DE102011005235A1

DE102011005235A1 - Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Wirtsantwort eines Patienten

Info

Publication number: DE102011005235A1
Application number: DE102011005235A
Authority: DE
Inventors: Dr. Möller Eva; Andriy Ruryk; Dr. Wlotzka Britta; Dr. Guillen Cristina; Dr. Felsmann Karen
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2012-09-13
Anticipated expiration: 2031-03-09
Also published as: DE102011005235B4; AT514311A5; CA2829503A1; WO2012120026A1; US20140128277A1; CH706461B1; JP2014508525A; GB201317714D0; GB2502759A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, in einer Probe, wobei eine Messvorrichtung verwendet wird, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Gensonden aufweist, welche das im Wesentlichen gesamte Humangenom repräsentieren, wobei die Probanden je nach ihrem Infektions- und/oder Inflammationsstatus in wenigstens zwei der klinisch ermittelte Phänotypgruppen eingeteilt werden, die Änderungen der Genexpressionssignale zwischen den Phänotypgruppen statistisch verglichen werden und solche Gensonden ausgewählt werden, deren Genexpressionssignale zwischen mindestens zwei Phänotypgruppen statistisch signifikant verändert sind. Daraus wird ein Master-Score als Maß für den Schweregrad der Host Response ermittelt und es wird eine im Vergleich zur Ausgangsmenge erheblich reduzierte Anzahl von Polynucleotiden durch Ermittlung eines Scores identifiziert, der eine vorgegebene Abweichung vom Master-Score nicht überschreitet. Dieser Score kann zur Diagnose, Vorhersage der Entwicklung oder der Überwachung eines akut infektiösen und/oder inflammatorischen Zustandes eines Patienten und/oder der Therapieverlaufskontrolle und/oder zur Fokuskontrolle, verwendet werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response (Wirtsantwort) eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, gemäß Anspruch 1. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704 wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist zur Erfassung eines Scores als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, gemäß Anspruch 18. Anspruch 19 betrifft die Verwendung von Polynucleotiden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendungen von Protein-Genprodukten aus den Polynucleotiden gemäß Anspruch 24.
Sepsis („Blutvergiftung”) ist eine lebensbedrohliche Infektion, die den gesamten Organismus erfasst. Sie ist mit hoher Sterblichkeit verbunden, kommt immer häufiger vor und erfasst Menschen in jedem Lebensalter. Sepsis gefährdet den medizinischen Fortschritt in vielen Bereichen der Hochleistungsmedizin und verbraucht einen Großteil der Ressourcen im Gesundheitswesen. Die Sterblichkeit der schweren Sepsis hat sich in den letzten Jahrzehnten nicht entscheidend verbessert. Die letzten beiden Innovationssprünge nach Einführung der Blutkultur (ca. 1880) waren die Einführung der Antibiotika vor über 60 und der Beginn der Intensivmedizin vor etwa 50 Jahren. Um heute ähnlich entscheidende Behandlungsfortschritte zu erzielen, müssen neuartige Diagnostika zur Verfügung gestellt werden.
Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)” aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis-Begriffs durchgesetzt [Bone et al., 1992]. Die internationale Sepsis-Konferenz 2001 schlug außerdem ein neues Konzept (PIRO genannt) zur Beschreibung der Sepsis vor, welches sich aus den Kriterien Prädisposition, Infektion, Immunantwort (Response) und Organdysfunktion zusammensetzt [Levy et al., 2003]. Trotz einer neuen Definition der SIRS/Sepsis mit dem Akronym PIRO [Opal et al., 2005] wird in den meisten Studien immer noch die ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 benutzt [Bone et al., 1992], um ihre Patienten zu klassifizieren.
Lebensbedrohliche bakterielle Infektionen und deren Folgen Sepsis und konsekutives Organversagen sind häufige Komplikationen bei Krankenhauspatienten und nehmen weltweit um 2% bis 7% pro Jahr zu. In Deutschland sterben von den rund 154.000 Erkrankten jährlich 60.000 Menschen an schwerer Sepsis, die damit eine der häufigsten Todesursachen auf Intensivstationen ist. Gezielte antibiotische Therapie, beginnend in den ersten Stunden nach der Infektion, gilt als ausschlaggebend für eine erfolgreiche Behandlung [Ibrahim et al., 2000; Fine et al., 2002; Garracho-Montero et al., 2003; Valles et al., 2003]. Die Sterblichkeit ist mit 40% bis 60% derzeit inakzeptabel hoch, wobei sich das Risiko im Falle einer verzögerten resistenzgerechten Behandlung erheblich vergrößert. Die spezifische Erregerdetektion bei Sepsis ist derzeit in der klinischen Anwendung unbefriedigend. Der „Goldstandard” Blutkultur leidet unter mangelnder Sensitivität und bleibt in 80% bis 90% aller Sepsisfälle negativ. Außerdem liegen die Blutkulturergebnisse erst nach 24 bis 72 Stunden vor und bilden dann nur die Basis einer weiteren mikrobiellen Diagnostik (Speziesdifferenzierung, Erstellung eines Antibiogramms). Häufig wird eine Therapie mit Breitbandantibiotika zum Zeitpunkt des ersten Sepsisverdachtes ohne gesicherten mikrobiologischen Befund eingeleitet werden. Dies fördert zum einen die Entwicklung multiresistenter Keime, zum anderen verringert die antibiotische Vorbehandlung die Erfolgsquote einer später entnommenen Blutkultur. Epidemiologische Daten belegen, dass im Falle einer inadäquaten Therapie mit einer verdoppelten Mortalität [Valles et al., 2003] und bei verzögertem effektivem Therapiebeginn mit einer Zunahme der Sterblichkeit von mehr als 5% pro Stunde zu rechnen ist [Iregui et al., 2002; Ibrahim et al., 2000; Fine et al., 2002; Garnacho-Montero et al., 2003; Valles et al., 2003; Kumar et al., 2006].
Die exakte Diagnose von systemisch-inflammatorisch und infektiös bedingten Krankheitszuständen und deren Ursachen und assoziierten Risiken für nachfolgende Komplikationen spielt für die klinischen Entscheidungen zur Behandlung von Patienten und anschließender Verlaufsbeobachtung neben der Sepsis auch in einer Reihe von weiteren Indikationen eine wichtige Rolle. In diesem Zusammenhang kann der Behandlung von akut und chronisch kranken Patienten sowie der peri-operative Kontrolle gesehen werden. Es ist bekannt, dass im Fall einer akuten Pankreatitis die Prognose eines letalen Ausgangs durch eine Infektion von 16% auf 40% signifikant verschlechtert. Bei der Ausbildung einer komplexen Superinfektion besteht ein hohes Risiko einer Sepsis mit einer Mortalität von bis zu 90%. Des Weiteren ist die Verlaufsbeobachtung einer intra-abdominalen Inflammation und/oder Infektion bei chronisch kranken, postoperativen und Trauma-Patienten von Bedeutung. Es bestehen auch heute Schwierigkeiten einer eindeutigen klinischen Diagnose von intra-abdominalen Infektionen. Die Verlaufsbeobachtung chronisch Kranker, wie zum Beispiel Patienten mit Leberzirrhose oder Niereninsuffizienz ist von klinischer Relevanz, da diese Patientengruppe in Abhängigkeit der Organdekompensation prädestiniert sein kann inflammatorische und oder infektiöse Krankenverläufe zu nehmen. Insbesondere niereninsuffiziente Patienten mit Peritonealdialyse neigen zu chronischen Inflammationen und Infektionen [Blake, 2008]. Von besonderem Interesse ist die Beobachtung von Patienten mit Leberzirrhose, da diese spontane bakterielle Peritonitiden entwickeln können, die eine hohe Mortalität aufweisen. [Koulaouzidis et al., 2009]. Die Diagnose von sekundären Peritonitiden im Rahmen einer postoperativen Nachbehandlung ist von großem klinischem Wert und kann den Operationserfolg stark beeinflussen. Postoperative Infektionen sind auch heute noch ein großes Problem in der chirurgischen Behandlung. Ein Prozent der durchgeführten Laparotomien führen zu Komplikationen nach der Operation. Dabei kann die Komplikationsrate zwischen den chirurgischen Prozeduren stark schwanken. Insbesondere Eingriffe am Magen-Darm-Trakt können durch Nahtinsuffizienzen zu einer fulminanten Ausbreitung von Bakterien in den sterilen Bauchraum führen.
Infektiöse Verläufe spielen unter anderem auch in der Operationsfolgebehandlung nach Transplantationen, Thorakotomien, Extremitäten- und Gelenkkorrekturen und neurochirurgischen Eingriffen eine Rolle.
Dem Fachmann ist bekannt, dass es sich bei diesen Ausführungen lediglich um eine beispielhafte Auswahl handelt und es zahlreiche weitere Anwendungsfelder gibt, für die die Erkennung und Verlaufsbeobachtung eines infektiös-inflammatorischen Prozesses und die Beurteilung seines Ausmaßes und das daraus resultierende Risiko des Auftretens von entsprechenden Komplikationen von großer Wichtigkeit ist. Mit der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung für dieses diagnostische Problem bereitgestellt.
Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von fachübergreifender klinisch-medizinischer Bedeutung, denn dadurch werden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z. B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz-/Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie, etc.) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos aufgrund unbalancierter und unkontrollierter infektiös-inflammatorischer Prozesse immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 wurde ein Anstieg um 139%, nämlich von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten verzeichnet [MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden.
Insbesondere bei Patienten, welche die initiale fulminante systemische Inflammationsantwort auf hochvirulente Erreger überstanden haben, kommt es zu einer lange andauernden Phase mit erhöhtem Risiko für Sepsis-induziertes Multiorganversagen (bis zu mehreren Wochen). Derzeit wird als Ursache dieses Risikos eine induzierte Immunsuppression diskutiert. Neben der Unfähigkeit des Immunsystems, die primäre Infektion zu neutralisieren, entwickeln sich im Intensivpatienten oft sekundäre Infektionen mit mehrfach anibiotikaresistenten und wenig virulenten Keimen bzw. kommt es zum Ausbruch latenter Virusinfektionen [Hotchkiss et al. 2009, 2010]. Daraus resultiert eine hohe klinische Relevanz, insbesondere vor dem Hintergrund der steigenden Resistenzentwicklung gegenüber Antibiotika und dem Mangel an neuen wirksamen antimikrobiellen Wirkstoffen. Ein wichtiges Ziel klinischer Forschung ist demnach die Prävention dieser Sepsis-induzierten Immunosuppression. Molekulare Targets für eine Intervention in Form einer molekularen Immunotherapie sind bekannt (wie IL-15 und IL-7 als antiapoptotische und immunstimulatorische Zytokine), jedoch zeigen erste klinische Untersuchungen auf, dass die Therapieentscheidung auf Basis des individuellen Immunstatus erfolgen sollte. Das enge Monitoring innater und adaptiver Immunfunktionen in weiteren Studien erfordert neue und komplexere Messwerkzeuge für die immunsupprimierten Patienten, um die Balance aus pro- und antiinflammatorischen Signalen zugunsten der Patienten zu verschieben.
Als Mechanismen der Immunosuppression werden derzeit angesehen:

• Produktion antiinflammatorischer Zytokine, z. B. IL-10, dadurch kann die Entwicklung der sog. T-Zell-Anergie induziert werden (non-responsives Verhalten)
• Absterben von Immunzellen
– Apoptotische Depletion von Immun-Effektorzellen (z. B. Lymphozyten und dendritische Zellen)
– Die Wiederherstellung der Normalpopulation spezifischer Zellen ist offenbar mit verbesserter Prognose verbunden
• Unterdrückung von MHC-ClassII-Molekülen (Unterdrückung der Induktion der adaptiven Immunantwort)
• Expression negativer kostimulatorischer Moleküle (PD-1, CTLA-4)

Eine Studie [Meisel et al 2009] liefert das erste Beispiel für eine therapeutische Intervention in immunsupprimierten Patienten. Es wurden molekulare Oberflächenmarker von Monozyten genutzt (HLA-DR), um eine Aussage über den Immunstatus zu gewinnen. Eine stark verringerte Monozytenpopulation ist ein charakteristischer Anzeiger für sepsis-assoziierte Immunosuppression (auch gezeigt in Venet et al. 2010). Bei geringer HLA-DR-Expression im Blut von Patienten wurden diese mit dem Wachstumsfaktor GM-CSF bzw. einem Placebo behandelt. GM-CSF hat stark immunostimulatorische Eigenschaften, insbesondere werden Phagozytose, Proliferation und die Pathogenabwehr von Neutrophilen und Monozyten/Makrophagen stimuliert. Es wurde in vorherigen Studien gezeigt, dass Immunstimulanzien die langandauernde Monozyten-Deaktivierung wieder umkehren können. Im Ergebnis der Studie konnte für viele Immunzellpopulationen ein zahlenmäßiger Anstieg nachgewiesen werden: Sowohl die Monozyten, als auch die Neutrophilen und Lymphozytenpopulationen profitierten von der Behandlung. Die Patienten wiesen in der Behandlungsgruppe ebenfalls Verbesserungen des klinischen Zustandes auf: kürzere Beatmungszeit und Krankenhausverweildauer zeichneten sich ab. Es konnte erstmals der positive Einfluss einer Biomarergeleiteten immunstimulatorischen Therapie auf immunologischer und klinischer Ebene nachgewiesen werden.
In einer weiteren Studie wurde die immunsuppressive Phase der Sepsis näher charakterisiert [Muenzer et al. 2010]. Auf die initiale hyperinflammatorische Phase, die mit einem sog. Zytokin-Sturm, daraus resultierender früher Organschädigung und Tod der Patienten verbunden sein kann, folgt eine Phase mit andauernder Immunsuppression. Die Balance des Immunsystems ist demzufolge in beiden Phasen gestört, die Bedeutung einer Intervention in der zweiten Phase wird durch das Auftreten von sekundären Infektionen und extrem hoher Mortalität unterstrichen. Im Mausmodell konnte gezeigt werden, wie im Sepsisverlauf über 7 Tage hinweg mit einem Immunmodulator die IL-10-Synthese blockiert und die Produktion proinflammatorischer Zytokine stimuliert werden konnte. Insbesondere wurde festgestellt, dass der Zeitpunkt eines sog. „second hit”, also einer zweiten Infektion, für das Überleben des Organismus von entscheidender Bedeutung ist. Der Status der Immunparalyse dauerte im Mausmodell 4 Tage an, am Tag 7 nach dem septischen Stimulus war die Immunantwort teilweise wiederhergestellt. Dies äußerte sich in der Überlebensrate der Tiere nach einem septischen Stimulus, diese war nach 7 Tagen höher als nach 4 Tagen. Im hypoinflammatorischen Zeitfenster (4Tage) konnte die Überlebensrate durch den Immunmodulator AS101 bzw. durch Blockierung von IL-10 ebenfalls gesteigert werden. Bis zur Normalisierung des Immunstatus, der Rückkehr der innaten Immunzellen und der Balancierung der pro- und antiinflammatorischen Signalkaskaden entsteht also eine kritische Lücke mit hohem Risiko für weitere Infektionen und das Überleben des Patienten.
Eine andere Studie beschreibt drastische Veränderungen der Lymphozytenpopulationen in Patienten mit septischem Schock [Venet et al. 2010]. Die Tatsache, dass diese extensiven Veränderungen zumeist zum Zeitpunkt der Diagnose festgestellt werden können, deutet darauf hin, dass sie ein sehr frühes Ereignis in der Kette der Prozesse sind, die zur Immunparalyse und Prädisposition für weitere Infektionen führen. In Studien mit Patienten lässt sich der genaue Beginn der septischen Episode nicht genau definieren, dadurch lassen sich die Studienpopulationen bezüglich des Krankeitsverlaufs nicht zuverlässig synchronisieren. Es konnte allerdings festgestellt werden, dass nach dem Einsetzen des septischen Schocks der immunsupprimierte Zustand für ca. 48 Stunden trotz intensivmedizinischer Maßnahmen anhielt. Hier entsteht enormer Bedarf nach einem Monitoring-Tool, um die Patienten für immunmodulatorische Interventionen zu qualifizieren.
Der Immunzustand von Patienten mit Sepsis-Diagnose ist demzufolge in starkem Umfang beeinträchtigt. Die Beeinträchtigung betrifft sowohl das innate als auch das adaptive Immunsystem. Merkmale dieser Beeinträchtigung sind der Verlust von Immun-Effektor-Zellen aus dem peripheren Blutstrom durch Apoptose, die Abnahme der Expression von MHCII Molekülen und die Abnahme der Stimulierbarkeit von Monozyten durch Zytokine. Diese Beeinträchtigung des Immunzustandes kann reversibel sein. Die Folge der Beeinträchtung ist einerseits die Unfähigkeit Infektionen zu eliminieren und einen Infektionsfokus zu kontrollieren, so dass dieser weiterhin aktiv bleibt. Zusätzlich besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit sekundäre, nosokomiale Infektionen auszubilden. Solche Infektionen werden häufig von minder-pathogenen Bakterien verursacht, die im Falle eines intakten Immunzustandes keine Gefährdung darstellen.
Die makroskopische post-mortem Untersuchung von 235 kritisch kranken Patienten, deren Totesursache Sepsis oder septischer Schock war, ergab, dass in 80% dieser Fälle ein aktiver Infektionsfokus festgestellt wurde [Torgersen et al., 2009]. Die am häufigsten betroffenen Organe waren Lunge, Abdomen und der Urogenitaltrakt. Eine große Zahl dieser Patienten wurde wegen einer Sepsisdiagnose auf die Intensivstation verlegt und dort vor ihrem Tod länger als 7 Tage behandelt. Dieser Zeitraum kann als ausreichend lang angesehen werden, um einen Infektionsfokus unter Kontrolle zu bringen. Obwohl die sofortige Fokussanierung in Kombination mit Antibiose die zentralen Maßnahmen der Sepsis-Therapie darstellen, waren die Maßnahmen zur Fokuskontrolle bei der Mehrzahl der Studienpatienten nicht erfolgreich gewesen und scheinen die Todesursache gewesen zu sein. Die Empfehlung der Autoren der Publikation ist es, bessere diagnostische und therapeutische Methoden zu entwickeln, um dem medizinischen Bedarf in diesem Bereich gerecht zu werden.
In einer kürzlich veröffentlichten Studie wird geschlussfolgert dass etwa 20% der Patienten, die mit einem Sepsis-Verdacht in der Klinik aufgenommen werden nach sorgfältiger Prüfung tatsächlich nicht-infektiöse Ursachen der Erkrankung aufweisen, die in ihrem Erscheinungsbild jedoch dem der Sepsis gleichen. Die Autoren interpretieren ihre Ergebnisse dahingehend, dass die Sepsis vielmehr das Kontinuum eines Syndroms umfasst und keine abgegrenzte spezifische Erkrankung darstellt [Heffner et al., 2010].
In einer Kohorte von 857 Patienten wurde der Endotoxin-Level am Tag ihrer Aufnahme auf der Intensivstation untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass Endotoxämie, ein signifikant erhöhter Endotoxin-Spiegel im Blut der Patienten, weit verbreitet bei kritisch krankern Patienten ist. In mehr als der Hälfte aller untersuchten Patienten wurde ein Endotoxin-Level höher als 2 Standard-Abweichungen des bei Gesunden Probanden ermittelten Wertes gemessen. Gleichzeitig wurde eine große Diskrepanz zwischen einem hohen Endotoxin-Wert und der Anzahl der bestätigten Infektionen mit gram-negativen Pathogenen beobachtet. Es wird geschlußfolgert, dass der Ursprung des Endotoxins endogener Natur sein und in der Darmflora liegen muss wobei aufgrund von Translokations-Prozessen sowohl Endotoxin als auch lebensfähige Bakterien in den Blutstrom gelangen können. Hohe Endotoxin-Werte waren mit höheren APACHE II Scores und einer höhere Prävalenz der schweren Sepsis korreliert sodass angenommen wird, das Endotoxämie eine Hoch-Risiko Subpopulation bei kritisch kranken Patienten anzeigt [Marshall et al., 2004].
Endotoxämie kann ebenfalls als eine Ursache exzessiver Stimulation des Immunsystems angesehen werden.
Ein Review gibt Überblick über klinische und immunologische Parameter, die das Risiko bestimmen, nach schweren Operationen und Trauma eine septische Komplikation und lethale Folgen zu eintwickeln [Kimura et al., 2010]. Der aktuelle Stand der Technik legt nahe, daß operative Eingriffe und traumatische Verletzungen die sog. innate und adaptive Immunantwort so schwerwiegend beeinflussen, daß eine Suppression der zellulären Immunität des Körpers als Folge einer überschießenden inflammatorischen Reaktion verantwortlich für die hohe Anfälligkeit einer nachfolgenden septischen Episode ist. Die Reaktionskaskaden der innaten und der adaptiven Immunantwort werden durch sog. Pathogen-assoziierte Molekulare Strukturen (PAMPS) und Gewebeschaden-assoziierte Molekulare Strukturen (DAMPS) durch die entsprechenden Erkennungsrezeptoren initiert und moduliert.
Das Spektrum des Krankheitsgeschehens, dass somit von der Erfindung erfasst wird, ist die Progression einer infektiös-inflammatorischen Reaktion des Körpers, auch Host Response oder Wirtsantwort genannt, von der Befähigung effektiv Pathogene zu bekämpfen bis zur Suppression der Immunabwehr, bei der die Pathogene and der Infektionsstelle persistieren und sekundäre und/oder nosokomiale Infektionen auftreten.
Bei dem Einsatz molekular-diagnostischer DNA-basierter Pathogenidentifizierung sind klinisch irrelevante Ergebnisse wie nicht-Erkrankungsassozierter Bakteremie, die Präsenz frei zirkulierender bakterieller und fungaler Nukleinsäuren aus Kolonisierung sowie auch die Detektion nicht-vitaler Pathogen-Zellen problematisch für die Bewertung des Ergebnisses. Die Präsenz zirkulierender mikriobieller DNA aus Translokationsprozessen oder das transiente Vorhandendensein von nicht-Krankheitsassoziierten Bakterien in Blut wurden in vivo nachgewiesen. [Dagan et al., 1998; Isaacman et al., 1998]. Die Herkunft und die klinische Signifikanz solcher Falsch-Positiv Ergebnisse sind meistens unklar und könnten aus bislang unbekannten Wirt-Pathogen Wechselwirkungen resultieren [Schrenzel, 2007]. Außerdem sind Fälle bekannt, bei denen Bakterien aus dem Blut symptomfreier Blutspender isoliert wurden und selbst von transienter Fungämie ohne sichtbare klinische Signifikanz wurde schon berichtet [Davenport et al., 2007, Rodero et al., 2002].
In den eben beschriebenen, ”unklaren” Fällen kann die Messung des definitionsgemäßen Immunzustandes genutzt werden, um die Signifikanz und klinische Relevanz des Befundes aus DNA-basierter Pathogendetektion zuverlässiger zu bewerten.
Der Gegenstand der Erfindung kann wie folgt zusammengefasst werden. Exzessive Stimulation des Immunsystems durch PAMPS und DAMPS, z. B. durch einen unkontrollierten Infektionsherd oder durch übermäßiges Entzündungsgeschehen nach einem schweren operativen Eingriff, beeinflusst das innate und adaptive Immunsystem. Die dadurch auftretende Reaktion des Körpers, auch als Host Response oder Wirtsantwort bezeichnet bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung” ist abhängig von dem Ausmaß, der Menge, der Dauer und/oder Frequenz der infektiösen und/oder inflammatorischen Stimulation. Diese Stimulation kann nicht direkt, sondern als Reaktion des Körpers auf die Stimulation, als Schweregrad der Host Response (Wirtsantwort), gemessen werden. Diese Reaktion weist eine kontinuierliche Veränderung in Form eines Anstieges vom Zustand des Gesunden bis zu einem Maximum, wie es z. B. im Extremfall der Blutstrom-Infektion vorliegt, auf. In einer Vielzahl von Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Körper in diesem Zustand nicht mehr über die Schutzmechanismen des Immunsystems verfügt. Vorhandene Infektionen können nicht mehr effektiv bekämpft werden. Es besteht ein hohes Risiko in dieser Phase eine sekundäre Infektion auszubilden. Dies gilt vor allem in Fällen, in denen sterile Prozesse Ursache für die Induzierung der Immunsuppression waren. Klinische Maßnahmen, wie z. B. Identifizierung der Ursache der exzessiven Stimulation, Kontrollieren des Infektionsherdes, operative Fokussanierung, gezielte Antibiose oder präventive medikamentöse Therapien, zu deren Beendigung/Blockierung, müssen in diesen Fällen zeitnah eingeleitet werden. Die Erfindung stellt einen diagnostischen Test zur Verfügung, der zur Feststellung und Verlaufsbeobachtung des beschriebenen Krankheitsprozesses sowie zur Erfolgskontrolle der ergriffenen Therapiemaßnahmen verwendet werden kann.
Die exzessive Stimulation kann die folgenden Ursachen haben:

– Unkontrollierter Infektionsherd
– Insult durch steriles inflammatorisches Geschehen
– Gewebeschaden durch Operation
– Gewebeschaden durch Trauma
– Nekrotische Vorgänge
– Endotoxämie
– Translokation aus dem Darm infolge eines schwerwiegenden pathologischen Geschehens

Die genannten Vorgänge führen zu transienter, induzierter Immunsuppression des innaten und adaptiven Immunsystems und sind korreliert mit:

– Hoher Moralität durch einen unkontrollierten Infektionsherd
– Hohem Risiko einer nosokomialen oder sekundären Infektion verbunden mit lebensbedrohlichen Komplikationen

Diesem pathophysiologischen Geschehen muss durch, für den jeweiligen Fall geeignete, klinische Maßnahmen begegnet werden:

– Identifizierung eines Infektionsfokus durch Eskalation der diagnostischen Maßnahmen
– Fokussanierung, auch durch operative Eingriffe
– Gezielte Antibiose bei bekannten Pathogenen
– Kalkulierte Antibiose zur Prävention einer sekundären Infektion
– Immunstimulatorische Therapiemaßnahmen
– Antiinflammatorische Therapiemaßnahmen bei sterilem infektiösen Geschehen

Mehrere Ansätze zur Diagnosestellung von SIRS und Sepsis wurden entwickelt.
Eine Gruppe enthält Score-Systeme wie beispielsweise APACHE, SAPS und SIRS, welche die Patienten auf der Basis einer Vielzahl physiologischer Indices stratifizieren können. Während in einigen Studien für den APACHE II Score ein diagnostisches Potential nachgewiesen werden konnte, haben andere Studien gezeigt, dass APACHE II und SAPS II nicht zwischen Sepsis und SIRS differenzieren können [Carrigan et al., 2004].
In einem Review fassen Pierrakos und Vincent [Pierrakos et al., 2010] den Stand der Biomarker-Suche in der Indikation Sepsis zusammen. Es wurden 3370 Publikationen zu 178 verschiedenen Biomarkern gesichtet. Die Schlussfolgerung ist, das die meisten Biomarker in vornehmlich in klinischen Studien und hauptsächlich als prognostische Marker untersucht wurden. Wenige wurden als diagnostische Marker getestet. Keiner dieser Kandidaten hat ausreichende Sensitivität oder Spezifität für eine routine-mäßige Anwendung in der Klinik gezeigt. Kein Marker wurde auf die eine Fragestellung zum Immunstatus eines Patienten getestet. Procalcitonin (PCT) und C-reactive Protein (CRP) werden zwar angewendet, aber zeigen ebenfalls nur begrenzte Eigenschaften zur Unterscheidung von Sepsis und anderen inflammatorischen Zuständen oder die Nützlichkeit zur Vorhersage bestimmter Outcomes.
Procalcitonin ist ein 116 Aminosäuren langes Protein, das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Trotz der weitgehenden Akzeptanz des Biomarkers PCT konnte in internationalen Studien gezeigt werden, dass die erreichten Sensitivitäten und Spezifitäten des Sepsismarkers PCT vor allem bei der Abgrenzung einer systemischen bakteriellen SIRS, also Sepsis, von einer nicht -bakteriellen SIRS noch immer unzureichend sind [Ruokonen et al., 1999; Suprin et al., 2000; Ruokonen et al., 2002; Tang et al., 2007a]. Die Meta-Analyse von Tang und Kollegen [Tang et al., 2007a], in der 18 Studien berücksichtigt wurden, zeigt, dass PCT nur schlecht geeignet ist, um SIRS von Sepsis zu diskriminieren. Darüberhinaus betonen die Autoren, dass PCT eine sehr schwache diagnostische Genauigkeit mit einem Odd Ratio (OR) von 7.79 hat.
C-reaktives Protein (CRP) ist ein 224 Aminosäuren langes Protein, das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Die Messung von CRP soll dazu dienen, um den Krankheitsverlauf sowie die Wirksamkeit der gewählten Therapie zu verfolgen.
In mehreren Berichten wurde beschrieben, dass im intensivmedizinischen Bereich PCT ein besser geeigneter diagnostischer Marker als CRP ist [Sponholz et al., 2006; Kofoed et al., 2007]. Darüber hinaus wird PCT als besser geeignet als CRP angesehen, um eine nicht infektiöse versus infektiöse SIRS sowie bakterielle versus virale Infektion zu unterscheiden [Simon et al., 2004].
Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass die mit dieser Erfindung bereitgestellte, Lösung mit den vorgenannten Biomarkern wie z. B. aber nicht ausschließlich PCT oder CRP kombiniert werden kann um die diagnostische Aussage zu erweitern.
Eine weitere Gruppe enthält Biomarker oder Profile, die auf Transkriptom-Ebene identifiziert wurden. Genexpressionsprofile oder Klassifikatoren sind für die Bestimmung des Schwergrads von Sepsis [ WO 2004/087949 ], die Unterscheidung zwischen einer lokalen oder systemischen Infektion [nicht veröffentlichte DE 10 2007 036 678.9 ], die Identifizierung der Infektionsquelle [ WO 2007/124820 ] oder von Genexpressionssignaturen für die Unterscheidung zwischen mehreren Ätiologien und Pathogen-assoziierten Signaturen [Ramilo et al., 2007] geeignet. Allerdings besteht aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensitivität der Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992], der aktuell verfügbaren Proteinmarker sowie aufgrund des Zeitbedarfs des Nachweises der Infektionsursache durch Blutkultur ein dringender Bedarf für neue Verfahren, die die Komplexität der Erkrankung berücksichtigen. Viele Geneexpressionsstudien, die entweder einzelne Gene und/oder Kombinationen von Genen, die als Klassifkatoren benannt sind, verwenden sowie zahlreiche Beschreibungen von statistischen Verfahren zur Ableitung eines Score und/oder Index [ WO 2003/084388 ; US 6960439 ] gehören zum Stand der Technik.
Bei der Verwendung von Genexpressionsmarkern für die Bestimmung eines pathophysiologischen Zustandes werden stets die in einer Probe vorhandenen Mengen der entsprechenden mRNA, die Genexpressions-Level, quantitativ bestimmt. Die durch diese Genexpressionslevel ermittelte Information ist die jeweilige Über- oder Unterexpression dieser mRNAs, die bezogen auf einen Kontroll-Zustand oder bezogen auf Kontroll-Gene experimentell ermittelt wird. Die Feststellung von Über- oder Unterexpression kann analog zur Bestimmung der Konzentration einer Protein-Biomarkers gesehen werden.
Mehrere Anwendungen von Genexpressionsprofilen sind in dem Stand der Technik bekannt.
Pachot und Kollegen [Pachot et al., 2006] untersuchten, ob sich anhand von differentieller Genexpression aus Vollblut Vorhersagen zur Outcome-Variable Überleben vs. nicht-Überleben bei Patienten mit septischem Schock treffen lassen. Zu dieser Fragestellung identifizierten sie durch Screening auf einem Affimetrix-Array eine Signatur aus 28 differentiell exprimierten Genen. In einem sehr kleinen Testdatensatz zeigten sie, dass sich mit dieser Signatur Survivor und Non-Survivor mit hoher Sensitivität und Spezifität unterscheiden liessen. Zur Plausibilität des Ergebnisses argumentieren sie, daß die Spätphase des septischen Schocks durch die Ausbildung eines immunsupprimierten Zustandes charakterisiert ist und dass eine Wiederherstellung der Immunfunktion notwendig für das Überleben der Patienten ist. Sie führen dazu aus, dass eine Reihe der bei Überlebenden überexprimierten Gene dem innaten Immunsystem zuzuordnen sind und begründen die festgestellte Überexpression mit der Erholung des Immunsystems.
Die vorliegende Erfindung kann von dem eingangs diskutierten Stand der Technik abgegrenzt werden. Die Erfindung hat die Feststellung und Verlaufsbeobachtung der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation, auch als Host Response oder Wirtsantwort bezeichnet, bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung” zum Gegenstand. Sie ist unabhängig vom Vorliegen eines septischen Schocks und nicht auf diese Patientengruppe beschränkt. Sie dient zur Feststellung eines bestimmten Zustandes und nicht zur Unterscheidung von Überleben vs. nicht-Überleben nach septischem Schock. Auch ist die vorliegende Erfindung unabhängig vom Vorliegen einer Infektion entsprechend der gängigen Sepsis-Definition. Es wird in der voliegenden Schrift gezeigt, dass ein kritischer Zustand, eine maximale Immunbelastung” auch ohne Infektion, z. B. exzessive Stimulation des innaten Systems durch andere Ursachen, vorliegen kann. Die Verwendung der Erfindung liegt in der Ableitung geeigneter Therapiemaßnahmen und der Verlaufsbeobachtung jedoch nicht in der Vorhersage, welcher der Patienten überleben wird.
In einem Review [Monneret et al., 2008] wird die Bedeutung des eines effektiv arbeitenden Immunssystems anhand einer Reihe von wissenschaftlichen Ergebnissen dargestellt und zusammengefasst, durch welche Untersuchungen diese Annahme plausibilisiert wird. Gleichzeitig wird ausgeführt, dass geeignete Verfahren zur routinemäßigen Feststellung des Immunzustandes erst noch determiniert werden müssen.
Der Stand der Technik enthält zahlreiche Studien zur Identifikation von Genexpressionsmarkern [Tang et al., 2007b] oder Genexpressionsprofilen für die Feststellung einer systemischen Infektion [Johnson et al., 2007].
Tang und Kollegen [Tang et al., 2007b] suchten in einer bestimmten Blutzellpopulation, den Neutrophilen, nach einer Signatur, welche eine Unterscheidung von Patienten mit SIRS und Sepsis ermöglicht. 50 Marker aus dieser Zellpopulation genügen um die Immunantwort auf eine systemische Infektion wiederzugeben und neue Erkenntnisse zur Pathophysiologie und den beteiligten Signalwegen zu ermöglichen.
Die Klassifikation von Patienten mit und ohne Sepsis gelingt mit hoher Sicherheit (PPV 88% bzw. 91% in Trainings- und Testdatensatz). Die Anwendbarkeit für die klinische Diagnose ist allerdings dadurch begrenzt, dass im Blut diese Signatur von Signalen aus anderen Blutzelltypen überlagert werden kann. Bezüglich der Anwendbarkeit ist die Präparation dieser Blutzellpopulation mit erheblich erhöhtem Aufwand verbunden. Die Aussagekraft der in dieser Studie publizierten Ergebnisse ist für praktische Anwendungen jedoch limitiert, weil die Patientenauswahl sehr stark heterogen war. Es wurden Patienten in die Studie eingeschlossen, die stark unterschiedliche Begleiterkrankungen wie z. B zu 11% bis 16% Tumorerkrankungen aufwiesen oder sehr stark unterschiedlichen therapeutischen Maßnahmen unterlagen (z. B. 27% bis 64% Vasopressor-Therapie), wodurch die Genexpressionsprofile stark beeinflusst wurden.
Johnson und Kollegen [Johnson et al., 2007] beschreiben an einem Kollektiv von Traumapatienten, dass sich die Ausprägung einer Sepsis bereits bis zu 48 Stunden vor der klinischen Diagnose anhand molekularer Veränderungen messen lässt. Die Traumapatienten wurden über mehrere Tage untersucht. Ein Teil der Patienten entwickelte eine Sepsis. Nichtinfektiöse SIRS-Patienten wurden mit präseptischen Patienten verglichen. Die identifizierte Signatur aus 459 Transkripten setzt sich aus Markern der Immunantwort und Entzündungsmarkern zusammen. Probenmaterial war Vollblut, die Analysen wurden auf einem Mikroarray durchgeführt. Unklar ist, ob sich diese Signatur auch auf andere Kollektive septischer bzw. präseptischer Patienten ausdehnen lässt. Eine Klassifikation und der diagnostische Nutzen dieser Signatur wurde nicht gezeigt.
Diese Arbeiten zielen alle auf die Identifizierung eines infektiösen Geschehens durch differentielle Genexpression. Somit können diese Veröffentlichungen gut vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung, der Identifizierung und Verlaufsbeobachtung der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation, auch als Host Response oder Wirtsantwort bezeichnet, bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung”, abgegrenzt werden
Das Ziel von Feezor und Kollegen [Feezor et al., 2003] war es, Unterschiede zwischen Infektionen mit gram-negativen und gram-positiven Erregern zu identifizieren. Blutproben von drei verschiedenen Spendern wurden ex vivo mit E.coli-LPS und Hitze-inaktiviertem S. aureus stimuliert. Mittels Microarraytechnologie wurden Genexpressionsuntersuchungen durchgeführt. Die Arbeitsgruppe fand sowohl Gene, die nach S. aureus-Stimulation hochreguliert und nach LPS-Stimulation herunterreguliert waren, als auch Gene die nach LPS-Behandlung stärker exprimiert wurden als nach der Zugabe von Hitze-inaktivierten S. aureus-Keimen. Gleichzeitig wurden viele Gene durch gram-positive und gram-negative Stimulation in gleichem Maße hochreguliert. Dies betrifft zum Beispiel die Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6. Die differentiell exprimierten Gene wurden leider nicht namentlich veröffentlicht, so dass lediglich ein indirekter Vergleich anderen Ergebnissen möglich ist. Neben der Genexpression wurden von Feezor und Kollegen auch die Plasmakonzentrationen einiger Zytokine untersucht. Dabei korrelierten die Genexpressionsdaten nicht zwangsweise mit den Plasmakonzentrationen. Bei der Genexpression wird die Menge an mRNA vermessen. Diese ist jedoch vor der Proteinsynthese posttranskriptionaler Regulation unterworfen, woraus die beobachteten Unterschiede resultieren können.
Die interessanteste Publikation zu diesem Thema wurde von einer texanischen Forschungsgruppe um Ramilo [Ramilo et al., 2007], veröffentlicht. Hier wurden ebenfalls Genexpressionsuntersuchungen an humanen Blutzellen durchgeführt, die Unterschiede in der molekularen Wirtsreaktion auf verschiedene Pathogene aufdeckten. Dazu wurden pediatrische Patienten mit akuten Infektionen, wie z. B. akuten Atemwegserkrankungen, Harnwegsinfektionen, Bakteriämien, lokalen Abszessen, Knochen- und Gelenkinfektionen sowie Meningitis untersucht. Microarrayexperimente wurden mit RNA-Proben durchgeführt, die aus peripheren mononuklearen Blutzellen von jeweils zehn Patienten mit E. coli- bzw. S. aureus-Infektion isoliert wurden. Die Identifizierung der Erreger erfolgte mittels Blutkultur. Anhand des Trainingsdatensatzes wurden 30 Gene identifiziert, durch deren Verwendung die verursachenden pathogenen Keime mit hoher Genauigkeit diagnostiziert werden konnten.
Diese Arbeiten lassen sich klar der vorliegenden Erfindung abgrenzen, da hier anhand von Genexpression-Signaturen der Wirtsantwort die verursachenden Pathogene festgestellt werden sollen, die Erfindung jedoch zur Feststellung und Verlaufsbeobachtung der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung” verwendet werden soll.
Keine dieser Publikationen bietet die Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Robustheit der hier offenbarten Erfindung. Diese Studien sind darauf konzentriert, den aus wissenschaftlicher Sicht ”besten” Multigenbiomarker (Klassifikator) zu identifizieren, jedoch nicht, wie in der vorliegenden Erfindung, den für eine spezifische klinische Fragestellung optimalen Multigenbiomarker [Simon et al., 2005].
Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, mit dem eine schnelle und zuverlässige Aussage über einen pathophysiologischen Zustand, im vorliegenden Fall handelt es sich um die Feststellung und Verlaufsbeobachtung der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation, auch als Host Response oder Wirtsantwort bezeichnet, bzw. die daraus resultierende „Immunbelastung” getroffen werden kann, jedoch ohne auf zustandsspezifische Biomarker angewiesen zu sein.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt verfahrenstechnisch durch die Merkmale des Anspruchs 1.
Bezüglich einer Verwendung wird die Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 18, 19 und 24 gelöst.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response (Wirtsantwort) eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, in einer Probe, wobei eine Messvorrichtung verwendet wird, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Gensonden aufweist, welche das im Wesentlichen gesamte Humangenom repräsentieren;
wobei

– Nucleinsäure-Proben einer Mehrzahl von Probanden, die einen bekannten phänotypischen physiologischen Zustand aufweisen, mit den Sonden der Messvorrichtung in Kontakt gebracht werden, um Expressionssignale einer jeweiligen Expression eines Gens zu erhalten;
– aus der Gesamtzahl der eingesetzten Gensonden solche ausgewählt werden, die ein Expressionssignal mit detektierbarer Intensität für mindestens eine Nucleinsäure-Probe eines Probanden liefern;
– die Probanden je nach ihrem Infektions- und/oder Inflammationsstatus in wenigstens zwei der folgenden klinisch ermittelten Phänotypgruppen eingeteilt werden:
wobei „a” eine UND-Verknüpfung zwischen den Eigenschaften S, L und N darstellt;
– die Änderungen der Genexpressionssignale zwischen den Phänotypgruppen statistisch verglichen werden und bewertet wird, ob ein signifikanter Unterschied zwischen mindestens zwei der Phänotypgruppen besteht;
– solche Gensonden ausgewählt werden, deren Genexpressionssignale zwischen mindestens zwei Phänotypgruppen statistisch signifikant verändert sind und eine geschätzte Anzahl von solchen Gensonden ausgeschlossen wird, die in Bezug auf einen vorgegebenen Schwellwert ein falsch positives Ergebnis liefern;
– ein Master-Score als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, durch Quantifizierung der Zu- und Abnahme in der Genexpressionsintensität der ausgewählten Gensonden ermittelt wird; und

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist; zur Erfassung eines Scores als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet.
Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist; zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
In der Praxis der Anmelderin hat sich herausgestellt, dass eine solche Verwendung besonders geeignet ist, welche dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR, insbesondere sondenbasierte Verfahren wie Taq-Man, Scorpions, Molecular Beacons; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays; und/oder direkter mRNA-Nachweis, insbesondere Sequenzierung oder Massenspektrometrie; und/oder isothermale Amplifikation, erfasst werden [Valasek et al., 2005; Klein, 2002]. Mit diesem klassischen Verfahren lassen sich hochsensitiv DNA und über die reverse Transkription (RT) auch RNA nachweisen [Wong et al., 2005; Bustin, 2002].
Real-Time-PCR, auch quantitative PCR (qPCR) genannt, ist eine Methode zur Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren in Echtzeit [Nolan et al., 2006]. In der Molekularbiologie gehört sie bereits seit einigen Jahren zu den etablierten Standardtechniken.
Die quantitative Bestimmung eines Templates kann mittels absoluter oder relativer Quantifizierung erfolgen. Bei der absoluten Quantifizierung findet die Messung anhand externer Standards, z. B. Plasmid-DNA in unterschiedlichen Verdünnungen, statt. Die relative Quantifizierung nutzt dagegen so genannte Housekeeping- oder Referenzgene als Referenz [Huggett et al., 2005].
Für die erfindungsgemäßen Verfahren (Arraytechnik und/oder Amplifikationsverfahren) wird die Probe ausgewählt aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.
Es ist bevorzugt, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Es ist dem Fachmann klar, dass die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeipielen sowie anhand der Zeichnung.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in einer Verwendung, die dadurch gekennzeichnet, dass aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands ist, wobei vorzugsweise der Index auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt wird.
Es ist ferner bevorzugt, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme, insbesondere für die Verwendung zur Patientenstratifikation und als Einschlusskriterium für klinische Studien, einsetzt.
Darüber hinaus ist eine Verwendung bevorzugt, bei welcher zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis 7704 aufweisen.
Vorzugsweise ist die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA.
Es muß jedoch betont werden, dass die genannten Primer lediglich beispielhaft sind.
Die genannten Amplikons können beispielsweise als Sonden für Hybridisierungsverfahren verwendet werden.
Im Rahmen eines optimierten EDV-gestützten Krankenhausmanagements wie auch zur weiteren Forschung auf dem Gebiet der Sepsis hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme einsetzt.
Bevorzugt ist der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index oder Score gebildet wird.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hat es sich ferner als vorteilhaft herausgestellt, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, erfasst werden.
Bei der Erfassung der Genaktivitäten auftretende differentielle Expressionssignale der in dem Multigenbiomarker enthaltenen Polynukleotidsequenzen können vorteilhaft und eindeutig einem pathophysiologischen Zustand, einem Verlauf und/oder Therapiemonitoring zugeordnet werden.
Dieser Score kann dem behandelnden Arzt ein schnelles diagnostisches Hilfsmittel in die Hand geben.
Die Anmelderin hat mehrere Verfahren entwickelt, das unterschiedliche Sequenzpools benutzt, um Zustände festzustellen und/oder zu unterscheiden oder definierte Untersuchungsfragen zu beantworten. Beispiele sind in folgenden Patentschriften zu finden: Unterscheidung zwischen SIRS, Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen [ WO 2004/087949 ; WO 2005/083115 ], Erstellung von Kriterien zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei Sepsis [ WO 05/106020 ], Unterscheidung zwischen nichtinfektiösen und infektiösen Ursachen eines Multiorganversagens [ WO 2006/042581 ], in vitro Klassifizierung von Genexpressionsprofilen von Patienten mit infektiösem/nichtinfektiösem Multiorganversagen [ WO 2006/100203 ], Feststellung der lokalen Ursachen eines Fiebers unklarer Genese [ WO 2007/144105 ], Polynukleotide zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion [ DE 10 2007 036 678.9 ].
Die Erfindung betrifft Polynukleotidsequenzen, ein Verfahren und ferner Kits zur Erstellung von Multigenbiomarkern, die in einem und/oder mehreren Modulen. Merkmale eines „In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays” (IVDMIA) aufweisen [FDA: In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays, 2007].
Bezüglich der in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Nucleotidsequenzen ist Folgendes zu bemerken:
RefSeq ist eine öffentliche Datenbank, die von Nukleotid- und Proteinsequenzen mit ihren Eigenschaften sowie bibliographische Informationen beinhaltet.
Die RefSeq Datenbank wurde durch das National Center for Biotechnology Information (NCBI), ein Abteilung von National Library of Medicine, die zum US National Institute of Health gehört erstellt und wird fortlaufend gepflegt und aktualisiert [Pruitt et al., 2007].
NCBI erstellt RefSeq aus den Sequenzdaten der Archiv-Datenbank „GenBank” [Benson et al., 2009], einer umfangreichen öffentlichen Datenbank von Sequenzen, die bei GenBank in den USA, der EMBL Datenbibliothek in Großbritannien und der DNS Datenbank von Japan eingestellt und auch zwischen diesen Datenbanken ausgetauscht werden.
Die RefSeq Sammlung ist einzigartig, wenn es um die Bereitstellung von fehlerkorrigierten, nichtredundanten, explizitverlinkten Nukleotid- und Proteindatenbanken geht. Die Einträge sind nichtredundant mit dem Ziel, die verschiedenen biologischen Moleküle zu repräsentieren, die für Organismus, Stamm oder Haplotyp charakteristisch sind.
Wenn bestimmte Einträge mehrfach in der Sammlung auftreten, kann es mehrere Gründe dafür geben:

– es kodieren alternative gespleißte Transkripte für das gleiche Proteinprodukt (sog. Transkriptvarianten),
– es existieren mehrere genomische Bereiche innerhalb einer Spezies oder zwischen Spezies, welche für das gleiche Proteinprodukt kodieren,
– wenn RefSeqs erstellt werden, die alternative Haplotypen darstellen und manche mRNA- und Proteinsequenzen sind dabei identisch in allen Haplotypen.

RefSeq Datenbank liefert das kritische Fundament für Sequenzintegration, genetische und funktionelle Information und gilt international als der Standard für Genomannotation. Bei der Sequenzsuche durch BLAST sind RefSeq Angaben in mehreren NCBI-Resourcen erhältlich einschließlich Entrez Nucleotide, Entrez Protein, Entrez Gene, Map Viewer, beim FTP-Download; oder durch die Vernetzung mit PubMed [Pruitt et al., 2007; The NCBI handbook 2002]. RefSeq Angaben können durch das eindeutige Accession-Format, welches den Unterstrich beinhaltet (_) identifiziert werden.
Arbeitsgruppen nutzen verschiedene Methoden und Protokolle und kompilieren die RefSeq Kollektion für verschiedene Organismen. RefSeq Unterlagen werden durch mehrere unterschiedliche Verfahren erstellt [The NCBI handbook 2002]:

1. wissenschaftliche Kooperation
2. Computer-unterstützte Genomannotationsverfahren
3. Fehlerkorrektur durch die NCBI-Mitarbeiter
4. Auszüge aus GenBank

Jede Angabe hat einen Kommentar, der den Stand der jeweiligen Fehlerkorrektur aufweist sowie die Zuordnung der kooperierenden Arbeitsgruppe. Dadurch beeinhaltet die RefSeq Angabe entweder die essentiell unveränderte, initial valide Kopie der originellen GenBank Einträge oder korrigierte sowie zusätzliche Informationen, die durch Kooperationspartner oder Experten hinzu gefügt wurden [The NCBI handbook 2002].
Falls ein Molekül in GenBank durch mehrere Sequenzen repräsentiert wird, wird durch die NCBI Mitarbeiter eine Entscheidung für die „beste” Sequenz getroffen, die dann als RefSeq präsentiert wird.
Die Entscheidung, die in der vorliegenden Anmeldung benannte Markerpopulation auf der Basis ihrer RefSeq-Identität für die Zwecke der vorliegenden Erfindung zu verwenden, wurde aufgrund der oben beschriebenen Eigenschaften der RefSeq-Datenbank gefällt. Die Eigenschaften dieser Datenbank, die Erstellung, Qualität, Pflege und Aktualisierungen der biologischen Sequenzen betreffend, sowie das Vorliegen funktioneller Informationen auf Nukleinsäureebene, gleichermaßen für alternative Spleißvarianten, gaben dafür den Ausschlag.
Wie bereits erläutert, bietet der biologische Mechanismus des alternativen Spleißing Raum für den Fachmann wohl bekannte Erstreckungen des Schutzumfangs. So ist denkbar, dass mit neuen Transkriptvarianten völlig neue Primärstrukturen identifiziert werden, oder dass sich Sequenzänderungen der bekannten Transkriptvarianten ergeben. Andererseits, werden die genomischen Regionen beansprucht, die für alle diese bekannten und unbekannten Varianten der kodierenden Transkripte, mitsamt ihren cis-regulatorischen Sequenzen als vollkommende genomische funktionelle Einheiten umfasst und somit unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen oder zumindest dem Fachmann leicht auffindbare Äquivalente zu den in den Ansprüchen, Beschreibung und im Sequenzprotokoll genannten Sequenzen zur Verfügung stellen.
Definitionen:
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden folgende Definitionen verwendet:
SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome, nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer, nichtinfektiöser Zustand eines Patienten.
Sepsis: Nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer infektiöser Zustand eines Patienten.
Entzündung/Inflammation: Es handelt sich um eine Reaktion des Körpers, hervorgerufen durch Verletzung oder Gewebezerstörung, die dazu dient das verletzende Agens oder das verletzte Gewebe zu beseitigen, verdünnen oder abzugrenzen.
Der Entzündungsvorgang kann durch physikalische, chemische oder biologische Agentien, einschließlich mechanischen Traumas, Strahlenbelastung durch Sonne, Röntgen- und radioaktive Strahlung, korrosive Chemikalien, extreme Hitze oder Kälte und infektiöse Agentien wie Bakterien, Viren, Pilze und andere pathogene Organismen hervorgerufen werden. Inflammation und Infektion können jedoch nicht als Synonyme verwendet werden.
Die klassischen Zeichen der Entzündung sind Wärme, Rötung, Schwellung, Schmerz und Funktionsverlust des betroffenen Gewebes. Dabei handelt es sich um Manifestationen der physiologischen Veränderungen, die während des Entzündungsvorganges auftreten. Die drei Hauptkomponenten dieses Vorganges sind

1) Änderungen des Durchmessers von Blutgefäßen und der Geschwindigkeit des Blutflusses durch diese Gefäße (hämodynamische Änderungen)
2) Gesteigerte Permeabilität der Kapillaren, und
3) Leukozytenwanderung

Infektion: Das Eindringen pathogener Mikroorganismen in den Körper und deren dortige Vermehrung, die eine Erkrankung durch die Verletzung von Zellen oder Zellverbänden, die Sekretion von Toxinen oder die Antigen-Antikörper Reaktion des Wirtes verursachen.
Eine systemische Infektion ist eine Infektion, bei der sich die Erreger über die Blutbahn im gesamten Organismus ausgebreitet haben.
Biologische Flüssigkeit: Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten der Säugetiere, einschließlich des Menschen, verstanden.
Gen: Ein Gen ist ein Abschnitt auf der Desoxyribonukleinsäure (DNA), der die Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven Ribonukleinsäure (RNA) sowie regulatorische Elemente, welche diese Herstellung aktivieren oder inaktivieren, enthält. Als Gene im Sinne der Erfindung werden auch alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetische Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren (PNA)) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt somit ausdrücklich keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Genlocus: Genlocus (Genort) ist die Position eines Gens im Genom. Besteht das Genom aus mehreren Chromosomen, ist die Position innerhalb des Chromosoms gemeint, auf dem sich das Gen befindet. Verschiedene Ausprägungen oder Varianten dieses Gens werden als Allele bezeichnet, die sich alle an derselben Stelle auf dem Chromosom, nämlich dem Genlocus befinden. Somit beinhaltet der Begriff „Genlocus” einerseits die reine genetische Information für ein spezifisches Genprodukt und andererseits sämtliche regulatorische DNA-Abschnitte sowie sämtliche zusätzliche DNA-Sequenzen, welche mit dem Gen am Genlocus in irgendeinem funktionellen Zusammenhang stehen. Die letzteren schließen an Sequenzregionen an, die in der unmittelbar Nähe (1 Kb) aber außerhalb des 5'- und/oder 3'-Endes eines Genlocus liegen. Die Spezifizierung des Genlocus erfolgt durch die Accession-Nummer und/oder RefSeq ID des RNA-Hauptproduktes, welches von diesem Locus abstammt.
Genaktivität: Unter Genaktivität wird das Maß der Fähigkeit eines Gens verstanden, transkribiert zu werden und/oder Translationsprodukte zu bilden.
Genexpression: Der Vorgang, ein Genprodukt zu bilden und/oder Ausprägung eines Genotyps zu einem Phänotyp.
Multigenbiomarker: Kombination von mehreren Gen-Sequenzen deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion ein kombiniertes Gesamtergebnis (z. B. eine Klassifikation und/oder ein Index) bilden. Dieses Ergebnis ist spezifisch für einen Zustand und/oder eine Untersuchungsfrage.
Hybridisierungsbedingungen: Dem Fachmann wohl bekannte physikalische und chemische Parameter, welche die Etablierung eines thermodynamischen Gleichgewichtes aus freien und gebundenen Molekülen beeinflussen können. Im Interesse optimaler Hybridisierungsbedingungen müssen Zeitdauer des Kontaktes der Sonden- und Probenmoleküle, Kationenkonzentration im Hybridisierungspuffer, Temperatur, Volumen sowie Konzentrationen und -verhältnisse der hybridisierenden Moleküle aufeinander abgestimmt werden.
Amplifikationsbedingungen: Konstante oder sich zyklisch verändernde Reaktionsbedingungen, welche die Vervielfältigung des Ausgangsmateriales in Form von Nukleinsäuren ermöglichen. Im Reaktionsgemisch liegen die Einzelbausteine (Desoxyribonukleotide) für die entstehenden Nukleinsäuren vor, ebenso wie kurze Oligonukleotide, welche sich an komplementäre Bereiche im Ausgangsmaterial anlagern können, sowie ein Nukleinsäure-Synthese-Enzym, Polymerase genannt. Dem Fachmann wohl bekannte Kationenkonzentrationen, pH-Wert, Volumen und die Dauer und Temperatur der einzelnen Reaktionsschritte sind von Bedeutung für den Ablauf der Amplifikation.
Primer: Als Primer wird in der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bezeichnet, das als Startpunkt für Nukleinsäure-replizierende Enzyme wie z. B. die DNA-Polymerase dient. Primer können sowohl aus DNA als auch aus RNA bestehen (Primer3, siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT)
Sonde: In der vorliegenden Anmeldung ist eine Sonde ein Nukleinsäurefragment (DNA oder RNA), das mit einer molekularen Markierung (z. B. Fluoreszenzlabel, insbesondere Scorpion^®, molecular beacons, Minor Groove Binding-Sonden, TagMan^®-Sonden, Isotopenmarkierung, usw.) versehen werden kann und zur sequenzspezifischen Detektion von Ziel-DNA- und/oder Ziel-RNA-Molekülen eingesetzt wird.
PCR: ist die Abkürzung für die englische Bezeichnung „Polymerase Chain Reaction” (Polymerase-Kettenreaktion). Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode, um DNA in vitro außerhalb eines lebenden Organismus mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA Polymerase zu vervielfältigen. PCR wird insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um kurze Teile – bis zu etwa 3.000 Basenpaare – eines interessierenden DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens oder auch um nicht kodierende DNA-Sequenzen handeln. Es ist dem Fachmann wohl bekannt, dass eine Reihe von PCR-Verfahren im Stand der Technik bekannt sind, welche alle durch den Begriff „PCR” mit umfasst sind. Dies gilt insbesondere für die „Real-Time-PCR” (vgl. auch die Erläuterungen weiter unten).
Transkript: Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird unter einem Transkript jegliches RNA-Produkt verstanden, welches anhand einer DNA-Vorlage hergestellt wird.
Small RNA: Kleine RNAs im Allgemeinen. Vertreter dieser Gruppe sind insbesondere, jedoch nicht ausschließlich:

a) scRNA (small cytoplasmatic RNA), welche eines von mehreren kleinen RNA-Molekülen im Cytoplasma eines Eukaryonten ist.
b) snRNA (small nuclear RNA), eine der vielen kleinen RNA-Formen, die nur im Zellkern vorkommen. Einige der snRNAs spielen beim Spleißen oder bei anderen RNA-verarbeitenden Reaktionen eine Rolle.
c) small non-protein-coding RNAs, welche die sogenannten small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), short interfering RNAs (siRNAs) und small double-stranded RNAs (dsRNAs) einschließen, welche die Genexpression auf vielen Ebenen, einschließlich der Chromatin-Architektur, RNA-Editierung, RNA-Stabilität, Translation und möglicherweise auch Transkription und Spleißen. Im Allgemeinen werden diese RNAs auf mehrfachem Wege prozessiert aus den Introns und Exons längerer Primärtranskripte, einschließlich proteincodierender Transkripte. Obwohl etwa nur 1,2% des Humangenoms Proteine codiert, wird ein großer Teil dennoch transkribiert. Tatsächlich bestehen ca. 98% der in Säugern und Menschen gefundenen Transkripte aus non-protein-coding RNAs (ncRNA) aus Introns von proteincodierenden Genen und den Exons und Introns von nicht proteincodierenden Genen, einschließlich vieler, welche anti-sense zu proteincodierenden Genen sind oder mit diesen überlappen. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) regulieren die sequenzspezifische Modifikation von Nukleotiden in Target-RNAs. Hierbei treten zwei Typen von Modifikationen auf, nämlich 2'-O-Ribosemethylierung und Pseudouridylierung, welche durch zwei große snoRNA-Familien reguliert werden, die einerseits box C/D-snoRNAs und andererseits box H/ACA snoRNAs genannt werden. Derartige snoRNAs weisen eine Länge von etwa 60 bis 300 Nukleotiden auf. miRNAs (microRNAs) und siRNAs (short interfering RNAs) sind noch kleinere RNAs mit im Allgemeinen 21 bis 25 Nukleotiden. miRNAs stammen aus endogenen kurzen Hairpin-Vorläuferstrukturen und benutzen gewöhnlich andere Loci mit ähnlichen – jedoch nicht identischen Sequenzen als Ziel translationaler Repression. siRNAs entstehen aus längeren doppelsträngigen RNAs oder langen Hairpins, oftmals exogenen Ursprungs. Sie haben gewöhnlich homologe Sequenzen an demselben Locus oder woanders im Genom zum Ziel, wo sie am sogenannten gene silencing, ein Phänomen, welches auch RNAi genannt wird, beteiligt sind. Die Grenzen zwischen miRNAs und siRNAs sind jedoch fließend.
d) Zusätzlich kann der Begriff ”small RNA” auch sogenannte transposable Elemente (TEs) und insbesondere Retroelemente umfassen, welche ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „small RNA” verstanden werden.

RefSeq ID: Diese Bezeichnung bezieht sich auf Einträge in der NCBI Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Diese Datenbank liefert nicht-redundante Referenz-Standards zu genomischer Information. Diese genomischen Informationen schließen unter anderem Chromosomen, mRNAs, RNAs und Proteine ein. Jede RefSeq ID stellt ein einzelnes, natürlich vorkommendes Molekül eines Organismus dar. Die biologischen Sequenzen, die eine RefSeq repräsentieren, sind von GenBank Einträgen (ebenfalls NCBI) abgeleitet, sind aber eine Zusammenstellung von Informationselementen. Diese Informationselemente stammen aus Primär-Forschung auf DNA-, RNA- und Proteinebene.
Accession-Nummer: Eine Accession-Nummer stellt die Eintragsnummer eines Polynukleotides in der dem Fachmann bekannten NCBI-GenBank dar. In dieser Datenbank werden sowohl. RefSeq ID's als auch weniger gut charakterisierte und redundante Sequenzen als Einträge verwaltet und der Öffentlichkeit zugänglich gemacht (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html).
Lokale Infektion: Die Infektion beschränkt sich auf die Eintrittspforte des Erregers (z. B. Wundinfektion)
Generalisierte Infektion: Pathogene dringen ins Gefäßsystem vor und ziehen den gesamten Organismus in Mitleidenschaft. Generalisierte Infektionen können zu einer Sepsis führen.
Kolonisierung: Die Gegenwart von Mikroorganismen löst im Organismus keinerlei Krankheitssymptome aus.
Bakteriämie: Ein Zustand, in dem vorübergehend und kurzfristig Bakterien im Blut anwesend sind, ohne dass dies mit dem Auftreten von bakteriell bedingten klinischen Symptomen verbunden sein muss.
Alternatives Splicing: ein Prozess, bei dem die Exons des primären Gentranskripts (pre-mRNA) nach Ausschneiden der Introns in unterschiedlichen Kombinationen wiederverbunden werden.
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool [nach Altschul et al., J Mol Biol 215: 403-410; 1990]. Sequenzvergleichalgorithmus, geschwindigkeitsoptimiert, wird für die Suche in Sequenzdatenbanken für eine optimale lokale Anpassung an die Anfragesequenz genutzt.
cDNA: Komplementäre DNA. DNA-Sequenz, Produkt der Reversen Transkription von mRNA.
Codierende Sequenz: Protein-kodierender Abschnitt eines Gens bzw. einer mRNA in Abgrenzung zu Introns (nicht kodierende Sequenzen) und 5-' oder 3'-nichttranslatierten Abschnitten. Kodierende Sequenzen der cDNA oder reifen mRNA umfassen den Bereich zwischen Start-(AUG oder ATG) und Stopcodon.
EST: Expressed Sequence Tag. Kurze ssDNA-Abschnitte der cDNA (normalerweise ~300–500 bp), üblicherweise in großen Mengen produziert. Repräsentieren die Gene, die in bestimmten Geweben und/oder während bestimmter Entwicklungsphasen exprimiert werden. Teilweise codierend bzw. nicht codierende Kennzeichnungen der Expression für cDNA-Bibliotheken. Wertvoll für die Größenbestimmung vollständiger Gene und im Rahmen von Kartierungen (Mapping).
Exon: Kodierender, der mRNA entsprechender Sequenzbereich typischer eukaryotischer Gene. Exons können die kodierenden Sequenzen, den 5'-nichttranslatierten Bereich oder den 3'-nichttranslatierten Bereich umfassen. Exons kodieren spezifische Abschnitte des vollständigen Proteins und sind normalerweise durch lange Abschnitte (Introns) getrennt, die bisweilen als ”junk DNA” bezeichnet werden und deren Funktion nicht genau bekannt ist aber wohl kurze, nichttranslatierte RNAs (snRNA) oder regulatorische Informationen kodieren.
GenBank Nukleotidsequenz-Datenbank mit Sequenzen aus mehr als 100.000 Organismen. Einträge, die mit Eigenschaften der kodierende Bereiche annotiert sind, umfassen auch die Translationsprodukte. GenBank ist Teil der internationalen Kooperation der Sequenzdatenbanken, die auch EMBL und DDBJ umfasst.
Intron: Nicht-codierender Sequenzbereich eines typischen eukaryotischen Gens, wird während des RNA-Splicings aus dem primären Transkript herausgeschnitten und befindet sich somit nicht mehr in der reifen, funktionellen mRNA, rRNA oder tRNA.
mRNA: Messenger RNA oder manchmal nur ”message”. RNA, die die für Proteinkodierung notwendigen Sequenzen enthält. Der Begriff mRNA wird in Abgrenzung zum (ungesplicten) Primärtranskript nur für das reife Transkript mit PolyA-Schwanz (exklusive der über das Splicing entfernten Introns) benutzt. Weist 5'-nichttranslatierte, Aminosäuren-kodierende, 3'-nichttranslatierte Bereiche und (fast immer) einen Poly(A)-Schwanz auf. Stellt typischerweise ca. 2% der gesamten zellulären RNA.
Poly(A)-Schwanz: ssAdenosin-Verlängerung (~50–200 Monomere), die während des Splicings an das 3'-Ende der mRNA gehangen wird. Der PolyA-Tail erhöht vermutlich die Stabilität der mRNA (möglicherweise Protektion gegen Nukleasen). Nicht alle mRNA weisen das Konstrukt auf, so z. B. die Histon-mRNA.
RefSeq NCBI-Datenbank der Rereferenzsequenzen. Fehler-korrigierte, nicht-redundante Sequenzsammlung genomischer DNA-Contigs, mRNA- und Protein-Sequenzen bzw. von bekannten Genen und vollständiger Chromosomen.
SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms. Auf einzelnen Nukleotidabweichungen beruhende genetische Unterschiede zwischen Allelen des gleiches Gens. Entstehen an spezifischen individuellen Positionen innerhalb eines Gens.
Transkriptvarianten: Alternative Splicing-Produkte. Die Exons des primären Gentranskripts (prä-mRNA) wurden auf unterschiedliche Weise wiederverbunden und werden nachfolgend translatiert.
3'-nichttranslatierter Bereich: Transkribierter 3'-terminaler mRNA-Bereich ohne proteinkodierende Information (Bereich zwischen Stopkodon und PolyA-Schwanz). Kann die Translationseffizienz oder die Stabilität der mRNA beeinflussen.
5'- nichttranslatierter Bereich: Transkribierter 5'-terminaler mRNA-Bereich ohne proteinkodierende Information (Bereich zwischen initialem 7-Methylguanosin und der Base unmittelbar vor dem ATG-Startcodon). Kann die Translationseffizienz oder die Stabilität der mRNA beeinflussen.
Polynucleotid-Isoformen: Polynucleotide mit gleicher Funktion, jedoch unterschiedlicher Sequenz.
Abkürzungen

CRP

C-reaktives Protein

OR

Odd Ratio

PCT

Procalcitonin

Sensitivität

Anteil der korrekten Tests in der Gruppe mit vorgegebenener Erkrankung (infektiöse SIRS bzw. Sepsis)

Spezifizität

Anteil der korrekten Tests in der Gruppe ohne vorgegebenene Erkrankung (nicht-infektiöse SIRS)

Darüber hinaus offenbart die nicht vorveröffentlichte DE 10 2009 044 085 ein System, das folgende Elemente umfaßt:

• Einen Set von Genaktivitätsmarkern
• Referenzgene als interne Kontrolle der Genaktivitätsmarkersignale in Vollblut
• Detektion hauptsächlich über Real-Time-PCR oder andere Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren
• Verwendung eines Algorithmus, um die Einzelergebnisse der Genaktivitätsmarker zu einem gemeinsamen numerischen Wert, Index oder auch Score, umzuwandeln
• Darstellung dieses numerischen Wertes auf einer entsprechend eingeteilten Skala
• Kalibrierung, d. h. Einteilung der Skala entsprechend der intendierten Anwendung durch vorherige Validierungsexperimente.

Das System liefert eine Lösung für das Problem der Feststellung von Krankheitszuständen wie z. B. die Unterscheidung von infektiösem und nicht-infektiösem Multiorganversagen aber auch für andere in diesem Kontext relevante Anwendungen und Fragestellungen.
Sämtlichen im Stand der Technik vorveröffentlichten und in dem oben angegebenen, zum Anmeldezeitpunkt noch nicht veröffentlichten Dokument DE 10 2009 044 085 enthaltenen Ansätzen zur diagnostischen/prognostischen Erfassung von inflammatorischen und/oder infektiösen Zuständen haben bislang jedoch nur – wie eingangs dargelegt – verhalten Eingang in die klinische Routine gefunden.
Unter Verwendung eines breiten Spektrums inflammatorisch-infektiöser klinischer Phänotypen vom gesunden Probanden über Patienten mit lokaler Inflammation und lokaler Infektion bis zu Intensivpflichtigen Patienten mit systemischer Inflammation (SIRS) und systemischer Infektion (Sepsis) und einer Meßplattform die in Form von 25.000 unterschiedlichen Sonden das gesamte humane Genom repräsentiert, wurde eine Studie zur differentiellen Genexpression aus peripheren Vollblutproben durchgeführt. Im Ergebnis wurde überraschenderweise eine transkriptomische Signatur identifiziert, die anstatt sprunghafter Änderungen in Abhängigkeit der verschiedenen Phänotypen ein inflammatorisch-infektiöses Kontinuum der differentiellen Genexpression darstellt. Ein weiteres überraschendes Ergebnis, dass aus dieser Feststellung folgte, war das Fehlen infektionsspezifischer Gen-Gruppen. Auch konnte in der Gruppe mit systemischer Inflammation eine, mit Patienten mit Blutstrom-Infektionen vergleichbare, differentielle Genexpression festgestellt werden.
Diese Ergebnisse können eine Erklärung für die im Folgenden ausgeführte Feststellung liefern, dass in weniger als der Hälfte der Sepsis-Verdachtsfälle ein Pathogen-Nachweis aus Blutproben gelingt. Ein Zustand, der durch weitgehende, gleichzeitige Über- und Unterexpression von bestimmten Gentranskripten repräsentiert wird, kann als kritisch angesehen werden und die in folgenden Abschnitten aufgeführten Merkmale der Sepsis umfassen. Er kennzeichnet die Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung”, auch als Host Response oder Wirtsantwort bezeichnet. Die Information über diesen Zustand, die durch sämtliche signifikant differentiell expriemierten Gentranskripten repräsentiert ist, lasst sich rechnerisch zu einem nicht-dimensionalen Zahlenwert, einem Score, zusammenfassen und als Abstand vom Zustand des Gesunden darstellen. Je größer der Zahlenwert des Scores, desto größer ist das Ausmaß der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung”. Eine vergleichbare Information über Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung” läßt sich ebenfalls anhand von Scores, gebildet aus Unterauswahlen aus allen differentiell exprimierten Genen erhalten.
Die Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung” kann sich nicht nur Vergrößern bzw verschlechtern, sondern sich auch in die Gegenrichtung, d. h. zum Zustand des Gesunden zurück bewegen bzw. verbessern. Diese Rückkehr kann als Erholungsprozesses betrachtet werden. Folgt diese Erholung unmittelbar auf eine therapeutische Maßnahme, zeigt sie den Therapieerfolg an.
Eine Progression des Zustandes in den kritischen Bereich zeigt ein hohes Mortalitäts-Risiko für den Patienten an. In diesem Zustand ist die Wahrscheinlichkeit für den Patienten hoch, eine lebensbedrohliche Komplikation in Form einer unkontrollierten Primärinfektion und/oder eine sekundäre Infektion zu erleiden und/oder an den Folgen der unkontrollierten inflammatorisch-infektiösen Wirtsantwort zu versterben.
Eine Progression in Richtung eines kritischen Zustandes kann als Früherkennung genutzt werden und auf deren Grundlage die erforderlichen therapeutischen Maßnahmen und Interventionen initiiert werden.
Die Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung” kann als Einzelbestimmung zur Feststellung eines Zustandes verwendet werden.
Der Immunstatus kann anhand von zeitlich aufeinanderfolgenden Mehrfachbestimmungen zur Verlaufsbeobachtung und Therapiekontrolle bei Patienten genutzt werden.
Medizinische Maßnahmen können die medikamentöse Behandlung sowie deren Eskalation oder De-Eskalation, invasive Maßnahmen wie chirurgische Eingriffe zur Fokussanierung und/oder weitere diagnostische Maßnahmen sein.
Die Bestimmung des Immunstatus kann zur differentiellen Diagnose herangezogen werden, indem festgestellt wird ob das Immunsystem einen Beitrag zum akuten Krankheitsgeschehen leistet oder als Ursache eines lebensbedrohlichen Zustandes eines Patienten nicht in Frage kommt.
Das Ziel der meisten Genexpression-Studien zur Sepsis-Diagnose lag bislang darin, Marker zu finden, die unterscheiden, ob ein systemisches inflammatorisches Response-Syndroms (SIRS, ACCP/SCCM, 1992) durch Erreger verursacht wurde oder nicht. In diesen Studien wurden insbesondere Proben von Intensiv-Patienten untersucht. Die Unterscheidung in Gruppen „sterile SIRS” vs. „Sepsis” (SIRS + positiver Erregernachweis) erfolgte insbesondere nach dem mikrobiologischen Nachweis. Diese Studien lieferten sehr heterogene Ergebnisse, wie in einer aktuellen vergleichenden Publikation festgestellt wurde [Tang et al. (2010)]. Die vorliegende Erfindung beleuchtet mit ihrem experimentellen Ansatz die Ursachen hierfür. Dem Versuchsplan der Erfinder lag die folgende Überlegung zugrunde:
Der bisherige Ansatz zur Sepsis-Diagnose wurde der Vorgehensweise bei einer lokalen Inflammation entnommen. Auch hier will man unterscheiden, ob die Entzündung an einem Organ durch Erreger verursacht wurde oder nicht (man spricht dann z. B. von einer bakteriellen oder aber einer sterilen Myokarditis oder Pankreatitis). Infektionsspezifische Genmarker müssen eine erhöhte oder aber eine reduzierte Expression auch bei einer Infektion zeigen, die sich nicht unbedingt durch eine systemische Inflammation manifestiert sondern lediglich eine Entzündung am betroffenen Organ/Ort hervorruft. Dies konnte jedoch für die bis jetzt gefundenen Genmarker im Stand der Technik nicht gezeigt werden.
Eine andere Erklärung für heterogene Ergebnisse wäre, dass die Genexpression-Studien RNA-Proben aus Blut verwenden. Somit mussten die besten Chancen für das Auffinden von infektionsspezifischen Genmarkern dann vorliegen, wenn nur Proben mit einer positiven Blutkultur, die ein „Gold Standard” für die Blutstrominfektion ist, vermessen werden. In den bisherigen Studien wurden Sepsis-Patienten unabhängig von der Ausbreitung der Infektion als eine Studiengruppe betrachtet
Die Anmelderin legt ihren Studien einen Versuchsplan zugrunde, in dem die Merkmale Infektion und Inflammation in ihrer räumlichen Ausbreitung unabhängig voneinander eingestuft wurden. Es wurde unterschieden, ob die Entzündung systemisch, lokal oder gar nicht ausgeprägt war. Dabei wurde eine systemische Inflammation durch die Definition des systemischen inflammatorischen Response-Syndroms (SIRS) bestimmt. Darüber hinaus wurde geprüft, ob Erreger im Blut (systemisch), an einem Organ (lokal) oder gar nicht gefunden wurden. Aus der Kombination der Ausbreitung von Infektion und Inflammation wurden die 9 möglichen Phänotypen definiert. Sie werden in der Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Darstellung der Phänotypen, die sich durch die räumliche Ausprägung von Inflammation und/oder Infektion ergeben. Jeder Phänotyp wird durch ein Kürzel aus 3 Buchstaben bezeichnet. Dabei bezeichnet der erste Großbuchstabe die Ausweitung der Infektion, der zweite die Ausbreitung der Inflammation. Beide wurden mit einem „a” (für und) verbunden
Aus Sicht der vorliegenden Erfindung ist diese Aufteilung eindeutig, vollständig und von anderen Faktoren unabhängig. D. h. jeder beliebige Proband kann zum Zeitpunkt der Probennahme einer der Gruppen zugeordnet werden.
Während eine Entzündung nicht unbedingt durch Erreger verursacht wird, ist eine Infektion ohne eine Entzündungsreaktion diagnostisch nicht relevant. Eine systemische Infektion, die nur eine örtlich begrenzte Entzündung hervorruft (so genannte Bakteriämie, z. B. bei einer Endokarditis), ist ein seltenes Phänomen und bildet einen Sonderfall. Daher bilden die Kombinationen LaN, SaN und SaL keine klinisch relevanten Phänotypen und wurden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht betrachtet.
Für die Studie haben die Erfinder diagnostisch relevante Patienten-Proben nach der räumlichen Ausbreitung einer Inflammation und/oder Infektion aufgeteilt. Es entstanden 6 Studien-Gruppen (in Tab. 1 fett geschrieben). Diese Gruppen repräsentieren die wichtigsten und häufigsten infektions-inflammatorischen Phänotypen. Insbesondere die 4 Phänotypen mit einer lokalen Infektion mit lokaler und systemischer Entzündung (LaL und LaS) sowie die entsprechenden Kontrollgruppen ohne eine Infektion (NaL und NaS) ermöglichen, im statistischen Vergleich, die Aufdeckung von infektionsspezifischen Genmarkern. Der Vergleich der Gruppen SaS und LaS gibt Hinweise darüber, ob bei systemischer Inflammation die Infektion der zirkulierenden Zellen (Blutistromnfektion), ein anderes Genexpressionsmuster als die lokal beschränkte Infektion anzeigt.
Der vorliegenden Anmeldung ist ein Sequenzprotokoll mit den SEQ-ID-Nummern 1-7718 beigefügt, dessen Inhalt vollständig zum Offenbarungsgehalt der vorliegenden Anmeldung gehört.
Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeispielen sowie anhand der Zeichnung.
Es zeigt:
1 zeigt eine Heatmap, bei welcher die Expressionsmuster nach Studien-Gruppen sortiert sind;
2 zeigt eine sortierte Heatmap, bei welcher die Expressionsmuster nach dem Score (Master-Score) sortiert sind;
3 zeigt Abstands-Dreiecke für die Studien-Proben;
4 zeigt Abstands-Dreiecke für zwei Patienten-Verläufe;
5 zeigt den Verlauf des Scores für alle Studien-Proben; und
6 zeigt den Verlauf des Scores, der aus Delta-Ct Werten der realtime PCR Genexpressionsmessung berechnet wurde im Vergleich zum Master-Score.
Beispiele
Beispiel 1: Bestimmung der Schwere der Wirtsantwort auf eine Belastung des Immunsystems durch eine akute Inflammation.
Patientengruppen
In die Auswahl wurden Proben von folgenden Probanden eingeschlossen: Gesunde Spender, Patienten aus den Kliniken für Hals-Nasen-Ohrheilkunde (HNO) und für Anästhesie und Intensivmedizin (KAI) des Universitätsklinikums Jena. Die Belegung der Gruppen war wie folgt:
SaS: 6 Intensivpatienten mit der Diagnose Schwere Sepsis/Septischer Schock. Die untersuchte Probe wurde am Tag entnommen, an dem in zwei unabhängigen Tests (Blutkultur und DNA-Nachweis) der gleiche Erreger im Blut bestätigt wurde.
LaS: 13 Intensivpatienten mit der Diagnose Schwere Sepsis/Septischer Schock, bei denen während der Erkrankung mindestes eine Blutprobe mit zwei unabhängigen Test (Blutkultur und DNA-Nachweis) auf Erreger geprüft wurde, aber alle Befunde negativ blieben. Die untersuchte Probe wurde am ersten Tag entnommen, an dem ein Erreger lokal bestätigt wurde.
NaS: 13 Intensivpatienten mit der Diagnose SIRS ohne Zeichen einer Infektion. Die untersuchte Probe wurde innerhalb der ersten 3 Tage mit der SIRS-Diagnose abgenommen.
LaL: 7 Patienten der HNO-Klinik mit einem akuten Peritonsillarabszess (PTA). Die untersuchte Probe wurde unmittelbar vor der operativen Entfernung des infektiösen Abszess entnommen. Die zugehörige mikrobiologische Blutuntersuchung (wie bei LaS) war negativ.
NaL: 8 Patienten der HNO-Klinik mit chronischer Tonsillitis ohne einen akuten Infektionsherd. Die untersuchte Probe wurde innerhalb der ersten 3 Tage nach der Tonsillektomie (operativen Mandelentfernung) entnommen. Die Patienten zeigten keine SIRS-Symptome, an der Eingriffstelle befand sich eine sterile Wundentzündung. Weiter wurden in die Gruppe 4 Patienten mit einer chronischen nicht infektiösen Pankreatitis ohne SIRS eingeschlossen.
NaN: 7 gesunde Spender, 3 Patienten mit chronischer Tonsillitis ohne einen akuten Infektionsherd. Die untersuchte Probe wurde vor der Tonsillektomie abgenommen, die postoperativen Proben dieser Patienten wurden nicht in die NaL Gruppe eingeschlossen.
Verlaufsproben: In der Studie wurden Proben von 2 Patienten über jeweils 6 nacheinander folgende Tage untersucht. In beiden Fällen wurde die erste Probe vor einem geplanten operativen Eingriff, die Folgeproben wurden auf der Intensivstation abgenommen. Fall 1: Patient erholt sich nach der Operation nicht. Die entzündungsrelevanten Parameter steigen ab dem 2. postoperativen Tag am 3. Tag wurde eine Infektion diagnostiziert, der Patient verstirbt nach 10 Tagen. Fall 2: Nach der Operation erholt sich der Patient sehr langsam. Am dritten Tag steigen einige entzündungsrelevanten Parameter. Nach den medizinischen Maßnahmen verbessert sich der Zustand, der Patient wird nach insgesamt 6 Tagen verlegt.
Die wichtigsten klinischen Parameter zu den untersuchten Proben wurden in der Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2: Zusammenfassung der klinischen Parameter der in die Studie eingeschlossenen Probanden. Wurde ein Merkmal nicht abgefragt oder ein Parameter nicht bestimmt, so wird es mit dem Kürzel n. a. versehen.
Experimentelle Durchführung
Vermessen wurden 73 RNA Proben aus dem Vollblut von 63 Personen. Dafür wurden kommerzielle Mikroarray-BeadChips HumanHT-12 v3 der Firma Illumina verwendet. Auf der verwendeten Messplattform befanden sich 48803 verschiedene Gensonden, die das gesamte humane Genom unabhängig vom Gewebe repräsentieren.
Die Proben wurden in folgenden Schritten verarbeitet und vermessen:

1. Isolierung und Stabilisierung der totalRNA aus Vollblutproben: Ausgangsmaterial für die Analyse des Transkriptoms von Blutproben sind 2,5 ml Vollblut. Dieses wurde in einem PAXgene-Röhrchen (PAXgene Blood RNA Tube PreAnalytiX #762165 (Becton Dickinson)) abgenommen und bei –80°C bis zur Aufarbeitung gelagert.
2. Standardmäßige automatische RNA-Isolation aus PAXgene Blutproben: Es wurde der QIAcube (Qiagen, Hilden) sowie der PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX # 762174) unter Verwendung des Programmes „PAXgene Blood RNA (CE)” zur Isolierung der totalRNA eingesetzt. Nach Ablauf des Protokolls wurden die Elutionstubes mit den RNA-Isolaten verschlossen. Restliche DNase-Enzymaktivitäten wurden durch Erhitzen der Proben für 5 min bei 65°C inaktiviert, die Proben danach sofort auf Eis gekühlt und bei –80°C gelagert.
3. Qualitätskontrolle der totalRNA: Die Überprüfung der isolierten RNA ist eine wichtige Maßnahme zur Qualitätssicherung der Hybridisierungsergebnisse. Nur eine intakte RNA kann ausgezeichnete Hybridisierungsergebnisse liefern. Die Prüfung der Integrität der isolierten total RNA erfolgte kapillarelektrophoretisch mit dem Bioanalyzer 2100 von Agilent Technologies unter Verwendung des RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent Technologies, Katalog-Nummer 5067–1511) nach den Vorgaben des Herstellers. Als Richtwert gilt ein RIN-Wert um 7,5 auf der Skala von 1–10. Alle verwendeten Proben erreichten RIN > 5, der zur Zwecken der Genexpressionsanalyse ausreichend ist (vgl. Fleige und Paffl, 2006).
4. Reduktion der Globin mRNA: Zur Verbesserung der Sensitivität der Genexpressionsmessungen im Vollblut wurde die hochabundante Globin mRNA empfohlen Dazu wurde der Kit „GLOBINclear TM-Human”, von Ambion/Applied Biosystems # AM 1980) eingesetzt. Nach Schätzungen des Herstellers überlagern die Transkripte von Globin mit ihrem Anteil von 70% aller mRNAs in Blut ganz erheblich weniger präsente Transkripte. Von jeder Probe wurde 1 μg totalRNA zur Bearbeitung eingesetzt.
5. Amplifikation von totalRNA zu cRNA: Die Vorbereitung der Globin-reduzierten RNA zur Hybridisierung erfolgte mit dem Ambion/Applied Biosystems ”Illumina TotalPrep RNA Amplifikation kit (AMIL 1791) nach den Angaben des Herstellers und mit einer eingesetzten Menge von 500 ng. Die cRNA-Eluate wurden auf Eis gekühlt, die Konzentration der cRNA am Nanodrop ND-2000 spektrophotometrisch vermessen.
6. Hybridisierung auf Illumina BeadChips: Es wurden die pangenomischen Illumina-BeadChips, Version human HT-12v3 eingesetzt. Von den cRNA-Proben wurden mit 750 ng in einem Volumen von 5 μl pro Array aufgetragen und über Nacht bei 58°C hybridisiert. Die Signaldetektion erfolgreich hybridisierter Sonden erfolgt über CY3-Streptavidin-Färbung (GE-Amersham) nach den Vorgaben des Herstellers. Illumina Protokoll: Whole-Genome Gene Expression with IntelliHybTM Seal; Experienced User Card; Part # 11226030 Rev. B, Illumina Inc. Die Auslesung der Fluoreszenzsignale erfolgte mit dem Illumina^® BeadArray Reader 500 und der entsprechenden Illumina software „BeadScan” (Version 3.6.17).
7. Imageanalyse der Mikroarrays: Die mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbten BeadChips werden mit dem Illumina^® BeadArray Reader gescannt. Die resultierenden Bilder werden mittels der Software von Illumina^® „Genome-Studio” (Version Genome Studio 2009.2) analysiert. Zur ersten Beurteilung der Hybridisierung werden technische Kontrollsignale abgefragt. Ein erster qualitativer Überblick wird mittels der Anzahl detektierter Gene und der mittleren Signalstärke pro Array gewonnen. Die Rohdaten werden einer Qualitätskontrolle und der statistischen Analyse unterzogen.

Datenanalyse und statistische Auswertung
Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version R 2.8.0 (R. app GUI 1.26 (5256), S. Urbanek & S. M. Iacus, © R Foundation for Statistical Computing, 2008) durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht [R Development Core Team (2006)]. Diese Software wird bevorzugt bei der Analyse von Genexpressionsdaten verwendet, da sie zahlreiche Algorithmen für die Bearbeitung dieser Art von Daten zur Verfügen stellt. Insbesondere konnten folgenden Software-Pakete in unserer Studie verwendet werden: lumi zum Einlesen der Illumina-Messwerte und der zugehörigen Gen-Annotation, vsn für Daten-Normalisierung (beide in Du u. a., 2008), fdrtool zum Bestimmen der falsch positiven Rate (Strimmer, 2008) und stats für die Durchführung statistischer Signifikanz-Tests, für Clustering und zum Visualisieren der Ergebnisse.
Die Analyse erfolgte in den folgenden Schritten. Die Rohdaten sowie zusätzlich verfügbare Annotationsdaten wurden eingelesen. Aufgrund von technisch bedingten Variationen bei der Probenbearbeitung sowie Abweichungen von Reagenzchargen, können die Fluoreszenzintensitäten verschiedener Proben in der Regel nicht direkt miteinander verglichen werden. Damit dies möglich wird, werden solche Variationen durch eine geeignete Normierung ausgeglichen. Es wurde eine varianzstabilisierende Transformation angewendet [Huber et al., 2002]
In die Datenanalyse wurden normalisierte und zur Basis 2 logarithmierte Messdaten einbezogen In der statistischen Analyse wurden 61 Proben der 6 Studiengruppen untersucht. Die Genexpression zwischen diesen Gruppen wurde mittels der Einweg-Varianzanalyse verglichen [Mardia u. a., 1979]. Dabei wurde geprüft, ob ein signifikanter Unterschied zwischen mindestens 2 der untersuchten Gruppen besteht. Der zugehörige Signifikanz-Test wurde, Gen für Gen, für 18517 Gensonden berechnet, die ein Signal mit detektierbarer Intensität für mindestens eine RNA-Probe lieferten. Die die Zahl falsch-positiver Tests wurde mittels der false discovery rate (FDR) [Storey et al. (2003)] bestimmt. Dabei wurde für jede Gensonde der so genannte q-Wert berechnet, der als die minimale FDR definiert ist, unter welcher die Sonde als signifikant verändert erscheint. Das verwendete Verfahren zur FDR-Kontrolle schätzte 87,5% der Gensonden als signifikant verändert. Das entspricht 16204 Sonden aus dem Pool der 18517 untersuchten.

Die Genexpressionsmuster der 6 Patientengruppen wurden weiter mittels des t-Tests paarweise verglichen. Der Test wurde Gen für Gen für insgesamt 15 Gruppenkombinationen angewandt. Dabei wurde die gleiche Gensonden-Auswahl berücksichtigt und die FDR-Kontrolle durchgeführt, die bei der Einweg-Varianzanalyse beschrieben wurde. Die Ergebnisse wurden in der Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3: Zusammenfassung der falsch positiven Raten (FDR) beim paarweise Vergleich aller Studien-Gruppen. In der Tabelle wird angegeben, wie viele Gensonden bei einem Vergleich einen FDR-Wert kleiner als die angegebene Schwelle erreicht haben. Die Interpretation wird am Beispiel erklärt: Beim Vergleich von NaS vs. NaL wurde eine Gruppe von 265 Genen mit FDR von 1% und weniger bestimmt, d. h. von den 265 Gensonden sind 2–3 falsch positiv.

FDR	< 0.01% (n)	< 0.1% (n)	< 1% (n)	< 2.5% (n)	< 5% (n)	< 10% (n)	Anteil veränderter Gensonden [%]
LaS vs. NaN	3412	5443	8309	9901	11314	13315	70,0
SaS vs. NaN	375	1909	6285	8518	10301	12549	69,4
LaS vs. NaL	2098	3962	6696	8232	9746	11850	65,5
SaS vs. NaL	137	912	4317	6531	8385	10591	62,7
NaS vs. NaN	0	73	3650	5654	7585	9932	59,8
NaS vs. NaL	0	0	265	2591	4799	7672	56,1
LaS vs. LaL	1	19	1019	2499	4416	6864	53,7
SaS vs. LaL	0	0	688	2620	4789	7276	53,3
LaL vs. NaN	0	0	527	2270	4398	7080	52,5
SaS vs. NaS	0	0	119	684	2048	4599	50,9
LaL vs. NaL	0	0	1	1	526	2589	44,5
LaS vs. NaS	0	0	0	0	0	522	33,1
SaS vs. LaS	0	0	0	0	0	0	27,8
NaS vs. LaL	0	0	0	1	6	154	27,0
NaL vs. NaN	0	0	5	86	236	841	26,0

Aus der Tabelle (letzte Spalte) folgt, dass die deutlichsten Unterschiede zwischen den Patienten mit einer Sepsis (LaS und SaS) und den Gruppen NaN (keine Entzündung) und NaL (nicht infektöse lokale Entzündung). Dagegen wurden wenig deutliche Unterschiede zwischen den Gruppenpaaren NaS und LaL, SaS und LaS sowie LaS und NaS. Beim Vergleich der Mengen von Gensonden, die im Vergleich LaS vs. NaS und NaS vs. LaL eine FDR < 0.1 erreichten, konnte keine Gensonden gefunden werden, die bei einer Infektion die gleiche Veränderung der Genexpression hatten. Somit konnten keine Gensonden aufgedeckt werden, die einen infektionsspezifischen Expressionsmuster aufzeigen. Es soll erwähnt werden, dass auch weitere statistische Vergleiche, darunter die 2-Wege-Varianzanalyse [Mardia u. a., 1979 zwischen den Gruppen NaL, NaS, LaL und LaS, sowie der Vergleich der Gruppen LaL und LaS vs. NaS, zum gleichen negativen Ergebnis führten.
Überraschender Weise ermöglichten die paarweise Vergleiche die folgende Anordnung der Studien Gruppen: (1) NaN, (2) NaL, (3) LaL, (4) NaS, (5) LaS, (6) SaS. Diese Anordnung zeichnet sich dadurch aus, dass die benachbarten Gruppen sich statistisch in ihrer Expression nur wenig unterscheiden. Genauer gesagt, im statistischen Vergleich wurden ausreichend viele veränderte Gensonden gefunden, Gensonden-Gruppen mit einer ausreichend kleinen falsch positiven Rate (ca. 5%) konnte zwischen den benachbarten Gruppen nicht gefunden werden. Dieses Phänomen tritt dann auf, wenn sich die Gruppenmittelwerte unterscheiden, die Streuung der Gruppen aber so hoch ist, dass sie zu einer Überlappung der beiden verglichenen Gruppen führt. Je weiter die Gruppen voneinander liegen desto größer die Unterschiede werden. Es soll erwähnt werden, dass ohne die Bestimmung der Genexpression eine gerichtete Anordung der Studien-Gruppen möglich war.
Um die aufgedeckte Änderung der Genexpression innerhalb der Studiengruppen darzustellen, wurden aus dem ersten statistischen Vergleich, in dem Gruppenunterschiede mittels einer Einweg-Varianzanalyse im allgemeinen untersucht wurden, 8537 Gensonden in die weitere Analyse eingeschlossen. Dieser Auswahl lag eine Schätzung der falsch positiven Rate von 0.3% zugrunde. Dies wird statistisch so interpretiert, dass ca. 26 Sonden in der Auswahlliste von 8537 Sonden (eben 0.3%) falsch positiv sind. Jede Erweiterung der Auswahl würde zur einer höheren falsch positiven Rate führen. Die ausgewählten 8357 Gensonden adressieren insgesamt 7694 verschiedene RNA-Transkripte
Die Genexpression dieser Gensonden innerhalb der Studie wurde nach ihrer Ähnlichkeit in 9 Gencluster mittels des k-means Algorithmus gruppiert (Hartigan u. Wong, 1979). Dafür wurde die R-Funktion kmeans verwendet, die Expressionssignale im Voraus wurde Gen für Gen bzgl des Mittelwertes und der Streuung standardisiert. Die Schätzung der Clusterzahl erfolgte nach der 2. Ableitung der Fehlerfunktion (Kostenfunktion), die sich aus der Wiederholung des Clustering-Verfahrens für 1 bis 20 Cluster ergibt [Goutte u. a., 1999].
Die Patientengrupen wurden in der Reihenfolge (1) NaN, (2) NaL, (3) LaL, (4) NaS, (5) LaS, (6) SaS angeordnet. Am Ende wurden die 12 Genexpressionmuster aus den 8537 Gensonden der Verlaufsproben beider Patienten angereiht. Die sortierte Expressionsmatrix wurde in einem sogenannten Heatmap visualisiert. In 1 repräsentiert jede Zeile eine Gensonde und jede Spalte eine RNA Probe. Es stellt die relative Veränderung der Genexpression in Graustufen dar. So kodiert dunkelgrau bis schwarz eine niedrigere Expression und hellgrau bis weiß eine höhere Expression als im Mittel pro Gensonde bestimmt wurde. Die Cluster wurden von 1 bis 9 durchnummeriert, die Zahl in Klammern unter der Clusternummer gibt die Anzahl der Gensonden im Cluster an. Innerhalb eines Clusters wurden die Gensonden abfallend sortiert, so dass Sonden mit größten Unterschieden innerhalb der Studien-Gruppen am oberen Ende des Clusters angeordnet sind.
Aus der 1 ist ersichtlich, dass es einen Trend in der Expression von links nach rechts gibt. Von der Gruppe NaN zur Gruppe SaS nimmt die Expression in den Genclustern 1 bis 4 zu und in den Genclustern 5 bis 9 ab. Jedoch zeigt sich auch eine hohe Variabilität innerhalb der einzelnen Gruppen, insbesondere der NaS-Gruppe. Die Übergänge zwischen einzelnen Gruppen sind fließend, die Gruppen überlappen sich.
Der mittlere Unterschied zwischen den Gruppen NaN (keine akute Entzündung) und SaS (SIRS-Patienten mit einer bestätigten Blutstrominfektion) ist am deutlichsten. Dieser Unterschied wurde im nächsten Schritt mittels eines Abstandsmaßes quantifiziert (vgl. nächsten Abschnitt). Alle anderen Proben wurden nach ihrem Abstand zu diesen beiden Gruppen angeordnet. In der sortierten Heatmap, die in der 2 dargestellt ist, wird diese Anordnung visualisiert. Proben, die dem Muster der Gesunden ähnlicher waren, wurden links und Proben, die dem Muster der Intensivpatienten mit einer Blutinfektion ähnlicher waren, wurden rechts sortiert.
Das sortierte Heatmap zeigt, dass die Patientenproben überwiegend nach ihrer Gruppenzugehörigkeit in der oben aufgestellten Reihenfolge sortiert wurden, bzw. in benachbarte Gruppen eingemischt werden. Jedoch werden einzelne Proben in deutlich höhere bzw. niedrigere Ränge als die meisten Gruppenverträter einsortiert. Das Genexpressionsmuster des Heatmaps zeigt eine gleichzeitige Zu- und Abnahme der Genaktivität von NaN zur SaS. Die einzelnen Gencluster unterscheiden sich lediglich im Fortschreiten der Abweichung.
Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Genexpression in besonderem Maße die Stärke der Wirtsantwort auf die durch eine Inflammation verursachte Belastung des Organismus widerspiegelt. Tatsächlich bedeutet eine Blutstrominfektion mit einer systemischen Inflammation die größte Belastung des Immunsystems. Eine ähnliche Belastung wird durch eine lokale Infektion entstehen, wenn das Immunsystem nicht im Stande ist an der Infektionsquelle die Erreger zu bekämpfen. Aber auch ein traumatisches Ereignis, z. B. eine schwere Operation, kann das Immunsystem kurzfristig an die Belastbarkeitsgrenze auslasten. Darüber hinaus bildet die Genexpression die Schwere der Wirtsanwort bei einer schwächeren Belastung, die durch eine lokale Inflammation verursacht wird, ab.
Wie bereits erwähnt, werden die selektierten Gene in lediglich 2 Gruppen aufgeteilt. In der einen Gruppe von 3041 Gensonden (36%) nimmt die Genexpression mit der Belastung des Immunsystems zu (Cluster 1 bis 4), in der anderen Gruppe von 5496 Gensonden (64%) ab (Cluster 5 bis 9). Aufgrund bekannter Referenzen [(vgl. Calvano u. a. (2005) und Foteinou u. a., 2008] würde man bei der Expressionszunahme von einer (pro- und anti-) inflammatorischen und bei der Expressionsabnahme von einer energetischen Antwort sprechen. Die energetische Erschöpfung bei anhaltender Inflammation führt zu einer unbändigen Immunantwort.
Quantifizierung der Schwere der Wirtsantwort
Die Sortierung des Heatmaps (vgl.) erfolgte nach dem folgenden Score. Für eine RNA-Probe sei X der zugehörige Genexpressionsvektor, der die Expressionssignale der ausgewählten Gensonden zusammenfasst. Man bezeichne mit d(X₁, X₂) den euklidischen Abstand zwischen zwei Vektoren X₁ und X₂. Weiter bezeichne cor(X₁, X₂) den Korrelationskoeffizienten zwischen X₁ und X₂ nach Pearson, der dem Cosinus-Wert des Winkels zwischen X₁ und X₂ entspricht [Mardia u. a., 1979].
Der Score wird nach der folgenden Formel score(X)[%] = 100% / d(mS, mH)·cor(X – mH, mS – mH)d(X, mS – mH) Formel 1 berechnet, wobei mH und mS die zwei Genexpressionsvektoren sind, die die Mittelwerte der Gruppen NaN (mH) und SaS (mS) Gen für Gen zusammenfassen.
Der Score kann wie folgt veranschaulich werden. Aus den Abständen d(mS, mH), d(mS, X) und d(X, mH) wird ein Dreieck gebildet, dessen Ecken der Einfachheit halber mit X, mH und mS bezeichnet werden (vgl. 3). Der Wert L_X = cor(X – mH, mS – mH)d(X, mS – mH) definiert die Lage des Fußpunkts des Lots von der Ecke X auf die Gerade, die durch d(mS, mH) bestimmt wird. Der Wert von L_X entspricht dem Abstand zwischen mH und diesem Lotfußpunkt. Er gibt auch an, wie weit die Ecke X des Dreiecks von der Ecke mH entfernt ist, die Höhe des Dreiecks wird nicht bewertet.
Schließlich gibt der Score, der durch Formel 1 definiert ist, den relativen Anteil des Abstands L_X bzgl. der Distanz d(mS, mH). Tatsächlich enthält man aus der Formel 1 für X = mH: score(mH) = 0% und für X = mS: score(mS) = 100%.
In der 3 liegt die Probe 3 von mS weiter als mH entfernt und bekommt den Score-Wert von –9,3%. Die Probe 59 liegt von mH weiter als mS und bekommt den Score-Wert von 127,8%. Schließlich liegt die Probe 37 zwischen mH und mS und bekommt den Score-Wert von 27,7%. Den Wert von 50% würde eine Probe bekommen, die den gleichen Abstand zum mH und mS hat.
Der Abstand d(mS, mH) setzt sich aus den Abständen der einzelnen Gensonden additiv zusammen. Zerlegt man diesen Gesamabstand in zwei Komponenten, wobei die eine Komponente d⁺(mS, mH) aus den Gensonden der Clustern 1 bis 4 und die andere d(mS, mH) aus den Gensonden der Clustern 5 bis 9 berechnet werden, so gewinnt man eine Information über den Beitrag der Expressionszu- und -abnahme an der Gesamtabweichung. Im von uns untersuchten Datensatz betrug die Zunahme, die von 36% der Gensonden repräsentiert wird, 51% des Gesamtabstands. Die Abnahme, repräsentiert durch 64% aller Sonden, betrug 49% des Gesamtabstands. Somit nahm im Mittel die Expression einer Gensonden aus den Clustern 1 bis 4 mehr ab als in den Clustern 5 bis 9. Das Gesamtverhältnis der Zu- und Abnahme war etwa gleich. Wird das Verhältnis der Zu- und Abnahme für jede Probe berechnet, so gewinnt man eine Information über das Fortschreiten der Abweichung in die ausgezeichnete Richtung.
Die 4 zeigt, wie sich das Abstandsdreieck für die beiden Patienten-Fälle im Verlauf der Erkrankung bewegt, wobei der Index oberhalb der Dreieckspitze den Tag der Abnahme angibt und mit 0 die pre-operative Probe bezeichnet wird.
In der 5 wird der Score für alle Studien-Proben dargestellt. Die Studien-Gruppen und die beiden Verläufe wurden wie in der 1 angeordnet. Die schwarzen Punkte markieren den Score-Wert, die Balken die Abweichung von 7,5 Prozentpunkten nach oben und unten.
Es soll erwähnt werden, dass der vorgeschlagene Score nicht der einzige ist, mit dem die Unterschiede in der Genexpression der Studiengruppen quantifiziert werden können. Der Vorteil dieses Scores liegt darin, dass damit ein relatives Maß definiert wird, nämlich einen prozentualen Anteil des Unterschieds, der zwischen der Genexpression zur Gruppe ohne akute Inflammation und SIRS-Patienten mit einer Blutinfektion ermittelt wurde. Der Score ist unabhängig von der Messplattform und von der Anzahl der verwendeten Genmarkern.
Obwohl der Score lediglich eine gleichzeitige Zu- und Abnahme der Genaktivität quantifiziert, wird er aus der Expression von mehreren Tausend von Genen berechnet. Die Ursache dafür liegt im untersuchten Phänomen. Die verwendeten Gene sind im Allgemeinen für unterschiedliche Prozesse zuständig. Daher kann die Expressionsabweichung vom Gesunden für ein einzelnes Gen verschiedene Ursachen haben. Das Schwarm-Verhalten vieler Gene in die ausgezeichnete Richtung spiegelt aber das quantitative Ausmaß der Immunbelastung wider.
An den Beispielen, in denen für 2 Patienten der postoperative Zustand beobachtet wurde, zeigt sich, dass der Score das momentane Ausmaß der Wirtsantwort erfasst. Daher kann er zur Überwachung/Monitoring verwendet werden. Tatsächlich verändert sich der Score für einen Patienten innerhalb von 6 Tagen vom Wert von ca. 20% bis ca. 90% Prozentpunkten. Darüber hinaus ist er zu allgemeiner Beurteilung der Immunbelastung geeignet. Tatsächlich zeigen die prä-operativen Proben von beiden Patienten einen erhöhten Score-Wert von über 20%. Dies kann eine der Ursachen für den an Komplikationen reichen postoperativen Verlauf sein.
Beispiel 2: Bestimmung der Schwere der Wirtsantwort bei Patienten mit einer akuten Inflammation mit einer reduzierten Anzahl von Markern
Genmarker-Auswahl basierend auf Simulationen
Für die Bestimmung der Stärke der Wirtsantwort wurde eine hohe Genmarkerzahl verwendet. Die untersuchten Gene sind im Allgemeinen für unterschiedliche Prozesse zuständig und die Expressionsabweichung vom Gesunden für ein einzelnes Gen hat verschiedene Ursachen. Je mehr Gene beobachtet werden, desto besser kann eine andere Ursache als die Belastung des Immunsystems für die Expressionsabweichung ausgeschlossen werden. Die Beobachtung aller relevanten Gene schließt andere Ursachen gänzlich aus. Es besteht jedoch eine begründete Vermutung, dass auch eine reduzierte Gensondenzahl ausreichend genug den Belastungszustand des Immunsystems widerspiegeln würde. Die Genzahl-Reduktion ist aber nur dann glaubwürdig, wenn der resultierende Score ausreichend nah am ursprünglichen Score (Master-Score) liegt. In unserer Studie konnte der Master-Score mit großer Genauigkeit aus den 4372 Gensonden ermittelt werden, deren mittlere Expression zwischen 2 Studiengruppen mindestes 0.8 betrug. Tatsächlich betrug die Abweichung nicht mehr als 1 Prozentpunkt. Wurde der Score aus den restlichen 4165 Gensonden berechnet, so lag die Abweichung unter 8 Prozentpunkten.
Da es keinen Algorithmus zur Markerauswahl gibt, ist es nahe liegend, über Computer-Simulationen zu prüfen, ob es eine bevorzugte Genzahl und Genmenge gibt, die den Master-Score abbilden. Um die Zahl der benötigten Gensonden abzuschätzen, wurden in ersten Simulationsläufen aus den 8357 Gensonden des Master-Scores zufällig maximal 1500 ausgewählt. Davon waren 36% aus den Clustern 1 bis 4 und 64% aus den Clustern 5 bis 9. Für jede Auswahl wurde der Score nach der Formel 1 für alle 73 RNA-Proben berechnet. Behalten wurden die Gensonden-Sets, deren Score nicht mehr als ±7.5 Prozentpunkte vom Master-Score abweichte. In 500 Wiederholungen wurden 241 solche Genmarker-Sets gefunden. In diesen Sets waren alle 8375 Gensonden vertreten. Das kürzeste Set enthielt 138 Gensonden. In nächsten 5000 Wiederholungen wurden maximal 150 Gensonden pro Lauf zufällig ausgewählt, ihre Verteilung über die Cluster war wie im ersten Lauf. Als Ergebnis erhielten wir 24 Sets mit der Länge von 86 bis 148 Gensonden, wobei die zugehörigen Score-Werte nicht mehr als ±7.5 Prozentpunkte vom Master-Score abweichten. Die Ergebnisse der Voruntersuchung zeigen, dass die Anzahl der Genmarker erheblich reduziert werden kann, wenn man eine sinnvolle Abweichung vom Master-Score akzeptiert. In den nachfolgend beschriebenen Simulationen wurde die maximale Gensondenzahl weiter reduziert. Die Ergebnisse dieser Simulationen wurden in der zusammengefasst.
In der ersten Simulation wurde wie folgt vorgegangen. Die Expressionsmatrix von 8357 Genmarkern und 61 Expressionsvektoren aus den 6 Studiengruppen wurde einer Hauptkomponentenanalyse (Mardia u. a., 1979) unterzogen. Dafür wurde die R-Funktion prcomp verwendet. Es wurden 512 Gensonden ausgesucht, die mit der ersten Hauptkomponente am stärksten korrelierten. Dabei waren 183 (36%) aus den Genclustern 1 bis 4 und 329 (64%) aus den Gencluster 5 bis 9. Damit wurde die Auswahlmenge auf Gensonden eingeschränkt, die am deutlichsten den untersuchten Trend in der Genexpressions-veränderung repräsentieren, wobei die Zu- und Abnahme im gleichen Verhältnis wie in der primären Auswahl standen.
Aus dieser Vorauswahl (512 Gensonden) wurden in 5000 Simulationsschritten zufällig 40 bis 50 Gensonden ausgewählt und aus ihnen nach der Formel 1 für alle 73 Genmuster der Score berechnet. Die Auswahl wurde verworfen, wenn die absolute Differenz zwischen dem Master-Score und dem neuem Score für mindestens eine Probe größer war als 7.5 Prozentpunkte. In anderem Fall wurde die Auswahl gespeichert. Diese Simulation lieferte 2 Gensonden-Sets, die die Bedingung erfüllten. Diese Mengen wurden als Set 1 und Set 2 in der über die zugehörige Sequenznummer beschrieben. Sie enthielten 49 und 47 Gensequenzen.
In nächsten 5000 Simulationschritten wurden die Gensonden-Tupels behalten, bei denen für 70 Proben (95%) der reduzierte Score vom Master-Score nicht mehr als 7.5 Prozentpunkte abweichte. In diesem Simulationsschritt wurden 14 verschiedene Kombinationen gefunden. Diese Mengen, als Set 3 bis Set 16 in der über die zugehörige Sequenznummer beschrieben, enthielten 46 bis 49 Gensequenzen.
In einer dritten Simulation wurde die Anzahl der zufällig ausgewählten Sonden auf maximal 20 reduziert und die Auswahl-Prozedur 50000 wiederholt. Behalten wurden ebenfalls die Gensonden-Tupels, bei denen für 70 Proben (95%) der reduzierte Score vom Master-Score nicht mehr als 7.5 Prozentpunkte abweichte. In dieser Simulation wurden 20 verschiedene Kombinationen gefunden, die die Auswahlbedingung erfüllten.
Diese Mengen, als Set 17 bis Set 36 in der über die zugehörigen Sequenznummer beschrieben, enthielten 18 bis 20 Gensequenzen.
Die Ergebnisse dieser Simulationen zeigen, dass der Score mit einer ausreichenden Genauigkeit auch aus einer deutlich geringeren Sondenzahl bestimmt werden kann. Tatsächlich erscheint ein Fehlerbalken von 15 Prozentpunkten (die einem Fehler von ±7.5 Prozentpunkten entspricht) akzeptabel, wenn er zu einer erheblichen Reduktion der Genmarker-Zahl führt. Dabei muss berücksichtigt werden, dass auch der ursprüngliche Score zufälligen Schwankungen unterliegt und von der unterliegenden Stichprobe abhängt.
Darüber hinaus zeigen die Simulationen, dass es keine bevorzugten Gensonden gibt, die den Score bestimmen. Tatsächlich führen unterschiedliche Gensonden-Tupels zu ähnlicher Schätzung des Master-Scores. Tatsächlich enthält die insgesamt 423 verschiedene Sequenznummern.
Tabelle 4: Zusammenfassung der Gensonden-Tupel, die in Simulationen die beschriebenen Auswahl-Kriterien erfüllten. Die Sets wurden von 1 bis 36 durchnummeriert, die Zahl n in Klammern gibt die Anzahl der Sequenzen im Set an. Die sich anschließende Folge von Zahlen gibt die zugehörigen Sequenznummern aus dem Sequenzprotokoll an.

Set 1 (n = 49) 508, 553, 611, 679, 734, 769, 851, 860, 871, 896, 1117, 1263, 1646, 1647, 1648, 1675, 1688, 1975, 2011, 2077, 2415, 2516, 2560, 2581, 3381, 3491, 3820, 3947, 4156, 4230, 4506, 4576, 5012, 5235, 5614, 5730, 5803, 5873, 6114, 6262, 6265, 6301, 6689, 6738, 6820, 6847, 6879, 7069, 7230 Set 2 (n = 47) 160, 309, 374, 428, 462, 911, 937, 1039, 1092, 1105, 1458, 1533, 1604, 1895, 1917, 1997, 2002, 2055, 2242, 2332, 2369, 2386, 2427, 2516, 2541, 2560, 2785, 3359, 3407, 3624, 4230, 4587, 4636, 5164, 5235, 5247, 5371, 5776, 6278, 6328, 6497, 6636, 7156, 7201, 7230, 7314, 7450 Set 3 (n = 48) 10, 366, 411, 462, 493, 495, 567, 1204, 1226, 1409, 1414, 1449, 1487, 1583, 1724, 1744, 2013, 2055, 2064, 2208, 2248, 2692, 2891, 3051, 3624, 4156, 4205, 4510, 4587, 4923, 5176, 5373, 5400, 5435, 5873, 5912, 5954, 6041, 6073, 6247, 6301, 6478, 6525, 6923, 7207, 7450, 7670, 7681 Set 4 (n = 47) 160, 359, 441, 493, 522, 541, 652, 691, 1128, 1408, 1583, 1651, 1652, 1664, 1688, 2002, 2077, 2248, 2273, 2415, 2676, 2690, 2755, 2876, 3053, 3623, 4216, 4327, 4525, 4587, 4765, 4870, 5013, 5164, 5431, 5614, 5950, 6098, 6265, 6432, 6497, 6981, 7062, 7202, 7314, 7450, 7607 Set 5 (n = 49) 97, 428, 441, 543, 611, 851, 1136, 1384, 1533, 1868, 1997, 2077, 2183, 2208, 2226, 2260, 2329, 2386, 2475, 2686, 2690, 2876, 3054, 3821, 4000, 4357, 4479, 4530, 4636, 4765, 4923, 5013, 5137, 5204, 5760, 5776, 5819, 5873, 5908, 6005, 6099, 6242, 6417, 6499, 6585, 6847, 7450, 7670, 7681 Set 6 (n = 48) 10, 97, 359, 475, 495, 627, 928, 1039, 1117, 1248, 1384, 1408, 1472, 1652, 1675, 1744, 1868, 1918, 2370, 2423, 2537, 2742, 2865, 3051, 3086, 3408, 3916, 4030, 4078, 4274, 4294, 4362, 4751, 5129, 5235, 5247, 5431, 5734, 5803, 5811, 5908, 5950, 6005, 6417, 6497, 6525, 6923, 7456 Set 7 (n = 49) 32, 160, 383, 414, 493, 611, 652, 679, 734, 885, 896, 946, 1177, 1640, 1650, 1704, 1882, 2077, 2248, 2250, 2260, 2415, 2561, 3086, 3488, 3623, 3624, 4135, 4156, 4160, 4510, 4525, 4530, 4742, 5137, 5204, 5247, 5730, 5950, 6114, 6210, 6225, 6430, 6478, 6497, 6545, 6668, 7314, 7607 Set 8 (n = 48) 359, 383, 515, 538, 544, 691, 769, 813, 1024, 1039, 1092, 1409, 1519, 1640, 1649, 1665, 1696, 1731, 1744, 2167, 2183, 2226, 2260, 2273, 2425, 2516, 2618, 2634, 2672, 3051, 3168, 3202, 4160, 4754, 4966, 5373, 5465, 5493, 5541, 5574, 5912, 6005, 6216, 6432, 6636, 6748, 6847, 7423 Set 9 (n = 46) 160, 352, 544, 691, 802, 885, 1126, 1147, 1163, 1336, 1416, 1639, 1969, 2002, 2058, 2077, 2183, 2331, 2332, 2426, 2526, 2742, 2855, 2860, 2891, 3054, 3138, 3488, 3947, 4560, 4576, 4707, 4776, 5235, 5371, 5400, 5431, 5760, 5873, 6247, 6301, 6417, 6673, 6820, 7447, 7604 Set 10 (n = 49) 8, 164, 462, 494, 495, 510, 545, 567, 611, 679, 941, 1039, 1105, 1128, 1147, 1318, 1533, 1649, 1918, 1973, 1975, 2011, 2077, 2080, 2370, 2537, 3051, 3202, 3676, 4274, 4587, 4928, 5204, 5373, 5431, 5465, 5541, 5734, 5908, 5912, 5950, 6278, 6417, 6497, 6668, 6673, 7156, 7230, 7670 Set 11 (n = 46) 89, 97, 160, 355, 359, 366, 374, 411, 462, 475, 515, 538, 543, 691, 1384, 1647, 1649, 1651, 1724, 2011, 2058, 2064, 2242, 2369, 2859, 3414, 4000, 4742, 4765, 4870, 4966, 5040, 5232, 5247, 5276, 5373, 5431, 5760, 5873, 5954, 6417, 6419, 6497, 6545, 6636, 7484 Set 12 (n = 49) 8, 89, 515, 543, 585, 769, 969, 1126, 1163, 1526, 1583, 1639, 1744, 2019, 2393, 2415, 2453, 2618, 2690, 2692, 2810, 2855, 2863, 3153, 3158, 3190, 3408, 4000, 4083, 4104, 4248, 4479, 4491, 4550, 4661, 4877, 4995, 5176, 5276, 5599, 5695, 6073, 6114, 6265, 6417, 6499, 6585, 6632, 6673 Set 13 (n = 48) 414, 538, 946, 1263, 1384, 1512, 1895, 2077, 2248, 2260, 2516, 2676, 2975, 3168, 3414, 4083, 4274, 4776, 4800, 4919, 4923, 5179, 5204, 5431, 5493, 5541, 5619, 5695, 5819, 6005, 6073, 6099, 6210, 6247, 6265, 6350, 6417, 6432, 6499, 6536, 6545, 6636, 6668, 6689, 7040, 7062, 7472, 7604 Set 14 (n = 47) 383, 428, 538, 553, 691, 814, 871, 896, 911, 937, 1426, 1639, 1685, 1688, 1983, 2093, 2253, 2260, 2454, 2516, 2587, 2672, 2761, 2865, 2975, 3086, 3781, 4000, 4030, 4308, 4510, 4636, 4923, 5137, 5235, 5574, 5776, 5819, 5908, 6226, 6278, 6417, 6632, 7202, 7230, 7315, 7456 Set 15 (n = 46) 97, 366, 383, 802, 1426, 1514, 1558, 1685, 1744, 1975, 2011, 2013, 2369, 2415, 2454, 2510, 2516, 2577, 2587, 2759, 2968, 3168, 3364, 3641, 3780, 4083, 4230, 4294, 4587, 4638, 4817, 5040, 5164, 5276, 5371, 5465, 5541, 6073, 6098, 6114, 6184, 6216, 6497, 6515, 7062, 7202 Set 16 (n = 49) 10, 504, 541, 553, 567, 652, 802, 1024, 1092, 1136, 1197, 1519, 1646, 1647, 1648, 1652, 2055, 2058, 2260, 2273, 2330, 2331, 2415, 2491, 2581, 2618, 2676, 2742, 3053, 3408, 3652, 3915, 4216, 4870, 5235, 5641, 5695, 5954, 6114, 6278, 6419, 6461, 6791, 6820, 6847, 6923, 7428, 7604, 7670 Set 17 (n = 20) 10, 160, 428, 871, 941, 1136, 1197, 1416, 1558, 1786, 1951, 2386, 2510, 2560, 3488, 3652, 3781, 5176, 5400, 6515 Set 18 (n = 20) 871, 1163, 1414, 1416, 1426, 1487, 2001, 2055, 2369, 2386, 2552, 2577, 2865, 3051, 4550, 4577, 5614, 6098, 7369, 7423 Set 19 (n = 20) 567, 958, 2226, 2250, 2260, 2427, 2516, 3364, 4030, 4135, 5235, 5574, 5950, 6114, 6226, 6267, 6278, 6418, 7069, 7518 Set 20 (n = 20) 409, 1647, 1648, 1770, 1883, 1951, 2013, 2386, 2423, 3152, 3491, 4205, 4577, 4661, 4765, 4919, 7428, 7604 Set 21 (n = 20) 355, 480, 494, 667, 1492, 2475, 2855, 2948, 3155, 3158, 3408, 3780, 4661, 5113, 5232, 5368, 5574, 6114, 6419, 6499 Set 22 (n = 19) 769, 1163, 1472, 2077, 2370, 2759, 3488, 3567, 3737, 3780, 4230, 4245, 4274, 4550, 5950, 6497, 7069, 7109, 7681 Set 23 (n = 20) 160, 164, 355, 411, 1106, 1408, 1675, 1679, 2386, 2453, 2516, 2810, 3168, 3202, 3652, 4230, 5574, 5986, 7428, 7484 Set 24 (n = 19) 10, 164, 885, 1263, 1318, 1416, 1492, 1508, 1647, 1951, 2250, 2560, 2785, 2827, 3086, 4506, 5137, 5575, 5954 Set 25 (n = 19) 32, 522, 679, 1519, 2001, 2491, 2516, 2676, 3412, 3737, 4205, 4294, 4560, 5235, 5954, 6005, 6114, 6499, 6525 Set 26 (n = 19) 958, 1449, 1472, 1582, 2332, 2516, 2552, 2891, 2975, 3168, 3190, 3683, 3820, 3947, 4245, 4530, 7040, 7069, 7145 Set 27 (n = 20) 428, 515, 544, 562, 567, 1263, 2002, 2332, 2526, 3438, 4577, 4754, 5574, 5614, 5912, 6328, 6515, 7156, 7423, 7456 Set 28 (n = 20) 355, 508, 937, 1263, 1973, 2002, 2510, 4078, 41.56, 4550, 4673, 4817, 5247, 5368, 5730, 6005, 6247, 6515, 7201, 7207 Set 29 (n = 20) 10, 544, 871, 1408, 1487, 1649, 2002, 2415, 2690, 2859, 2975, 3126, 4577, 4636, 5541, 6073, 6417, 6432, 6866, 6879 Set 30 (n = 20) 896, 1248, 1318, 1472, 1786, 1830, 1983, 2386, 2865, 2975, 3641, 3916, 4030, 4530, 4995, 5472, 5619, 6099, 6247, 6265 Set 31 (n = 20) 355, 462, 1416, 1983, 2011, 2183, 2248, 2618, 3190, 3412, 4490, 4576, 4776, 4923, 5164, 6101, 6114, 6278, 7314, 7369 Set 32 (n = 20) 310, 1226, 1895, 2248, 2427, 2516, 2552, 2690, 3086, 3438, 3915, 4216, 4587, 5235, 5276, 5954, 6265, 6478, 6515, 7207 Set 33 (n = 20) 493, 584, 633, 937, 2330, 2377, 2491, 2587, 3153, 3683, 4216, 4248, 4530, 6114, 6419, 6478, 6525, 6689, 7202, 7456 Set 34 (n = 20) 10, 359, 383, 478, 626, 1472, 1487, 1647, 2475, 3683, 3780, 4490, 4636, 5179, 5247, 5371, 5950, 6748, 6923, 7670 Set 35 (n = 20) 97, 626, 1039, 1163, 1426, 1617, 1704, 2002, 2248, 2690, 3168, 4216, 4638, 5247, 5614, 5950, 6265, 6461, 6632, 7428 Set 36 (n = 20) 366, 414, 544, 734, 1263, 1416, 2167, 2208, 2250, 2370, 2491, 2526, 2855, 3190, 3488, 4083, 4248, 6673, 6845, 6847

Es soll bemerkt werden, dass die einzelnen in Tabelle 4 genannten Sets 1 bis 36 sowie die beiden folgenden Sets: Set 37 (n = 10): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431, 3043, 1665, 5776, 2902, 6585, 3167 und 745; und

Set 38 (n = 7): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431, 3043, 1665, 5776 und 7695 jeweils für sich genommen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, mit denen sich ein Score-Wert erhalten läßt, der lediglich in den Grenzen der vorliegenden Erfindung angegebenen Abweichung von einem Master-Score liegt, so dass die einzelnen Sets 1 bis 38 jeweils exakte Aussagen bezüglich des zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response (Wirtsantwort) eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, in einer Probe eines Probanden oder Patienten ermöglichen.
Bevorzugte Genmarker-Tupel
In einer früheren nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung DE 10 2009 044 085 der Anmelderin wurden Genexpressions-Marker gefunden, die eine Infektion bei Patienten mit einem systemischen inflammatorischen Response-Syndrom (SIRS) anzeigen können ( DE 10 2009 044 085 ). Von den dort untersuchten 13 Genmarkern finden sich 6–7 Marker in der hier untersuchten Liste der 8537 Gensonden wieder. Die Erklärung dafür liegt darin, dass SIRS-Patienten mit einer Infektion häufiger einer hohen Immunbelastung ausgesetzt sind als SIRS-Patienten ohne eine Infektion. In den folgenden Schritten wird gezeigt, dass der aus der Expression dieser Marker und nach der Formel 1 berechnete Score die Wirtsantwort ähnlich wie der im 1. Anwendungsbeispiel eingeführte Master-Score abbildet. Darüber hinaus wird gezeigt, dass durch die Erweiterung des Markersets die Abweichung vom Master-Score sehr deutlich reduziert werden kann.
In der Gen-Auswahl des 1. Anwendungsbeispiels finden sich 6 Gensequenzen aus einer nicht vorveröffentlichten Anmeldung ( DE 10 2009 044 085 ) der Anmelderin, die hier durch ihre Symbole angegeben werden: TLR5 und CD59 im Heatmap-Cluster 2, CPVL und FGL2 im Heatmap-Cluster 5, HLA-DPA1 und IL7R im Heatmap-Cluster 6. Für einen weiteren Gemmarker (CLU) lieferte die auf dem Mikroarray-BeadChips HumanHT-12 v3 verwendete Gensonde keine Signale. Für diese 7 Genmarker lagen Expressionswerte für 67 Patienten-Proben aus der Tabelle 2 vor, die auf einer alternativen Plattform, der so genannten realtime PCR vermessen wurden. Aus der Liste von 8537 Gensonden wurde der Ersatz-Vertreter TFPI für CLU ausgesucht, dessen Expressionswerte auf dem Mikroarray mit den zum Marker CLU zugehörigen Expressionswerten auf der realtime PCR eine Korrelation von 0,8 (Korrelationskoeffizient nach Pearson) erreichten.
Aus der Genexpression der 73 untersuchten RNA-Proben, die auf dem Mikroarray für den 7-Tupel von Gensonden bestimmt wurde, haben wir den Score nach der Formel 1 berechnet. Seine Abweichung vom Master-Score betrug für die Hälfte der Proben maximal ±6 Prozentpunkte, für drei Viertel der Proben maximal ±11 Prozentpunkte und für 90% der Proben ±18.3 Prozentpunkte.
Im nächsten Schritt wurden diesem Set von 7 Markern nacheinander jeweils 1 Gensonde von den verbliebenen 8530 Gensonden zugefügt und der zugehörige Score nach der Formel 1 berechnet. Der Set wurde um die Sonde erweitert, die den kleinsten Fehler lieferte. Der Fehler wurde als der 95%-Quantil aller absoluten Abweichungen vom Master-Score definiert. Die Prozedur wurde wiederholt bis dieser Fehler kleiner als ±10 Prozentpunkte betrug. Dieser Fall trat auf, nach dem der Genmarker-Tupel auf 10 Gensonden ausgeweitet wurde. Die Werte des Scores für 7 und 10 Gensonden sowie der Master-Score wurden in der Tabelle 5 zusammengefasst. In dieser Tabelle sind weiter die zur Basis 2 logarithmieren Expressionssignale der zugehörigen Gensequenzen angegeben. Tabelle 5: Score-Werte für 7 und 10 ausgewählte Gensonden im Vergleich zum Master-Score (Spalte 2 bis 4). Zur Basis 2 logarithmierten Exprssionswerte für 10 ausgewählte Gensonden, die durch die zugehörige Sequenznummer (2. Zeile), Accession (3. Zeile) und Symbol (4. Zeile) beschrieben sind. In der 5. Zeile wird das Heatmap-Cluster angegeben, in das die jeweilige Sonde eingeordnet wurde.
Beispiel 3: Bestimmung der Schwere der Wirtsantwort auf alternativen Messplattformen
Wie im 2. Beispiel bereits erwähnt, wurden für 7 relevante Genmarker aus der Tabelle 5 und für 67 RNA-Proben, Genexpressions-Signale mittels einer realtime PCR vermessen. Dafür wurden die folgenden Mess- und Analyseschritte durchgeführt.
Real-Time-PCR

Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG-Kit der Firma Invitrogen (Invitrogen Deutschland, Karlsruhe, BRD). Die Patienten-cDNA wurde 1:25 mit Wasser verdünnt, davon wurde jeweils 1 μl in die PCR eingesetzt. Die Proben wurden jeweils in 3 Replikaten pipettiert.

PCR-Ansatz pro well (10 μl)	2 μl Templat-cDNA 1:100
	1 μl forward primer, 10 mM
	1 μl reverse primer, 10 mM
	1 μl Fluorescein Reference Dye
	5 μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG

Es wurde ein Mastermix ohne Templat hergestellt, dieser wurde in 9 μl-Aliquots in die PCR-Platte aliquotiert, dazu wurden jeweils die Patienten-cDNAs pipettiert.
Das sich daran anschließende PCR-Programm bestand aus den folgenden Schritten:
Verwendet wurde das iO^TM 5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware. Die so genannten Ct-Werte (geschätzte Anzahl der Zyklen beim Schwellenüberschritt) wurden als Messergebnis vom Programm automatisch im Bereich des linearen Anstiegs der Kurven berechnet. Die Messwerte wurden im String-Format abgespeichert.
Datenanalyse:
Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version R 2.8.0 (R. app GUI 1.26 (5256), S. Urbanek & S. M. lacus, © R Foundation for Statistical Computing, 2008) durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht (vgl. R Development Core Team, 2006).
Die in die Analyse eingegangenen Datenmatrizen der gemessenen Ct-Werte wurden wie folgt bearbeitet. Zusammen mit den Markergenen wurden 3 so genannte Housekeeper Gene vermessen, die als Referenzen verwendet wurden. Zum Normalisieren wurde für jede Probe der Mittelwert der 3 ausgewählten Housekeeper-Gene berechnet. Von diesem Wert wurde der Ct-Wert jedes einzelnen Markers abgezogen. Jeder so gewonnene Delta Ct Wert spiegelt die relative Abundanz des Targettranskriptes bezogen auf den Kalibrator wider, wobei ein positiver Delta Ct Wert eine Abundanz höher als der Mittelwert der Referenzen und negativer Delta Ct Wert eine Abundanz kleiner als der Mittelwert der Referenzen bedeuten. Datenmatrix der normalisierten Delta Ct-Werte wurde in der Tabelle 6 zusammengefasst.
Nach der Formel 1 und der Beschreibung im 1. Beispiel wurde aus den Expressionssignalen, die mittels realtime PCR vermessen wurden, der zugehörige Score zur Quantifizierung der Schwere der Wirtsantwort berechnet. Der Vergleich dieses Scores mit dem Master-Score wird in der 6 demonstriert, wobei der Master-Score durch den zugehörigen Fehlerbalken von 10 Prozentpunkten nach unten und oben und der aus der PCR Messung bestimmte Score als Raute-Zeichen dargestellt sind. Wie bereits im 1. Beispiel beschrieben, ist die Berechungsvorschrift des Scores von der Anzahl der verwendeten Genmarker und der Messplattform unabhängig, für seine Berechnung benötigt man lediglich die mittleren Expressionssignale der Phänotyp-Gruppen NaN und SaS, die in Tabelle 1 definiert wurden.
Wie aus der 6 ersichtlich, zeigt der Score, der aus der realtime PCR Messung von 7 Markern bestimmt wurde, einen ähnlichen Trend wie der Master-Score und gibt damit Hinweise auf die Schwere der Wirtsantwort unter einer akuten inflammatorischen Belastung des Organismus. Es soll erwähnt werden, dass die realtime PCR eine einfachere schnellere und günstigere Messplattform zur Bestimmung der Genexpression als ein Mikroarray ist. Ihre Limitierung liegt in der niedrigeren Anzahl der gleichzeitig messbaren Genmarker. Tabelle 6: Zusammenfassung der bzgl. 3 Referenzen normalisierten Delta Ct-Werte für 7 ausgewählte Gensequenzen und 67 RNA-Proben. Die Proben ID bezieht sich auf Patienten-Proben, die in der Tabelle 2 dargestellt wurden.
Beispiel 4: Differentielle Expression von Proteinen zur in-vitro Bestimmung eines Schweregrades der Host-Response (Wirtsantwort) von Patienten
Die differentielle Expression von Markern zur in-vitro Bestimmung eines Schweregrades der Host-Response von Patienten kann nicht nur anhand von transkriptomischen Markern erfolgen, sondern ebenfalls auf der Ebene von Proteinen. Für die Verwendung von Proteinen als Biomarker gibt es zahlreiche Beispiele, auf die bereits kurz eingegangen wurde (Pierrakos, 2010). Es wird ebenfalls darauf verwiesen, das einzelne Protein-Marker bislang keine zufriedenstellenden oder nur mittelmäßige Resultate liefern und dass Kombinationen von Proteinmarker bevorzugt Verwendung haben sollten.
Im Folgenden werden beispielhaft Experimente beschrieben, mit deren Ergebnis gezeigt werden kann, dass Protein-Marker gleichermaßen geeignet sind, um die in-vitro Bestimmung eines Schweregrades der Host-Response von Patienten zu bestimmen. Bevorzugt wurden Proteine für die Untersuchung ausgewählt, für deren Gentranskripte in vorangegangenen Beispielen schon gezeigt werden konnte, dass sie sich für den genannten Zweck eignen.
Untersuchte Patienten-Gruppen
Es wurden Proben von 9 Sepsis-Patienten, 3 Patienten nach Herzchirurgischen Eingriffen und 7 gesunden Probanden untersucht (EDTA Blut Proben). Die Patienten nach Herzchirurgischem Eingriff (ICU-Patienten) wurden nach klinischen Kriterien zum Zeitpunkt der Probennahme mit der Diagnose SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome) klassifiziert. Die drei Patientengruppen repräsentieren die Phänotypen LaS und SaS (zusammen), NaS und NaN aus der Tabelle 1.
Experimentelle Durchführung
Aus den Blutproben wurden mit Hilfe eines Dichte-Gradienten (Lymphocyte Separation Medium LSM 1077, PAA Laboratories GmbH, Cölbe) zwei Zellpopulationen weißer Blutzellen isoliert: periphere einkernige Zellen (peripheral blond mononuclear cells, PBMCs) und vielkernige Zellen (polymorphonuclear cells, PMNs). Die für die Experimente verwendeten Zellen stellten zwei Subpopulationen der PBMCs dar: die T-Lymphozyten und Monozyten.
Die Detektion der Proteine erfolgte mittels Durchflußzytometrie und Western Blot, wobei die Durchflußzytometrie für Oberflächenproteine und der Western Blot für intrazelluläre Proteine eingesetzt wurden. Für beide Methoden wurden bevorzugt monoklonale Antikörper verwendet.
Mittels Durchflußzytometrie (FACSCalibur Flow Cytometer, Becton Dickinson GmbH Heidelberg) wurde die Expression der Proteine von folgenden Genen auf T-Lymphozyten und Monozyten untersucht: CD59, HLA-DPA1, IL7R, TLR5 und HLA-DR-Komplex. Die analysierten Blutproben setzten sich folgendermaßen zusammen: Sepsis-Patienten (n = 9), ICU-Patienten (n = 3) und gesunde Kontrollen (n = 7). Die Unterscheidung von T-Lymphozyten und Monozyten erfolgte anhand zweier Oberflächenmarker: CD3-Korezeptor für T-Lymphozyten [Tsoukas et al., 1985] und CD14-Rezeptor für Monozyten [Goyert et al., 1988]. Außerdem wurden die Zellen anhand ihrer Zellgröße (FSC-H) und ihrer Granularität (SSC-H) identifiziert.
Mittels Western Blot wurde die Expression der Proteine aus folgenden Genen im Lysat der Gesamtpopulation der PBMCs bei Sepsis-Patienten und gesunden Probanden untersucht: FGL2, CLU und CPVL. Die Experimente wurden anhand von Standard-Western-Blot-Protokollen durchgeführt, Positiv-Kontrollen (Lysate von transfizierten Zellen) wurden immer mitgeführt und die Normalisierung der Experimente erfolgte anhand von β-Aktin. Die anti-fibrinogen-like protein 2-(Produkt von FGL2-Gen), anti-clusterin-(Produkt von CLU-Gen) und anti-vitellogenic carboxypeptidase-like protein-(Produkt von CPVL-Gen)-Antikörper waren monoklonale Maus-Antikörper, der sekundäre Antikörper war ein HRP-gekoppelter Kaninchen-anti-Maus-Antikörper. Der Antikörper für β-Aktin war ein monoklonaler (13E5) Kaninchen-Antikörper (Cell Signalling Technology Inc., Denvers USA).
Datenanalyse
Die Messdaten wurden von der Software der jeweiligen Messvorrichtung zur Verfügung gestellt. Sie wurden in der Tabelle 7 zusammengefasst. Die Expression einzelner Proteine wurde für die 2 bis 3 untersuchten Phänotypgruppen auf statistisch signifikante Unterschiede getestet. Dabei wurden wie im 1. Ausführungsbeispiel die Einweg-Varianzanalyse (Anova) und der paarweise t-Test verwendet. Die Ergebnisse der Vergleiche sind am Ende der Tabelle 7 angereiht. Sie werden nachfolgend zusammengefasst.
In T-Lymphozyten war die Protein-Expression aus dem IL7R-Gen bei Sepsis-Patienten signifikant kleiner als bei gesunden Spendern. Damit zeigte sich eine Änderung in der gleichen Richtung wie in der Genexpression. Die Expression von MHC class II HLA-DPA1 antigen (Produkt aus HLA-DPA1-Gen) war bei Sepsis-Patienten signifikant höher als bei gesunden Spendern. Damit zeigte sich eine Änderung in der entgegen gesetzter Richtung als in der Genexpression. Die T-Lymphozyten zeigten bei der Proteinexpression aus CD59-, TLR5- und HLA-DR-Genen keine signifikanten Unterschiede zwischen den untersuchten Phänotypgruppen.
Die Monozyten zeigten bei der Proteinexpression aus den Genen HLA-DPA1 und TLR5 keine Unterschiede in den 3 Gruppen; die Protein-Expression aus CD59- und HLA-DR-Gen war jedoch bei den gesunden Probanden signifikant höher als bei SIRS- und Sepsis-Patienten. Ein IL7R-Genprodukt war in Monozyten nicht nachweisbar.
Die Western-Blot-Analyse von PBMC-Lysaten zeigte, daß die Proteinexpression aus FGL2-Gen in Sepsis-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erhöht, die Proteinexpression aus CLU-Gen bei Sepsis-Patienten jedoch reduziert ist. Damit zeigte sich für beide Proteine eine Änderung der Expression in der entgegen gesetzen Richtung als in der Genexpression. Ein CPVL-Genprodukt war in den Lysaten nicht nachweisbar. Tabelle 7: Protein-Expressionswerte für ausgewählte Marker. Nicht gemessenen Werte wurden mit n. a. bezeichnet. Patienten-Mittelwerte, die sich vom Gesunden signifikant unterschieden, wurden entsprechend markiert („**” für p < 0,01, „*” für p < 0,05, und „+” für p < 0,1).
Zusammenfassung
Aus dem beschriebenen Beispiel wird ersichtlich, dass sich der Schweregrad der Wirtsantwort bei einer akuten Inflammation auch in der Expression von Proteinen aus ausgewählten Genen widerspiegelt. Die Ergebnisse der Genexpressionsanalyse stellen eine umfangreiche Sammlung von Markerkandidaten zur Verfügung. Daher liegt es nahe, einen geeigneten Schweregrad-Score aus der Proteinexpression zu bestimmen, der den im Beispiel 1 eingeführten Master-Score aus der Genexpression ausreichend ähnlich ist.
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Claims

Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response (Wirtsantwort) eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, in einer Probe, wobei eine Messvorrichtung verwendet wird, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Gensonden aufweist, welche das im Wesentlichen gesamte Humangenom repräsentieren; wobei – Nucleinsäure-Proben einer Mehrzahl von Probanden, die einen bekannten phänotypischen physiologischen Zustand aufweisen, mit den Sonden der Messvorrichtung in Kontakt gebracht werden, um Signale einer jeweiligen Expression eines Gens zu erhalten; – aus der Gesamtzahl der eingesetzten Gensonden solche ausgewählt werden, die ein Expressionssignal mit detektierbarer Intensität für mindestens eine Nucleinsäure-Probe eines Probanden liefern; – die Probanden je nach ihrem Infektions- und/oder Inflammationsstatus in wenigstens zwei der folgenden klinisch ermittelten Phänotypgruppen eingeteilt werden:
wobei „a” eine UND-Verknüpfung zwischen den Eigenschaften S, L und N darstellt; – die Änderungen der Genexpressionssignale zwischen den Phänotypgruppen statistisch verglichen werden und bewertet wird, ob ein signifikanter Unterschied zwischen mindestens zwei der Phänotypgruppen besteht; – solche Gensonden ausgewählt werden, deren Genexpressionssignale zwischen mindestens zwei Phänotypgruppen statistisch signifikant verändert sind und eine geschätzte Anzahl von solchen Gensonden ausgeschlossen wird, die in Bezug auf einen vorgegebenen Schwellwert ein falsch positives Ergebnis liefern; – ein Master-Score als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, durch Quantifizierung der Zu- und Abnahme in der Genexpressionsintensität der ausgewählten Gensonden ermittelt wird; und – eine im Vergleich zur Ausgangsmenge erheblich reduzierte Anzahl von Polynucleotiden durch Ermittlung eines Scores identifiziert wird, der höchstens eine vorgegebene Abweichung vom Master-Score aufweist und der ebenfalls als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, dient.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Messvorrichtung verwendet wird, die 20.000 bis 50.000 Gensonden aufweist und/oder die Messvorrichtung, ein Biochip mit darauf matrixförmig immobilisierten Gensonden ist, wobei jeder einzelnen Gensonde eineindeutig Ortskoordinaten auf dem Biochip zugeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionssignale erhalten werden durch Hybridisierung und/oder Amplifikation, insbesondere PCR, bevorzugt quantitative PCR, vorzugsweise Real-time PCR und/oder Proteinnachweis.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die 6 Phänotypgruppen aus der Tabelle 1 paarweise miteinander verglichen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der statistisch signifikante Unterschied zwischen Gruppen, von denen mindestens eine Gruppe mehr als eine Phänotypgruppe umfasst, ermittelt wird
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein vorgegebener Schwellwert für eine geschätzte Anzahl von Gensonden, die ein falsch positives Ergebnis liefern, im Bereich von 0,1 bis 5%, insbesondere ca. 0,3% der eingesetzten Anzahl der Gensonden liegt und die geschätzte Anzahl der falsch positiven Gensonden ausgeschlossen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Master-Score der relative Abstand der Genexpressionssignale bezüglich des euklidischen Abstandes zwischen dem Mittelwert mS der Phänotypgruppe SaS und dem Mittelwert mH der Phänotypgruppe NaN dient.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der relative Abstand wie folgt erhalten wird: score(X)[%] = 100% / d(mS, mH)·cor(X – mH, mS – mH)d(X, mS – mH) wobei mit d(X₁, X₂) der euklidische Abstand und mit cor(X₁, X₂) der Pearson-Korrelationskoeffizient zwischen zwei Vektoren X₁ und X₂ bezeichnet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Score höchstens 5 bis 15 Prozentpunkte, insbesondere 10 Prozentpunkte vom Master-Score nach oben oder unten abweichen darf.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Master-Score gebildet wird aus der Gruppe der Polynucleotide mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Teilmengen-Sets von Polynucleotiden erhalten werden, wobei „n” die Anzahl der Polynucleotide des jeweiligen Sets angibt: Set 1 (n = 49)) SEQ-ID Nummern: 508, 553, 611, 679, 734, 769, 851, 860, 871, 896, 1117, 1263, 1646, 1647, 1648, 1675, 1688, 1975, 2011, 2077, 2415, 2516, 2560, 2581, 3381, 3491, 3820, 3947, 4156, 4230, 4506, 4576, 5012, 5235, 5614, 5730, 5803, 5873, 6114, 6262, 6265, 6301, 6689, 6738, 6820, 6847, 6879, 7069, 7230 Set 2 (n = 47) SEQ-ID Nummern: 160, 309, 374, 428, 462, 911, 937, 1039, 1092, 1105, 1458, 1533, 1604, 1895, 1917, 1997, 2002, 2055, 2242, 2332, 2369, 2386, 2427, 2516, 2541, 2560, 2785, 3359, 3407, 3624, 4230, 4587, 4636, 5164, 5235, 5247, 5371, 5776, 6278, 6328, 6497, 6636, 7156, 7201, 7230, 7314, 7450 Set 3 (n = 48) SEQ-ID Nummern: 10, 366, 411, 462, 493, 495, 567, 1204, 1226, 1409, 1414, 1449, 1487, 1583, 1724, 1744, 2013, 2055, 2064, 2208, 2248, 2692, 2891, 3051, 3624, 4156, 4205, 4510, 4587, 4923, 5176, 5373, 5400, 5435, 5873, 5912, 5954, 6041, 6073, 6247, 6301, 6478, 6525, 6923, 7207, 7450, 7670, 7681 Set 4 (n = 47) SEQ-ID Nummern: 160, 359, 441, 493, 522, 541, 652, 691, 1128, 1408, 1583, 1651, 1652, 1664, 1688, 2002, 2077, 2248, 2273, 2415, 2676, 2690, 2755, 2876, 3053, 3623, 4216, 4327, 4525, 4587, 4765, 4870, 5013, 5164, 5431, 5614, 5950, 6098, 6265, 6432, 6497, 6981, 7062, 7202, 7314, 7450, 7607 Set 5 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 97, 428, 441, 543, 611, 851, 1136, 1384, 1533, 1868, 1997, 2077, 2183, 2208, 2226, 2260, 2329, 2386, 2475, 2686, 2690, 2876, 3054, 3821, 4000, 4357, 4479, 4530, 4636, 4765, 4923, 5013, 5137, 5204, 5760, 5776, 5819, 5873, 5908, 6005, 6099, 6242, 6417, 6499, 6585, 6847, 7450, 7670, 7681 Set 6 (n = 48) SEQ-ID Nummern: 10, 97, 359, 475, 495, 627, 928, 1039, 1117, 1248, 1384, 1408, 1472, 1652, 1675, 1744, 1868, 1918, 2370, 2423, 2537, 2742, 2865, 3051, 3086, 3408, 3916, 4030, 4078, 4274, 4294, 4362, 4751, 5129, 5235, 5247, 5431, 5734, 5803, 5811, 5908, 5950, 6005, 6417, 6497, 6525, 6923, 7456 Set 7 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 32, 160, 383, 414, 493, 611, 652, 679, 734, 885, 896, 946, 1177, 1640, 1650, 1704, 1882, 2077, 2248, 2250, 2260, 2415, 2561, 3086, 3488, 3623, 3624, 4135, 4156, 4160, 4510, 4525, 4530, 4742, 5137, 5204, 5247, 5730, 5950, 6114, 6210, 6225, 6430, 6478, 6497, 6545, 6668, 7314, 7607 Set 8 (n = 48) SEQ-ID Nummern: 359, 383, 515, 538, 544, 691, 769, 813, 1024, 1039, 1092, 1409, 1519, 1640, 1649, 1665, 1696, 1731, 1744, 2167, 2183, 2226, 2260, 2273, 2425, 2516, 2618, 2634, 2672, 3051, 3168, 3202, 4160, 4754, 4966, 5373, 5465, 5493, 5541, 5574, 5912, 6005, 6216, 6432, 6636, 6748, 6847, 7423 Set 9 (n = 46) SEQ-ID Nummern: 160, 352, 544, 691, 802, 885, 1126, 1147, 1163, 1336, 1416, 1639, 1969, 2002, 2058, 2077, 2183, 2331, 2332, 2426, 2526, 2742, 2855, 2860, 2891, 3054, 3138, 3488, 3947, 4560, 4576, 4707, 4776, 5235, 5371, 5400, 5431, 5760, 5873, 6247, 6301, 6417, 6673, 6820, 7447, 7604 Set 10 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 8, 164, 462, 494, 495, 510, 545, 567, 611, 679, 941, 1039, 1105, 1128, 1147, 1318, 1533, 1649, 1918, 1973, 1975, 2011, 2077, 2080, 2370, 2537, 3051, 3202, 3676, 4274, 4587, 4928, 5204, 5373, 5431, 5465, 5541, 5734, 5908, 5912, 5950, 6278, 6417, 6497, 6668, 6673, 7156, 7230, 7670 Set 11 (n = 46) SEQ-ID Nummern: 89, 97, 160, 355, 359, 366, 374, 411, 462, 475, 515, 538, 543, 691, 1384, 1647, 1649, 1651, 1724, 2011, 2058, 2064, 2242, 2369, 2859, 3414, 4000, 4742, 4765, 4870, 4966, 5040, 5232, 5247, 5276, 5373, 5431, 5760, 5873, 5954, 6417, 6419, 6497, 6545, 6636, 7484 Set 12 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 8, 89, 515, 543, 585, 769, 969, 1126, 1163, 1526, 1583, 1639, 1744, 2019, 2393, 2415, 2453, 2618, 2690, 2692, 2810, 2855, 2863, 3153, 3158, 3190, 3408, 4000, 4083, 4104, 4248, 4479, 4491, 4550, 4661, 4877, 4995, 5176, 5276, 5599, 5695, 6073, 6114, 6265, 6417, 6499, 6585, 6632, 6673 Set 13 (n = 48) SEQ-ID Nummern: 414, 538, 946, 1263, 1384, 1512, 1895, 2077, 2248, 2260, 2516, 2676, 2975, 3168, 3414, 4083, 4274, 4776, 4800, 4919, 4923, 5179, 5204, 5431, 5493, 5541, 5619, 5695, 5819, 6005, 6073, 6099, 6210, 6247, 6265, 6350, 6417, 6432, 6499, 6536, 6545, 6636, 6668, 6689, 7040, 7062, 7472, 7604 Set 14 (n = 47) SEQ-ID Nummern: 383, 428, 538, 553, 691, 814, 871, 896, 911, 937, 1426, 1639, 1685, 1688, 1983, 2093, 2253, 2260, 2454, 2516, 2587, 2672, 2761, 2865, 2975, 3086, 3781, 4000, 4030, 4308, 4510, 4636, 4923, 5137, 5235, 5574, 5776, 5819, 5908, 6226, 6278, 6417, 6632, 7202, 7230, 7315, 7456 Set 15 (n = 46) SEQ-ID Nummern: 97, 366, 383, 802, 1426, 1514, 1558, 1685, 1744, 1975, 2011, 2013, 2369, 2415, 2454, 2510, 2516, 2577, 2587, 2759, 2968, 3168, 3364, 3641, 3780, 4083, 4230, 4294, 4587, 4638, 4817, 5040, 5164, 5276, 5371, 5465, 5541, 6073, 6098, 6114, 6184, 6216, 6497, 6515, 7062, 7202 Set 16 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 10, 504, 541, 553, 567, 652, 802, 1024, 1092, 1136, 1197, 1519, 1646, 1647, 1648, 1652, 2055, 2058, 2260, 2273, 2330, 2331, 2415, 2491, 2581, 2618, 2676, 2742, 3053, 3408, 3652, 3915, 4216, 4870, 5235, 5641, 5695, 5954, 6114, 6278, 6419, 6461, 6791, 6820, 6847, 6923, 7428, 7604, 7670 Set 17 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 10, 160, 428, 871, 941, 1136, 1197, 1416, 1558, 1786, 1951, 2386, 2510, 2560, 3488, 3652, 3781, 5176, 5400, 6515 Set 18 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 871, 1163, 1414, 1416, 1426, 1487, 2001, 2055, 2369, 2386, 2552, 2577, 2865, 3051, 4550, 4577, 5614, 6098, 7369, 7423 Set 19 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 567, 958, 2226, 2250, 2260, 2427, 2516, 3364, 4030, 4135, 5235, 5574, 5950, 6114, 6226, 6267, 6278, 6418, 7069, 7518 Set 20 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 409, 1647, 1648, 1770, 1883, 1951, 2013, 2386, 2423, 3152, 3491, 4205, 4577, 4661, 4765, 4919, 7428, 7604 Set 21 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 355, 480, 494, 667, 1492, 2475, 2855, 2948, 3155, 3158, 3408, 3780, 4661, 5113, 5232, 5368, 5574, 6114, 6419, 6499 Set 22 (n = 19) SEQ-ID Nummern: 769, 1163, 1472, 2077, 2370, 2759, 3488, 3567, 3737, 3780, 4230, 4245, 4274, 4550, 5950, 6497, 7069, 7109, 7681 Set 23 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 160, 164, 355, 411, 1106, 1408, 1675, 1679, 2386, 2453, 2516, 2810, 3168, 3202. 3652, 4230, 5574, 5986, 7428, 7484 Set 24 (n = 19) SEQ-ID Nummern: 10, 164, 885, 1263, 1318, 1416, 1492, 1508, 1647, 1951, 2250, 2560, 2785, 2827, 3086, 4506, 5137, 5575, 5954 Set 25 (n = 19) SEQ-ID Nummern: 32, 522, 679, 1519, 2001, 2491, 2516, 2676, 3412, 3737, 4205, 4294, 4560, 5235, 5954, 6005, 6114, 6499, 6525 Set 26 (n = 19) SEQ-ID Nummern: 958, 1449, 1472, 1582, 2332, 2516, 2552, 2891, 2975, 3168, 3190, 3683, 3820, 3947, 4245, 4530, 7040, 7069, 7145 Set 27 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 428, 515, 544, 562, 567, 1263, 2002, 2332, 2526, 3438, 4577, 4754, 5574, 5614, 5912, 6328, 6515, 7156, 7423, 7456 Set 28 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 355, 508, 937, 1263, 1973, 2002, 2510, 4078, 4156, 4550, 4673, 4817, 5247, 5368, 5730, 6005, 6247, 6515, 7201, 7207 Set 29 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 10, 544, 871, 1.408, 1487, 1649, 2002, 2415, 2690, 2859, 2975, 3126, 4577, 4636, 5541, 6073, 6417, 6432, 6866, 6879 Set 30 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 896, 1248, 1318, 1472, 1786, 1830, 1983, 2386, 2865, 2975, 3641, 3916, 4030, 4530, 4995, 5472, 5619, 6099, 6247, 6265 Set 31 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 355, 462, 1416, 1983, 2011,. 2183, 2248, 2618, 3190, 3412, 4490, 4576, 4776, 4923, 5164, 6101, 6114, 6278, 731' 4, 7369 Set 32 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 310, 1226, 1895, 2248, 2427, 2516, 2552, 2690, 3086, 3438, 3915, 4216, 4587, 5235, 5276, 5954, 6265, 6478, 6515, 7207 Set 33 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 493, 584, 633, 937, 2330, 2377, 2491, 2587, 3153, 3683, 4216, 4248, 4530, 6114, 6419, 6478, 6525, 6689, 7202, 7456 Set 34 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 10, 359, 383, 478, 626, 1472, 1487, 1647, 2475, 3683, 3780, 4490, 4636, 5179, 5247, 5371, 5950, 6748, 6923, 7670 Set 35 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 97, 626, 1039, 1163, 1426, 1617, 1704, 2002, 2248, 2690, 3168, 4216, 4638, 5247, 5614, 5950, 6265, 6461, 6632, 7428 Set 36 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 366, 414, 544, 734, 1263, 1416, 2167, 2208, 2250, 2370, 2491, 2526, 2855, 3190, 3488, 4083, 4248, 6673, 6845, 6847 Set 37 (n = 10): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431, 3043, 1665, 5776, 2902, 6585, 3167 und 745; Set 38 (n = 7): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431, 3043, 1665, 5776 und 7695.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmente der Polynucleotide eingesetzt werden, insbesondere solche mit Längen von 20 bis 1000, insbesondere 15 bis 500 Nucleotiden, vorzugsweise 15 bis 200, bevorzugt 20 bis 200 Nucleotiden und/oder Fragmenten, die eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 20%, vorzugsweise ca. 50% besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynucleotiden aufweisen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reihe von Score-Werten gemessen werden, die jeweils zu unterschiedlichen Zeitpunkten gehören, um den zeitlichen Verlauf des Schweregrads der Host Response eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder inflammatorischen Zustand befindet, zu erfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der akut infektiöse Zustand wenigstens einen der folgenden pathophysiologischen Zustände umfasst: Abszesse; Bakteriämien; postoperative Infektionen; Wundinfektionen; lokale Infektionen; systemische Infektionen; Sepsis; schwere Sepsis; septischer Schock.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der akut inflammatorische Zustand wenigstens einen der folgenden pathophysiologischen Zustände umfasst: Traumata; Verbrennungen; Strahlenschäden; toxische Schäden; Ischämie-Reperfusionsschäden; akute Abstoßungsreaktionen; inflammatorische Darmerkrankungen; onkologische Erkrankungen; postoperative Zustände; lokale Inflammation; systemische Inflammation; SIRS; allergische Reaktionen; anaphylaktischer Schock.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch. gekennzeichnet, dass der Score zur Diagnose, Vorhersage der Entwicklung oder der Überwachung des akut infektiösen und/oder inflammatorischen Zustandes eines Patienten und/oder der Therapieverlaufskontrolle und/oder zur Fokuskontrolle, verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Score verwendet wird, um eine Chance für eine Recovery oder Non-Recovery eines Patienten mit akut infektiösem und/oder akut inflammatorischem Zustand anzugeben.
Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist; zur Erfassung eines Scores als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet.
Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist; zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18.
Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der folgenden Teilmengen-Sets von Polynucleotiden verwendet werden, wobei „n” die Anzahl der Polynucleotide des jeweiligen Sets angibt: Set 1 (n = 49)) SEQ-ID Nummern: 508, 553, 611, 679, 734, 769, 851, 860, 871, 896, 1117, 1263, 1646, 1647, 1648, 1675, 1688, 1975, 2011, 2077, 2415, 2516, 2560, 2581, 3381, 3491, 3820, 3947, 4156, 4230, 4506, 4576, 5012, 5235, 5614, 5730, 5803, 5873, 6114, 6262, 6265, 6301, 6689, 6738, 6820, 6847, 6879, 7069, 7230 Set 2 (n = 47) SEQ-ID Nummern: 160, 309, 374, 428, 462, 911, 937, 1039, 1092, 1105, 1458, 1533, 1604, 1895, 1917, 1997, 2002, 2055, 2242, 2332, 2369, 2386, 2427, 2516, 2541, 2560, 2785, 3359, 3407, 3624, 4230, 4587, 4636, 5164, 5235, 5247, 5371, 5776, 6278, 6328, 6497, 6636, 7156, 7201, 7230, 7314, 7450 Set 3 (n = 48) SEQ-ID Nummern: 10, 366, 411, 462, 493, 495, 567, 1204, 1226, 1409, 1414, 1449, 1487, 1583, 1724, 1744, 2013, 2055, 2064, 2208, 2248, 2692, 2891, 3051, 3624, 4156, 4205, 4510, 4587, 4923, 5176, 5373, 5400, 5435, 5873, 5912, 5954, 6041, 6073, 6247, 6301, 6478, 6525, 6923, 7207, 7450, 7670, 7681 Set 4 (n = 47) SEQ-ID Nummern: 160, 359, 441, 493, 522, 541, 652, 691, 1128, 1408, 1583, 1651, 1652, 1664, 1688, 2002, 2077, 2248, 2273, 2415, 2676, 2690, 2755, 2876, 3053, 3623, 4216, 4327, 4525, 4587, 4765, 4870, 5013, 5164, 5431, 5614, 5950, 6098, 6265, 6432, 6497, 6981, 7062, 7202, 7314, 7450, 7607 Set 5 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 97, 428, 441, 543, 611, 851, 1136, 1384, 1533, 1868, 1997, 2077, 2183, 2208, 2226, 2260, 2329, 2386, 2475, 2686, 2690, 2876, 3054, 3821, 4000, 4357, 4479, 4530, 4636, 4765, 4923, 5013, 5137, 5204, 5760, 5776, 5819, 5873, 5908, 6005, 6099, 6242, 6417, 6499, 6585, 6847, 7450, 7670, 7681 Set 6 (n = 48) SEQ-ID Nummern: 10, 97, 359, 475, 495, 627, 928, 1039, 1117, 1248, 1384, 1408, 1472, 1652, 1675, 1744, 1868, 1918, 2370, 2423, 2537, 2742, 2865, 3051, 3086, 3408, 3916, 4030, 4078, 4274, 4294, 4362, 4751, 5129, 5235, 5247, 5431, 5734, 5803, 5811, 5908, 5950, 6005, 6417, 6497, 6525, 6923, 7456 Set 7 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 32, 160, 383, 414, 493, 611, 652, 679, 734, 885, 896, 946, 1177, 1640, 1650, 1704, 1882, 2077, 2248, 2250, 2260, 2415, 2561, 3086, 3488, 3623, 3624, 4135, 4156, 4160, 4510, 4525, 4530, 4742, 5137, 5204, 5247, 5730, 5950, 6114, 6210, 6225, 6430, 6478, 6497, 6545, 6668, 7314, 7607 Set 8 (n = 48) SEQ-ID Nummern: 359, 383, 515, 538, 544, 691, 769, 813, 1024, 1039, 1092, 1409, 1519, 1640, 1649, 1665, 1696, 1731, 1744, 2167, 2183, 2226, 2260, 2273, 2425, 2516, 2618, 2634, 2672, 3051, 3168, 3202, 4160, 4754, 4966, 5373, 5465, 5493, 5541, 5574, 5912, 6005, 6216, 6432, 6636, 6748, 6847, 7423 Set 9 (n = 46) SEQ-ID Nummern: 160, 352, 544, 691, 802, 885, 1126, 1147, 1163, 1336, 1416, 1639, 1969, 2002, 2058, 2077, 2183, 2331, 2332, 2426, 2526, 2742, 2855, 2860, 2891, 3054, 3138, 3488, 3947, 4560, 4576, 4707, 4776, 5235, 5371, 5400, 5431, 5760, 5873, 6247, 6301, 6417, 6673, 6820, 7447, 7604 Set 10 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 8, 164, 462, 494, 495, 510, 545, 567, 611, 679, 941, 1039, 1105, 1128, 1147, 1318, 1533, 1649, 1918, 1973, 1975, 2011, 2077, 2080, 2370, 2537, 3051, 3202, 3676, 4274, 4587, 4928, 5204, 5373, 5431, 5465, 5541, 5734, 5908, 5912, 5950, 6278, 6417, 6497, 6668, 6673, 7156, 7230, 7670 Set 11 (n = 46) SEQ-ID Nummern: 89, 97, 160, 355, 359, 366, 374, 411, 462, 475, 515, 538, 543, 691, 1384, 1647, 1649, 1651, 1724, 2011, 2058, 2064, 2242, 2369, 2859, 3414, 4000, 4742, 4765, 4870, 4966, 5040, 5232, 5247, 5276, 5373, 5431, 5760, 5873, 5954, 6417, 6419, 6497, 6545, 6636, 7484 Set 12 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 8, 89, 515, 543, 585, 769, 969, 1126, 1163, 1526, 1583, 1639, 1744, 2019, 2393, 2415, 2453, 2618, 2690, 2692, 2810, 2855, 2863, 3153, 3158, 3190, 3408, 4000, 4083, 4104, 4248, 4479, 4491, 4550, 4661, 4877, 4995, 5176, 5276, 5599, 5695, 6073, 6114, 6265, 6417, 6499, 6585, 6632, 6673 Set 13 (n = 48) SEQ-ID Nummern: 414, 538, 946, 1263, 1384, 1512, 1895, 2077, 2248, 2260, 2516, 2676, 2975, 3168, 3414, 4083, 4274, 4776, 4800, 4919, 4923, 5179, 5204, 5431, 5493, 5541, 5619, 5695, 5819, 6005, 6073, 6099, 6210, 6247, 6265, 6350, 6417, 6432, 6499, 6536, 6545, 6636, 6668, 6689, 7040, 7062, 7472, 7604 Set 14 (n = 47) SEQ-ID Nummern: 383, 428, 538, 553, 691, 814, 871, 896, 911, 937, 1426, 1639, 1685, 1688, 1983, 2093, 2253, 2260, 2454, 2516, 2587, 2672, 2761, 2865, 2975, 3086, 3781, 4000, 4030, 4308, 4510, 4636, 4923, 5137, 5235, 5574, 5776, 5819, 5908, 6226, 6278, 6417, 6632, 7202, 7230, 7315, 7456 Set 15 (n = 46) SEQ-ID Nummern: 97, 366, 383, 802, 1426, 1514, 1558, 1685, 1744, 1975, 2011, 2013, 2369, 2415, 2454, 2510, 2516, 2577, 2587, 2759, 2968, 3168, 3364, 3641, 3780, 4083, 4230, 4294, 4587, 4638, 4817, 5040, 5164, 5276, 5371, 5465, 5541, 6073, 6098, 6114, 6184, 6216, 6497, 6515, 7062, 7202 Set 16 (n = 49) SEQ-ID Nummern: 10, 504, 541, 553, 567, 652, 802, 1024, 1092, 1136, 1197, 1519, 1646, 1647, 1648, 1652, 2055, 2058, 2260, 2273, 2330, 2331, 2415, 2491, 2581, 2618, 2676, 2742, 3053, 3408, 3652, 3915, 4216, 4870, 5235, 5641, 5695, 5954, 6114, 6278, 6419, 6461, 6791, 6820, 6847, 6923, 7428, 7604, 7670 Set 17 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 10, 160, 428, 871, 941, 1136, 1197, 1416, 1558, 1786, 1951, 2386, 2510, 2560, 3488, 3652, 3781, 5176, 5400, 6515 Set 18 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 871, 1163, 1414, 1416, 1426, 1487, 2001, 2055, 2369, 2386, 2552, 2577, 2865, 3051, 4550, 4577, 5614, 6098, 7369, 7423 Set 19 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 567, 958, 2226, 2250, 2260, 2427, 2516, 3364, 4030, 4135, 5235, 5574, 5950, 6114, 6226, 6267, 6278, 6418, 7069, 7518 Set 20 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 409, 1647, 1648, 1770, 1883, 1951, 2013, 2386, 2423, 3152, 3491, 4205, 4577, 4661, 4765, 4919, 7428, 7604 Set 21 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 355, 480, 494, 667, 1492, 2475, 2855, 2948, 3155, 3158, 3408, 3780, 4661, 5113, 5232, 5368, 5574, 6114, 6419, 6499 Set 22 (n = 19) SEQ-ID Nummern: 769, 1163, 1472, 2077, 2370, 2759, 3488, 3567, 3737, 3780, 4230, 4245, 4274, 4550, 5950, 6497, 7069, 7109, 7681 Set 23 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 160, 164, 355, 411,. 1106, 1408, 1675, 1679, 2386, 2453, 2516, 2810, 3168, 3202, 3652, 4230, 5574, 5986, 7428, 7484 Set 24 (n = 19) SEQ-ID Nummern: 10, 164, 885, 1263, 1318, 1416, 1492, 1508, 1647, 1951, 2250, 2560, 2785, 2827, 3086, 4506, 5137, 5575, 5954 Set 25 (n = 19) SEQ-ID Nummern: 32, 522, 679, 1519, 2001, 2491, 2516, 2676, 3412, 3737, 4205, 4294, 4560, 5235, 5954, 6005, 6114, 6499, 6525 Set 26 (n = 19) SEQ-ID Nummern: 958, 1449, 1472, 1582, 2332, 2516, 2552, 2891, 2975, 3168, 3190, 3683, 3820, 3947, 4245, 4530, 7040, 7069, 7145 Set 27 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 428, 515, 544, 562, 567, 1263, 2002, 2332, 2526, 3438, 4577, 4754, 5574, 5614, 5912, 6328, 6515, 7156, 7423, 7456 Set 28 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 355, 508, 937, 1263, 1973, 2002, 2510, 4078, 4156, 4550, 4673, 4817, 5247, 5368, 5730, 6005, 6247, 6515, 7201, 7207 Set 29 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 10, 544, 871, 1408, 1487, 1649, 2002, 2415, 2690, 2859, 2975, 3126, 4577, 4636, 5541, 6073, 6417, 6432, 6866, 6879 Set 30 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 896, 1248, 1318, 1472, 1786, 1830, 1983, 2386, 2865, 2975, 3641, 3916, 4030, 4530, 4995, 5472, 5619, 6099, 6247, 6265 Set 31 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 355, 462, 1416, 1983, 2011, 2183, 2248, 2618, 3190, 3412, 4490, 4576, 4776, 4923, 5164, 6101, 6114, 6278, 7314, 7369 Set 32 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 310, 1226, 1895, 2248, 2427, 2516, 2552, 2690, 3086, 3438, 3915, 4216, 4587, 5235, 5276, 5954, 6265, 6478, 6515, 7207 Set 33 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 493, 584, 633, 937, 2330, 2377, 2491, 2587, 3153, 3683, 4216, 4248, 4530, 6114, 6419, 6478, 6525, 6689, 7202, 7456 Set 34 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 10, 359, 383, 478, 626, 1472, 1487, 1647, 2475, 3683, 3780, 4490, 4636, 5179, 5247, 5371, 5950, 6748, 6923, 7670 Set 35 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 97, 626, 1039, 1163, 1426, 1617, 1704, 2002, 2248, 2690, 3168, 4216, 4638, 5247, 5614, 5950, 6265, 6461, 6632, 7428 Set 36 (n = 20) SEQ-ID Nummern: 366, 414, 544, 734, 1263, 1416, 2167, 2208, 2250, 2370, 2491, 2526, 2855, 3190, 3488, 4083, 4248, 6673, 6845, 6847 Set 37 (n = 10): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431, 3043, 1665, 5776, 2902, 6585, 3167 und 745; Set 38 (n = 7): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431, 3043, 1665, 5776 und 7695.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass Isoformen der Polynucleotide eingesetzt werden, insbesondere solche, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Polynucleotiden mit den SEQ-ID Nummern: 507, 7695, 7696, 7697, 7698, 7699, 7700, 7701; 5431, 4636; 7702, 7703, 7704.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmente der Polynucleotide eingesetzt werden, insbesondere solche mit Längen von 20 bis 1000, insbesondere 15 bis 500 Nucleotiden, vorzugsweise 15 bis 200, bevorzugt 20 bis 200 Nucleotiden und/oder Fragmenten, die eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 20%, vorzugsweise ca. 50% besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynucleotiden aufweisen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Score über Expressionssignale erfasst wird, wobei die Expressionssignale erhalten werden durch Hybridisierung und/oder Amplifikation, insbesondere PCR, bevorzugt quantitative PCR, vorzugsweise Real-time PCR und/oder Proteinnachweis
Verwendung einer Mehrzahl von Protein-Genprodukten der Polynucleotide, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, zur Erfassung eines Scores als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet.
Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass solche Protein-Genprodukte der Polynucleotide von k-Tupeln an Polynucleotiden verwendet werden, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist.
Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass Protein-Genprodukte verwendet werden, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: TLR5, CD59, CPVL, FGL2, IL7R, HLA-DPA1, HLA-DR; und CLU.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass solche Fragmente der Proteine verwendet werden, die eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 20%, vorzugsweise ca. 50% besonders bevorzugt ca. 80% zu den Proteinen aufweisen.