DE102023200837A1

DE102023200837A1 - Probengefäß zur Kultivierung biologischer Proben, Vorrichtung zu dessen Betrieb und Mikroskop

Info

Publication number: DE102023200837A1
Application number: DE102023200837.8A
Authority: DE
Inventors: Anne Wuttke; Matthias Eibl
Original assignee: Carl Zeiss AG
Current assignee: Carl Zeiss AG
Priority date: 2023-02-02
Filing date: 2023-02-02
Publication date: 2024-08-08
Also published as: WO2024160966A1; EP4658751A1; US20250354106A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Probengefäß (1) zur Kultivierung biologischer Proben (9), umfassend eine Kavität (2) zur Aufnahme eines Mediums (8); mindestens eine Zugangsöffnung (10) zur Zuführung des Mediums (8) in die Kavität (2); und einen innerhalb der Kavität (2) angeordneten Probenraum (3) zur Aufnahme einer Probe (9), wobei der Probenraum (3) durch mindestens eine Seitenwand (4) gegen einen verbleibenden Raum der Kavität (2) abgetrennt ist und die mindestens eine Seitenwand (4) Durchbrüche (6) aufweist, mittels derer das in der Kavität (2) enthaltene Medium (8) mit dem Probenraum (3) in Verbindung treten kann.
Das Probengefäß (1) ist dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Seitenwand (4) auf einem Boden (5) des Probenraums (3) aufsteht; und der Boden (5) für Wellenlängen mindestens eines Wellenlängenbereichs sichtbaren Lichts durchlässig ist, sodass eine Beleuchtung des Probenraums (3) und/oder eine Erfassung einer aus dem Probenraum (3) kommenden Detektionsstrahlung durch den Boden (5) der Kavität(2) hindurch ermöglicht ist.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung (12) zum Betrieb des Probengefäßes (1) und ein Mikroskop (17).

Description

Die Erfindung betrifft ein Probengefäß zur Kultivierung biologischer Proben gemäß dem Oberbegriff des Hauptanspruchs, sowie eine Vorrichtung zum Betrieb des Probengefäßes und ein Mikroskop mit einer solchen Vorrichtung gemäß den nebengeordneten Ansprüchen.
Neben der Kultivierung von im Wesentlichen flächigen Zellkulturen (2D-Zellkulturen) nimmt die Bedeutung der Kultivierung von dreidimensionalen biologischen Objekten (3D-Zellkulturen, 3D-Kultur), wie zum Beispiel von Organoiden und Sphäroiden, zu. In einer Umgebung, die eine 3D-Kultivierung erlaubt, kann der üblicherweise räumlichen Ausdehnung von biologischen Geweben Rechnung getragen werden. Die mittels einer 3D-in-vitro-Kultur erzeugten biologischen Objekte (nachfolgend auch: biologische Probe, oder nur kurz: Probe) können an einer Oberfläche anhaften, auf einer solche aufliegen, in einer gelartigen Matrix (wie Matrigel und Artverwandtes) eingebettet sein oder frei in einem umgebenden Medium schwimmen („free-floating“).
Die räumliche Ausdehnung der biologischen Objekte beziehungsweise deren Aufenthalt in dem umgebenden Medium stellt erhebliche technische Herausforderungen, wenn das Medium ganz oder teilweise ausgetauscht werden soll. Ein solcher Austausch dient dabei der Zufuhr von Nährstoffen, von Grundbausteinen für die (Protein-)biosynthese, von Signalstoffen, sowie der Versorgung mit Sauerstoff und der Abfuhr von Stoffwechselprodukten und verbrauchten Mediums. Werden zum Austausch des Mediums beispielsweise Pipettenspitzen verwendet, können diese ungewollt die Probe berühren oder beschädigen. Frei im Medium schwimmende Proben können zudem versehentlich verwirbelt oder sogar mit abgesaugt werden.
Im Gegensatz zu 2D-Zellkulturen wird daher in 3D-Kulturen ein Wechsel des Mediums meist manuell vorgenommen, was allerdings recht aufwändig ist. Ein probenschonender Wechsel des Mediums ist bei 3D-in-vitro Kulturen besonders wichtig, da diese über einen langen Zeitraum kultiviert werden müssen. Jede Störung kann negative Auswirkungen auf die Entwicklung und Qualität der Probe haben.
Aus dem Stand der Technik sind für 2D-Zellkulturen Möglichkeiten des (teil-)automatisierten Wechsels des verwendeten Mediums bekannt. Allerdings sind diese insbesondere für adhärente 2D-Zellkulturen ausgelegt, die nicht direkt auf frei schwimmende Proben einer 3D-Kultur übertragen werden können. Wird die Probe einer 3D-Kultur dagegen in einem Matrigeltropfen kultiviert, ist die Probe zwar lokalisiert, allerdings kann der Matrigeltropfen unterschiedlich hoch sein und einen Großteil eines Probengefäßes, beispielsweise eines Wells einer (Mikro-)titerplatte, ausfüllen. Das birgt die Gefahr, dass die Probe durch die Pipettenspitze beschädigt wird.
Um die oben genannten Gefahren für die Probe zu reduzieren, kann ein Medienwechsel durch vorsichtiges Kippen des Probengefäßes oder durch Pipettieren mit einem großen Überschuss an Medium erfolgen. In beiden Fällen verbleibt ein erheblicher Anteil des Mediums im Probengefäß.
Es sind außerdem optimierte Kulturplatten bekannt, die das Volumen für die Probe minimieren und so einen Medienaustausch erleichtern. Ein Beispiel dafür ist eine Multiwellplatte der Firma Insphero AG, Schlieren, Schweiz (Akura™ 96 Spheroid Microplate). In jedem als Probengefäß dienendem Well ist ein Kanal ausgebildet, der sich zum Boden des Probengefäßes hin verengt. Infolge der Verengung ist ein Aufenthaltsbereich der Probe festgelegt und eine Pipette kann an eine definierte Position in dem Well gefahren werden, ohne die Probe zu berühren. Diese Platte ist allerdings nur eingeschränkt für Kulturen in Matrigel geeignet. Für Kulturen, die eine größere Fläche für das Wachstum benötigen, ist die Platte nicht kompatibel.
Um einen automatisierten Wechsel des Mediums vorzunehmen, können Objektträger, wie die Chips Fluidic 480 und Fluidic 983 der Firma Chipshop, Jena, Deutschland, an Pumpen angeschlossen werden. Ein solches Design ist jedoch nicht mit Matrigel kompatibel und nur für verhältnismäßig kleine 3D-Zellkulturen geeignet. Des Weiteren ist eine Skalierung schwierig, da jeder einzelne Objektträger mit einer eigenen Pumpe ausgestattet sein muss.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte Möglichkeit zur Kultivierung und optischen Erfassung von 3D-Zellkulturen vorzuschlagen.
Die Aufgabe wird durch die Gegenstände des unabhängigen Anspruchs sowie der nebengeordneten Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Die Aufgabe wird mit einem Probengefäß zur Kultivierung biologischer Proben gelöst, das eine Kavität zur Aufnahme eines Mediums; mindestens eine Zugangsöffnung zur Zuführung des Mediums in die Kavität; und mindestens einen innerhalb der Kavität angeordneten Probenraum zur Aufnahme einer Probe umfasst, wobei der Probenraum durch mindestens eine Seitenwand gegen einen verbleibenden Raum der Kavität abgetrennt ist. Die mindestens eine Seitenwand weist Durchbrüche auf, mittels derer ein in der Kavität enthaltenes Medium mit dem Probenraum in Verbindung treten kann. Dabei kann das Medium ein in dem Probenraum befindliches weiteres Medium berühren oder in den Probenraum eindringen und diesen beispielsweise durchfließen.
Gekennzeichnet ist ein erfindungsgemäßes Probengefäß dadurch, dass die mindestens eine Seitenwand auf einem Boden des Probenraums aufsteht. Außerdem ist der Boden für Wellenlängen mindestens eines Wellenlängenbereichs sichtbaren und/oder des infraroten Lichts durchlässig (transparent), sodass eine Beleuchtung des Probenraums und/oder eine Erfassung einer aus dem Probenraum kommenden Detektionsstrahlung durch den Boden der Kavität hindurch ermöglicht ist.
In weiteren Ausführungen des erfindungsgemäßen Probengefäßes kann neben der mindestens einen Seitenwand ein Boden des Probenraums mit Durchbrüchen versehen sein, mittels derer ein in der Kavität enthaltenes Medium mit dem Probenraum in Verbindung treten kann.
Grundgedanke der Erfindung ist, die Kavität physisch und funktionell so zu unterteilen, dass die Probe in einem Bereich lokalisiert ist, während beispielsweise eine Pipettenspitze an einem anderen Ort der Kavität verwendet werden kann, ohne die Probe zu gefährden. Im Gegensatz zum Stand der Technik ist die Probe zudem vor einem ungewollten Wegspülen geschützt, da die Probe in dem Probenraum positioniert ist und hohe Strömungsgeschwindigkeiten beziehungsweise ein hohes Verfrachtungsvermögen vorteilhaft durch eine geeignete Wahl der Anzahl, Größe und Anordnung der Durchbrüche vermieden werden können. Zudem erlaubt das erfindungsgemäße Probengefäß eine optische Erfassung, Überwachung und/oder Darstellung der Vorgänge im Probengefäß.
Um den oben umrissenen Vorteil zu erreichen, weisen die Durchbrüche eine größte lichte Weite von höchstens 1000 µm, vorteilhaft von höchstens 500 µm, bevorzugt von höchstens 200 µm auf. In weiteren Ausführungen des Probengefäßes können die Durchbrüche lichte Weiten von weniger als 200 µm, beispielsweise 100 µm oder 50 µm aufweisen. Um einzelne Zellen in dem Probenraum zu halten, können die Durchbrüche lichte Weiten von höchstens 10 µm aufweisen.
Eine Seitenwand des Probenraums kann dabei Durchbrüche unterschiedlicher lichter Weite aufweisen. So kann in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Probengefäßes die lichte Weite der Durchbrüche mit zunehmenden Abstand vom Boden des Probenraums größer werden. Auf diese Weise kann im Bereich des Aufenthalts einer Probe die strömungstechnische Belastung dieser gering gehalten sein, ohne die Versorgung der Probe beispielsweise mit Sauerstoff und/oder Nährstoffen zu gefährden.
Als Seitenwand oder Seitenwände können flächige und mit Durchbrüchen versehene Strukturen, dicht nebeneinander angeordnete Stäbe und/oder Gitter dienen. Der Querschnitt des Probenraums kann in der Draufsicht kreisförmig, oval, n-eckig beziehungsweise halbrund sein.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Probengefäß in seiner Ausrichtung im Verwendungszustand oben offen. Optional kann es ganz oder teilweise mit einem Deckel versehen sein, um die Gefahr einer Kontamination und eines unbeabsichtigten Verdunstens von Inhalten der Kavität zu reduzieren. Der Deckel kann abnehmbar sein oder eine Öffnung aufweisen, die optional wiederum verschließbar sein kann. Als Zugangsöffnung kann der nach oben offene beziehungsweise zu öffnende Querschnitt des Probengefäßes dienen. In weiteren Ausführungen kann die Zugangsöffnung durch einen gesondert ausgebildeten und in der Kavität endenden Kanal gebildet sein. Entsprechendes gilt für eine vorhandene Auslassöffnung.
In einer weiteren mögliche Ausführung der Erfindung ist nur der Probenraum teilweise beziehungsweise gänzlich durch einen Deckel abgedeckt, während wenigstens ein als Zugangsöffnung dienender Abschnitt des Querschnitts der Kavität (Draufsicht) frei bleibt.
Um in der Kavität einen Bereich für die Zufuhr des Mediums, beispielsweise unter Verwendung einer in die Kavität geführten Pipettenspitze, zu schaffen, verbleibt vorteilhaft zwischen der Seitenwand des Probenraums und einer Wand der Kavität ein Freiraum, in den das Medium zugeführt werden kann. Dieser Freiraum dient vorteilhaft wenigstens über Abschnitte seiner Ausdehnung als Zugangsöffnung. Im Rahmen dieser Beschreibung wird das Medium meist beispielhaft unter Verwendung von Pipettenspitzen zu- beziehungsweise weggeführt. Gleichbedeutend sind entsprechende Leitungen, Schläuche und/oder Kanäle.
Der Freiraum kann seitlich um den Probenraum umlaufen. Der Probenraum ist dann von den Seitenwänden und dem Freiraum rundherum umfangen. Dabei kann der Probenraum in der Mitte der Kavität ausgebildet sein, sodass der Freiraum zwischen Probenraum und Wand der Kavität umlaufend etwa gleichbleibend ist. Eine solche Ausführung unterstützt einen allseitigen Austausch beziehungsweise ein allseitiges In-Kontakt-Treten der Medien in der Kavität und optional eine gleichmäßige Durchströmung von Kavität und/oder Probenraum.
In anderen Ausführungen des erfindungsgemäßen Probengefäßes kann der Freiraum mindestens um einen seitlichen Winkelbereich oder Sektor des Probenraums vorhanden sein. Die Wandung des Probenraums ist dabei über einen Abschnitt durch die Wand der Kavität gebildet, während die Seitenwand mit den Durchbrüchen den verbleibenden Sektor gegen die Kavität abgrenzt. Auf diese Weise kann ein großer Freiraum geschaffen werden.
Um ein in der Kavität vorhandenes Medium auszutauschen, kann neben der Zugangsöffnung eine Auslassöffnung vorhanden sein, durch die das Medium aus der Kavität abgeleitet werden kann. Dabei kann das Medium an der nach oben offenen Seite abgeführt werden, indem dort beispielsweise eine (weitere) Pipettenspitze mit dem Medium in Kontakt gebracht und ein Anteil des Mediums mittels einer mit der Pipettenspitze verbundenen Absaugvorrichtung (Pipette, Pumpe) abtransportiert wird.
Um eine gleichmäßige An- und/oder Durchströmung des Probenraums zu erreichen, kann die Auslassöffnung im oder nahe des Bodens der Kavität ausgebildet sein. Bei einer Zufuhr von Medium in einem oberen Bereich der Kavität und einer bodennahen Ableitung des Mediums wird die Kavität und der Probenraum durchströmt und verbleibende Toträume, in denen kaum oder kein Medienaustausch erfolgt, werden vorteilhaft reduziert.
Die Auslassöffnung kann zudem einen gesteuert zu betätigenden Verschluss aufweisen, um im Zusammenwirken mit der Menge zugeführten Mediums einen Volumenstrom des Mediums durch die Kavität zu beeinflussen. Die Zugangsöffnung kann ebenfalls mit einem gesteuert zu betätigenden Verschluss versehen sein.
Der Verschluss kann beispielsweise im Sinne eines Ventils, eines Schiebers oder eines Lamellenverschlusses umgesetzt sein. Im Sinne eines gesteuerten Verschlusses beziehungsweise eines Antriebs zu dessen Betätigung werden bei einer Verwendung von Pipettenspitzen oder dergleichen auch die entsprechenden technischen Elemente beispielsweise eines Pipettierkopfes, einer Multipette oder dergleichen angesehen, mittels denen der Inhalt beispielsweise einer Pipettenspitze abgegeben beziehungsweise in diese eingesogen werden kann.
Die Auslassöffnung kann insbesondere am Boden der Kavität zusammen mit einem Auslassstutzen ausgebildet sein. An diesem kann beispielsweise eine Leitung angeschlossen sein beziehungsweise angeschlossen werden.
Weiterhin ist es möglich, dass die Auslassöffnung mit einer porösen Matrix verschlossen ist, durch deren Strömungswiderstand das Medium an einem Abfließen aus der Kavität gehindert ist. Um das Medium abzuleiten, kann an der Auslassöffnung ein Unterdruck angelegt werden, durch dessen Wirkung das Medium durch die poröse Matrix gesogen wird. Eine solche Ausführung erlaubt die Verwendung des Probengefäßes, ohne dass eine formschlüssige Verbindung mit einem Kanal, Schlauch oder dergleichen hergestellt werden muss. Ein Kanal könnte mit einem seiner Enden gegen den Boden des Probengefäßes gedrückt werden, wobei das Kanalende die Auslassöffnung umfängt. Vorteilhaft ist an einer Stirnseite (Kanalende) des Kanals, die gegen den Boden gedrückt wird, eine Dichtung vorhanden, um den Aufbau eines Unterdrucks zu unterstützen und um ein Austreten des Mediums nach außerhalb des Kanals zu vermeiden. Statt einer porösen Matrix kann in weiteren Ausführungen des erfindungsgemäßen Probengefäßes ein Verschluss aus einem flexiblen Material, beispielsweise eine Klappe oder ein sternförmiger Verschluss aus einer Gummimischung, sein.
In einer einfachen Ausführung des erfindungsmäßen Probengefäßes steht die mindestens eine Seitenwand auf dem Boden des Probengefäßes auf. In einer vorteilhaften Weiterbildung kann beispielsweise am Boden des Probenraums eine Probenauflage ausgebildet sein. Auf dieser kann die zu kultivierende Probe aufliegen. Die Probenauflage kann eine Oberflächenstruktur aufweisen, die beispielsweise der Adhäsion der Probe oder von Bestandteilen, aus denen sich die Probe über einen Zeitraum entwickelt beziehungsweise weiterentwickelt, dient. Die Oberflächenstruktur kann dabei eine physische Gestaltung der Oberfläche sein, indem diese beispielsweise bestimmte Rauheiten aufweist oder regelmäßige beziehungsweise unregelmäßige Strukturierungen besitzt. Die Probenauflage kann alternativ oder zusätzlich mit Molekülen (Linker) versehen sein, die eine spezifische Bindung von Molekülen der Proben beziehungsweise von in dem Medium enthaltener Moleküle an die Probenauflage erlauben. In weiteren Ausführungen der Erfindung kann der Probenraum, insbesondere dessen Boden und/oder mindestens ein Bereich der Seitenwand derartige Oberflächenstrukturen aufweisen.
Zusätzlich oder alternativ zu den vorstehenden Ausführungsmöglichkeiten kann die Probenauflage durch ihre Formgebung Wirkungen auf eine Probe entfalten. In einer vorteilhaften Ausführung ist die Probenauflage in Richtung des Probenraums konkav gewölbt ausgebildet und bildet somit eine Mulde. Es wurde gefunden, dass eine solche Formgebung die Entstehung von Sphäroiden, also von Zusammenballungen einzelner Zellen und/oder Zellverbände, unterstützt.
Um die Vorgänge im Probengefäß, insbesondere im Probenraum, besser optisch erfassen, beobachten und/oder darstellen zu können, kann der Boden des Probengefäßes und/oder des Probenraums durch mindestens zwei, einen Winkel kleiner 180° einschließende, flächige oder gewölbte Seitenwände gebildet sein. Eine derartige Ausführung ist für eine optische Erfassung, Beobachtung und/oder Darstellung durch den Boden des Probengefäßes hindurch, also mittels einer inversen Anordnung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang, vorteilhaft. Dabei werden vorteilhaft Abbildungsfehler reduziert, die auftreten, wenn Beleuchtungsstrahlung beziehungsweise Detektionsstrahlung schräg durch den Boden des Probengefäßes verläuft, beziehungsweise verlaufen.
Um ein erfindungsgemäßes Probengefäß nach einem der genannten Ausführungen zu betreiben, ist eine Vorrichtung zum Betrieb des Probengefäßes vorteilhaft, die eine erste Pumpe zur Zuführung des Mediums in die Kavität beziehungsweise in den Freiraum der Kavität ermöglicht. Die erste Pumpe ist mit einer Steuerung in einer zum Austausch von Daten und zur Übermittlung von Steuerbefehlen geeigneten Weise verbunden. Die Steuerung kann beispielsweise ein Rechner, ein Microcontroller oder ein FPGA (field progammable gate array) sein.
Entsprechend kann in einer weiteren Ausführung eine zweite Pumpe vorhanden sein, die zur Ableitung des Mediums durch die Auslassöffnung dient. Die zweite Pumpe wird ebenfalls vorteilhaft mittels der Steuerung angesteuert.
Die Vorrichtung zum Betrieb des Probengefäßes kann Bestandteil eines Mikroskops sein. Dieses umfasst dabei eine Lichtquelle zur Bereitstellung einer Beleuchtungsstrahlung. Diese wird entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs geführt und kann optional durch darin angeordnete optische Elemente, beispielsweise optische Linsen, geformt werden. Weiterhin umfasst das Mikroskop ein Detektionsobjektiv zur Erfassung von aus dem Probenraum kommender Detektionsstrahlung, sowie einen Detektor zur Umwandlung erfasster Detektionsstrahlung in elektronische Signale (Bilddaten).
Die Lichtquelle und das Detektionsobjektiv können in einer Konfiguration zur Durchlichtbeleuchtung angeordnet sein. Dabei wird der Probenraum und die darin befindliche Probe von der Beleuchtungsstrahlung beleuchtet. Als Detektionsstrahlung kann reflektierte und/oder abgeschwächte Beleuchtungsstrahlung genutzt werden. Durch Wirkung der Beleuchtungsstrahlung kann in der Probe auch die Emission einer Detektionsstrahlung ausgelöst werden, indem beispielsweise Bestandteile der Probe mit Fluorophoren (Marker) versehen sind, die durch die Beleuchtungsstrahlung zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden können.
Eine Durchlichtbeleuchtung kann insbesondere für eine quantitative Bewertung der Vorgänge in dem Probenraum beziehungsweise der aktuellen Eigenschaften der Probe eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführung eines erfindungsgemäßen Mikroskops sind die Lichtquelle und das Detektionsobjektiv in einer Konfiguration zur inversen Beleuchtung und Detektion durch einen Boden des Probengefäßes hindurch angeordnet.
Die vorstehend genannten Ausführungsmöglichkeiten des Probengefäßes können sinnentsprechend auch dann realisiert sein, wenn in einer Kavität mehr als ein Probenraum ausgebildet ist. Andererseits ist es vorteilhaft möglich, eine Mehrzahl von Probengefäßen auf einem gemeinsamen Träger anzuordnen. Ein solcher Träger kann dabei vorteilhaft die Abmessungen standardisierter Platten, beispielsweise SBS-Platten oder dergleichen, aufweisen und beispielsweise 6, 12, 24, 48, 96 oder 384 Probengefäße aufweisen. Auf diese Weise kann die Erfindung mit bereits vorhandenen Laborgeräten verwendet und bei Bedarf einfach automatisiert werden.
Sind mehrere Probengefäße pro Träger vorhanden, können diese auf einer gemeinsamen Bodenplatte aufsetzen, durch die die jeweiligen Böden der Probengefäße gebildet werden.
Die erfindungsgemäßen Probenträger können natürlich vorteilhaft in sterilisierter Form bereitgestellt werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes in einer perspektivischen Ansicht als Drahtmodell;
2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes in einer perspektivischen Ansicht als Drahtmodell;
3 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes in einer perspektivischen Ansicht als Drahtmodell;
4 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und eines vierten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes in einer seitlichen Schnittdarstellung;
5 eine schematische Darstellung des ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und eines fünften Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes in einer seitlichen Schnittdarstellung;
6 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und eines sechsten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes in einer seitlichen Schnittdarstellung;
7 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer seitlichen Schnittdarstellung;
8 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops als Durchlichtmikroskops in einer seitlichen Schnittdarstellung;
9 eine schematische Darstellung des ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops als Durchlichtmikroskops und eines siebten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes mit einer konkaven Probenauflage in einer seitlichen Schnittdarstellung;
10 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops als inverses Mikroskop in einer seitlichen Schnittdarstellung;
11 eine schematische Darstellung des zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops als inverses Mikroskop und eines achten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes in einer seitlichen Schnittdarstellung;
12 eine schematische Darstellung des zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops als inverses Mikroskop und eines neunten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes in einer seitlichen Schnittdarstellung; und
13 eine schematische Darstellung eines Trägers in Form einer Platte mit einer Mehrzahl erfindungsgemäßer Probengefäße in einer perspektivischen Ansicht.

Die Abbildungen der Ausführungsbeispiele sind schematisch und nicht maßstabsgerecht. Zur besseren Veranschaulichung sind die 1 bis 3 als sogenannte Drahtmodelle dargestellt, bei denen nur die Außenkonturen der jeweiligen Strukturen gezeigt sind und auf eine Darstellung geschlossener Flächen, wie zum Beispiel die Wand des Probengefäßes 1, verzichtet wird. Bei den 7 bis 12 sind der Übersichtlichkeit halber technische Elemente weggelassen, die der Zu- und Abführung eines Mediums 8 dienen.
Ein erfindungsgemäßes Probengefäß 1 ist im gezeigten Ausführungsbeispiel als ein nach oben offener Hohlzylinder mit einem Boden 5 ausgebildet (1). Das als Kavität 2 bezeichnete innere Volumen des Probengefäßes 1 nimmt einen Probenraum 3 auf, dessen mindestens eine Seitenwand 4 eine Mehrzahl von Durchbrüchen 6 aufweist und auf dem Boden 5 aufsteht. Der Boden 5 ist in allen Ausführungsbeispielen mindestens über die Ausdehnung des Probenraums 3 und mindestens für bestimmte Wellenlängenbereiche, insbesondere des sichtbaren und/oder des infraroten Lichtes, transparent.
Der Probenraum 3 weist einen Durchmesser auf, der geringer als der Durchmesser der Kavität 2 ist, sodass zwischen der Seitenwand 4 und der Wand des Probengefäßes 1 ein Freiraum 7 verbleibt. Im ersten Ausführungsbeispiel ist der Probenraum 3 mittig in der Kavität 2 angeordnet, sodass der Freiraum 7 mit einer gleichbleibenden Ausdehnung um den Probenraum 3 umläuft. Der Freiraum 7 dient als Zugangsöffnung 10 und/oder als Auslassöffnung 11.
Optional ist ein Deckel 27 vorhanden, mit dem das Probengefäß 1 verschlossen, zumindest aber bei Bedarf abgedeckt werden kann. Der Deckel 27 kann in weiteren Ausführungen auch nur einen Abschnitt der Kavität 2 überdecken (siehe dazu 3). Weiterhin kann der Deckel 27 Öffnungen für Zufuhr- und/oder Abfuhr eines darin enthaltenen Mediums 8 aufweisen (siehe auch 2). Die Öffnungen können aktiv oder passiv zu öffnen oder wieder verschließbar sein.
In einem zweiten Ausführungsbeispiel ist der Probenraum 3 dezentral in der Kavität 2 angeordnet, sodass in einer Richtung ein gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel größerer Freiraum 7 trotz gleicher Größe des Probenraums 3 geschaffen ist (2). Der optional vorhandene Deckel 27 weist in der gezeigten Ausführungsvariante eine Zugangsöffnung 10 auf, durch die hindurch Medium 8 in den Freiraum 7 eingebracht werden kann. Die Öffnung 10 kann natürlich wahlweise auch als eine Auslassöffnung 11 dienen, durch die hindurch das Medium 8 ganz oder anteilig entnommen werden kann.
Die Seitenwand 4 kann in einem dritten Ausführungsbeispiel von einer insbesondere vertikal verlaufenden Kontaktlinie zu einer anderen vertikalen Kontaktlinie an der Wand des Probengefäßes 1 verlaufen und dort jeweils mit der Wand verbunden sein (3). Der optional zu verwendende Deckel 27 verschließt hier beispielsweise lediglich den Probenraum 3 an seiner Oberseite, während der Freiraum 7 im Wesentlichen von oben her frei zugänglich bleibt und als Zugangsöffnung 10 und/oder Auslassöffnung 11 dient.
Die beispielhaft angeführten Ausführungen des Deckels 27 können unter Beachtung der technischen Erfordernisse frei mit den oben beziehungsweise den nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen des Probengefäßes 3 kombiniert werden.
Das Probengefäß 1 kann in einer Vorrichtung 12 zum Betrieb des Probengefäßes 1 verwendet sein. In der 4 ist beispielhaft ein teilweise mit einem Medium 8 gefülltes Probengefäß 1 in einem Vertikalschnitt gezeigt. Innerhalb des Probenraums 3 sind einzelne Zellen, Zellverbände und/oder Aggregationen in dem Medium 8 schwimmend vorhanden, die als Probe 9 dienen. Die Abmessungen der Durchbrüche 6 (siehe oben) in der Seitenwand 4 sind so bemessen, dass die Probe 9 selbst bei einer in dem Medium 8 vorhandenen Strömung nicht aus dem Probenraum 3 ausgespült wird.
Um das Medium 8 der Kavität 2 zuzuführen, ist eine beispielsweise als Pipettenspitze ausgebildete Leitung 13 vorhanden, die an der als Zugangsöffnung 10 fungierenden offenen Seite des Probengefäßes 1 in den Freiraum 7 gerichtet ist. Das Medium 8 kann ausgehend von der Leitung 13 entlang des Freiraums 7 sowie durch die Durchbrüche 6 hindurch in den Probenraum 3 und wieder aus diesem herausströmen. Eine gerichtete Strömung (durch Pfeile angedeutet) kann erzeugt werden, indem im Bereich des Freiraums 7 eine Auslassöffnung 11 vorhanden und ein zum wahlweisen Schließen der Auslassöffnung 11 dienender optionaler Verschluss 14 geöffnet ist. Das abfließende Medium 8 gelangt durch eine beispielsweise als Anschlussstutzen zum Anschließen eines Schlauchs oder eines Rohrs, ausgebildete Leitung 13 wieder aus dem Probengefäß 1 heraus. Das Medium 8 wird mittels einer ersten Pumpe 25 der Leitung 13 an der Zugangsöffnung 10 zugeführt und mittels einer zweiten Pumpe 26 über die Auslassöffnung 11 abgepumpt.
Zum Betrieb der Vorrichtung 12, insbesondere zum Ansteuern der Verschlüsse 14 und der Pumpen 25, 26, ist eine Steuerung 15 vorhanden, die mit jeweils einem Antrieb 16 verbunden ist. Wie bereits weiter oben angesprochen, wird auch eine technische Einheit zur Abgabe einer Menge des Mediums 8 unter dem Begriff des steuerbaren Verschlusses verstanden. Der betreffende Antrieb 16 erhält von der Steuerung 15 Steuerbefehle und stellt bei deren Ausführung den Öffnungsgrad des jeweiligen Verschlusses 14 ein. Eine Fördermenge des Mediums 8 kann mittels der Ansteuerung der Pumpen 25, 26 eingestellt und geregelt werden.
Anhand des ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung 12 ist ein fünftes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Probengefäßes 1 gezeigt, bei dem in der Kavität 2 eine Mehrzahl von Probenräumen 3, in diesem Falle zwei, vorhanden sind (5). Diese stehen strömungstechnisch miteinander in Verbindung. Eine solche Ausführung des Probengefäßes 1 kann beispielsweise verwendet werden, wenn Reaktionen der Probe 9 in einem strömungstechnisch nachgeordneten Probengefäß 1 auf beispielsweise physiologische Vorgänge in einem strömungstechnisch vorgeordneten Probengefäß 1 untersucht werden sollen. Beispielsweise können mit dem strömenden Medium 8 Hormone, Wachstumsfaktoren und/oder Stoffwechselprodukte aus dem vorgeordneten Probenraum 3 zu dem nachgeordneten Probenraum 3 transportiert werden und dort gegebenenfalls eine Reaktion auslösen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung 12 kann mit einem weiteren Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Probengefäßes 1 verwendet werden (6). Auf einem Träger 28 sind mehrere Probenräume 3 ausgebildet. Jeder der Probenräume 3 ist durch eine Trennwand 29 seitlich gegen seine benachbarten Probenräume 3 abgegrenzt, wobei die Trennwand 29 keinen Austausch von flüssigen oder gasförmigen Medien zulässt. Jeder der Probenräume 3 kann individuell gesteuert über eine Leitung 13 befüllt und über eine Auslassöffnung 11 versorgt werden. In weiteren Ausführungen kann eine gemeinsame Leitung 13 verwendet werden. Dazu werden Träger 28 und Leitung 13 gesteuert relativ zueinander bewegt, indem beispielsweise ein Pipettierkopf und/oder ein verfahrbarer Probentisch vorhanden und verwendet sind. Die Relativbewegung kann ebenfalls mittels der Steuerung 15 kontrolliert und geregelt beziehungsweise gesteuert werden. Weitere Alternativen weisen einen gemeinsamen Auslasskanal 30 auf (siehe 13), über den Medium aus mehreren oder allen Probengefäße 1 weggeführt werden kann.
In einem zweiten Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 12 (7) wird die nach oben offene Seite des Probengefäßes 1 sowohl als Zugangsöffnung 10 für eine Leitung 13, als auch als Auslassöffnung 11 genutzt. Die Probe 9 ist beispielhaft durch ein Organoid oder ein Sphäroid gegeben, dass eine dreidimensionale Ausdehnung besitzt.
Die Vorrichtung 12 kann Bestandteil eines zur Durchlichtbeleuchtung eingerichteten Mikroskops 17 sein (8). Das Mikroskop 17 umfasst eine Lichtquelle 18, mittels der eine Beleuchtungsstrahlung bereitgestellt werden kann, die entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs 19 in den Probenraum 3 gerichtet ist. Im Beleuchtungsstrahlengang 19 können zum Zwecke der Leitung und/oder Formung der Beleuchtungsstrahlung optische Elemente, beispielsweise ein Beleuchtungsobjektiv 24 (siehe zum Beispiel 10) vorhanden sein, die hier aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt sind. Die durch die Probe 9 hindurchtretenden Anteile der Beleuchtungsstrahlung und/oder eine durch Wirkung der Beleuchtungsstrahlung emittierte Fluoreszenzstrahlung werden entlang eines Detektionsstrahlengangs 20 geführt, mittels eines Detektionsobjektivs 21 gesammelt, auf einen Detektor 22 gelenkt und durch diesen als Messwerte (Bildsignale, Bilddaten) erfasst.
Die Beleuchtung des Probenraums 3 und einer darin befindlichen Probe 9 erfolgt im Ausführungsbeispiel von oberhalb des Probengefäßes 1. In weiteren, nicht gezeigten, Ausführungen kann eine Durchlichtbeleuchtung erzielt werden, indem die Lichtquelle 18 unterhalb des Probengefäßes 1 angeordnet ist und die Beleuchtung durch den transparenten Boden 5 hindurch erfolgt. Das Detektionsobjektiv 21 und der Detektor 22 können in einer solchen Ausführung oberhalb des Probenraums 3 vorhanden sein. Neben den bereits oben beschriebenen Funktionen der Steuerung 15 können durch diese auch die Lichtquelle 18 und/oder der Detektor 22 angesteuert werden.
In einem fünften Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Probengefäßes 1 weist diese auf seinem Boden 5 eine konkave Probenauflage 23 auf (9). Die Formgebung und Dimensionierung der Probenauflage 23 unterstützt vorteilhaft eine Zusammenballung beispielsweise von Zellen und kleineren Zellverbänden zu einem die Probe 9 bildenden Sphäroid. Die Probenauflage 23 ist für eine zu erfassende Detektionsstrahlung und/oder eine Beleuchtungsstrahlung transparent. Eine eventuell lichtstreuende Wirkung der Probenauflage 23 ist unschädlich, wenn zum Beispiel als Detektionsstrahlung lediglich das Vorhandensein beispielsweise einer Fluoreszenzstrahlung einer bestimmten Wellenlänge nachgewiesen werden soll, ohne eine Bildgebung der Probe 9 und/oder eine Lokalisierung des Ursprungsorts der Detektionsstrahlung anzustreben. Das Material des Bodens 5 und der Probenauflage 23 weisen dabei vorteilhaft für die zu nutzenden Wellenlängen der Detektionsstrahlung eine hohe Transparenz (Transmissivität) auf. Ein Arbeitsabstand zwischen dem Detektionsobjektiv 21 und einer zu erfassenden Probe 9 wird dabei vorteilhaft möglichst gering gehalten.
Ein Mikroskop 17 mit einer inversen Beleuchtungs- und Detektionsanordnung ist in 10 gezeigt. Eine Beleuchtung erfolgt mittels eines unter einem Winkel ungleich 90°, vorteilhaft unter einem Winkel in einem Bereich von 30 bis 60°, von außerhalb des Probengefäßes 1 auf den Boden 5 gerichteten Beleuchtungsobjektivs 24. Die Detektionsstrahlung wird mit dem ebenfalls unter einem Winkel in einem Bereich von 30 bis 60°, von außerhalb des Probengefäßes 1 auf den Boden 5 gerichteten Detektionsobjektiv 21 erfasst, wobei die optischen Achsen von Beleuchtungsobjektiv 24 und Detektionsobjektiv 21 miteinander vorteilhaft einen Winkel von 90° einschließen.
Um die bei einem schrägen Durchtritt der Beleuchtungs- und Detektionsstrahlung durch den Boden 5 auftretenden Aberrationen kann der Boden 5 vorteilhaft in einer weiteren Ausführung des erfindungsgemäßen Probengefäßes 1 in Kombination mit dem inversen Mikroskop 17 durch zwei oder mehr miteinander einen Winkel ungleich 180° einschließende Wände gebildet sein (11). Das Beleuchtungsobjektiv 24 und das Detektionsobjektiv 21 sind so zu dem Boden 5 angeordnet, dass deren jeweilige optische Achsen senkrecht auf die betreffende Wand des Bodens 5 gerichtet sind. Auf diese Weise kann ein erheblicher Anteil der an der Grenzfläche des Bodens 5 auftretenden Aberrationen vermieden werden. Zugleich kann die Form der Wände des Bodens 5 vorteilhaft die Bildung von Sphäroiden unterstützen.
Eine Abwandlung des zu 11 gezeigten Probengefäßes 1 weist oberhalb des tiefsten Punktes des Probenraums 3 eine Probenauflage 23 auf (12). Diese dient der Positionierung der Probe 9 relativ zu den Strahlengängen der Objektive 21, 24. Die Probenauflage 23 kann, ebenso wie die des oben beschriebenen Beispiels, mit einer für die Anheftung und/oder Zusammenballung vorteilhaften Oberflächenstruktur versehen sein. Die Ausführungen des Mikroskops 17 in inverser Bauweise kann natürlich auch für die Untersuchung frei schwimmender Proben 9 genutzt werden.
Die 13 illustriert vereinfacht einen Träger 28 in Form einer Platte, in der eine Mehrzahl von in Reihen und Spalten angeordneter Probengefäße 1 (vereinfacht dargestellt) enthalten ist. Die Probengefäße 1 sind an der nach oben weisenden Seitenfläche des Trägers 28 offen. Eine gemeinsame Bodenplatte 5.1 des Trägers 28 schließt die Probengefäße 1 an ihrer Unterseite ab und bildet den Boden 5 (siehe oben) des jeweiligen Probengefäßes 1. Die Bodenplatte 5.1 besteht aus einem Material, das für eine Detektionsstrahlung und/oder Beleuchtungsstrahlung transparent ist. Der Träger 28 kann aus einem einzigen Material bestehen. In weiteren Ausführungen ist die Bodenplatte 5.1 aus einem anderem Material als der übrige Träger 28 gefertigt. Optional kann auch hier ein Deckel 27 vorgesehen sein (nicht dargestellt).
Die einzelnen Probengefäße 1 weisen jeweils eine Auslassöffnung 11 in der Bodenplatte 5.1 oder in der nach oben weisend gezeigten Seitenfläche des Trägers 28 auf. Es ist möglich, dass alle oder eine Anzahl der Probengefäße 1 an ihren Auslassöffnungen 11 mit einem Auslasskanal 30 in Verbindung stehen, über den das Medium 8 aus den betreffenden Probengefäßen 1 weggeführt werden kann (als Option mit unterbrochener Volllinie gezeigt). Ein Verschluss 14 der Probengefäße 1 kann optional vorhanden sein. Entsprechend kann ein gemeinsamer Verschluss 14 (nicht dargestellt) des Auslasskanals 30 vorhanden sein.
Ein Auslasskanal 30 kann beispielsweise die in einer Zeile und/oder in einer Spalte auf dem Träger 28 angeordneten Probengefäße 1 verbinden. In weiteren Ausführungen können ausgewählte Probengefäße 1 in einer anderen Anordnung miteinander verbunden sein.
Bezugszeichen

1: Probengefäß
2: Kavität
3: Probenraum
4: Seitenwand
5: Boden
5.1: Bodenplatte
6: Durchbruch
7: Freiraum
8: Medium
9: Probe
10: Zugangsöffnung
11: Auslassöffnung
12: Vorrichtung
13: Pipettenspitze, Leitung, Schlauchanschluss
14: Verschluss
15: Steuerung
16: Antrieb
17: Mikroskop
18: Lichtquelle
19: Beleuchtungsstrahlengang
20: Detektionsstrahlengang
21: Detektionsobjektiv
22: Detektor
23: Probenauflage
24: Beleuchtungsobjektiv
25: erste Pumpeneinheit
26: zweite Pumpeneinheit
27: Deckel
28: Träger
29: Trennwand
30: Auslasskanal

Claims

Probengefäß (1) zur Kultivierung biologischer Proben (9), umfassend - eine Kavität (2) zur Aufnahme eines Mediums (8); - mindestens eine Zugangsöffnung (10) zur Zuführung des Mediums (8) in die Kavität (2); - mindestens einen innerhalb der Kavität (2) angeordneten Probenraum (3) zur Aufnahme einer Probe (9), wobei der Probenraum (3) durch mindestens eine Seitenwand (4) gegen einen verbleibenden Raum der Kavität (2) abgetrennt ist und die mindestens eine Seitenwand (4) Durchbrüche (6) aufweist, mittels derer das in der Kavität (2) enthaltene Medium (8) mit dem Probenraum (3) in Verbindung treten kann; dadurch gekennzeichnet, dass - die mindestens eine Seitenwand (4) auf einem Boden (5) des Probenraums (3) aufsteht; und - der Boden (5) für Wellenlängen mindestens eines Wellenlängenbereichs sichtbaren Lichts durchlässig ist, - sodass eine Beleuchtung des Probenraums (3) und/oder eine Erfassung einer aus dem Probenraum (3) kommenden Detektionsstrahlung durch den Boden (5) der Kavität(2) hindurch ermöglicht ist.
Probengefäß (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchbrüche (6) eine größte lichte Weite von höchstens 1000 µm, vorteilhaft von höchstens 500 µm, bevorzugt von höchstens 200 µm aufweisen.
Probengefäß (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Seitenwand (4) des Probenraums (3) und einer Wand der Kavität (2) ein Freiraum (7) verbleibt, in den das Medium (8) zugeführt werden kann.
Probengefäß (1) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Freiraum (7) um den Probenraum (3) umläuft.
Probengefäß (1) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Freiraum (7) mindestens um einen seitlichen Winkelbereich des Probenraums (3) vorhanden ist.
Probengefäß (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kavität (2) eine Auslassöffnung (11) aufweist, durch die das Medium (8) aus der Kavität (2) abgeleitet werden kann.
Probengefäß (1) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Auslassöffnung (11) einen gesteuert zu betätigenden Verschluss (14) aufweist.
Probengefäß (1) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Auslassöffnung (11) mit einer porösen Matrix versehen ist, durch die hindurch mittels eines erzeugten Unterdrucks auf der dem Probenraum (3) abgewandten Seite das Medium (8) aus der Kavität (2) abgesaugt werden kann.
Probengefäß (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet, durch eine am Boden (5) des Probenraums (3) vorhandene Probenauflage (23), die in Richtung des Probenraums (3) konkav gewölbt ausgebildet ist.
Probengefäß (1) nach einem der der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden (5) des Probengefäßes (1) und/oder des Probenraums (3) durch mindestens zwei einen Winkel kleiner 180° einschließende flächige Wände gebildet ist.
Vorrichtung (12) zum Betrieb eines Probengefäßes (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend - eine erste Pumpeneinheit (25) zur Zuführung des Mediums (8) in die Kavität (2); und - eine Steuerung (15) zur Ansteuerung der ersten Pumpeneinheit (25).
Vorrichtung (12) nach Anspruch 11, gekennzeichnet, durch eine zweite Pumpeneinheit (26) zur Ableitung des Mediums (8) durch die Auslassöffnung (11), wobei die zweite Pumpeneinheit (26) mittels der Steuerung (15) angesteuert wird.
Mikroskop (17) mit einer Vorrichtung (12) nach einem der Ansprüche 11 und 12, umfassend - eine Lichtquelle (18) zur Bereitstellung einer Beleuchtungsstrahlung entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs; - ein Detektionsobjektiv (21) zur Erfassung von aus dem Probenraum (3) kommender Detektionsstrahlung; und - einen Detektor (22) zur Umwandlung erfasster Detektionsstrahlung in elektronische Signale.
Mikroskop (17) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (18) und das Detektionsobjektiv (21) in einer Konfiguration zur Durchlichtbeleuchtung angeordnet sind.
Mikroskop (17) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (18) und das Detektionsobjektiv (21) in einer Konfiguration zur inversen Beleuchtung und Detektion durch den Boden (5) des Probengefäßes (1) hindurch angeordnet sind.