DE102011077809A1

DE102011077809A1 - Biokompatibles Klebemittel sowie Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE102011077809A1
Application number: DE102011077809A
Authority: DE
Inventors: Michael Sittinger; Jochen Ringe; Tilo Dehne; Boris Habermann; Rafael Valbuena; Prof. Dr. Westphal Günter
Original assignee: INST AGRAR und STADTOEKOLOGISCHE PROJEKTE AN DER HUMBOLDT UNI ZU BERLIN; Institut fur Agrar- und Stadtokologische Projekte An Der Humboldt-Universitat Zu Berlin; Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: INST AGRAR und STADTOEKOLOGISCHE PROJEKTE AN DER HUMBOLDT UNI ZU BERLIN; Institut fur Agrar- und Stadtokologische Projekte An Der Humboldt-Universitat Zu Berlin; Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2012-12-20
Also published as: WO2012175563A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Klebemittel, enthaltend oder bestehend aus 1 bis 20 Gew.-% Kollagen, 0,5 bis 15 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat und 65 bis 98,5 Gew.-% Wasser; wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen; sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Klebemittels.

Description

Biokompatible Klebstoffe oder Klebemittel werden in vielen Bereichen der Medizin verwendet. Dabei kommt es nicht nur darauf an, dass das Klebemittel eine hohe Klebewirkung aufweist, sondern es ist ebenfalls wichtig, dass das Klebemittel gut verträglich und damit biokompatibel ist. Aus diesem Grund ist man bemüht, Klebemittel bereitzustellen, die bevorzugt aus gut verträglichen Komponenten bestehen.
So sind beispielsweise aus US 5,209,776 , US 2008/0208114 A1 oder US 4,280,954 Klebemittel bekannt, die die Komponenten Kollagen und Hyaluronsäure enthalten können.
Ein Problem dieser Klebemittel besteht z.B. darin, dass diese Klebemittel entweder denaturiertes Kollagen enthalten, eine kovalente Bindung zwischen Kollagen und Hyaluronsäure erzeugt wird und/oder Katalysatoren oder andere Bestandteile eingesetzt werden, die ein erhöhtes Allergiepotential mit sich bringen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, verbesserte Klebemittel sowie Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Klebemittel sowie Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, die eine ausreichende Klebewirkung mit einer hohen Biokompatibilität und einem geringen Allergiepotenzial verbinden.
Gelöst wird die Aufgabe durch die Bereitstellung eines Verfahren zur Herstellung eines Klebemittels, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Kollagenlösung mit einer Konzentration an gelöstem Kollagen von 0,01 bis 5% (w/v) und einem pH-Wert von 2 bis 5 mit einer wässrigen Hyaluronatlösung mit einer Hyaluronat- oder Hyaluronsäurekonzentration von 0,02 bis 5% (w/v) und einem pH-Wert von 6 bis 7 gemischt wird und das erhaltene Präzipitat von der flüssigen Phase getrennt wird. Bevorzugt wird die Mischung der wässrigen Kollagenlösung und der wässrigen Hyaluronatlösung gerührt bis sich das Präzipitat gebildet hat.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass die Herstellung des Klebemittels ohne Zugabe eines Katalysators auskommt.
Das erhaltene Präzipitat ist ein biokompatibles Klebemittel mit guter Klebewirkung, einer hohen Biokompatibilität und einem geringen Allergiepotential.
Das erfindungsgemäße Klebemittel enthält oder besteht aus 1 bis 20 Gew.-% Kollagen, 0,5 bis 15 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat und 65 bis 98,5 Gew.-% Wasser; wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.
Nach Durchmischung der beiden Komponenten, wässrige Kollagenlösung und wässrige Hyaluronatlösung, strukturieren sich die Ausgangspolymere als Polyionenkomplex (PIK) aus positiv geladenem Kollagen und negativ geladener Hyaluronsäure. Zwischen den Polymeren entstehen ionische Wechselwirkungen und keine kovalenten Bindungen. Mittels eines Polyionenkomplexes wird über den Wechselwirkungsmechanismus eine verbesserte Nachhaltigkeit der Klebeeigenschaften erreicht. Die funktionellen Gruppen der Polymeren sind über ionische Wechselwirkungen reversibel miteinander assoziiert und sind somit nach einer vorübergehenden Trennung gleich wieder voll reaktionsfähig. Durch die Wechselwirkung der beiden Polymeren ergeben sich eine flüssige Phase und eine gelartige, klebrige feste Phase als Präzipitat (im Weiteren auch als Copräzipitat oder Klebemittel bezeichnet). Das biokompatible Klebemittel (also die feste, klebrige Phase, das Präzipitat oder das Copräzipitat) wird durch Trennung von der flüssigen Phase gewonnen. Zur Trennung der beiden Phasen können verschiedene Verfahren wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration oder einfaches Dekantieren eingesetzt werden. Die gebildeten PIK’s des Präzipitats besitzen im Weiteren funktionelle, insbesondere nukleophile Gruppen, die eine fortwährende Wechselwirkung mit umgebenden zellulären Systemen bzw. Geweben gewährleisten können. Die freien funktionellen Gruppen der Polymere im Präzipitat (Klebemittel) können somit Bindungen mit der Umgebung, z. B. in Form von Geweben oder Gerüstmaterialien, eingehen. Das Klebemittel ist insbesondere geeignet für eine Anwendung im medizinischen Bereich.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine wässrige Kollagenlösung eingesetzt, die eine Konzentration an gelöstem Kollagen aufweist von 0,01% bis 5% (w/v), bezogen auf das Gesamtvolumen der wässrigen Kollagenlösung. Bevorzugt weist die wässrige Kollagenlösung eine Konzentration an gelöstem Kollagen auf von 0,1% bis 1% (w/v), jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der wässrigen Kollagenlösung.
Die wässrige Kollagenlösung weist einen pH-Wert im sauren Bereich auf von pH 2 bis pH 5, bevorzugt einen pH-Wert von pH 2,3 bis pH 4,5.
Unter gelöstem Kollagen wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Kollagen verstanden, welches in der wässrigen Kollagenlösung gelöst vorliegt und im Wesentlichen nicht-hydrolysiert und/oder nicht-denaturiert ist. Dabei kann das Kollagen beispielsweise als natives Kollagen vorliegen oder renaturiert worden sein. Bevorzugt liegt das gelöste Kollagen in der wässrigen Kollagenlösung in nativer tripelhelikaler Struktur vor. Die Gewinnung von solchem Kollagen ist dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Bevorzugt kann das Kollagen aus der Haut, insbesondere aus der Haut von Tieren, wie beispielsweise Schweinen gewonnen werden.
Das erfindungsgemäß verwendete Kollagen enthält oder besteht bevorzugt aus Kollagen Typ I oder einer Mischung verschiedener Kollagen Typen, wobei bevorzugt Kollagen vom Typ I in der Mischung im Vergleich zu jedem einzelnen anderen Kollagen Typ den größten Massenanteil ausmacht. Andere Kollagen-Typen können beispielsweise Kollagen vom Typ II, III, V sein. Es können aber auch andere Kollagen-Typen in der Mischung vorhanden sein. Bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Kollagen um Kollagen Typ I in im Wesentlichen reiner Form oder um eine Mischung verschiedener Kollagen Typen, wobei Kollagen vom Typ I mindestens 30%, besonders bevorzugt mindestens 50% der gesamten Kollagenmasse ausmacht. Das Kollagen kann Atelokollagen und/oder Tropokollagen enthalten oder daraus bestehen. Atelokollagen zeichnet sich dadurch aus, dass es sich dabei um gelöstes Kollagen ohne Telopeptiden handelt.
Die wässrige Kollagenlösung wird im erfindungsgemäßen Verfahren gemischt mit einer wässrigen Hyaluronatlösung. Bevorzugt wird dabei Hyaluronsäure oder Hyaluronat eingesetzt, welches ein mittleres Molekulargewicht aufweist von 1.400 bis 2.400 kDa. Die wässrige Hyaluronatlösung weist eine Hyaluronsäurekonzentration oder eine Hyaluronatkonzentration auf von 0,02% bis 5% (w/v), bevorzugt von 0,2% bis 1% (w/v), jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der wässrigen Hyaluronatlösung. Bei dem verwendeten Hyaluronat handelt es sich um ein Salz der Hyaluronsäure mit verschiedenen Kationen, bevorzugt um das Natriumsalz der Hyaluronsäure.
Die wässrige Hyaluronatlösung weist vor der Mischung mit der wässrigen Kollagenlösung einen pH-Wert auf von pH 6 bis pH 7, bevorzugt von pH 6,3 bis pH 6,5.
Die Konzentrationsangaben für Kollagen und Hyaluronsäure bzw. Hyaluronat sowie die pH-Wertbereiche für die wässrige Kollagenlösung und die wässrige Hyaluronatlösung vor der Mischung der beiden wässrigen Lösungen sind wesentliche Komponenten dafür, dass sich das Präzipitat und damit das gewünschte Klebemittel ohne Verwendung eines Katalysators bilden kann. Somit wird sichergestellt, dass das Klebemittel einerseits Kollagen in nativer oder renaturierter Form enthält und damit die Bildung eines Polyionenkomplexes mit der Hyaluronsäure erlaubt sowie andererseits der Einsatz von Katalysatoren, die möglicherweise allergenes Potential aufweisen oder nur wenig biokompatibel sind, vermieden werden kann.
Das Allergiepotential des erhaltenen Klebemittels kann weiter gesenkt werden, wenn beispielsweise Hyaluronat oder Hyaluronsäure nicht-tierischen Ursprungs, bevorzugt bakteriellen Ursprungs eingesetzt wird. Dieses kann beispielsweise biotechnologisch gewonnen worden sein. Als besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn das Hyaluronat bzw. die Hyaluronsäure peptidfrei ist.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die wässrige Kollagenlösung und die wässrige Hyaluronatlösung miteinander gemischt, um ein Präzipitat zu erzeugen, welches, von der wässrigen Phase getrennt, ein erfindungsgemäßes Klebemittel darstellt. Besonders günstige Ergebnisse werden erzielt, wenn die wässrige Kollagenlösung und die wässrige Hyaluronatlösung in einem festgelegten Massenverhältnis zueinander miteinander gemischt werden. Bevorzugt werden die wässrige Kollagenlösung und die wässrige Hyaluronatlösung in einem Massenverhältnis von 1:0,5 bis 1:1,5 miteinander gemischt, besonders bevorzugt in einem Massenverhältnis von 1:0,7 bis 1:1,2.
Die Effizienz der Herstellung des Klebemittels mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann noch dadurch gesteigert werden, dass die Mischung bis zur Bildung eines Präzipitats gerührt wird.
Nach Bildung des Präzipitats wird das Präzipitat von der wässrigen Phase getrennt und kann als erfindungsgemäßes Klebemittel verwendet werden. Dabei kann die Trennung des Präzipitats von der wässrigen Phase des Gemisches mittels herkömmlicher Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Zentrifugation, Filtration und/oder Dekantieren.
Aufgrund der Wahl von Kollagen in nativem oder renaturiertem Zustand und Hyaluronsäure bzw. Hyaluronat als Komponenten des Klebemittels, zeichnet sich das erhaltene Klebemittel durch eine hohe Biokompatibilität aus. Grundsätzlich können wässrige Kollagenlösung und/oder wässrige Hyaluronatlösung und somit ggf. auch das erhaltene Klebemittel daneben weitere Bestandteile aufweisen, wobei hier bevorzugt biokompatible Bestandteile zum Einsatz kommen. Beispielsweise können biokompatible Ionen, Salze, organische oder anorganische Säuren und/oder Basen, Zucker, Proteine, Telopeptide und/oder Gelatine sowie Gemische davon verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Klebemittel, enthaltend oder bestehend aus:
1 bis 20 Gew.-% Kollagen,
0,5 bis 15 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat und
65 bis 98,5 Gew.-% Wasser;
wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält oder besteht das erfindungsgemäße Klebemittel aus:
5 bis 15 Gew.-% Kollagen,
3 bis 10 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat und
75 bis 92 Gew.-% Wasser;
wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.
Das erfindungsgemäße Klebemittel zeichnet sich durch eine besonders günstige Klebewirkung aus, wenn im Klebemittel Kollagen und Hyaluronsäure oder Hyaluronat im Gewichtsverhältnis von 0,5:1 bis 5:1 vorliegen.
Das erfindungsgemäße Klebemittel kann nach dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Klebemittels hergestellt sein.
Die Erfindung wird an Hand nachfolgender Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Figuren:
1: zeigt Ergebnisse aus der SDS-PAGE-Untersuchung von mit Säurelösungen extrahierten nativen Kollagenen, wobei in Spur 1 ein Molmassenstandard (Bande bei 64, 98, 148 und 250 kDa), in Spur 2 ein Kollagenstandard (Mischung aus Kollagen Typ I und Kollagen Typ II) und in Spuren 3 bis 7 mit Säurelösungen extrahierte native Kollagene gezeigt sind. Es bedeuten: Col I = Kollagen Typ I (mit α1/α2-Ketten bei ca. 100 kDa, β11/β12-Ketten bei ca. 200 kDa und γ-Ketten bei ca. 300 kDa); Col III = Kollagen Typ III; Col V = Kollagen Typ V.
2: zeigt das IR-Spektrum eines Copräzipitats aus Atelokollagen und Na-Hyaluronat biotechnologischen Ursprungs.
3: zeigt die Ergebnisse einer Adhäsivitätsbestimmung in vitalem Knorpel- (A) und Knochengewebe (B). Dargestellt sind die Durchschnittswerte aus 5 Messungen mit der Standardabweichung als Fehlerbalken.
Beispiele:
Zunächst wird die Aufbereitung der Schweinehaut für die Kollagenproduktion näher beschrieben: Rohe, enthaarte und maschinell weitgehend entfettete Schweinehaut (1,5 bis 2,5 mm dick), die gegebenenfalls in einer NaCl-Lösung zur Konservierung gelagert war, wird in Stücke (etwa 2 bis 4 mm² Oberfläche) geschnitten. Danach wird in folgenden Schritten vorgegangen.

– Vorreinigung: Abtrennung von Schmutz- und Blutresten sowie gegebenenfalls zur NaCl-Entfernung; zur Hydratisierung und Auflockerung des Gewebes wird die geschnittene Haut mit der 5-fachen Wassermenge dreimal unter Rühren gewaschen (jeweils 2 Stdn. Behandlungszeit).
– Hautentfettung: die gewaschene Haut wird dreimal mit reinem Aceton (jeweils 2 Stdn. Behandlungszeit, Haut-Aceton-Verhältnis 1:5 w/v) unter Rühren extrahiert.
– Aufquellen der Haut: zur nochmaligen Hydratisierung der Haut wird diese nach der Acetonextraktion erneut dreimal mit reinem Wasser (jeweils 2 Stdn. Behandlungszeit, Haut-Wasser-Verhältnis 1:5 w/v) unter Rühren extrahiert.
– Eiweißabtrennung: nicht kollagene Eiweiße sind aus der Haut abzutrennen. Zu diesem Zweck wird eine Lösung, die 6% NaCl (w/v) und 1% Ameisensäure (w/v) enthält, bereitet. Die aufgequollene Haut wird mit dieser Lösung zweimal unter Rühren extrahiert (jeweils 24 Stdn. Behandlungszeit, Haut-Lösung-Verhältnis 1:5 w/v).
– nochmaliges Aufquellen der Haut – dieser Schritt erfolgt analog. Wie bei allen o. g.

Behandlungen wird nach Ablauf der Zeit die Haut von dem Extraktionsmittel abgetrennt. Nach der Vorbehandlung kann die Kollagenextraktion aus der Schweinehaut auf unterschiedlichen Wegen erfolgen.
Beispiel 1: Gewinnung von Tropokollagen
Bei der Extraktion mittels Essigsäure werden 20 g der aufbereiteten Haut mit 125 ml Essigsäure (0,1 M bis 1,0 M, bevorzugt 0,5 M) versetzt und unter Rühren 48 Stdn. bei 25 °C extrahiert. Anschließend wird die flüssige Phase (Kollagenlösung) von der festen Phase (Hautrückstand) abgetrennt. Die Kollagenlösung wird dann mittels Ultrafiltration (Cross-Flow-Filtration an einer UF-Membrane aus Polyethersulfon, MWCO 50 kDa) gereinigt und aufkonzentriert. Die Kollagenmenge kann über eine Aminosäureanalyse oder eine Hydroxyprolinbestimmung nach der Methode von Stegemann und Stalder ermittelt werden. Die Bestimmung des Anteils an nativem Kollagen kann mittels CD-Spektroskopie und SDS-PAGE-Elektrophorese erfolgen. Das auf diesem Wege extrahierte Kollagen liegt als Tropokollagen vor (siehe Tabelle 1 und ).
Bei der Extraktion mittels Harnstoff werden 20 g der aufbereiteten Haut mit 125 ml Harnstofflösung (4 M bis 8 M, bevorzugt 6 M) versetzt und unter Rühren 48 Stdn. bei 25 °C extrahiert. Anschließend wird die Kollagenlösung vom Hautrückstand abgetrennt und mittels Dialyse (Dialyseschlauch aus regenerierter Cellulose, Porengröße 8–15 kDa) gegen 0,1 M Essigsäure gereinigt. Das Kollagen liegt ebenfalls als Tropokollagen, hier renaturiert, vor (siehe Tabelle 1).
Beispiel 2: Herstellung von Atelokollagen aus Schweinehaut

20 g der aufbereiteten Haut werden mit 125 ml einer 0,5 M Essigsäurelösung, die 5 % Pepsin (w/v) enthält, versetzt und unter Rühren 48 Stdn. bei 5 °C extrahiert. Anschließend wird 1 l einer 0,1 M Essigsäurelösung zugesetzt und die Mischung zur weiteren Enzymeinwirkung drei Wochen bei 25 °C stehen gelassen. Nach Zugabe von 0,1 M Essigsäure bis zu einem Gesamtvolumen von 3 l und Einstellung des pH-Wertes auf 8 bis 9 mittels 10 M NaOH wird das Pepsin gefällt und durch Zentrifugation vom Überstand (Kollagenlösung) abgetrennt. Zur Reinigung der gewonnenen Kollagenlösung wird der pH-Wert auf 3 bis 4 mit Essigsäure eingestellt und das Kollagen mit NaCl (2,5 M NaCl in der Gesamtmischung) ausgefällt und dann abzentrifugiert. Es folgen zwei weitere Reinigungsschritte. In jedem dieser Schritte wird das Kollagen erneut in 0,1 M Essigsäure aufgelöst, mit NaCl (1,8 M NaCl in der Gesamtmischung) wieder ausgefällt und anschließend abzentrifugiert. Um enthaltenes NaCl zu entfernen, wird das gereinigte Kollagen zum Schluss gegen 0,1 M Essigsäure dialysiert (Dialyseschlauch aus regenerierter Cellulose, Porengröße 8–15 kDa). Das Kollagen liegt als Atelokollagen vor (siehe Tabelle 1). Tabelle 1: Aminosäurezusammensetzung von Tropokollagen (Beispiel 1) und Atelokollagen (Beispiel 2)

Kollagenprodukt	Tropokollagen	Tropokollagen	Atelokollagen
Beispiel	1	1	2
Extraktionsmittel	Säurelösung	Harnstoff lösung	Essigsäure- Pepsin-Lösung
Hyp [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	80,06	84,56	88,81
Asp [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	46,31	42,71	46,28
Thr [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	15,71	17,16	16,34
Ser [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	29,47	34,12	35,72
Glu [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	76,80	74,93	74,41
Pro [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	134,90	135,32	130,94
Gly [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	331,87	336,85	337,22
Ala [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	111,29	109,37	108,23
Val [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	25,89	22,97	23,55
Met [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	4,23	3,03	4,86
Ile [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	10,30	9,69	10,34
Leu [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	25,47	24,52	22,32
Tyr [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	1,69	3,12	1,45
Phe [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	13,54	13,67	12,44
His [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	5,92	5,46	7,57
Hyl [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	5,77	6,30	6,11
Lys [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	28,74	25,99	27,33
Arg [Anzahl pro 1000 Aminosäuren]	52,04	50,76	46,08
Hyp/Pro	0,59	0,62	0,68
Hyp/(Hyp+Pro)	0,37	0,38	0,40
Hyl/Lys	0,20	0,24	0,22
Hyl/(Hyl+Lys)	0,17	0,20	0,18
Hyl/Hyp	0,07	0,07	0,07
µg Protein inj	3,17	10,18	2,78
µg Protein/Probe	3959,32	2544,37	2782,96
µg Collagen	3251,17	2216,06	2550,18
% Collagen	82,10	87,10	91,60

Beispiel 3: Herstellung eines Klebemittels aus Kollagen auf der Basis von Tropokollagen
Eine wie in dem Beispiel 1 gewonnene Kollagenlösung, die hauptsächlich Tropokollagenmoleküle enthält (Kollagenkonzentration 0,1 bis 1,0 % w/v) und einen pH-Wert von 2,3 bis 4,5 aufweist, wird mit einer bereits hergestellten Lösung aus Na-Hyaluronat biotechnologischen Ursprungs (pH 6,3 bis 6,5, Konzentration 0,2 bis 1,0 % w/v, MG des Hyaluronats 1.400 bis 2.400 kDa) im Massenverhältnis 1:1 (Kollagenlösung zu
Hyaluronatlösung) gemischt. Die Mischung ist dann bis zur Bildung eines Copräzipitats zu rühren. Dieses wird von der flüssigen Phase durch Zentrifugieren oder Dekantieren abgetrennt. Das Copräzipitat ist hochadhäsiv und stellt das Klebemittel dar. Das Copräzipitat enthält 5,0 bis 15,0 % (w/w) Kollagen, 3,0 bis 10,0 % (w/w) Hyaluronsäure und 75,0 bis 92,0% Wasser.
Beispiel 4: Herstellung eines Klebemittels aus Kollagen und Hyaluronsäure unter Anwendung von Atelokollagen
In Beispiel 4 wird die Herstellung eines Klebemittels auf der Basis von Atelokollagen beschrieben. Eine wie im Beispiel 2 gewonnene Kollagenlösung, die hauptsächlich Atelokollagenmoleküle enthält (Kollagenkonzentration 0,1 bis 1,0 % w/v) und einen pH-Wert von 2,3 bis 4,5 aufweist, wird mit einer bereits hergestellten Lösung aus Na-Hyaluronat biotechnologischen Ursprungs (pH 6,3 bis 6,5, Konzentration 0,2 bis 1,0 % w/v, MG des Hyaluronats 1.400 bis 2.400 kDa) in Massenverhältnis 1:1 (Kollagenlösung zu Hyaluronatlösung) gemischt. Die Mischung ist dann bis zur Bildung eines Copräzipitats zu rühren. Dieses wird von der flüssigen Phase durch Zentrifugieren oder Dekantieren abgetrennt. Das Copräzipitat ist hochadhäsiv und stellt das Klebemittel dar. Das Copräzipitat enthält 5,0 bis 15,0 % (w/w) Kollagen, 3,0 bis 10,0 % (w/w) Hyaluronsäure und 75,0 bis 92,0% Wasser. Die zeigt das IR-Spektrum eines Copräzipitats aus Atelokollagen und Na-Hyaluronat biotechnologischen Ursprungs.
Für die Messung der Adhäsivität der gemäß den Beispielen 3 und 4 hergestellten Klebemittel im biologischen Gewebe wurde vitales Knochen- und Knorpelgewebe aus dem Schwein verwendet. Als Referenz-Klebemittel diente Fibrinkleber der Firma Baxter (TISSUCOL Duo S).
In Vorbereitung der Messung wurden mit Hilfe einer Rundstanze Zylinder von 10 mm Durchmesser und 20 mm Länge aus der medialen und lateralen Kondyle eines Femurknochens des Schweins gefertigt. Diese Rohstanze enthält sowohl Knochen- als auch Knorpelgewebe. Zur Anfertigung einer für die Messung verwendeten Knorpelstanze wurde die Oberfläche mit Hilfe eines Mikrotoms plan geschnitten. Für eine in den Messungen verwendete Knochenstanze wurde die Knorpelschicht komplett abgetragen.
Für die Messung der Adhäsivität wurden jeweils zwei Zylinder (Knorpel oder Knochen) mittels eines Rundprobenhalters vertikal gegenüberliegend, zentriert und in einem Abstand von 5 mm in einem Kraftmessstand der Firma Zwick (Z005) angebracht. Der Ablauf der Messung stellte sich wie folgt dar.
40 μl des zu prüfenden Adhäsivs wurden zunächst auf der Oberfläche des unteren Gewebezylinders verteilt. Mit einer Geschwindigkeit von 10 mm pro Minute wurden dann die gegenüberliegenden Gewebeflächen gegeneinander verfahren, bis eine Kraft von 1 Newton [N] auf die Messfläche (A = 0,875 cm2) wirkte. Diese Position wurde für 30 Sekunden gehalten, bevor die beiden Messflächen mit einer Geschwindigkeit von 10 mm pro Minute wieder auseinander gezogen wurden. Der Verlauf der auftretenden Kraft über die Zeit wurde aufgezeichnet, die der vertikalen Bewegung entgegenwirkt. Der Maximalwert wurde um die Kraft korrigiert, die bei gleicher Verfahrensweise ohne Verwendung eine Adhäsivs auftritt. Die so ermittelte Kraft ist ein Maß für die Adhäsivität.
In der beschriebenen Messanordnung konnte für das erfindungsgemäß hergestellte Klebemittel gegenüber Knorpelgewebe eine Adhäsivität von durchschnittlich 15,2 kN/m² mit einer Standardabweichung von 1,0 kN/m² gemessen werden. Für Fibrinkleber lag dieser Wert im gleichen Gewebe nur bei 5,2 kN/m², mit einer Standardabweichung von 2,5 kN/m² ( ). Im Knochengewebe wurde für das Kollagen-Hyaluronsäure-Klebemittel eine Adhäsivität von 11,8 kN/m², mit einer Standardabweichung von 1,9 kN/m² bestimmt. Für Fibrinkleber war diese mit 2,6 kN/m² deutlich geringer, die Standardabweichung lag bei 1,9 kN/m² ( ).
Die Klebewirkung der gemäß der Beispiele 3 und 4 hergestellten Klebemittel unterscheidet sich nicht, jedoch besitzt das auf Basis Atelokollagen hergestellte Klebemittel ein verringertes Allergiepotential.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 5209776 [0002]
US 2008/0208114 A1 [0002]
US 4280954 [0002]

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Klebemittels, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Kollagenlösung mit einer Konzentration an gelöstem Kollagen von 0,01 bis 5% (w/v) und einem pH-Wert von 2 bis 5 mit einer wässrigen Hyaluronatlösung mit einer Hyaluronat- oder Hyaluronsäurekonzentration von 0,02 bis 5% (w/v) und einem pH-Wert von 6 bis 7 gemischt wird und das erhaltene Präzipitat von der flüssigen Phase getrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Kollagenlösung eine Konzentration an gelöstem Kollagen aufweist von 0,1 bis 1% (w/v).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wässrige Kollagenlösung einen pH-Wert von 2,3 bis 4,5 aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das gelöste Kollagen in der wässrigen Kollagenlösung im Wesentlichen in nativer tripelhelikaler Struktur vorliegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wässrige Hyaluronatlösung eine Hyaluronat- oder Hyaluronsäurekonzentration von 0,2 bis 1% (w/v) aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wässrige Hyaluronatlösung einen pH-Wert von 6,3 bis 6,5 aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hyaluronat oder die Hyaluronsäure der wässrigen Hyaluronatlösung bakteriellen Ursprungs ist und bevorzugt im Wesentlichen peptidfrei ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das gelöste Kollagen in der wässrigen Kollagenlösung Atelokollagen und/oder Tropokollagen enthält oder daraus besteht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hyaluronat oder die Hyaluronsäure der wässrigen Hyaluronatlösung ein mittleres Molekulargewicht aufweist von 1.400 bis 2.400 kDa.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wässrige Kollagenlösung und die wässrige Hyaluronatlösung im Massenverhältnis von 1:0,5 bis 1:1,5 gemischt werden, bevorzugt von 1:0,7 bis 1:1,2.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wässrige Kollagenlösung und/oder die wässrige Hyaluronatlösung weitere Bestandteile enthalten kann, beispielsweise Ionen, Salze, organische Säuren, Zucker, Proteine, Telopeptide und/oder Gelatine.
Klebemittel enthaltend oder bestehend aus: 1 bis 20 Gew.-% Kollagen, 0,5 bis 15 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat und 65 bis 98,5 Gew.-% Wasser; wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.
Klebemittel nach Anspruch 12, enthaltend oder bestehend aus: 5 bis 15 Gew.-% Kollagen, 3 bis 10 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat und 75 bis 92 Gew.-% Wasser; wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.
Klebemittel nach einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei im Klebemittel Kollagen und Hyaluronsäure oder Hyaluronat im Gewichtsverhältnis von 0,5:1 bis 5:1 vorliegen.
Klebemittel nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei das Klebemittel nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 hergestellt ist.