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DE102011106984B3 - Microarray-Vorrichtung für das Screenen oder Auffinden von HSP90 Inhibitoren und von Inhibitoren weiterer krankheitsrelevanter Zielstrukturen - Google Patents

Microarray-Vorrichtung für das Screenen oder Auffinden von HSP90 Inhibitoren und von Inhibitoren weiterer krankheitsrelevanter Zielstrukturen Download PDF

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DE102011106984B3
DE102011106984B3 DE102011106984A DE102011106984A DE102011106984B3 DE 102011106984 B3 DE102011106984 B3 DE 102011106984B3 DE 102011106984 A DE102011106984 A DE 102011106984A DE 102011106984 A DE102011106984 A DE 102011106984A DE 102011106984 B3 DE102011106984 B3 DE 102011106984B3
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protein
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microarray
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DE102011106984A
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Dr. Melzner Dieter
Prof. Dr. Scheper Thomas
Thomas Schüler
Frank Stahl
Denise van Rossum
Johanna-Gabriela Walter
Carsten Zeilinger
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Sartorius Stedim Biotech GmbH
Original Assignee
Sartorius Stedim Biotech GmbH
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Publication date
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Priority to PCT/EP2012/001725 priority patent/WO2013007324A1/de
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Microarray-Vorrichtung für das Screenen oder das Auffinden von Proteininhibitoren, ein Verfahren zur Herstellung derselben, sowie ein entsprechendes Verfahren zum Screenen oder Auffinden von Proteininhibitoren. Die erfindungsgemäße Microarray-Vorrichtung umfasst eine feste Unterstützung mit einem Trägermaterial, mindestens ein darauf immobilisiertes Protein, für das Inhibitoren gescreent oder aufgefunden werden sollen, und mindestens einen bekannten Inhibitor des mindestens einen Proteins, wobei der Inhibitor an das mindestens eine Protein gebunden ist und eine nachweisbare Markierung umfasst.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Microarray-Vorrichtung für das Screenen oder das Auffinden von Proteininhibitoren, ein Verfahren zur Herstellung derselben, sowie ein entsprechendes Verfahren zum Screenen oder Auffinden von Proteininhibitoren. Die erfindungsgemäße Microarray-Vorrichtung umfasst eine feste Unterstützung mit einem Trägermaterial, mindestens ein darauf immobilisiertes Protein, für das Inhibitoren gescreent oder aufgefunden werden sollen, und mindestens einen bekannten Inhibitor des mindestens einen Proteins, wobei der Inhibitor an das mindestens eine Protein gebunden ist und eine nachweisbare Markierung umfasst.
  • Biochips mit immobilisierten Nukleinsäuren, Peptiden oder Proteinen, sogenannte Microarrays, haben großes Potential nicht nur in der biologischen und biochemischen Grundlagenforschung, sondern auch in Bereichen der Diagnostik oder der Pharmakologie, beispielsweise bei der Suche nach neuen therapeutisch relevanten Wirkstoffen. Sie ermöglichen die parallele Analyse von bis zu tausenden Einzelnachweisen, beispielsweise Bindungsreaktionen, in einer geringen Menge biologischen Probenmaterials, und erfreuen sich daher immer größerer Beliebtheit.
  • Microarrays bestehen für gewöhnlich aus einer festen Unterstützung oder aus einer festen Unterstützung mit einem Trägermaterial, beispielsweise aus behandeltem oder unbehandeltem Glas oder Kunststoff, auf dem biologische Moleküle in hunderten oder tausenden präzise definierten Positionen, sogenannten Spots, immobilisiert sind. Diese Spots können wiederum in exakt definierten Anordnungen, beispielsweise in mehreren quadratischen Feldern von 10 mal 10 Spots, vorhanden sein. Dabei werden die biologischen Moleküle von speziellen Druckern auf die Unterstützung oder auf das Trägermaterial aufgebracht oder „gespottet”. Diese Drucker sind in der Lage, winzige Tröpfchen von Lösungen, welche die biologischen Moleküle enthalten, in definierten Mustern aufzubringen.
  • Sind die biologischen Moleküle auf der Unterstützung oder auf dem Trägermaterial immobilisiert, kann der Microarray verwendet werden.
  • Hitzeschockproteine (HSPs) sind in allen zellulären Systemen vorhanden, und sind in Eukaryonten essentiell. Einige HSPs, wie zum Beispiel HSP90, sind Zielstrukturen für die Entwicklung von Krebstherapeutika und Ansatzstelle für die Entwicklung von Wirkstoffen gegen weitere schwerwiegende Krankheiten. HSP90 ist ein hochkonserviertes Protein, das im Chaperonkomplex der Zelle eine wichtige Faltungsmaschine darstellt, indem es ungefaltete oder fehlerhaft gefaltete Proteine in die richtige Form bringt. Daher spielt dieses Protein, das erst durch zellulären Stress induziert wird, eine wichtige Rolle in einer Reihe von Krankheitsprozessen. Untersuchungen zeigen beispielsweise, dass HSP90 in Krebszellen wesentlich häufiger vorkommt, als in normalen Zellen. Dabei ist in fortgeschrittenen Tumoren die HSP90-Expression sogar noch verstärkt. Entstehen bei Krebserkrankungen aufgrund von Mutationen mehr ungefaltete Proteine, steigt also auch der HSP90-Gehalt der betroffenen Zellen. Dies verhindert die eigentlich notwendigen Apoptose der Zellen, die ansonsten unweigerlich durch die Anhäufung von ungefalteten Proteinen eintreten würde. Kann also die Aktivität von HSP90, beispielsweise durch einen HSP90-Inhibitor, gehemmt werden, stirbt die Krebszelle ab.
  • Neben den HSPs existiert auch noch eine Vielzahl weiterer Zielstrukturen für die Entwicklung von therapeutisch wirksamen Substanzen zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheitsbildern, beispielweise weitere Chaperone, Ionenkanäle und Rezeptoren.
  • Verträgliche und nebenwirkungsfreie Inhibitoren von HSP90 und einer Vielzahl weiterer krankheitsrelevanter Strukturen sind somit als Wirkstoffe für die Behandlung von Tumoren und einer Vielzahl weiterer Erkrankungen von verstärktem Interesse. In diesem Zusammenhang wurden bereits zahlreiche Wirkstoffe selektioniert. Dennoch ist eine Optimierung und Weiterentwicklung des Wirkstoffarsenals erforderlich, da viele der bisherigen Wirkstoffe erhebliche Nebenwirkungen aufweisen oder in ihrer Anwendung zunehmen aufgrund von Resistenzentwicklung eingeschränkt sind.
  • Bisherige Verfahren zum Screenen von solchen Inhibitoren, wie zum Beispiel Fluoreszenzpolarisation, interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) oder das sogenannte Alphascreen®-Verfahren, sind dabei insbesondere im high throughput Bereich sehr teuer und aufwendig. Weiter konnte ein funktionelles Screening von Proteininhibitoren mit herkömmlichen Microarrays bisher nicht erbracht werden, da diese lediglich in der Lage waren, strukturelle Informationen zu liefern. So kann normalerweise durch den Nachweis der Bindung zweier Bindungspartner noch nichts über die funktionellen Konsequenzen ausgesagt werden.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Möglichkeiten für das Screenen oder Auffinden von Proteininhibitoren bereitzustellen, welche einfach und kostengünstig herzustellen sind, eine hohe Sensitivität aufweisen, wenig Material verbrauchen, leicht standardisierbar sind, und für eine Vielzahl von möglichen Zielstrukturen und Krankheiten anwendbar sind.
  • Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst. Insbesondere wird erfindungsgemäß eine Microarray-Vorrichtung für das Screenen oder Auffinden von Proteininhibitoren, ein Verfahren zu deren Herstellung, sowie ein entsprechendes Screening- oder Auffind-Verfahren bereitgestellt. Die erfindungsgemäße Microarray-Vorrichtung zeichnet sich dabei durch ihre einfache und kostengünstige Herstellung, eine hohe Sensitivität und Genauigkeit bei geringstem Materialverbrauch, gute Standardisierbarkeit und die Eigenschaft, bei einer Vielzahl krankheitsrelevanter Zielstrukturen anwendbar zu sein, aus.
  • Dementsprechend betrifft ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Microarray-Vorrichtung für das Screenen oder Auffinden von Proteininhibitoren, umfassend:
    • (a) eine feste Unterstützung mit einem Trägermaterial,
    • (b) mindestens ein Protein, für das Inhibitoren gescreent oder aufgefunden werden sollen, wobei das Protein auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert ist, und
    • (c) mindestens einen bekannten Inhibitor des mindestens einen Proteins, wobei der Inhibitor an das mindestens eine Protein gebunden ist und eine nachweisbare Markierung umfasst.
  • Geeignete feste Unterstützungen zur Verwendung in erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtungen unterliegen dabei keinerlei besonderen Beschränkungen und sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise können herkömmliche Objektträger aus Glas, Kunststoff und Silikon verwendet werden. Weiter können Unterstützungen, die Glas- und/oder Metall-, beispielsweise Goldoberflächen haben, verwendet werden. Erfindungsgemäß können aber auch vliesartige Materialien wie Papier oder Pappe eingesetzt werden. Die Unterstützungen können mit einem Trägermaterial, z. B. mit Nitrocellulose oder mit mehrlagigen Trägermaterialien, wie Nitrocellulose und Metall, z. B. einem metallisierten Trägermaterial, das Nitrocellulose enthält, beschichtet sein. Dabei fungiert das Metall nicht nur als Trägermaterial, sondern dient gleichzeitig als Reflexionsschicht zur Signalverstärkung. Die Nitrocellulose kann dabei porös oder unporös sein. Wenn die Trägermaterialien porös sind, können die erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtungen im lateralen Fließmodus (lateral flow) betrieben werden. Kommerziell erhältliche, Nitrocellulose-beschichtete Glasträger zur Verwendung in Microarrays werden beispielsweise von der Firma Schott unter dem Namen „Nexterion® Slide NC-N” und von der Firma Avantra Biosciences Corp. unter dem Namen „Path Slide” vertrieben.
  • Bei dem auf der erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung immobilisierten Protein handelt es sich bevorzugt um ein Protein, das eine krankheitsrelevante Zielstruktur darstellt, d. h. dessen Inhibierung einen nachgewiesenen oder vermuteten therapeutischen Nutzen hat bzw. haben könnte. Bevorzugt ist das Protein aus der Gruppe, bestehend aus Chaperonen, darunter Hitzeschockproteine (HSPs), Ionenkanälen und Rezeptoren ausgewählt. Besonders bevorzugt ist dabei HSP90, ganz besonders bevorzugt humanes HSP90. Weitere bevorzugte Proteine sind bakterielle Hitzeschockproteine wie die sogenannten HtpG-Proteine, die in krankheitsrelevanten Erregern wie z. B. Helicobacter pylori, Helicobacter hepaticus, Mycobacterium tuberculosum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis, und Escherichia coli vorkommen, Hitzeschockproteine der Malariaerreger aus der Gattung Plasmodium oder von Erregern wie Schistosoma mansoni oder Leishmania sp., oder tierische und pflanzliche HSPs. Das immobilisierte Protein ist kovalent oder adsorptiv auf der erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung immobilisiert, und ist bevorzugt ein natives Protein voller Länge, es können jedoch auch Proteinfragmente verwendet werden, solange diese die Bindungsstelle für den bekannten Inhibitor in deren nativer Konfiguration enthalten. Weiter werden bevorzugt hochgereinigte Proteine verwendet.
  • Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen für die Verwendung in der erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung sind im Stand der Technik bekannt. Sie umfassen beispielsweise die Expression der Proteine in bakteriellen oder eukaryotischen Systemen (z. B. in E. coli, Säugerzellen oder Insektenzellen), sowie die anschließende Aufreinigung der Proteine.
  • Der bekannte Inhibitor des auf der erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung immobilisierten Proteins unterliegt ebenfalls keinerlei besonderen Beschränkungen. Insbesondere sind für eine Vielzahl von relevanten Proteinen Inhibitoren im Stand der Technik bekannt. Es kann sich dabei um andere Proteine, Peptide oder organische Verbindungen handeln. Der Inhibitor liegt auf der erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung an dessen nativer Bindungsstelle an das immobilisierte Protein gebunden vor, und umfasst eine nachweisbare Markierung.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung können anstelle bekannter Inhibitoren beliebige markierte Liganden des immobilisierten Proteins verwendet werden. Auf diese Weise können auch unbekannte Bindungsstellen an dem immobilisierten Protein, bzw. daran bindende Substanzen untersucht werden.
  • In Ausführungsformen, in denen das immobilisierte Protein HSP90 ist, ist der bekannte Inhibitor bevorzugt aus der Gruppe, bestehend aus Geldanamycin, einem benzochinoiden Ansamycin aus Streptomyces hygroscopicus, Geldanamycin-Analoga und Geldanamycin-Derivaten, ausgewählt. Dabei ist besonders bevorzugt 17-Allylamino-17-demethoxy-geldanamycin (17-AAG).
  • Die nachweisbare Markierung des bekannten Inhibitors unterliegt ebenfalls keinen besonderen Beschränkungen. Insbesondere sind geeignete Markierungen im Stand der Technik bekannt. Sie umfassen bevorzugt Fluoreszenzfarbstoffe, wobei ein besonders bevorzugter Fluoreszenzfarbstoff Fluoresceinisothiocyanat (FITC) ist. Weiter kann als Markierung Biotin verwendet werden, sowie Verfahren zur Markierung des Inhibitors mit einer geeigneten nachweisbaren Markierung sind im Stand der Technik bekannt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Microarray-Vorrichtung mindestens ein oder mehrere weitere Proteine, für die Inhibitoren gescreent werden sollen. Dabei sind die unterschiedlichen Proteine in verschiedenen und unterscheidbaren Bereichen des festen Trägermaterials immobilisiert. Die Anzahl an verschiedenen, auf einer erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung immobilisierten Proteinen ist dabei lediglich durch die Anzahl an unterscheidbaren Bereichen auf dem festen Trägermaterial begrenzt. Die weiteren Proteine sind bevorzugt Proteine wie vorstehend für das mindestens eine Protein definiert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Microarray-Vorrichtung mindestens einen oder mehrere weitere bekannte Inhibitoren des mindestens einen Proteins. Diese sind ebenfalls an ihre native Bindungsstelle an dem Protein gebunden und umfassen eine nachweisbare Markierung. Dabei sind die nachweisbaren Markierungen der verschiedenen Inhibitoren voneinander unterscheidbar. Weiter sind die verschiedenen Inhibitoren an verschiedenen Bindungsstellen an das Protein gebunden. Die Anzahl an verschiedenen Inhibitoren ist somit lediglich durch die Anzahl an Bindungsstellen für Inhibitoren auf dem Protein begrenzt. Die weiteren Inhibitoren sind bevorzugt Inhibitoren wie vorstehend für den mindestens einen Inhibitor definiert.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung, umfassend die Schritte:
    • (a) Bereitstellen einer geeigneten festen Unterstützung mit einem Trägermaterial,
    • (b) Immobilisieren mindestens eines Proteins, für das Inhibitoren gescreent werden sollen, auf der Oberfläche des Trägermaterials, und
    • (c) Binden mindestens eines bekannten Inhibitors des mindestens einen Proteins an das mindestens eine Protein, wobei der Inhibitor eine nachweisbare Markierung umfasst.
  • Dabei sind die feste Unterstützung, das Trägermaterial, das mindestens eine Protein, gegebenenfalls vorhandene weitere Proteine, der mindestens eine bekannte Inhibitor, gegebenenfalls vorhandene weitere Inhibitoren, sowie die nachweisbare Markierung wie vorstehend definiert.
  • Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf festen Trägermaterialien sind im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise das Spotten einer das zu immobilisierende Protein enthaltenden Lösung auf das feste Trägermaterial mit Hilfe eines geeigneten Druckers. Verfahren zur Markierung des Inhibitors mit einer geeigneten nachweisbaren Markierung sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt. Weiter sind Verfahren zum Binden des Inhibitors an das mindestens eine Protein bekannt. Sie umfassen beispielsweise die Inkubation der Microarray-Vorrichtung, auf der bereits Protein immobilisiert ist, mit einer den markierten Inhibitor enthaltenden Lösung.
  • Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung wird die Microarray-Vorrichtung mit einer oder mehreren Testlösungen inkubiert, welche im Verdacht stehen, einen Inhibitor für das immobilisierte Protein zu enthalten. Sind in den Testlösungen Substanzen vorhanden, die stärker an das immobilisierte Protein binden, als der daran gebundene bekannte und markierte Inhibitor, wird dieser von dem immobilisierten Protein verdrängt. Sind in den Testlösungen Substanzen mit vergleichbarer Bindungswechselwirkung vorhanden, werden diese den immobilisierten Inhibitor auf Grund ihrer hohen freien Konzentration kompetitiv von den immobilisierten Proteinen verdrängen. Beides ist durch eine Abnahme des Signals, das von der nachweisbaren Markierung erzeugt wird, nachweisbar. Somit Isst sich aus einer Abnahme des Signals, das von der nachweisbaren Markierung erzeugt wird, an einer bestimmten Stelle der erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung ableiten, dass die an dieser Stelle vorhandene Testlösung einen Inhibitor enthält, der an die gleiche Bindungsstelle wir der bekannte Inhibitor bindet.
  • Dementsprechend betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Screenen oder Auffinden von Proteininhibitoren, umfassend die Schritte:
    • (a) Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung,
    • (b) Bestimmen der Intensitäten der Signale, die von der auf der Microarray-Vorrichtung gebundenen nachweisbaren Markierung erzeugt werden,
    • (c) Inkubieren der Microarray-Vorrichtung mit einer oder mehreren zu screenenden oder zu durchsuchenden Testlösungen,
    • (d) erneutes Bestimmen der Intensitäten der Signale, die von der auf der Microarray-Vorrichtung gebundenen nachweisbaren Markierung erzeugt werden, und
    • (e) Bestimmen, ob in einer Testlösung ein Proteininhibitor vorhanden war, wobei ein Proteininhibitor vorhanden war, wenn die in Schritt (d) bestimmten Intensitäten kleiner als die in Schritt (b) bestimmten Intensitäten sind.
  • Dabei sind Verfahren zur Bestimmung der Intensitäten der Signale, die von der auf der Microarray-Vorrichtung gebundenen nachweisbaren Markierung erzeugt werden, im Stand der Technik bekannt. Sie umfassen beispielsweise, für den Fall dass Fluoreszenzfarbstoffe als nachweisbare Markierung verwendet werden, das Scannen der Microarray-Vorrichtung mit einem herkömmlichen Microarray Scanner.
  • Die Figuren zeigen:
  • 1: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung mit immobilisiertem HSP90 und FITC-markiertem Geldanamycin als Inhibitor. (A) Das Microarray-Substrat besteht aus einem Glasträger, auf dem 16 Nitrocellulose Pads vorliegen. (B) Detailansicht eines Nitrocellulose Pads. HSP90 wird in 10 Replikaten auf jedes Pad gedruckt. Theoretisch ist eine Bedruckung mit 10 × 10 Spots möglich. (C) Prinzip des Verdrängungsassays. An das immobilisierte HSP90 wird zunächst FITC-markiertes Geldanamycin gebunden. Dieses kann von einem Inhibitor, der dieselbe Bindungsstelle wie Geldanamycin aufweist, verdrängt werden. Das Resultat der Verdrängung ist eine Abnahme der Fluoreszenzintensität.
  • 2: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung mit mehreren verschiedenen immobilisierten Proteinen und mehreren verschiedenen Inhibitoren. (A) Das Microarray-Substrat besteht aus einem Glasträger, auf dem 16 Nitrocellulose Pads vorliegen. (B) Der Microarray bietet die Möglichkeit, mehrere verschiedene Proteine zu Immobilisieren (Multiplexing auf Target-Ebene). So kann die Wirkung eines potentiellen Inhibitors auf die verschiedenen Proteine untersucht werden. (C) Daneben ist auch die Möglichkeit vorhanden, mehrere verschiedene bekannte Inhibitoren zu verwenden (Multiplexing auf Inhibitor-Ebene). So kann beispielsweise neben FITC-markiertem Geldanamycin zusätzlich Novobiocin, das mit einem anderen Fluorophor markiert ist, eingesetzt werden. Dabei bindet Novobiocin an einer anderen Position des HSP90 als Geldanamycin, führt aber ebenso zur Inhibierung der HSP90 Aktivität. Somit können auf einem einzigen Microarray mehrere mögliche Angriffspunkte am HSP90 untersucht werden. In dem dargestellten Fall verdrängt der Inhibitor das Geldanamycin, während die Bindung des Novobiocins nicht beeinflusst wird.
  • 3: Strukturformel von FITC-markiertem Geldanamycin.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele näher erläutert.
  • Beispiel 1: Herstellung einer erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung
  • Die Microarrays wurden auf Nitrocellulose-beschichtete 16-Pad Slides (Nexterion® Slide NC-N16; Schott, Mainz, Deutschland) gedruckt. Zum Drucken wurde ein kontaktfreier Drucker (Nano-Plotter NP 2.1; Gesim, Grosserkmannsdorf, Deutschland) sowie eine Nano-Tip A (Gesim) verwendet.
  • Das Target (HSP90) wurde in Puffer A (20 mM Tris, 50 mM KCl, 6 mM Mercaptoethanol, 10% Glycerin, pH 7,5) in einer Konzentration von 3 mg/ml vorgelegt. Vor dem Spotten wurden 10% einer 5%-igen Trehalose Lösung zu der Target-Lösung gegeben (finale Proteinkonzentration: 2,73 mg/ml, finale Trehalose-Konzentration: 0,5%). Nachfolgend wurde die Target-Lösung auf den Slide gedruckt. Dabei wurden je Spot 8 Droplets gespottet. Jede Target-Lösung wird in 10 Replikaten auf jedes der 16 Felder des Microarrays gedruckt. Anschließend wurde der Microarray für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann für 45 min in 1% BSA in Puffer A unter Schütteln bei Raumtemperatur blockiert, und dann 3 × 20 min mit Puffer A unter Schütteln bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Danach wurde der Microarray über Nacht (16 bis 18 h) bei 4°C unter Lichtausschluss und unter Schütteln mit 3 ml einer Lösung von 15 nM FITC-markiertem Geldanamycin in Puffer B (20 mM HEPES-KOH, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM Na2MoO4, 1 mM DTT, 0,01% Tween 20, 2% DMSO, 0,1 mg/mL BSA, pH 7,3) inkubiert. Anschließend wurde der Microarray dreimal für jeweils 20 min unter Lichtausschluss und unter Schütteln mit jeweils 3 ml Puffer B gewaschen und dann mit Druckluft getrocknet.
  • Beispiel 2: Verwendung einer erfindungsgemäßen Microarray-Vorrichtung
  • Der Microarray wurde mit einem GenePix 4000B Scanner (Molecular Devices, Ismaning, Deutschland) im Cy3 Kanal gescannt. Dabei wurde die Laserleistung auf 33% reduziert, und die Verstärkung so gewählt, dass deutliche, jedoch nicht gesättigt Signale erhalten wurden (gain 250 – gain 350).
  • Anschließend wurde eine selbstklebende 16 Pad Hybridisierungskammer (Nexterion® 16 Well Superstructures; Schott) auf den Microarray aufgebracht. Die 16 Wells der Hybridisierungskammer wurden dann mit den zu untersuchenden potentiellen Inhibitoren befüllt. Dabei wurden je Well 50 μl der Substanz in Puffer B verwendet. Um eine Verdrängungskurve aufzunehmen, wurden dabei Konzentrationen zwischen 0,25 pM und 2,5 μM eingesetzt. Ein Well wurde mit 2,5 μM 17-AAG als Positivkontrolle befüllt, ein weiteres Well mit Puffer B als Negativkontrolle. Die Hybridisierungskammer wurde mit Folie verschlossen und der Microarray in eine feuchte Kammer gegeben. Die Inkubation mit den Inhibitoren erfolgte über Nacht (16 bis 18 h) bei 4°C unter Schütteln und Lichtausschluss.
  • Danach wurde die Folie von der Hybridisierungskammer entfernt und die Lösung aus den einzelnen Wells entnommen. Jedes der Wells wurde dreimal mit jeweils 100 μl Puffer B für 5 min gewaschen. Dann wurde die Hybridisierungskammer entfernt und der Microarray mit Druckluft getrocknet.
  • Anschließend wurde der Microarray mit denselben Scanner-Einstellungen gescannt, die auch nach der Inkubation mit FITC-markiertem Geldanamycin verwendet wurden.
  • Die Rohauswertung erfolgte durch Quantifizierung der mittleren Signalintensität (z. B. mittels ImaGene oder GenePix Pro; Molecular Devices). Dabei wurden sowohl der Scan nach Inkubation mit FITC-markiertem Geldanamycin als auch der Scan nach Inkubation mit den potentiellen Inhibitoren ausgewertet. Für jeden Spot ergaben sich somit zwei mittlere Signalintensitäten. Durch Differenzbildung aus diesen Signalintensitäten ergab sich das verdrängte Signal. Durch Auswertung von jeweils 10 Replikaten wurden Mittelwerte und Standardabweichungen erhalten, die Bestimmung von IC50 Werten erfolgt über Verdrängungskurven z. B. mittels Origin (OriginLab, Northampton, USA).

Claims (15)

  1. Microarray-Vorrichtung für das Screenen oder das Auffinden von Proteininhibitoren, umfassend: (a) eine feste Unterstützung mit einem Trägermaterial, (b) mindestens ein Protein, für das Inhibitoren gescreent oder aufgefunden werden sollen, wobei das Protein auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert ist, und (c) mindestens einen bekannten Inhibitor des mindestens einen Proteins, wobei der Inhibitor an das mindestens eine Protein gebunden ist und eine nachweisbare Markierung umfasst.
  2. Microarray-Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die feste Unterstützung aus Papier oder Pappe besteht.
  3. Microarray-Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Trägermaterial Nitrocellulose ist.
  4. Microarray-Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Trägermaterial metallisiert ist und Nitrocellulose enthält.
  5. Microarray-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das mindestens eine Protein aus der Gruppe, bestehend aus Hitzeschockproteinen (HSPs), Chaperonen, Ionenkanälen und Rezeptoren, ausgewählt ist.
  6. Microarray-Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei das mindestens eine Protein HSP90 ist.
  7. Microarray-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der mindestens eine bekannte Inhibitor aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Peptiden und organischen Verbindungen, ausgewählt ist.
  8. Microarray-Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei der mindestens eine bekannte Inhibitor von HSP90 aus der Gruppe, bestehend aus Geldanamycin, Geldanamycin-Analoga und Geldanamycin-Derivaten, ausgewählt ist.
  9. Microarray-Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei der mindestens eine bekannte Inhibitor von HSP90 17-Allylamino-17-demethoxy-geldanamycin (17-AAG) ist.
  10. Microarray-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die nachweisbare Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
  11. Microarray-Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei der Fluoreszenzfarbstoff Fluoresceinisothiocyanat (FITC) ist.
  12. Microarray-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Microarray-Vorrichtung mindestens ein weiteres Protein, für das Inhibitoren gescreent oder aufgefunden werden sollen, umfasst, wobei die verschiedenen Proteine in verschiedenen Bereichen auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert sind.
  13. Microarray-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Microarray-Vorrichtung mindestens einen weiteren bekannten Inhibitor des mindestens einen Proteins umfasst, wobei der weitere Inhibitor an das mindestens eine Protein gebunden ist und eine nachweisbare Markierung umfasst, wobei die nachweisbaren Markierungen der verschiedenen Inhibitoren unterscheidbar sind.
  14. Verfahren zur Herstellung der Microarray-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer geeigneten festen Unterstützung mit einem Trägermaterial, (b) Immobilisieren mindestens eines Proteins, für das Inhibitoren gescreent werden sollen, auf der Oberfläche des Trägermaterials, und (c) Binden mindestens eines bekannten Inhibitors des mindestens einen Proteins an das mindestens eine Protein, wobei der Inhibitor eine nachweisbare Markierung umfasst.
  15. Verfahren zum Screenen von Proteininhibitoren, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Microarray-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, (b) Bestimmen der Intensitäten der Signale, die von der auf der Microarray-Vorrichtung gebundenen nachweisbaren Markierung erzeugt werden, (c) Inkubieren der Microarray-Vorrichtung mit einer oder mehreren zu screenenden oder zu durchsuchenden Testlösungen, (d) erneutes Bestimmen der Intensitäten der Signale, die von der auf der Microarray-Vorrichtung gebundenen nachweisbaren Markierung erzeugt werden, und (e) Bestimmen, ob in einer Testlösung ein Proteininhibitor vorhanden war, wobei ein Proteininhibitor vorhanden war, wenn die in Schritt (d) bestimmten Intensitäten kleiner als die in Schritt (b) bestimmten Intensitäten sind.
DE102011106984A 2011-07-08 2011-07-08 Microarray-Vorrichtung für das Screenen oder Auffinden von HSP90 Inhibitoren und von Inhibitoren weiterer krankheitsrelevanter Zielstrukturen Active DE102011106984B3 (de)

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