DE102024108046A1 - Superauflösendes Mikroskop mit schneller quasikonfokaler Detektion - Google Patents

Abstract

2.1. Zur Steigerung des Auflösungsvermögens quasikonfokaler Linienrastermikroskope mit Hauptstrahlteiler zur Kopplung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang wird im „Re-Scan“-Verfahren nach einem Descanning durch die beleuchtende Strahlablenkungseinheit das Probenlicht im Detektionsstrahlengang noch einmal abgetastet, indem es hinter der konfokalen Blende durch eine zweite Strahlablenkeinheit in der Querrichtung zum linienförmigen Fokus über den Sensor bewegt wird. Zur Auflösungssteigerung in Längsrichtung kann die Beleuchtungslinie strukturiert sein. Die optische Anordnung hat den Nachteil erheblicher Lichtverluste aufgrund einer großen Anzahl von zu passierenden optischen Grenzflächen.
2.2. Lichtempfindlicher und flexibler ist ein Mikroskop, in dem die beleuchtende Strahlablenkeinheit optisch zwischen der Lichtquelle und dem Hauptstrahlteiler angeordnet ist, so dass das Probenlicht abseits der beleuchtenden Strahlablenkeinheit (non-descanned) zum Sensor gelangt, und eine Steuereinheit in einem Betriebsmodus das Probenlichtbündel nur mittels der zweiten Strahlablenkeinheit über den Sensor bewegt. Je nach Betriebsmodus kann eine Synchronisierung mit der ersten Strahlablenkeinheit vorgesehen sein.
2.3. Durch die hohe Lichtempfindlichkeit ist das Mikroskop besonders für die Fluoreszenzmikroskopie geeignet.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang, einem Detektionsstrahlengang und einem Strahlteiler, wobei der Detektionsstrahlengang einen Probenraum, ein Mikroskopobjektiv, eine Tubuslinse, ein durch die Tubuslinse erzeugtes Zwischenbild und einen zweidimensional ortsauflösenden optoelektronischen Sensor mit einer Detektionsoptik zum Abbilden des Zwischenbilds auf den Sensor aufweist und der Beleuchtungsstrahlengang eine Lichtquelle und eine erste einstellbare Strahlablenkeinheit zum Bewegen eines Beleuchtungslichtbündels („Abtasten“, „Rastern“) durch den Probenraum aufweist und der Detektionsstrahlengang eine zweite einstellbare Strahlablenkeinheit zum Bewegen eines Probenlichtbündels über den Sensor aufweist, wobei der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang mittels des Strahlteilers optisch derart zu einem gemeinsamen Strahlengang gekoppelt sind, dass Beleuchtungslicht von der Lichtquelle über den Strahlteiler durch das Mikroskopobjektiv in den Probenraum gelangt und Probenlicht aus dem Probenraum durch das Mikroskopobjektiv über den Strahlteiler und danach über die zweite Strahlablenkeinheit zum Sensor gelangt. Die Strahlablenkeinheiten sind dabei in oder zumindest in der Nähe einer jeweiligen Ebene angeordnet, die mit einer rückwärtigen Brennebene (engl. „back focal plane“) des Mikroskopobjektivs, welche bei telezentrischen Strahlengängen einer Pupillenebene des Mikroskopobjektivs entspricht, optisch konjugiert ist.
• Die konfokale Fluoreszenz-Bildgebung liefert kontrastreiche, hochaufgelöste Bilder biologischer Proben. Dabei wird die Probe wie in DE 197 02 753 A1 mittels Laserbeleuchtung über eine Strahlablenkeinheit punktweise abgetastet und das erzeugte Probenlicht über dieselbe Strahlablenkeinheit enttastet (engl. „descanned“), so dass von jedem Probenort ein ruhendes Strahlenbündel auf der optischen Achse vorliegt, und durch eine konfokale Lochblende (engl. „pinhole“) detektiert. Durch diese Blende wird der Sensor von außerfokalem Licht weitgehend abgeschirmt, was den hohen Kontrast bewirkt. Nachteilig ist allerdings eine vergleichsweise hohe Aufnahmedauer durch das punktweise Abtasten. Dabei kommt es zwangsläufig auch zu einer hohen phototoxischen Probenbelastung durch das Anregungslicht.
• Diese Nachteile der punktweisen Bildgebung können durch eine Parallelisierung reduziert werden. Beispiele hierfür sind Konfokalmikroskope mit Nipkow-Scheibe und Lichtblattmikroskope, wobei letztere eine zusätzliche Beleuchtungsoptik benötigen. Eine Parallelisierung kann alternativ über eine linienförmige Beleuchtung erfolgen wie in EP 1 617 258 A1 . Um Konfokalität wenigstens in einer Dimension (quer zur Beleuchtungslinie) zu erreichen, ist hier zur Unterdrückung außerfokalen Lichts eine linienförmige Detektion mit einer Schlitzblende notwendig. Längs der Linie ist das Auflösungsvermögen vergleichbar mit einem Weitfeldmikroskop.
• Zur weiteren Steigerung des Auflösungsvermögens quer zur Linie (Superauflösung jenseits der Beugungsgrenze) kann das Probenlicht im Detektionsstrahlengang nach dem Enttasten durch die beleuchtende Strahlablenkungseinheit noch einmal abgetastet (engl. „re-scanned“) werden, wozu es hinter der konfokalen Blende durch eine Strahlablenkeinheit in der Querrichtung über den Sensor bewegt wird (De Luca et al.: „Re-scan confocal microscopy: scanning twice for better resolution“ in Biomedical Optics Express 2013, Bd. 4, Nr. 11, S. 2644). Die Pixel des superaufgelösten Bilds der Probe müssen durch Verknüpfung von Intensitäten unterschiedlicher Pixel zu verschiedenen Zeitpunkten errechnet werden. Die optische Anordnung hat den Nachteil erheblicher Lichtverluste aufgrund einer großen Anzahl von zu passierenden optischen Grenzflächen.
• Zur Steigerung des Auflösungsvermögens längs der Beleuchtungslinie kann diese im „Re-scan“-Verfahren zusätzlich in ihrer Längsrichtung hinsichtlich ihrer Intensität strukturiert (moduliert) werden (Shen et al.: „Confocal rescan structured illumination microscopy for real-time deep tissue imaging with superresolution" in Advanced Photonics Nexus 2023, Bd. 2 (1), S. 016009-1). Jeder Ort auf der Probe muss hierbei in mindestens drei verschiedenen Phasen (unterschiedlichen Lagen der Linienstruktur) beleuchtet und in eine entsprechende Anzahl von Phasenbildern abgebildet werden. Wie in der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (engl. „Structured Illumination Microscopy“; SIM) im Weitfeld muss das Gesamtbild durch Verknüpfung aller Phasenbilder errechnet werden (Demodulation).
• Die geringe Lichtempfindlichkeit der im „Re-Scan“-Verfahren eingesetzten optischen Anordnungen bleibt auch mit der strukturierten Beleuchtung erhalten. Zudem sind die Anordnungen auf das spezielle scannende Mikroskopierverfahren beschränkt und damit unflexibel.
• Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop der eingangs genannten Art zu verbessern, so dass der Detektionsstrahlengang vereinfacht und dadurch eine höhere Lichtübertragungseffizienz und damit Lichtempfindlichkeit erreicht wird. Zumindest in besonderen Ausführungsformen soll auch eine größere Flexibilität des Mikroskops ermöglicht werden.
• Die Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskop, welches die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist.
• Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
• Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die erste Strahlablenkeinheit optisch zwischen der Lichtquelle und dem Strahlteiler angeordnet ist, so dass das Probenlicht abseits der ersten Strahlablenkeinheit zum Sensor gelangt und dass das Mikroskop eine Steuereinheit umfasst, die dazu eingerichtet ist, in einem Betriebsmodus das Probenlichtbündel mittels der zweiten Strahlablenkeinheit über den Sensor zu bewegen. Diese Bewegung ist zunächst prinzipiell unabhängig von einer Bewegung der ersten Strahlablenkeinheit. Je nach Arbeitsmodus kann eine Synchronisierung mit der ersten Strahlablenkeinheit vorgesehen sein.
• Das Probenlicht gelangt abseits der ersten Strahlablenkeinheit zum Sensor, was als nicht-enttastete (engl. „non-descanned“) Detektion bezeichnet werden kann. Im Unterschied zu den bekannten „Re-scan“-Mikroskopen wird die Bewegung der ersten Strahlablenkeinheit also nicht zurückgenommen, auch nicht durch die zweite Strahlablenkeinheit. Die aufgrund der abtastenden Beleuchtung nacheinander von unterschiedlichen Orten im Probenraum ausgehenden Strahlenbündel (Probenlichtbündel) fallen also unter entsprechend verschiedenen Winkeln zur optischen Achse in jede zur rückwärtigen Brennebene des Mikroskops konjugierte Ebene (und damit unter verschiedenen Winkeln zur optischen Achse auf die zweite Strahlablenkeinheit). Es gibt erfindungsgemäß vor der zweiten Strahlablenkeinheit kein ruhendes Strahlenbündel. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass auch mit nur genau einer Strahlablenkeinheit im Detektionsstrahlengang eine Abtastung eines Strahlenbündels möglich ist, welche dem „Re-Scanning“ entspricht. Dementsprechend liegt (in dem ersten Betriebsmodus) auch hinter der zweiten Strahlablenkeinheit kein ruhendes Strahlenbündel vor, sondern der Winkel des Strahlbündels zur optischen Achse nach dem Passieren der zweiten Strahlablenkeinheit variiert zeitlich.
• Zur vorteilhaften Steigerung der Auflösung kann der Winkel der Ausbreitungsrichtung der aus dem Probenraum kommenden Strahlenbündel gegenüber der optischen Achse durch die zweite Strahlablenkeinheit sogar vergrößert werden. Dieses Verfahren kann als Zusatz-Abtastung („Add-Scanning“) bezeichnet werden. Zu diesem Zweck kann die Steuereinheit dazu eingerichtet sein, in dem ersten Betriebsmodus das Probenlichtbündel mittels der zweiten Strahlablenkeinheit so über den Sensor zu bewegen, dass das Zwischenbild vergrößert auf den Sensor abgebildet wird. Insbesondere kann die Bewegung derart erfolgen, dass ein Betrag eines Quotienten zwischen einem ersten Winkel, den eine Ausbreitungsrichtung eines von einem Ort im Probenraum ausgehenden Strahlenbündels des Probenlichts unmittelbar hinter der zweiten Strahlablenkeinheit mit einer optischen Achse der Detektionsoptik einschließt, und einem zweiten Winkel, den die Ausbreitungsrichtung des Strahlenbündels unmittelbar vor der zweiten Strahlablenkeinheit mit einer optischen Achse des Mikroskopobjektivs einschließt, größer als eins ist.
• Die rechnerische Auswertung der Pixelintensitäten des Sensors aus unterschiedlichen Zeitpunkten zur Erzeugung eines superaufgelösten Bildes der Probe quer zur Längsrichtung der Beleuchtungslinie entspricht dabei der bekannten Auswertung von enttastet und wieder-abgetastet (und dadurch, vorzugsweise um den Faktor zwei, eindimensional quer zur Längsrichtung der Beleuchtungslinie vergrößert auf den Senor abgebildetem Zwischenbild) aufgenommenen Pixelintensitäten. Mit einem durch die Zusatzabtastung nur eindimensional wirksamen Vergrößerungsfaktor von zwei wird die maximale Auflösungssteigerung quer zur Beleuchtungslinie erreicht.
• Die Vergrößerung gelingt mit geringem Aufwand, indem mindestens im ersten Betriebsmodus die Bewegung der zweiten Strahlablenkeinheit mit der Bewegung der ersten Strahlablenkeinheit synchronisierbar oder synchronisiert ist, beispielsweise durch die Steuereinheit oder eine andere elektrische Verbindung. Insbesondere kann die Steuereinheit dabei die erste Strahlablenkeinheit und die zweite Strahlablenkeinheit mit identischer oder näherungsweise identischer Winkelamplitude bewegen, um durch die Zusatzabtastung mit der nur eindimensional wirksamen mechanischen Vergrößerung um den Faktor 2 die maximale Auflösungssteigerung zu erzielen.
• Die mechanisch-technischen Anforderungen an die zweite Strahlablenkeinheit sind geringer als bei den herkömmlichen „Re-Scan“-Anordnungen. Sie muss lediglich dieselben Anforderungen erfüllen wie die erste Strahlablenkeinheit, weil sie nicht - wie im Stand der Technik - eine doppelt so große Winkelamplitude wie jene abtasten muss, was Probleme bei der Linearisierung bereiten könnte und außerdem die insgesamte Aufnahmegeschwindigkeit begrenzen würde, beispielsweise im Falle eines Galvanometerspiegels.
• Vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen der Beleuchtungsstrahlengang einen Strahlformer (beispielsweise eine Zylinderlinse) zum Erzeugen einer linienförmigen Verteilung des Beleuchtungslichts („Beleuchtungslinie“) aufweist. Die linienförmige Verteilung kann dabei entlang ihrer Längsrichtung intensitätsmoduliert, insbesondere periodisch intensitätsmoduliert sein. Vorzugsweise entsteht eine solche Verteilung („Lichtmuster“) im Probenraum indem der Strahlformer, der beispielsweise zu diesem Zweck einen räumlichen Lichtmodulator umfasst, simultan mindestens zwei linienförmige, miteinander interferenzfähige Lichtverteilungen erzeugt, die in einer zu einer rückwärtigen Fokusebene des Mikroskopobjektivs (BFP) optisch konjugierten Ebene vorliegen. Durch die Strukturierung längs der Beleuchtungslinie ist es möglich, die Auflösung quer zur Beleuchtungslinie zu steigern, indem Rohbilder in mehreren Phasenlagen der modulierten Lichtverteilung aufgenommen und ausgewertet werden. Vorzugsweise erzeugt der Strahlformer die Verteilung des Beleuchtungslichts so, dass sich im Probenraum eine (modulierte oder unmodulierte) Beleuchtungslinie ergibt, die durch den Detektionsstrahlengang geometrisch parallel zu den Pixelzeilen des Sensors auf diese Pixelzeilen abgebildet wird.
• Vorzugsweise kann der Strahlformer wiederholt, insbesondere motorisch und gesteuert durch die Steuereinheit, aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar sein. Dadurch kann das Mikroskop auch mit Weitfeldbeleuchtung in alternativen Betriebsmodi genutzt werden. Die wiederholte motorische Entfernbarkeit ermöglicht dabei große Flexibilität. Alternativ oder zusätzlich zur Entfernbarkeit kann der Strahlformer einen räumlichen Lichtmodulator (SLM) umfassen, insbesondere einen phasenmodulierenden SLM in einer konjugierten Pupillenebene (hintere Brennebene des Mikroskopobjektivs). Dieser kann insbesondere derart durch die Steuereinheit gesteuert werden, dass im zeitlichen Wechsel unterschiedliche Beleuchtungslichtverteilungen im Probenraum entstehen. So ist es möglich, alternativ eine unmodulierte linienförmige Beleuchtung oder, mittels mindestens zweier interferenzfähiger Lichtverteilungen in der Pupillenebene/BFP, eine modulierte linienförmige Beleuchtung im Probenraum zu erzeugen. Der Wechsel kann beispielsweise mit einer Frequenz von 50 Hz bis 100 Hz durch Umschreiben des Phasenmusters auf dem SLM sehr schnell geschehen. Mittels eines SLM wäre auch eine schnelle Umschaltung auf eine punktförmige Beleuchtung im Wechsel mit linienförmiger Beleuchtung möglich, beispielsweise zur optischen Manipulation im Wechsel mit der Beobachtung der Probe. Zweckmäßigerweise kann die erste Strahlablenkeinheit für diesen Zweck zweidimensional einstellbar sein.
• In besonders vorteilhaften Ausführungsformen ist die erste Strahlablenkeinheit zum zweidimensionalen Abtasten des Probenraums in einer ersten Dimension quer zu der Längsrichtung der linienförmigen Beleuchtungslichtverteilung und in einer zweiten Dimension parallel zu der Längsrichtung ausgebildet. Durch die Bewegung in der zweiten Dimension kann die Beleuchtungslichtverteilung mit geringem Aufwand und in kurzer Zeit in verschiedene Phasenlagen gebracht werden, um die zur Auflösungssteigerung erforderliche Anzahl unterschiedlich beleuchteter Rohbilder aufnehmen zu können. Diesem Zweck kann vorzugsweise eine Steuereinheit dienen, die die erste Strahlablenkeinheit in mindestens drei unterschiedliche Stellungen entlang der zweiten Dimension stellt, wobei zwei der resultierenden Positionen der Beleuchtungslichtverteilung im Probenraum an den Stellungen entlang der zweiten Dimension um weniger als eine Länge der Beleuchtungslichtverteilung in Längsrichtung, insbesondere um eine Periodenlänge der intensitätsmodulierten Lichtverteilung oder weniger als eine Periodenlänge, voneinander beabstandet sind, und wobei insbesondere für jede der Stellungen ein separates Rohbild erstellt wird.
• Alternativ zur Verschiebung des Lichtmusters längs zur (intensitätsmodulierten) Beleuchtungslinie kann der Beleuchtungsstrahlengang eine Optik zum Beleuchten des Probenraums in unterschiedlichen Phasenlagen der intensitätsmodulierten Beleuchtungslichtverteilung umfassen, insbesondere einen räumlichen Phasenmodulator (phasenbeeinflussender räumlicher Lichtmodulator) und/oder einen elektrooptischen Modulator in Verbindung mit einer Viertelwellenplatte. In dieser Alternative kann die erste Strahlablenkeinheit vorteilhafterweise zum nur eindimensionalen Abtasten des Probenraums quer zur Längsrichtung der linienförmigen Beleuchtungslichtverteilung ausgebildet sein. Eine nur eindimensional einstellbare Strahlablenkungseinheit ist kostengünstiger und vor allem stabiler.
• Im Vergleich zur herkömmlichen SIM-Bildaufnahme, bei der 13 oder sogar 15 Rohbilder gebraucht werden, kann ein Ergebnisbild mit nur drei Rohbildern errechnet werden. Dabei kann ein interessierender Bereich (ROI) des Probenraums zumindest in Längsrichtung der Beleuchtungslinie mittels der zweiten Dimension der ersten Strahlablenkeinheit 21 ausgewählt werden. Ein kleiner interessierender Bereich kann extrem schnell mit der Beleuchtungslinie abgetastet und aufgenommen werden.
• In allen Ausführungsformen kann der Sensor, insbesondere ein CMOS-Sensor, ein EMCCD-Sensor, ein iCCD-Sensor oder ein SPAD-Array-Sensor, eine deaktivierbare zeilenförmige elektronische Blende aufweisen, die konfokal zu dem Zwischenbild angeordnet ist. Vorzugsweise kann die elektronische Blende in Form eines entsprechend betriebenen „Rolling Shutters“ realisiert sein, beispielsweise wie in WO 2006/008637 A1 , insbesondere mit Synchronisierbarkeit oder Synchronisierung einer Einstellung der ersten Strahlablenkeinheit mit einer dynamischen Position (Bewegung) der Blende zumindest im ersten Betriebsmodus (so dass die Lage der elektronischen Blendenöffnung mit der Lage der Abbildung der Beleuchtungslinie aus dem Probenraum auf dem Sensor übereinstimmt). Die elektronische Blende erlaubt ein Unterdrücken von außerfokalem Probenlicht und damit wie eine mechanische konfokale Blende sowohl eine axiale als auch eine laterale Auflösungsverbesserung. Eine Steigerung der lateralen Auflösung (quer zur Beleuchtungslinie) ist durch die vergrößerte Abbildung mittels der zweiten Strahlablenkeinheit aber auch ohne konfokale Blende möglich. Außerfokales Licht wird auch durch die Berechnung aus mehreren Rohbildern in unterschiedlichen Beleuchtungsphasenlagen zumindest teilweise unterdrückt.
• Die Verwendung eines Sensors mit elektronischer Blende hat den Vorteil, dass eine schnelle Umschaltung zwischen konfokaler und Weitfeld-Detektion möglich ist, beispielsweise zwischen aufeinanderfolgenden Bildern.
• Zum Zwecke der Synchronisation kann der Sensor vorzugsweise über einen Lichtblatt-Auslesemodus (von Hamamatsu als „Lightsheet Readout Mode“ bezeichnet) verfügen und einen Ausgang aufweisen, an welchem eine Information über die Position und/oder Bewegung der Blende anliegt, insbesondere ein Signal, das einen Beginn eines Bildes (engl. „frame“) auf dem Sensor anzeigt. Kommerziell sind Sensoren mit einem solchen Modus und einem entsprechenden Ausgang von Hamamatsu verfügbar: https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmoscameras/lightsheet-readout-mode.html. Der Ausgang wird von Hamamatsu als „external trigger output“ bezeichnet. Zweckmäßigerweise ist die Steuereinheit elektrisch mit dem Sensor und der Strahlablenkeinheit verbunden.
• Besonders vielseitig ist ein Mikroskop, in dem die Steuereinheit elektrisch mit dem Sensor und den Strahlablenkeinheiten verbunden ist und in dem ersten wählbaren Betriebsmodus die elektronische Blende aktiviert und die Bewegungen der ersten Strahlablenkeinheit, der zweiten Strahlablenkeinheit und die Bewegung der elektronischen Blende synchronisiert und/oder in einem zweiten wählbaren Betriebsmodus die elektronische Blende aktiviert, die Bewegung der ersten Strahlablenkeinheit und die Bewegung der elektronischen Blende synchronisiert und die zweite Strahlablenkeinheit in einer konstanten Stellung, insbesondere in einer Neutralstellung, betreibt und/oder in einem dritten wählbaren Betriebsmodus die elektronische Blende deaktiviert und die zweite Strahlablenkeinheit in einer konstanten Stellung betreibt und/oder in einem vierten wählbaren Betriebsmodus die elektronische Blende deaktiviert und die erste und zweite Strahlablenkeinheit wie im ersten Betriebsmodus betreibt.
• Ein solches System kann sowohl in einem klassischen Weitfeldmodus (beispielsweise mit inkohärenter Beleuchtung über eine Lampe als Lichtquelle, deren Beleuchtungslicht beispielsweise abseits der ersten Strahlablenkeinheit, beispielsweise durch einen anderen Ausgang des Mikroskops, über das Mikroskopobjektiv in den Probenraum geführt wird) oder im Laser-Weitfeldmodus (dritter Betriebsmodus) als auch in einem konfokalen Modus (zweiter Betriebsmodus) als auch in einem Zusatz-Abtastungs-Modus (erster und vierter Betriebsmodus) arbeiten, ohne dass eine mechanische Veränderung am System notwendig wäre. Darüber hinaus sind mit dem Sensor in weiteren Betriebsmodi auch quasisimultan Phasenmessungen (beispielsweise Phasenkontrast, Differentialinterferenzkontrast, Intensitätstransportgleichung, Differentialphasenkontrast) möglich. Es ist lediglich notwendig, eine oder beide Strahlablenkeinheiten in ihrer Ruheposition (Neutralstellung) zu belassen und die elektronische Blende zu aktivieren und gegebenenfalls ihre Größe entsprechend einzustellen oder sie zu deaktivieren. Dies gelingt einfach und schnell von der Steuereinheit aus, beispielsweise per Software. Das ermöglicht die Realisierung von Messaufgaben, die mit einem herkömmlichen „Re-Scan“-System nicht möglich wären. Insbesondere bei multimodalen Aufnahmen derselben Probe ist die mehrfache Nutzung desselben Sensors in der Regel vorteilhaft, da die Daten aus den verschiedenen Messungen dann bereits pixelgenau aufeinander ausgerichtet sind. Außerdem ist der Kostenaufwand gering, weil für die unterschiedlichen Verfahren nur ein Sensor benötigt wird.
• Eine vorteilhafte Option kann deshalb darin bestehen, dass die Steuereinheit in dem dritten Betriebsmodus den Strahlformer aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt und/oder in dem zweiten Betriebsmodus eine Intensitätsmodulation des Beleuchtungslichts deaktivierbar oder deaktiviert ist (so dass im Probenraum eine unmodulierte Beleuchtungslinie entsteht) und/oder die Steuereinheit eine Auswahleinheit zur Auswahl eines von mehreren Betriebsmodi umfasst und die Steuereinheit das Mikroskop nach der Auswahl in dem ausgewählten Betriebsmodus betreibt, insbesondere mit einer zusätzlichen Auswahlmöglichkeit in der Auswahleinheit zwischen mehreren Untermodi mit jeweils unterschiedlichen Lichtquellen, insbesondere für den dritten Betriebsmodus. Das ermöglicht eine flexible, kostengünstige Nutzung mit geringem Bedienaufwand.
• Vorteilhaft kompakt und lichteffizient ist ein Mikroskop, in dem der Detektionsstrahlengang zwischen dem von der Tubuslinse erzeugten Zwischenbild und der Detektionsoptik frei ist von konfokalen Feldblenden, insbesondere von Schlitzblenden, und insbesondere frei ist von mit dem Zwischenbild konjugierten Bildebenen und/oder in dem der Detektionsstrahlengang zwischen dem von der Tubuslinse erzeugten Zwischenbild und der Detektionsoptik genau eine zur rückwärtigen Brennebene des Mikroskopobjektivs konjugierte Ebene aufweist.
• Besonders kompakt und lichteffizient kann ein Mikroskop gebaut werden, indem der gemeinsame Strahlengang optisch zwischen dem Zwischenbild und dem Strahlteiler eine Optik, vorzugsweise eine Abtastoptik (engl. „scan lens“), zum Erzeugen einer zur rückwärtigen Brennebene des Mikroskopobjektivs konjugierten Ebene auf oder in der Nähe der ersten Strahlablenkeinheit und auf oder in der Nähe der zweiten Strahlablenkeinheit aufweist. Dadurch ist zum einen der Strahlteiler in kollimiertem Licht angeordnet, so dass eventuelle Verschmutzungen nur geringen Einfluss auf seine Übertragungsqualität haben. Zum anderen kann auf diese Weise eine kompakte Kopplung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang erfolgen, ohne dass es - wie im Stand der Technik - einer zusätzlichen Kollimierung bedürfte. Insbesondere kann dadurch auf eine zusätzliche Relaisoptik verzichtet werden.
• Besonders vorteilhaft kann hier die konjugierte Ebene (Pupillenebene) durch Reflexion am Strahlteiler entstehen, so dass die erste Strahlablenkeinheit in oder in der Nähe der reflektierten konjugierten Ebene liegt, insbesondere mit Transmission der konjugierten Pupillenebene in den Detektionsstrahlengang auf oder in die Nähe der zweiten Strahlablenkeinheit, so dass die zweite Strahlablenkeinheit in oder in der Nähe der transmittierten konjugierten Ebene liegt. Auf diese Weise wird keine zusätzliche Optik im Detektionsstrahlengang benötigt, was die Anzahl der optischen Grenzflächen minimal hält und dadurch die Lichtempfindlichkeit der Detektion maximiert. Die Transmission in den Detektionsstrahlengang führt (gegenüber einer Anordnung in Reflexion) zu einer besseren Auslöschung des Anregungslichtes, so dass am Detektor ein verbesserter Kontrast von Messsignal zu Anregungssignal erreicht wird.
• Vorzugsweise verlaufen sowohl das Beleuchtungslicht auf seinem Weg zum Mikroskopobjektiv als auch das Probenlicht auf seinem Weg zum Sensor durch dasselbe von der Tubuslinse erzeugte Zwischenbild. Dabei kann der Strahlteiler als Hauptstrahlteiler oder Hauptfarbteiler optisch zwischen der ersten Strahlablenkeinheit und dem von der Tubuslinse erzeugten Zwischenbild angeordnet sein.
• Durch die gemeinsame Nutzung desselben Zwischenbilds für Beleuchtung und Detektion wird vorteilhafterweise nur ein einzelner optischer Anschluss (engl. „port“) des Mikroskops belegt. Eventuelle weitere Ausgänge stehen für andere Nutzungen zur Verfügung, so dass das Mikroskop eine noch größere Flexibilität aufweist. Insbesondere kann die schnelle quasikonfokale Mikroskopie mit anderen Methoden, welche einen eigenen Ausgang benötigen, in multimodaler Weise kombiniert werden. Die erfindungsgemäße Anordnung aus Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang, jeweils bis zum bzw. ab dem Zwischenbild, oder nur aus dem Detektionsstrahlengang vom Zwischenbild bis zum Sensor kann dadurch vorteilhafterweise in einem einzelnen Modul integriert werden, was den Herstellungs- und Installationsaufwand verringert und eine kompaktere und stabilere Bauweise ermöglicht, wobei im Falle des kombinierten Moduls mit Beleuchtungs- und Strahlengang die eigentliche Lichtquelle außerhalb des Moduls angeordnet und optisch mit diesem verbindbar oder verbunden sein kann, beispielsweise mittels Lichtleitfaser(n) oder Freistrahleinkopplung in das Modul. Gegenüber Lichtblattmikroskopen wird zudem nur eine einzelne Beleuchtungsoptik in Form des Mikroskopobjektivs benötigt.
• Alternativ kann das Mikroskop eine zweite Tubuslinse aufweisen, welche ein zweites Zwischenbild erzeugt, wobei das Beleuchtungslicht auf seinem Weg zum Mikroskopobjektiv durch das zweite Zwischenbild (beispielsweise an einem zweiten optischen Anschluss des Mikroskops) verläuft. So kann beispielsweise ein vorhandenes Laser-Scanning-Modul zur Beleuchtung genutzt werden. An das erste Zwischenbild am ersten Anschluss des Mikroskops wird dann beispielsweise nur der Detektionsstrahlengang als eigenes Modul angebunden.
• In einer möglichen Ausführungsform kann der Detektionsstrahlengang zwischen dem Strahlteiler und der Detektionsoptik einen Nebenfarbteiler aufweisen, welcher das Probenlicht in zwei spektral disjunkte Anteile aufteilt und diese auf disjunkte Bereiche des Sensors oder auf einen jeweiligen Sensor leitet (beispielsweise wie in DE 10 2021 134 427 A1 oder in DE 10 2023 005 252 A1 ), und der Beleuchtungsstrahlengang kann eine zweite Lichtquelle mit einer anderen Emissionswellenlänge als die erste Lichtquelle aufweisen. Auf diese Weise können simultan zwei zu den Emissionswellenlängen gehörende Spektralbereiche, insbesondere von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, aufgenommen werden. Die erste und die zweite Lichtquelle können dieselbe Lichtquelle sein, beispielsweise in Form eines Multilinien-Lasers oder einer Breitbandlichtquelle, insbesondere einer Weißlichtquelle. Die beiden Farben können zur präzisen Strukturierung vorteilhafterweise auf der ersten Stahlablenkeinheit aufeinander liegen, wobei die Gitterkonstanten des Beleuchtungsmusters in der Probe identisch sind.
• Vorteilhafterweise umfasst die erste Strahlablenkeinheit MEMS-Mikrospiegel, insbesondere kontinuierlich um zwei orthogonale Raumrichtungen verstellbare MEMS-Mikrospiegel. Dadurch kann ein Modul (mit Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang, jeweils bis zum Zwischenbild oder nur dem Detektionsstrahlengang ab dem Zwischenbild) kompakt, leise und kostengünstig bereitgestellt werden. Zweidimensional verstellbare MEMS-Scanner haben zudem den Vorteil, dass der Ablenkspiegel immer in der optischen Pupille/BFP liegt, was die Genauigkeit der Platzierung des Beleuchtungsfokusvolumens optimiert. Die zweite Achse kann insbesondere mitgenutzt werden, um die Beleuchtungslinie entlang ihrer Längsrichtung zu verschieben, um die verschiedenen Beleuchtungsphasenlagen einer strukturierten Beleuchtung zu erzeugen. Weiterhin kann damit der Ausleuchtungsbereich definiert und/oder eine längere (modulierte oder unmodulierte) oder homogenere (unmodulierte) Linie erzeugt werden. Außerdem kann die zweite Achse genutzt werden, um entlang der Beleuchtungslinie sehr kleine Bewegungen zu erzeugen, die die Linienbeleuchtung homogenisieren (ohne SIM-Modus). Schließlich ist damit auch eine gute Bildfeldausleuchtung garantiert, wenn mit über die erste Strahlablenkeinheit die Probe optisch manipuliert wird.
• Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen das Mikroskop ein Stativ aufweist, an welchem das Mikroskopobjektiv, insbesondere in einem Objektivrevolver, angeordnet ist, wobei das Stativ einen ersten Anschluss, in dessen Bereich die Tubuslinse und das Zwischenbild angeordnet sind, und mindestens einen weiteren Anschlussmit einer weiteren Tubuslinse und einem weiteren Zwischenbild aufweist, wobei das Probenlicht mittels mindestens eines zweiten Strahlteilers, insbesondere eines wiederholt entfernbaren Strahlteilers, oder mittels eines Spiegels simultan oder sequentiell zu beiden Ausgängen leitbar ist, wobei der erste Strahlteiler, die Detektionsoptik, der Sensor, die erste und die zweite Strahlablenkeinheit und eine Abtastoptik innerhalb eines Moduls angeordnet sind, welches mit einem der Anschlüsse lösbar mechanisch und optisch verbunden ist. So kann ein flexibel nutzbares Mikroskopsystem mit hoher Lichtempfindlichkeit bei kurzer Aufnahmedauer bereitgestellt werden.
• Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
• In den Zeichnungen zeigen:
• 1 ein Mikroskop,
• 2 die optischen Verhältnisse in dem Mikroskop,
• 3 ein alternatives Mikroskop und
• 4 Prinzipien des Steuer- und Synchronisationsregimes.
• In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.
• 1 zeigt in schematischer Darstellung ein Mikroskop 1. Es besteht aus einem Stativ 2, einem „Add-Scan“-Modul 3 und einem Lasermodul 4. Das Stativ 2 weist ein beispielsweise telezentrisches Mikroskopobjektiv 5 mit Tubuslinsen 6 auf, die im Bereich zweier Ausgänge 7/7' jeweils ein Zwischenbild ZB erzeugen. Das Mikroskopobjektiv 5 ist an einem nicht eigenständig dargestellten Objektivrevolver angeordnet. Das Stativ weist zudem einschwenkbare Strahlteiler 9 auf, beispielsweise Neutralteiler oder Farbteiler, um selektiv konfigurierbar Licht anteilig zu den Ausgängen und/oder zum Okular 10 und/oder Licht von einer Lampe 11 zum Mikroskopobjektiv 5 und von dort in den Probenraum P zu leiten. Im Probenraum liegt die Probe auf einem der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellten, motorisch dreidimensional verfahrbaren Tisch (engl. „stage“).
• Das Lasermodul 4 umfasst rein beispielhaft vier Laser 12 mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen, deren jeweilige Intensität mittels eines jeweiligen AOTF 13 einstellbar ist. Alternativ (nicht abgebildet) können einer oder mehrere der Laser direkt modulierbar sein. Ihr Beleuchtungslicht wird über Einkoppeloptiken 14 in Lichtleitfasern 15 eingekoppelt und zum Scanmodul 3 geleitet, wo es mittels beispielsweise längsverschieblicher Kollimatoren 16 kollimiert wird. Die Kollimatoren 16 können zur Kompensation von Farblängsfehlern und/oder zur Fokussierung des Beleuchtungslichts in unterschiedliche Tiefen des Probenraums P dienen. Alternativ (nicht abgebildet) können die unterschiedlichen Emissionswellenlängen beispielsweise schon im Lasermodul vereinigt werden, so dass nur eine einzelne Lichtleitfaser 15 benötigt wird und auf Kollimatoren 16 verzichtet werden kann. Über einen Spiegel 17 und einen Strahlvereiniger 18 gelangt das derart vereinigte Beleuchtungslicht zu einem Umlenkspiegel 19, welcher das Beleuchtungslicht so ablenkt, dass es, nachdem es einen Strahlformer 20, der beispielsweise einen phasenmodifizierenden räumlichen Lichtmodulator (SLM) und eine Zylinderlinse umfasst, passiert hat, auf die erste Strahlablenkeinheit 21, beispielsweise ein kontinuierlich zweidimensional einstellbares mikroelektromechanisches System (MEMS) mit Mikrospiegeln, fällt. Vom Strahlteiler 22 gelangt das Beleuchtungslicht über die Abtastoptik 23, das Zwischenbild ZB und eine der Tubuslinsen 6 zum Mikroskopobjektiv 5 und von dort in den Probenraum P. Da der Strahlformer 20 das Beleuchtungslicht in einer Dimension in die auf der Strahlablenkeinheit 21 liegende, mit der Pupille des Mikroskopobjektivs 5 konjugierte Ebene fokussiert, resultiert im Probenraum ein im Grundsatz linienförmiges Beleuchtungsfokusvolumen (Beleuchtungslinie). Mittels des SLM kann das Beleuchtungslicht so modifiziert werden, dass es auf der ersten Strahlablenkeinheit, die in der konjugierten Pupillenebene PE' angeordnet ist, zwei separate Punkte oder echt parallele Linien bildet, die im Probenraum so interferieren, dass das Beleuchtungsfokusvolumen entlang seiner längeren Ausdehnung (Längsrichtung der Beleuchtungslinie) mit einem periodisches Intensitätsmuster beleuchtet wird.
• Probenlicht, insbesondere auch in der Probe durch das Beleuchtungslicht im Grundsatz linienförmig angeregte Fluoreszenz, gelangt auf dem umgekehrten Weg über das Zwischenbild ZB bis zum Strahlteiler 22. Der in der Probe und unterwegs dorthin reflektierte Anteil des Beleuchtungslichts wird durch den Strahlteiler 22, der beispielsweise als dichroitischer Kerbfilter (engl. „notch filter“) ausgestaltet ist und damit als Hauptfarbteiler wirkt, zurück zur ersten Strahlablenkeinheit 21 reflektiert. Im Probenlicht enthaltene Fluoreszenz wird, insbesondere aufgrund der Stokes-Verschiebung, durch den Strahlteiler 22 zur zweiten Strahlablenkeinheit 24, beispielsweise einem nur eindimensional kontinuierlich einstellbaren MEMS-Spiegel oder einem Galvanometerspiegel, transmittiert. Die das Probenlicht kollimierende erste Abtastoptik 23 ist so ausgebildet, dass einerseits auf der ersten Strahlablenkeinheit 21 und andererseits auf der zweiten Strahlablenkeinheit 24 eine zur Pupille PE des Mikroskopobjektivs 5 konjugierte Ebene PE'' liegt. Hinter der zweiten Strahlablenkeinheit 24 wird das Probenlicht durch eine Detektionsoptik 25 auf den zweidimensional ortsauflösenden Sensor 28, beispielsweise ein CMOS-Chip oder eine Matrix von einzelphotonenzählenden Lawinenphotodioden (SPAD-Array), fokussiert. In der Neutralstellung (Nullstellung) der zweiten Strahlablenkeinheit 24 fallen die optischen Achsen des Mikroskopobjektivs 5 und der Detektionsoptik 25 aufeinander. Der Sensor 28 weist eine elektronische Schlitzblende in Form eines „Rolling Shutters“ auf, deren Schlitzbreite einstellbar ist und die vollständig deaktivierbar ist. Die Beleuchtungslinie im Probenraum ist so ausgerichtet, dass sie parallel zu den Pixelzeilen des Sensors 28 (und damit parallel zur elektronischen Schlitzblende) auf diesen abgebildet wird.
• Eine Steuereinheit 29 mit einer Auswahleinheit 30 für beispielsweise vier unterschiedliche Betriebsmodi (mit weiteren Untermodi) ist elektrisch mit dem Stativ 2, dem „Add-Scan“-Modul 3 und dem Lasermodul 4 verbunden. Sie steuert einerseits die darin enthaltenen mechanischen und optischen Komponenten, andererseits empfängt sie Messwerte von den enthaltenen Sensoren, insbesondere vom Sensor 28.
• Wählt der Benutzer den ersten Betriebsmodus („Add-Scan-Modus“) aus, aktiviert die die Steuereinheit 29 die elektronische Blende des Sensors 28 und bewegt das aus dem Probenraum kommende Probenlichtbündel mittels der zweiten Strahlablenkeinheit 24 so über den Sensor 28, dass das Zwischenbild ZB in Bewegungsrichtung vergrößert auf den Sensor 28 abgebildet wird, wobei sie die Bewegung der zweiten Strahlablenkeinheit 24 mit der Bewegung der ersten Strahlablenkeinheit 21 synchronisiert und beide mit beispielsweise identischer Winkelamplitude bewegt. Die Bewegung der Strahlablenkeinheiten 21, 24 wird von der Steuereinheit 29 zudem mit der Bewegung der elektronischen Schlitzblende des Sensors 28 synchronisiert, so dass diese als konfokale Blende wirkt und das Beleuchtungsfokusvolumen in die Schlitzblendenöffnung abgebildet wird.
• Das auf der zweiten Strahlablenkeinheit 24 eintreffende Probenlicht weist dabei bereits einen vom Ursprungsort im Probenraum abhängigen Einfallswinkel (bezogen auf die optische Achse des Mikroskopobjektivs 5) auf. Die Synchronisation der ersten Strahlablenkeinheit 21 und der zweiten Strahlablenkeinheit 24 verstärkt diesen Effekt. Durch die identische Amplitude und die gewählte gleichphasige Schwingungsrichtung weist das von der zweiten Strahlablenkeinheit 24 reflektierte Probenlicht einen doppelt so großen Winkel bezogen auf die optische Achse der Detektionsoptik 25 auf. In einem herkömmlichen System betrüge dieser Winkel wegen des dortigen Enttastens Null, das Probenlichtbündel würde ruhen.
• Aus der Vergrößerung des Winkels resultiert eine eindimensionale Vergrößerung quer zur Beleuchtungslinie, im Falle einer Verdopplung durch identische Amplituden der Strahlablenkeinheiten 21/24 eine „nichtoptische“ anisotrope Vergrößerung um den Faktor M_mech=2, die zu einer eventuellen rein optischen (typischerweise isotropen) Vergrößerung M_opt durch die Detektionsoptik 25 in Verbindung mit der Abtastoptik 23 hinzukommt. Das führt einerseits zu einer entsprechenden Verbreiterung der Punktabbildungsfunktion (PSF), andererseits aber auch dazu, dass der Abstand zweier auf den Sensor 28 abgebildeter Punkte des Probenraums auf dem Sensor 28 stärker vergrößert wird als die Breite der PSF zunimmt, was einem „Re-Assignment“ oder „Re-Scanning“ entspricht. Das am Sensor 28 aufgenommene Bild muss in der Richtung quer zur Beleuchtungslinie eindimensional um den Faktor M_mech gestaucht (rückprojiziert) werden, um die Proportionen des Probenraums korrekt wiederzugeben. Da die abgebildeten Punkte stärker gespreizt wurden als die PSF verbreitert war, verbleibt trotz der Stauchung in der Querrichtung eine bessere Auflösung als in einer vergleichbaren beugungsbegrenzten Weitfeldabbildung - unmittelbar optisch-mechanisch ohne komplexe Rekonstruktionsberechnungen. Die Auflösung in Längsrichtung der Beleuchtungslinie wird hingegen insoweit nicht beeinflusst.
• Die zweite Strahlablenkeinheit 24 wirkt in der Richtung quer zur Beleuchtungslinie folgendermaßen. Die Abbildung B eines fluoreszierenden Objektes O(x_O, y_O) im Probenraum in der objektseitigen Brennebene des Mikroskopobjektivs auf den Sensor 28 kann mit einer Faltung beschrieben werden, wobei die optische Vergrößerung ohne Beschränkung der Allgemeinheit als M_opt=1 angenommen werden kann: $$B\left(x_D,y_D\right)={\displaystyle \int d{x}_O}{H}_{em}\left(x_D-x_O,y_D-y_O\right)O\left(x_O,y_O\right)$$
• Hierbei ist H_em(x_D - x_O, y_D - y_O) die Intensitätspunktabbildungsfunktion für die Abbildung von Objekten in der Objektebene in die Detektionsebene auf dem Sensor 28. Die Koordinaten mit dem Index O beschreiben den Probenraum, die Koordinaten mit dem Index D den Bildraum auf dem Sensor 28.
• Das Abtasten des Objektes Ô(x_O, y_O) mit der fluoreszenzanregenden Beleuchtungslinie am Ort x_O/y_O führt dann zu: $$O\left(x_O,y_O\right)=\widehat{O}\left(x_O,y_O\right)H_{ex}\left(x_O-x_S\right),$$
• Einsetzen in Gleichung (1) ergibt: $$B\left(x_D,y_D,x_S\right)={\displaystyle \int d{x}_O{x}_S}{H}_{em}\left(x_D-x_O,y_D-y_O\right)\widehat{O}\left(x_O,y_O\right)H_{ex}\left(x_O-x_S\right)$$
• Mit der Integration über den Abtastvektor x_S quer zur Längsrichtung der Beleuchtungslinie resultiert ein Weitfeldbild. Unter Hinzunahme der eindimensional konfokalen elektronischen Blende D(x), ebenfalls an der Stelle x_S, ergibt sich: $$\begin{array}{l}B\left(x_D,y_D,x_S\right)={\displaystyle \int d{x}_O{x}_S}{H}_{em}\left(x_D-x_O,y_D-y_O\right)\widehat{O}\left(x_O,y_O\right)H_{ex}\left(x_O-x_S\right)D(x_D\\ -x_S)\end{array}$$
• Anhand dieser Gleichungen kann hergeleitet werden, dass die PSF dadurch gekennzeichnet ist, dass in der Längsrichtung der Beleuchtungslinie eine Bildgebung wie im Weitfeldfall vorliegt, während in der Richtung der Wirkung der konfokalen elektronischen Blende (also quer zur Beleuchtungslinie) das Punktbild einer Faltung der Anregungs-PSF mit der Spaltfunktion D entspricht: $$H_{conf}\left(x_D,y_D\right)=H_{em}\left(x_D,y_D\right)\left[H_{ex}\left(x_D,y_D\right){\otimes }_{x_D}D\left(x_D\right)\right]$$
• Für eine Konfokalblende mit D(x) = δ(x) folgt auch hier wieder die vollkonfokale PSF, während bei einer offenen Blende mit D(x) ≡ 1 die Faltung eine Konstante ergibt und das Bild des Punktemitters der Emissions-PSF entspricht.
• Um die Gleichungen kompakt zu halten, wird nachfolgend die Bildgebung für den Fall der zweiten Strahlablenkeinheit 24 nur in der betroffenen Variable dargestellt. Entlang der Richtung y_D längs der Beleuchtungslinie (und längs der durch die jeweilige Sensorzeile gebildeten elektronischen Blende) kann das Punktbild weiterhin durch eine Weitfeldbildgebung beschrieben werden.
• Die zweite Strahlablenkeinheit 24 führt zu einer Verschiebung der Detektions-PSF um einen zweiten Abtastvektor $x_s^{\text{'}}:$ $$B\left(x_D,x_S,x_S^{\text{'}}\right)={\displaystyle \int d{x}_O}{H}_{ex}\left(x_S-x_O\right)H_{em}\left(x_D-x_S^{\text{'}}-x_O\right)\widehat{O}\left(x_O\right)$$ Die zweite Strahlablenkeinheit 24 wird im ersten (und vierten) Betriebsmodus mit der ersten Strahlablenkeinheit 21 gemäß $x_s^{\text{'}}=\left(M_{mech}-1\right)x_s$ synchronisiert. Der Fall M_mech =1 beschreibt eine ruhenden zweite Strahlablenkeinheit 24, während M_mech = 2 bedeutet, dass die zweite Strahlablenkeinheit 24 mit der gleichen Winkelamplitude und optisch gleichsinnig mit der ersten Strahlablenkeinheit 21, welche die Beleuchtungslinie durch den Probenraum bewegt, schwingt. Für M_mech = 0 kompensiert die zweite Strahlablenkeinheit 24 die Wirkung der ersten Strahlablenkeinheit 21.
• Die effektive Intensitäts-PSF ist gegeben durch: $$H_{eff}\left(x_D\right)={\displaystyle \int d{x}_S}{H}_{ex}\left(x_S\right)H_{em}\left(x_D-\left(M_{mech}-1\right)x_S\right)$$
• Damit ergibt sich schließlich für M_mech = 2: $$H_{eff}\left(x_O\right)=H_{ex}\left(2x_O\right)\otimes H_{em}\left(2x_O\right),$$ was insbesondere für η=2 mit Gleichung S9 bei Shen et al., in Advanced Photonics Nexus 2023, Bd. 2 (1), S. 016009-1, Supplementary Information, übereinstimmt. Zudem stimmt dieses Resultat überein mit Formel 3 bei C. J. R. Sheppard: „Superresolution in Confocal Imaging" in Optik 1988, Bd. 80, S. 53. Dies gibt einen Hinweis auf die, auch explizit nachweisbare, mathematische Verwandtschaft zum sogenannten Image Scanning.
• Verallgemeinert auf den zweidimensionalen Fall gilt: $$H_{eff}\left(x,y\right)=H_{ex}\left(2x\right){\otimes }_x{H}_{em}\left(2x,y\right)$$
• Zur Auflösungssteigerung in der Längsrichtung der Beleuchtungslinie kann die zusätzliche strukturierte Beleuchtung (durch Intensitätsmodulation längs der Linie) dienen. Die Steuereinheit 29 stellt die erste Strahlablenkeinheit 21 in mindestens drei unterschiedliche Stellungen entlang der Längsrichtung der Beleuchtungslinie, so dass benachbarte resultierende Positionen (Phasenlagen) im Probenraum um weniger als eine Periodenlänge der intensitätsmodulierten Lichtverteilung voneinander beabstandet sind und erstellt für jede der Stellungen ein separates Rohbild des Probenraums. Zweckmäßigerweise wird der interessierende Bereich des Probenraums für jede dieser Phasenlagen des Beleuchtungsmusters zunächst vollständig abgetastet und ein jeweiliges Rohbild mit eindimensional (quer zur Linie) erhöhter Auflösung erstellt. Dieser Ablauf wird mit der zweiten Phasenlage und mit der dritten Phasenlage jeweils wiederholt. Aus den drei Rohbildern wird dann gemäß dem SIM-Verfahren ein Ergebnisbild mit erhöhter Auflösung errechnet. Die oben beschriebene Stauchung um M_mech quer zur Beleuchtungslinie zur Rückprojektion kann dabei vor oder nach der SIM-Rekonstruktion (beispielsweise umfassend Transformieren der Rohbilder in den Frequenzraum, Separieren von Ordnungs-Raumfrequenzspektren und Verschieben der Ordnungs-Raumfrequenzspektren im Frequenzraum sowie Rücktransformieren in den Ortsraum, siehe beispielsweise Shen et al., in Advanced Photonics Nexus 2023, Bd. 2 (1), S. 016009-1, Abschnitte 2.1 und 2.2) erfolgen, weil die Strukturierung längs der Beleuchtungslinie und die Rekonstruktion der erhöhten Auflösung in dieser Richtung unabhängig von der Zusatz-Abtastung quer zur Beleuchtungslinie ist. Vor der superauflösenden SIM-Rekonstruktion können die Rohbilder, vorzugsweise im Frequenzraum nach Fouriertransformation, hochpassgefiltert werden, um im Sinne einer OS-SIM-Behandlung (Neil et al.: „Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope" in Optics Letters 1997, Bd. 22, Nr. 24, S. 1905) durch optisches Schneiden außerfokalen Untergrund zu verringern. Die Steuereinheit kann eingerichtet sein, das Ergebnisbild mit erhöhter Auflösung zu berechnen, insbesondere gemäß der vorgenannten Schritte.
• Unter Kombination der Strukturierung der Beleuchtungslinie für eine 2D-SIM-Beleuchtung entlang der Längsrichtung der Linie (und der elektronischen Pixelzeilenblende) und der Zusatzabtastung mit M_mech=2 resultiert die effektive PSF: $$\begin{array}{l}{H}_{eff}\left(x,y\right)\\ =\left(1+\text{cos}\left(kNAy\right)\right){\displaystyle \int fz}{\left(\frac{2J_1\left(kNA\sqrt{\left(4z^2+y^2\right)}\right)}{kNA\sqrt{(4z^2+y^2}}\right)}^2{\left(\frac{\text{sin}\left(kNA2\left(x-z\right)\right)}{kNA2\left(x-z\right)}\right)}^2\end{array}$$
• Diese PSF kann insbesondere für eine die Auflösung weiter verbessernde Entfaltung verwendet werden.
• Wählt der Benutzer den zweiten Betriebsmodus, aktiviert die Steuereinheit 29 die elektronische Blende, synchronisiert die Bewegung der ersten Strahlablenkeinheit 21 und die Bewegung der elektronischen Blende, hält aber die zweite Strahlablenkeinheit 24 konstant in ihrer Neutralstellung und deaktiviert die Intensitätsmodulation. Dieser Modus erlaubt Bildaufnahmen wie mit einem herkömmlichen linienabtastenden konfokalen Mikroskop. Im dritten Betriebsmodus deaktiviert die Steuereinheit 29 die elektronische Blende und hält die zweite Strahlablenkeinheit 24 ebenfalls in ihrer Neutralstellung. Damit sind herkömmliche Weitfeldbildaufnahmen möglich. Der Benutzer kann hierbei alternativ zu den Lasern 12 die Lampe 11 als Weitfeldlichtquelle verwenden.
• In einem vierten wählbaren Betriebsmodus deaktiviert die Steuereinheit 29 die elektronische Blende und betreibt die erste und zweite Strahlablenkeinheit 21, 24 wie im ersten Betriebsmodus. Dieser Modus erlaubt die Nutzung des „Add-Scan“-Verfahrens mit geringerer Unterdrückung des außerfokalen Lichts. Auch die Errechnung des Ergebnisbildes aus den strukturierten Rohbildern unterdrückt jedoch außerfokales Lichts zu einem gewissen Grad. Da eine Blende nicht zwingend nötig ist, kann auch ein Sensor 28 ohne eine solche eingesetzt werden.
• In 2 sind beispielhafte optische Verhältnisse durch die Brennweite f₁ der Abtastoptik 23 und die die Brennweite f₂ der Detektionsoptik 25 dargestellt. Sowohl die erste Strahlablenkeinheit 21 als auch die zweite Strahlablenkeinheit 24 sind dabei in identischer Entfernung d vom Strahlteiler 22 angeordnet, so dass beide in einer jeweiligen konjugierten Pupillenebene PE' bzw. PE'' liegen. Das Verhältnis der Brennweiten M_opt=f₂/f₁ beschreibt die optische Vergrößerung des Zwischenbildes ZB auf dem Sensor 28. Hinzu kommt die eindimensionale mechanische Vergrößerung M_mech durch die Bewegung der zweiten Strahlablenkeinheit 24, welche sich bei zur ersten Strahlablenkeinheit 21 synchroner, gleichphasiger Bewegung aus dem Verhältnis der Winkelamplituden α₁ der ersten Strahlablenkeinheit 21 und α₂ der zweiten Strahlablenkeinheit 24 als M_mech (α₁+α₂)/α₁ ergibt. Dargestellt ist als Schnitt A-A auch die Wirkung des Strahlformers 20 auf das Beleuchtungsmuster mit der Intensitätsverteilung I_PE(x,y) in der beleuchtungsseitigen konjugierten Pupillenebene PE' im ersten Betriebsmodus. Es besteht aus zwei separaten, parallelen Linien, die durch die von der Abtastoptik 23 bewirkte Fouriertransformation im Zwischenbild ZB zu einem Liniengitter mit der Intensitätsverteilung I_ZB(x,y) interferieren, welches durch die Tubuslinse 6 und das Mikroskopobjektiv 5 in den Probenraum übertragen wird. Durch einen Doppelpfeil ist die Bewegung des Liniengitters in x_ZB-Richtung zum Abtasten der Probe mittels der ersten Strahlablenkeinheit 21 angedeutet. Die unterschiedlichen Beleuchtungsphasen werden durch Verstellen der ersten Strahlablenkeinheit 21 derart erreicht, dass das Liniengitter in y_ZB-Richtung versetzt ist, vorzugsweise um weniger als eine Periode des Liniengitters.
• 3 zeigt eine alternative Ausführungsform, in welchem der Beleuchtungsstrahlengang durch ein separates Laser-Scanning-Modul 31 bereitgestellt wird. Dieses verfügt neben dem Strahlformer 20 und der ersten Strahlablenkeinheit 21 über eine eigene Abtastoptik 32, einen Hauptstrahlteiler 33, eine Schlitzblende 34 und einen Zeilendetektor 35. Das Modul 31 stellt eine linienförmige Lichtverteilung im Probenraum wie in 1 bereit. Das „Add-Scan“-Modul 3 umfasst hier nur Teile des Detektionsstrahlengangs (vom Zwischenbild ZB bis zu den Sensoren 28). Es weist zwischen dem Strahlteiler 22 und der Detektionsoptik 25 einen Nebenfarbteiler 26 auf, der das Probenlicht in zwei spektral disjunkte Anteile aufteilt und diese einen jeweiligen Sensor 28, 28' leitet. Die Steuereinheit 29 schaltet beispielsweise zwei Laser 12 mit unterschiedlichen Emissionswellenlänge ein, um zwei Fluoreszenzfarbstoffe simultan aufnehmen zu können. Da der Strahlteiler 22 zweckmäßigerweise wie in 1 als Farbteiler ausgebildet ist, kann der Zeilendetektor 35 in diesem Betriebsmodus nicht verwendet werden, weil kein Probenlicht zu ihm gelangt (sondern in des „Add-Scan“-Modul geleitet wird).
• 4 stellt die Verbindungen und Aufgaben der Steuereinheit 29 und die Synchronisierung im ersten Betriebsmodus schematisch dar. So sind beispielsweise die Strahlablenkeinheiten 21, 24 mit dem Sensor 28 synchronisiert. Die Steuereinheit 29 kann den Vergrößerungsfaktor M einstellen, indem sie das Verhältnis der Amplituden der Strahlablenkeinheiten 21, 24 ändert. Auch kann über die Steuereinheit 29 der Probentisch verfahren oder eines mehrerer Mikroskopobjektive 5 aus dem Objektivrevolver ausgewählt werden.
• Bezugszeichenliste

1

Mikroskop

2

Stativ

3

„Add-Scan“-Modul

4

Lasermodul

5

Mikroskopobjektiv

6

Tubuslinsen

7

Ausgang

8

 

9

Strahlteiler

10

Okular

11

Lampe

12

Laser

13

AOTF

14

Einkoppeloptik

15

Lichtleitfaser

16

Kollimator

17

Spiegel

18

Strahlvereiniger

19

Umlenkspiegel

20

Strahlformer

21

Erste Strahlablenkeinheit

22

Hauptstrahlteiler

23

Abtastoptik

24

Zweite Strahlablenkeinheit

25

Detektionsoptik

26

Nebenfarbteiler

27

 

28

Sensor

29

Steuereinheit

30

Auswahleinheit

31

Laser-Scanning-Modul

32

Abtastoptik

33

Hauptstrahlteiler

34

Schlitzblende

35

Zeilendetektor

P

Probenraum

ZB

Zwischenbild

PE

Pupillenebene

PE'(')

Konjugierte Pupillenebene

• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
• Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
• Zitierte Patentliteratur
• DE 197 02 753 A1 [0002]
• EP 1 617 258 A1 [0003]
• WO 2006/008637 A1 [0021]
• DE 10 2021 134 427 A1 [0033]
• DE 10 2023 005 252 A1 [0033]
• Zitierte Nicht-Patentliteratur
• Shen et al.: „Confocal rescan structured illumination microscopy for real-time deep tissue imaging with superresolution“ in Advanced Photonics Nexus 2023, Bd. 2 (1), S. 016009-1 [0005]
• Shen et al., in Advanced Photonics Nexus 2023, Bd. 2 (1), S. 016009-1 [0056]
• C. J. R. Sheppard: „Superresolution in Confocal Imaging“ in Optik 1988, Bd. 80, S. 53 [0056]
• Shen et al., in Advanced Photonics Nexus 2023, Bd. 2 (1), S. 016009-1, Abschnitte 2.1 und 2.2 [0058]
• Neil et al.: „Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope“ in Optics Letters 1997, Bd. 22, Nr. 24, S. 1905 [0058]

Claims (16)

1. Mikroskop (1) mit einem Beleuchtungsstrahlengang, einem Detektionsstrahlengang, einem Strahlteiler (22), wobei der Detektionsstrahlengang einen Probenraum (P), ein Mikroskopobjektiv (5), eine Tubuslinse (6), ein durch die Tubuslinse (6) erzeugtes Zwischenbild (ZB) und einen zweidimensional ortsauflösenden optoelektronischen Sensor (28) mit einer Detektionsoptik (25) zum Abbilden des Zwischenbilds (ZB) auf den Sensor (28) aufweist und der Beleuchtungsstrahlengang eine Lichtquelle (12) und eine erste einstellbare Strahlablenkeinheit (21) zum Bewegen eines Beleuchtungslichtbündels durch den Probenraum (P) aufweist und der Detektionsstrahlengang eine zweite einstellbare Strahlablenkeinheit (24) zum Bewegen eines Probenlichtbündels über den Sensor aufweist, wobei der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang mittels des Strahlteilers (22) optisch derart zu einem gemeinsamen Strahlengang gekoppelt sind, dass Beleuchtungslicht von der Lichtquelle (12) über den Strahlteiler (22) durch das Mikroskopobjektiv (5) in den Probenraum (P) gelangt und Probenlicht aus dem Probenraum (P) durch das Mikroskopobjektiv (5) über den Strahlteiler (22) und danach über die zweite Strahlablenkeinheit (24) zum Sensor (28) gelangt, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Strahlablenkeinheit (21) optisch zwischen der Lichtquelle (12) und dem Strahlteiler (22) angeordnet ist, so dass das Probenlicht abseits der ersten Strahlablenkeinheit (21) zum Sensor (28) gelangt, und gekennzeichnet durch eine Steuereinheit (29), die dazu eingerichtet ist, in einem Betriebsmodus das Probenlichtbündel mittels der zweiten Strahlablenkeinheit (24) über den Sensor (28) zu bewegen.
2. Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Steuereinheit (29) dazu eingerichtet ist, in dem ersten Betriebsmodus das Probenlichtbündel mittels der zweiten Strahlablenkeinheit (24) so über den Sensor (28) zu bewegen, dass das Zwischenbild (ZB) vergrößert auf den Sensor (28) abgebildet wird, insbesondere durch eine Bewegung derart, dass ein Betrag eines Quotienten zwischen einem ersten Winkel, den eine Ausbreitungsrichtung eines von einem Ort im Probenraum ausgehenden Strahlenbündels des Probenlichts unmittelbar hinter der zweiten Strahlablenkeinheit mit einer optischen Achse der Detektionsoptik einschließt, und einem zweiten Winkel, den die Ausbreitungsrichtung des Strahlenbündels unmittelbar vor der zweiten Strahlablenkeinheit mit einer optischen Achse des Mikroskopobjektivs (5) einschließt, größer als eins ist.
3. Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei mindestens im ersten Betriebsmodus die Bewegung der zweiten Strahlablenkeinheit (24) mit der Bewegung der ersten Strahlablenkeinheit (21) synchronisierbar oder synchronisiert ist, insbesondere mit identischer oder näherungsweise identischer Winkelamplitude der ersten Strahlablenkeinheit (21) und der zweiten Strahlablenkeinheit (24).
4. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Beleuchtungsstrahlengang einen Strahlformer (20) zum Erzeugen einer linienförmigen Verteilung des Beleuchtungslichts aufweist, insbesondere einer entlang ihrer Längsrichtung intensitätsmodulierten Verteilung, insbesondere einer periodisch intensitätsmodulierten Verteilung, insbesondere einer solchen Verteilung im Probenraum durch simultanes Erzeugen mindestens zweier linienförmiger, miteinander interferenzfähiger Lichtverteilungen, die in einer zu einer rückwärtigen Fokusebene (PE) des Mikroskopobjektivs (5) optisch konjugierten Ebene (PE') vorliegen.
5. Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei der Strahlformer (20) wiederholt, insbesondere motorisch und gesteuert durch die Steuereinheit (29), aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist und/oder einen räumlichen Lichtmodulator umfasst, insbesondere derart durch die Steuereinheit (29) gesteuert, dass im zeitlichen Wechsel unterschiedliche Beleuchtungslichtverteilungen im Probenraum entstehen.
6. Mikroskop nach Anspruch 4 oder 5, wobei die erste Strahlablenkeinheit (21) zum zweidimensionalen Abtasten des Probenraums in einer ersten Dimension quer zu einer Längsrichtung der linienförmigen Beleuchtungslichtverteilung und in einer zweiten Dimension parallel zu der Längsrichtung ausgebildet ist, insbesondere mit einer Steuereinheit, die die erste Strahlablenkeinheit (21) in mindestens drei unterschiedliche Stellungen entlang der zweiten Dimension stellt, wobei zwei der resultierenden Positionen der Beleuchtungslichtverteilung im Probenraum an den Stellungen entlang der zweiten Dimension um weniger als eine Länge der Beleuchtungslichtverteilung in Längsrichtung, insbesondere um eine Periodenlänge der intensitätsmodulierten Lichtverteilung oder weniger als eine Periodenlänge, voneinander beabstandet sind, und insbesondere für jede der Stellungen ein separates Rohbild erstellt.
7. Mikroskop nach Anspruch 4 oder 5, wobei der Beleuchtungsstrahlengang eine Optik (20) zum Beleuchten des Probenraums in unterschiedlichen Phasenlagen der intensitätsmodulierten Beleuchtungslichtverteilung umfasst, insbesondere einen räumlichen Phasenmodulator und/oder einen elektrooptischen Modulator in Verbindung mit einer Viertelwellenplatte, insbesondere mit Ausbildung der erste Strahlablenkeinheit (21) zum nur eindimensionalen Abtasten des Probenraums quer zu einer Längsrichtung der linienförmigen Beleuchtungslichtverteilung.
8. Mikroskop nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei der Sensor (28), insbesondere ein CMOS-Sensor oder ein SPAD-Sensor, eine deaktivierbare zeilenförmige elektronische Blende aufweist, die konfokal zu dem Zwischenbild angeordnet ist, insbesondere in Form eines Rolling Shutters, insbesondere mit Synchronisierbarkeit einer Einstellung der ersten Strahlablenkeinheit mit einer dynamischen Position der Blende.
9. Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Steuereinheit (29) elektrisch mit dem Sensor (28) und den Strahlablenkeinheiten (21, 24) verbunden ist und in dem ersten wählbaren Betriebsmodus die elektronische Blende aktiviert und die Bewegungen der ersten Strahlablenkeinheit (21), der zweiten Strahlablenkeinheit (24) und die Bewegung der elektronischen Blende synchronisiert und/oder in einem zweiten wählbaren Betriebsmodus die elektronische Blende aktiviert, die Bewegung der ersten Strahlablenkeinheit (21) und die Bewegung der elektronischen Blende synchronisiert und die zweite Strahlablenkeinheit (24) in einer konstanten Stellung, insbesondere in einer Neutralstellung, betreibt und/oder in einem dritten wählbaren Betriebsmodus die elektronische Blende deaktiviert und die zweite Strahlablenkeinheit (24) in einer konstanten Stellung betreibt und/oder in einem vierten wählbaren Betriebsmodus die elektronische Blende deaktiviert und die erste und zweite Strahlablenkeinheit (21, 24) wie im ersten Betriebsmodus betreibt.
10. Mikroskop nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Steuereinheit (29) in dem dritten Betriebsmodus den Strahlformer (20) aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt und/oder in dem zweiten Betriebsmodus eine Intensitätsmodulation des Beleuchtungslichts deaktivierbar oder deaktiviert ist und/oder die Steuereinheit eine Auswahleinheit (30) zur Auswahl eines von mehreren Betriebsmodi umfasst und die Steuereinheit (29) das Mikroskop nach der Auswahl in dem ausgewählten Betriebsmodus betreibt, insbesondere mit einer zusätzlichen Auswahlmöglichkeit in der Auswahleinheit zwischen mehreren Untermodi mit jeweils unterschiedlichen Lichtquellen (12), insbesondere für den dritten Betriebsmodus.
11. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektionsstrahlengang zwischen dem von der Tubuslinse (6) erzeugten Zwischenbild (ZB) und der Detektionsoptik (25) frei ist von konfokalen Feldblenden, insbesondere von Schlitzblenden, und insbesondere frei ist von mit dem Zwischenbild konjugierten Bildebenen und/oder wobei der Detektionsstrahlengang zwischen dem von der Tubuslinse (6) erzeugten Zwischenbild (ZB) und der Detektionsoptik (25) genau eine zur rückwärtigen Brennebene (PE) des Mikroskopobjektivs (5) konjugierte Ebene (PE') aufweist.
12. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der gemeinsame Strahlengang optisch zwischen dem Zwischenbild (ZB) und dem Strahlteiler (22) eine Optik (23), vorzugsweise eine Abtastoptik, zum Erzeugen einer zur rückwärtigen Brennebene (PE) des Mikroskopobjektivs (5) konjugierten Ebene (PE') auf oder in der Nähe der ersten Strahlablenkeinheit (21) und auf oder in der Nähe der zweiten Strahlablenkeinheit (24) aufweist.
13. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sowohl das Beleuchtungslicht auf seinem Weg zum Mikroskopobjektiv (5) als auch das Probenlicht auf seinem Weg zum Sensor (28) durch dasselbe von der Tubuslinse (6) erzeugte Zwischenbild (ZB) verlaufen, insbesondere mit Anordnung des Strahlteilers (22) als Hauptstrahlteiler oder Hauptfarbteiler optisch zwischen der ersten Strahlablenkeinheit und dem von der Tubuslinse (6) erzeugten Zwischenbild (ZB), oder wobei das Mikroskop eine zweite Tubuslinse (6') aufweist, welche ein zweites Zwischenbild (ZB) erzeugt, und das Beleuchtungslicht auf seinem Weg zum Mikroskopobjektiv (5) durch das zweite Zwischenbild (ZB) verläuft.
14. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektionsstrahlengang zwischen dem Strahlteiler (22) und der Detektionsoptik (25) einen Nebenfarbteiler (26) aufweist, welcher das Probenlicht in zwei spektral disjunkte Anteile aufteilt und diese auf disjunkte Bereiche des Sensors (28) oder auf einen jeweiligen Sensor (28, 28') leitet, insbesondere mit einer zweiten Lichtquelle (12) mit einer von der ersten Lichtquelle (12) verschiedenen Emissionswellenlänge im Beleuchtungsstrahlengang.
15. Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Strahlablenkeinheit (21) MEMS-Mikrospiegel umfasst, insbesondere kontinuierlich um zwei orthogonale Raumrichtungen verstellbare MEMS-Mikrospiegel.
16. Mikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mikroskop ein Stativ (2) aufweist, an welchem das Mikroskopobjektiv (5) angeordnet ist, wobei das Stativ (2) einen ersten Anschluss (7), in dessen Bereich die Tubuslinse (6) und das Zwischenbild (ZB) angeordnet ist, und mindestens einen weiteren Anschluss (7') mit einer weiteren Tubuslinse (6') und einem weiteren Zwischenbild (ZB) aufweist, wobei das Probenlicht mittels mindestens eines zweiten Strahlteilers (9), insbesondere eines wiederholt entfernbaren Strahlteilers, oder mittels eines Spiegels simultan oder sequentiell zu beiden Ausgängen (7, 7') leitbar ist, wobei der erste Strahlteiler (22), die Detektionsoptik (25), der Sensor (28), die erste und die zweite Strahlablenkeinheit (21, 24) und eine Abtastoptik (23) innerhalb eines Moduls (3) angeordnet sind, welches mit einem der Anschlüsse (7) lösbar mechanisch und optisch verbunden ist.