffer oder Tris-Puffer. Eine Denaturierung ist auch durch andere Maßnahmen zu erreichen wie beispielsweise Kochen bei einer Temperatur größer als 95°C, eventuell unter Zusatz mild denaturierender Chemikalien. Eine Denaturierung der nachzuweisenden Nukleinsäure ist immer dann notwendig, wenn doppelsträngige Nukleinsäuren in der Probe vorliegen. Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, daß der Laufpuffer gemäß Verfahrensschritt ii) Phosphat- bzw. TRIS-Puffer ist und als mild denaturierendes Agens eines oder mehrere der nachfolgend genannten im Laufpuffer enthalten sind: Formamid, DMSO, Harnstoff. Zur Neutralisierung und als Laufpuffer können jedoch erfindungsgemäß alle unten aufgeführten Laufpuffer verwendet werden. Der Puffer, der zur Neutralisierung verwendet wird, kann identisch sein zum Laufpuffer.
  • Puffer und Lösungsmittel, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und Beispiele sind beschrieben in US 4,740,468 und US 6,037,127. Der pH für den Laufpuffer befindet sich normalerweise im Bereich von 4-11, bevorzugt im Bereich 5-11 und am meisten bevorzugt im Bereich von 6-9. Der pH wird so gewählt, daß ein erhebliches Maß an Bindungsaffinität zwischen allen Bindungspartnern inklusive der hybridisierenden Nukleinsäuren erhalten bleibt und auch ein optimales Signal vom Signal-produzierenden System erhalten werden kann. Typischerweise verwendete Puffer enthalten Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und ähnliches. Normalerweise spielt die Wahl des geeigneten Puffers keine kritische Rolle für das erfindungsgemäße Verfahren. Für spezielle Tests können jedoch einige Puffer mehr geeignet sein als andere. Herkömmliche Hybridisierungsverfahren werden mit erwärmten Lösungen in Hybridisierungsöfen oder Wasserbädern durchgeführt. Dies erfolgt typischerweise bei 30° bis 70°C, bevorzugt bei 50°C. Für ein Nukleinsäurenachweissystem im Trockenschnelltestformat muß bei Raumtemperatur gearbeitet werden. Um gute Sensitivitäten zu erzielen, ist es daher notwendig, die oben erwähnten mild denaturierenden Agenzien dem Laufpuffer hinzuzufügen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann natürlich bei allen Temperaturen zwischen 4°C und 50°C durchgeführt werden. Am zweckmäßigsten und daher bevorzugt ist jedoch die Raumtemperatur.
  • Der Begriff Hybridisierung bezieht sich auf die Bildung von Duplexstrukturen durch zwei einzelsträngige Nukleinsäuren aufgrund von komplementärer Basenpaarung. Hybridisierung kann zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder zwischen Nukleinsäuresträngen erfolgen, welche kleinere Regionen an Fehlpaarung aufweisen. Die Stabilität des Nukleinsäuren-Duplexes wird gemessen durch die Schmelztemperatur Tm. Die Schmelztemperatur Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei welcher 50% der Basenpaare dissoziiert sind.
  • Bedingungen, bei denen lediglich vollständig komplementäre Nukleinsäuren hybridisieren, werden als stringente Hybridisierungsbedingungen bezeichnet. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt (z. B. Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Im allgemeinen, werden stringente Bedingungen so ausgewählt, daß die Schmelztemperatur 5°C niedriger ist als die Tm für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und pH. Wenn die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt wird, dann werden Sequenz-Fehlpaarungen toleriert. Das Ausmaß an Sequenz-Fehlpaarungen kann durch Veränderung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.
  • Die Durchführung der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist besonders wichtig für das erfindungsgemäße Verfahren. Stringent im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß das Detektionsverfahren eine eindeutige Unterscheidung zwischen einer positiven Reaktion und einer negativen Reaktion im Reaktionsfeld des Streifens zuläßt. Dies kann insbesondere durch folgende Maßnahmen erzielt werden:
    Struktur der Sonde: Durch die Länge der zur Zielsequenz komplementären Struktur der Sonde; bevorzugt sind 15 bis 20mere.
    Laufpuffer: Durch den Salzgehalt wird die Stringenz beeinflußt. Die Ionenstärke liegt bevorzugt zwischen 100-400 mM, insbesondere bevorzugt um 250 mM.
  • Weiterhin kann durch die oben erwähnten mild denaturierenden Substanzen im Laufpuffer (DMSO, Formamid, Harnstoff) die Stringenz individuell eingestellt und optimiert werden. Die Stringenz wird auch durch den pH-Wert des Laufpuffers beeinflußt. Alle der oben genannten Maßnahmen sind letztlich Maßnahmen, die Einfluß auf Wasserstoffbrückenbindungen haben.
  • Erfindungsgemäß bevorzugt ist, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäure mit einer spezifischen Sequenz ist, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die nachzuweisende Nukleinsäure hybridisiert. Spezifische Sequenz bedeutet, daß eine definierte Nukleinsäurestruktur von vielen anderen Strukturen unterschieden werden kann. Dies kann zur Differenzierung von Mikroorganismen und Viren aber auch zu Unterscheidung von Nukleinsäurepolymorphismen bei genetischen oder epidemiologischen Fragestellungen sein.
  • Die nachzuweisende Nukleinsäure kann isoliert werden aus einer Vielzahl von Organismen wie bakteriellen und viralen Pathogenen. Die nachzuweisende Nukleinsäure kann auch Gegenstand eines diagnostischen Nachweises für eine genetisch bedingte Krankheit sein. Die nachzuweisende Nukleinsäure kann jeder vorstellbaren Quelle entstammen, wenn die Detektion der Nukleinsäure oder Teile davon nachgewiesen, differenziert oder charakterisiert werden sollen. Meistens wird die nachzuweisende Nukleinsäure nicht direkt nachgewiesen, sondern muß vorher amplifiziert werden. (Für die Darstellung von möglichen Amplifikationsmethoden siehe auch US 6,037,127.)
  • Die im folgenden beschriebene Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens soll die Erfindung näher erläutern. In dieser Ausführungsform ist die nachzuweisende Nukleinsäure ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis assoziierten Bakteriums oder komplementär zu diesem. In dieser Ausführungsform ist die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäure mit einer speziesspezifischen Sequenz ist, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die nachzuweisende Nukleinsäure hybridisiert. Bevorzugt ist die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist:
    SEQ ID No.: 1-29, beziehungsweise ist ein Fragment davon. (siehe auch Abb. 6 und 7)
  • Dem Fachmann ist bewußt, daß ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Sonden entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Sonden abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Sonden denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Sonden mit den Sequenzen SEQ ID No. 1-29 am 5'- und/oder 3'-Ende Verlängerungen oder Verkürzungen um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Ebenso ist denkbar, daß einzelne oder wenige Nukleotide einer Sonde durch andere Nukleotide austauschbar sind, solange die Spezifität der Sonde nicht zu stark verändert wird und der Schmelzpunkt der Sonde nicht zu stark verändert wird. Das schließt ein, daß bei Abwandlung die Schmelztemperatur der abgewandelten Sonde nicht zu stark von der Schmelztemperatur der ursprünglichen Sonde abweicht. Die Schmelztemperatur wird dabei nach der G (= 4°C) + C (= 2°C) Regel ermittelt. Dem Fachmann ist klar, daß neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.
  • Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit einer oder mehreren Sonden hybridisiert.
  • Prinzipiell ist möglich, das durch Hybridisierung mit einer einzelnen spezifischen Sonde die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies zu bestimmen. Es ist aber auch möglich, die Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit mehr als einer Sonde zu hybridisieren. Dadurch wird die Aussagekraft des Verfahrens erhöht. Man erhält dann ein genaues Profil und kann die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies mit hoher Sicherheit bestimmen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Vorrichtung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Trockenschnelltestes enthaltend ein chromatographisches Material umfassend
    • - eine Probenaufnahmezone,
    • - eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind und
    • - eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind.
  • Die bevorzugten Ausführungsformen der Vorrichtung entsprechen im wesentlichen denen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Bevorzugt erfolgt die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsäuresonden an die Membran über einen Polymerlinker erfolgt, der mit einem Verankerungsmolekül verbunden ist. Die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, beträgt mehr als 30 nm beträgt. Bevorzugt beträgt die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 40 nm.
  • Insbesondere ist bevorzugt, daß der Linker Polythymidin ist.
  • Des weiteren ist bevorzugt, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist.
  • Bevorzugt ist das chromatographische Material der erfindungsgemäßen Vorrichtung Nitrozellulose. Es ist weiterhin bevorzugt, daß das chromatographische Material eine Porengröße von 4 µm und größer aufweist.
  • In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäure, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis assoziierten Bakteriums oder an die dazu komplementäre Sequenz hybridisiert.
  • In dieser Ausführungsform ist insbesondere bevorzugt, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist: SEQ ID No.: 1-29 beziehungsweise Fragmente davon enthält.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren, insbesondere zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Parodontitis assoziierten Bakterien.
  • Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis von Amplifikationsprodukten aus Amplifikationsverfahren wie der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und der Nukleinsäurestrang basierende Amplifikation (NASBA). Es wird darauf hingewiesen, daß die Amplifikationsprodukte auch durch andere Nukleinsäureamplifikationstechniken entstanden sein können wie z. B. durch die Transcriptase vermittelte Amplifikation (TMA), Reverse Transcriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), Q-beta Replicase Amplifikation (β-Q- Replicase) und die Einzelstrangverdrängungs Amplification (SDA).
    • Abbildungsbeschreibung Abb. 1
  • Abbildung eines Teststreifens geeignet für den erfindungsgemäßen Trockenschnelltest
    • Abb. 2
  • Trockenschnelltest (A) positiv für Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis und Bacteroides forsythus, sowie Trockenschnelltest (B) positiv für Actinobacillus actinomycetemcomitans. 150 µl Testansatz wurden auf das Auftragskissen des Tests getropft und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Als Sonden für (A) wurden (von oben nach unten) eine Laufkontrolle (Biotin-BSA) und die Sonden für
    Actinobacillus actinomycetemcomitans: 5'-PsoC6-T85-SEQ ID No.: 16,
    Porphyromonas gingivalis: 5'-PsoC6-T85-SEQ ID No.: 21 und
    Bacteroides forsythus: 5'PsoC6-T84-SEQ ID No.: 23
    auf der Nitrozellulosemembran immobilisiert. Das heißt, daß alle Sonden jeweils 5'Psoralen markiert sind und einen Polythymidinlinker von 85 Thymidinen aufweisen.
  • In (A) ist eine für alle drei Sonden positive Probe gezeigt, während in (B) nur ein Amplifikat des Actinobacillus actinomycetemcomitans spezifisch detektiert wurde. Die Amplifikation wurde mit einem speziesspezifischen Primerpaar durchgeführt (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4).
  • In Abb. 2 verwendete Sonden:
    SEQ ID No.: 16: 5'PsoC6-T85-ccgaagaagaactcag (A. actinomycetemcomitans)
    SEQ ID No.: 21: 5'PsoC6-T85-catacacttgtattattgc (Porphyromonas gingivalis)
    SEQ ID No.: 23: 5'PsoC6-T85-aacaggggttccgca (Bacteroides forsythus)
  • In Abb. 2 verwendete Primer:
    SEQ ID No.: 14: 5'-Biotin- ggattggggtttagcccc
    SEQ ID No. 4.: 5'-Biotin- ggataagggttgcgctcgtt
    • Abb. 3
  • Einfluß der Länge des Linkerarms auf die Sensitivität. Variation der Sonde SEQ ID No.: 16 im Polythymidinlinker: (A) ohne Linker, (B) 20 Thymidinresten und (C) 100 Thymidinresten. Als Amplifikat diente Actinobacillus actinomycetemcomitans (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No.: 14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4).
    • Abb. 4
  • Einfluß der Psoralenmarkierung auf die Sensitivität. In (A) wurde die Sonde SEQ ID No. 16 mit Polythymidinlinker von 85 Thymidinresten ohne Psoralenmarkierung und in (B) mit Psoralenmarkierung immobilisiert. Amplifiziert wurde jeweils Actinobacillus actinomycetemcomitans (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No.: 14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4).
    • Abb. 5
  • Einfluß mild denaturierender Verbindungen auf die Sensitivität. Denaturiertes Actinobacillus actinomycetemcomitans -Amplifikat (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No.: 14; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4) wurde mit Hybridisierungspuffer (A) ohne DMSO, (B) 10% DMSO, 20% DMSO und 30% DMSO auf den Trockenschnelltest aufgetragen. (Sonde SEQ ID No. 16, psoralenmarkiert und mit dem Polymidinlinker mit 85 Polymidinresten).
    • Abb. 6 und Abb. 7
  • Sequenzen SEQ ID No. 1-29, Nukleinsäuresonden für den Nachweis Parodontitis assoziierter Bakterien
    • Beispiel 1 Nachweis Parodontitis assoziierter Bakterien mit Hilfe des erfindungsgemäßen Trockenschnelltestes
  • Dazu werden die Sonden SEQ ID No. 1-29 (die Sonden sind am 5'-Ende mit Psoralen modifiziert) auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht und durch UV-Bestrahlung gebunden. Der Aufbau des Schnelltestes ist in Abb. 1 dargestellt.
  • DNS-Isolierung: Dazu wurde von Festmedien mit einer sterilen Impföse bakterielles Material entnommen und in 30 µl 10 mM Tris/HCl pH 7,5 suspendiert. Aus Flüssigkulturen wurde 1 ml entnommen, 5 min bei 13.000 rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand verworfen und in 30 µl 10 mM Tris/HCl pH 7,5 resuspendiert. Die so erhaltenen Zellsuspensionen wurden 15 min bei 95°C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert, 15 min in einem Ultraschallbad (Bandelin electronic, Berlin, Deutschland) beschallt und 10 min bei 13.000 rpm in einer Tischzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zentrifugiert. Vom Überstand wurden jeweils 5 µl in die Amplifikationsreaktion eingesetzt.
    • Amplifikation
  • Alle Primer wurden kommerziell synthetisiert (Interactiva, Ulm, Deutschland). Der PCR- Ansatz enthielt 1 × Taq-Puffer (Qiagen, Hilden, Deutschland), je 1 µM Primer, 200 µM dNTP (Roche, Mannheim, Deutschland) und 1 U Hotstar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die PCR-Amplifikation wurde auf einem Thermocyeler PE 9600 (ABI, Weiterstadt, Deutschland) mit 15 min 95°C, 10 Zyklen mit 30 sek 95°C und 2 min 60°C und mit 20 Zyklen 10 sek 95°C, 50 sek 55°C und 30 sek 70°C durchgeführt.
  • DNS-Amplifikat wurde mit einem ethidiumbromidgefärbtem Agarosegel nachgewiesen.
  • Auf eine Nitrozellulosemembran AE 99 (Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) wurden in Form von Linien durch einen Probenautomat 3 "Freemode" (CAMAG, Berlin, Deutschland) 5'-Psoralenmarkierte Oligonukleotidsonden (Aal, Pg2, Bf) gelöst in 3 × SSC (10 × SSC-Lösung 1,5 M NaCl, 0,15 M Trinatriumcitrat) aufgetragen. Als Färbekontrolle wurde eine Linie Biotin-BSA (SIGMA, München, Germany) 1 mg/ml aufgesprüht. Die Oligonukleotide wurden auf der Membran, nachdem sie vollständig getrocknet waren, in einem UV- Crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm2 fixiert. Die beschichtete Membran wurde auf einen Vinylrücken geklebt und mit einem Probehkissen (Grad 903 Papier, Schleicher & Schüll, vorbehandelt mit 0,01 M Natriumtetraborat, 1% Triton X-100, pH 7,4) und einem Zugkissen (Grad 470 Papier, Schleicher & Schüll) versehen. Die geschnittenen Streifen wurden in ein Kunststoffgehäuse eingepackt.
  • Für die Detektion wurden mit Streptavidin konjugierte Goldpartikel 2O0 nm (British Biocell, Cardiff, Großbritannien) OD524, 4,0 benützt. 3 µl dieser Goldpartikelsuspension wurden mit 20 µl biotiniliertem Amplifikat vermischt Smin inkubiert. Die Denaturierung des Amplifikats wurde durch Zugabe einer NaOH-Lösung (Endkonzentration 200 mM) erreicht. Nach fünfminütiger Inkubation wurde die Lösung in 150 µl Laufpuffer bestehend aus 250 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1% Tween 20 und 20% DMSO (SIGMA, München, Germany) neutralisiert und komplett auf die Auftragszone gegeben. Nach ca. 5 min können die entwickelten Zonen abgelesen werden.
    • Beispiel 2 Einfluß der Länge des Linkerarms auf die Sensitivität
  • Um eine größere Sensitivität zur Verfügung zu haben, wurde die Detektion für die nachfolgenden Experimente ohne konjugierte Partikel, sondern durch eine Alkalische Phosphatase katalysierte Färbung mit NBT/BCIP durchgeführt. Dazu wurde der Streifen, nachdem die Zielnukleinsäure im Trockenschnelltestverfahren hybridisiert hatte, aus dem Gehäuse genommen und einmal in 1 × SSC für 1 min gewaschen. Durch Inkubation in 5 g/l Blockingreagenz (Roche, Mannheim, Deutschland) in Maleinsäurepuffer pH 7,5 (8,26 g NaCl und 10,06 g Maleinsäure in 1 l Wasser) mit Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat (1 : 5000 Verdünnung, Dianova, Hamburg, Deutschland) für 15 min. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (3 × SSC, 0,1% Tween 20) konnten die hybridisierte DNS durch Inkubation in Substratpuffer (274 mM Tris/Cl pH 7,5, 68,6 mM Na3Citrat, 200 mM NaCl, 27,4 mM MgCl2 × 6 H2O) mit NBT (75 mg/ml Nitroblaütetrazoliumsalz in 70% Dimethylformamid) und BCIP (50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indonylphosphat-toluidiniumsalz in 100% Dimethylformamid) gefärbt werden.
  • Auf den Streifen wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben die Sonde SEQ ID No. 16 ohne Polythymidinlinker, die gleiche Sonde mit Polythymidinlinker aus 20 Thymidinresten und mit 100 Thymidinresten hybridisiert und mit NBT/BCIP entwickelt. Als Amplifikat diente Actinobacillus actinomycetemcomitans (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No.: 14; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4). Es ist eine deutliche Sensitivitätsabstufung korrelierend mit der Länge des Linkers zu sehen (siehe Abb. 3). Die Sonde deren Linker 100 Thymidinresten lang ist, zeigt die höchste Sensitivität.
    • Beispiel 3 Einfluß der Psoralenmarkierung auf die Sensitivität
  • Auf den Streifen wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben die Sonde SEQ ID No. 16 mit Polythymidinlinker aus 100 Thymidinresten mit und ohne 5'-Psoralenmarkierung hybridisiert und mit NBT/BCIP entwickelt. Als Amplifikat diente Actinobacillus actinomycetemcomitans (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No.: 14; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4). Es ist eine deutliche Sensitivitätsabstufung korrelierend mit dem Vorhandensein der Psoralenmarkierung zu sehen. (Abb. 4). Psoralenmarkierte Sonden sind sensitiver.
    • Beispiel 4 Einfluß mild denaturierender Verbindungen auf die Sensitivität
  • Auf den Streifen wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben die Sonde SEQ ID No. 16 mit Polythymidinlinker aus 100 Thymidinresten und mit 5'-Psoralenmarkierung hybridisiert und mit NBT/BCIP entwickelt. Denaturiertes Actinobacillus actinomycetemcomitans-Amplifikat (Primerpaar 5'-Biotin-SEQ ID No.: 14; 5'-Biotin-SEQ ID No. 4) wurde mit Hybridisierungspuffer (A) ohne DMSO, (B) 10% DMSO, 20% DMSO und 30% DMSO auf den Trockenschnelltest aufgetragen. Das heißt, der Laufpuffer enthält steigende Konzentration von DMSO von 0, 10, 20 und 30%. Der Test wird sensitiver bei DMSO Konzentrationen von mehr als 10%. (Abb. 5) SEQUENCE LISTING













Claims (25)

1. Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes; der Trockenschnelltest enthaltend ein chromatographisches Material umfassend
eine Probenaufnahmezone,
eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind und
eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone,
dadurch gekennzeichnet, daß
die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
a) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert,
b) die nachzuweisende Nukleinsäure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen,
c) die nachzuweisende Nukleinsäure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone,
d) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der sequenzspezifischen Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde
e) die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsäure angebracht ist oder über die Detektion einer Markierung des Nukleinsäuredoppelstranges.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsäuresonden an die Membran über einen Polymerlinker erfolgt, der mit einem Verankerungsmolekül verbunden ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 30 nm beträgt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 40 nm beträgt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker Polythymidin ist.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure mit Biotin oder Fluoreszein markiert ist.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das chromatographische Material Nitrozellulose ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Denaturierung gemäß Verfahrensschritt i) mit NaOH erfolgt und die Neutralisierung gemäß Verfahrensschritt i) mit einem Phosphatpuffer erfolgt.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Laufpuffer gemäß Verfahrensschritt ii) Phosphatpuffer ist und als mild denaturierendes Agens eines oder mehrere der nachfolgend genannten im Laufpuffer enthalten sind: Formamid, DMSO, Harnstoff.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis assoziierten Bakteriums oder komplementär zu diesem ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäure mit einer speziesspezifischen Sequenz ist, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die nachzuweisende Nukleinsäure hybridisiert.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist: SEQ ID No.: 1-29 beziehungsweise Fragmente davon enthält.
14. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 in Form eines Trockenschnelltestes enthaltend ein chromatographisches Material umfassend
eine Probenaufnahmezone,
eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind und
eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone,
dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind.
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsäuresonden an die Membran über einen Polymerlinker erfolgt, der mit einem Verankerungsmolekül verbunden ist.
16. Vorrichtung gemäß Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 30 nm beträgt.
17. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 40 nm beträgt.
18. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker Polythymidin ist.
19. Vorrichtung gemäß Anspruch 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist.
20. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das chromatographische Material Nitrozellulose ist.
21. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20 dadurch gekennzeichnet, daß daß das chromatographische Material eine Porengröße von 4 µm und größer aufweist.
22. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäure ist, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Fragment aus dem Genom eines Paradontitis assoziierten Bakteriums oder an die dazu komplementäre Sequenz hybridisiert.
23. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist: SEQ ID No.: 1-29 beziehungsweise Fragmente davon enthält.
24. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14-23 zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren.
25. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14-23 zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Parodontitis assoziierten Bakterien.
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