DE102008000715B9 - Verfahren zur in vitro Erfasssung und Unterscheidung von pathophysiologischen Zuständen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe be sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; Fokus einer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven und/oder gram-negativen Bakterien; wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Isolierung von Probennukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe; b) Bestimmung von Genaktivitäten mittels einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines für die Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder den Verlauf von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten charakteristischen Multigenbiomarkers; c) Bestimmung von Genaktivitäten wenigstens eines internen Referenzgens, auf die die unter b) bestimmten Genaktivitäten bezogen, insbesondere normalisiert, werden; d) Bilden eines Index-Wertes aus den einzelnen...

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen gemäß Anspruch 1, die Verwendung einer Mehrzahl von Polynukleotiden und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays gemäß Anspruch 4; die Verwendung mindestens eines Polynukleotids und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten zur Herstellung eines Assays gemäß Anspruch 11, sowie einen Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 14.
• Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polynukleotiden zur Erfassung von Genaktivitäten von mindestens einem Multigenbiomarker, zur Herstellung eines Hilfsmittels zur Diagnose bei Patienten mit bestimmten pathophysiologischen Zuständen, wie beispielsweise Sepsis und Sepsisähnliche Zuständen, mit ähnlichen Merkmalen wie ein „In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay” (IVDMIA).
• Sepsis („Blutvergiftung”) ist eine lebensbedrohliche Infektion, die den gesamten Organismus erfasst. Sie ist mit hoher Sterblichkeit verbunden, kommt immer häufiger vor und erfasst Menschen in jedem Lebensalter. Sepsis gefährdet den medizinischen Fortschritt in vielen Bereichen der Hochleistungsmedizin und verbraucht einen Großteil der Ressourcen im Gesundheitswesen. Die Sterblichkeit der schweren Sepsis hat sich in den letzten Jahrzehnten nicht entscheidend verbessert. Die letzten beiden Innovationssprünge nach Einführung der Blutkultur (ca. 1880) waren die Einführung der Antibiotika vor über 60 und der Beginn der Intensivmedizin vor etwa 50 Jahren. Um heute ähnlich entscheidende Behandlungsfortschritte zu erzielen, müssen neuartige Diagnostika zur Verfügung gestellt werden.
• Sepsis wird durch Infektionserreger verursacht. Da es bislang keine spezielle Therapie gegen die Sepsis gibt, hängt der Erfolg der Behandlung weitgehend von der erfolgreichen Bekämpfung der zugrunde liegenden Infektion und der Qualität der intensivmedizinischen Behandlung ab. Entscheidend für das Überleben ist die frühzeitige Gabe eines Antibiotikums, das außerdem den verursachenden Erreger erfolgreich bekämpft [Kumar et. al., 2006]. Defizite der Sepsis-Diagnostik verzögern jedoch den Therapiebeginn und die Wahl eines geeigneten Antibiotikums. Da die Identifizierung des Sepsiserregers mit den derzeitigen Methoden der Blutkultur nur in weniger als 25% der Sepsisfälle gelingt und die Befunde im Fall des Erregernachweises erst nach 2–3 Tagen vorliegen, muss die initiale Wahl des Antibiotikums oder Antimykotikums (gegen Pilze gerichtete Substanzen) „kalkuliert”, d. h. auf Verdacht gewählt werden. In 20–30% der Fälle ist diese Wahl nicht richtig.
• Weitere Ursachen für die Verzögerung der Therapie liegen in der Fehlinterpretation der Krankheitssymptome und Laborwerte. Verbesserte Diagnostika, die die Sepsisdiagnose vereinfachen und beschleunigen, können zu einer erheblichen Reduktion der Sepsissterblichkeit und Verkürzung ihrer Behandlungsdauer beitragen. Medizinische Fachgesellschaften bestätigen die Defizite der bisherigen Sepsis-Diagnostik in Umfragen unter nordamerikanischen und europäischen Intensivmedizinern [Marshall et. al., 2003]. Auch die Betroffeneninitiative „Deutsche Sepsis Hilfe e. V.” und der Deutschen Sepsis-Gesellschaft beklagen die Defizite.
• Im Zuge der Entwicklung marktreifer in-vitro-Diagnostika aus dem Bereich molekularer Diagnostik wurde am 26.7.2007 ein Richtlinienentwurf der Food and Drug Administration (FDA) der Vereinigten Staaten von Amerika veröffentlicht. Diese Richtlinie liefert Empfehlungen, Definitionen und Anhaltspunkte für den Entwicklungs- und Zulassungsprozess. Weiterhin werden Spezifikationen für die neue Klasse der „in vitro-diagnostischen multivariaten Index-Assays (IVDMIA)” vorgeschlagen. Kennzeichen dieser Assays sind:
• 1) Die Kombination von mehreren Einzelwerten mittels eines Interpretationsschrittes, um einen einzelnen patientenspezifischen Ausgabewert in Form eines Index, Score oder einer Klassifikation zu erhalten. Dieser Wert ist für diagnostische Aussagen, zur Schadensbegrenzung, Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit einsetzbar.
• 2) Das erreichte Ergebnis ist von den Messwerten in einer Weise abgeleitet, die keine Rückschlüsse auf die eigentlichen Messdaten erlaubt. Daher kann das Ergebnis vom End-Anwender nicht bestätigt bzw. nachvollzogen werden.
• 3) Dadurch ist es notwendig, dem Anwender alle Informationen zur Interpretation des Testergebnisses zur Verfügung zu stellen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Gene und/oder deren Fragmente und ihre Verwendung zur Erstellung von Multigenbiomarkern, welche spezifisch für einen Zustand und/oder Untersuchungsfrage sind.
• Die Erfindung betrifft ferner von den Markergenen abgeleitete PCR-Primer und Sonden für Hybridisierungs- bzw. Vervielfertigungsverfahren.
• Nach wie vor ist die Sepsis eines der schwierigsten Krankheitsbilder in der modernen Intensivmedizin, wobei für den klinisch tätigen Arzt nicht nur die Therapie, sondern auch die Diagnose eine Herausforderung darstellt. Trotz Fortschritten im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten sind generalisierte inflammatorische Zustände wie SIRS und Sepsis bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankungen [Marshal et al., 2003; Alberti et al., 2003]. Die Sterblichkeit beträgt ca. 20% bei SIRS, ca. 40% bei Sepsis und steigt bei Entwicklung von multiplen Organdysfunktionen bis auf 70–80% an [Brun-Buisson et al., 1995; Le-Gall et al., 1995; Brun-Buisson et al., 2003]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von fachübergreifender klinisch-medizinischer Bedeutung, denn dadurch werden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z. B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz/Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie, etc.) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos für SIRS und Sepsis immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 wurde ein Anstieg um 139%, nämlich von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten verzeichnet [MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden.
• Im Laufe der Zeit hat der Sepsisbegriff einen erheblichen Bedeutungswandel erfahren. Eine Infektion bzw. der dringliche Verdacht auf eine Infektion sind auch heute noch wesentlicher Bestandteil aktueller Sepsisdefinitionen. Besondere Berücksichtigung findet jedoch dabei die Beschreibung Infektionsort-ferner Organfehlfunktionen im Rahmen der inflammatorischen Wirtsreaktion. Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)” aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis-Begriffs durchgesetzt [Bone et al., 1992]. Entsprechend dieser Kriterien werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom” (SIRS), „Sepsis”, „severe Sepsis” und „septic shock” unterschieden. Als SIRS wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber > 38°C oder Hypothermie < 36°C, eine Leukozytose > 12 g/l oder eine Leukopenie < 4 g/l bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe > 20 Atemzüge/min oder ein PaCO₂ (Partialdruck des Kohlendioxid im arteriellen Blut) < 4,3 kPa. Diese Definition hat eine hohe Sensitivität, aber eine niedrige Spezifität. Für intensivmedizinische Belange ist sie wenig hilfreich, da in der Regel jeder Intensivpatient, zumindest für kurze Zeit, die SIRS-Kriterien erfüllt.
• Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS-Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine Infektion wird definiert als ein pathologischer Prozess, welcher durch eine Invasion von Pathogenen beziehungsweise potentiell pathogenen Organismen in ein normalerweise steriles Gewebe hervorgerufen wird. Wenn es dem Körper nicht gelingt, diese Infektion auf den Ursprungsort zu begrenzen, induzieren die Krankheitserreger oder deren Toxine in den vom Infektionsort entfernten Organen bzw. Geweben des Körpers eine Entzündung. Eine sofortige intensivmedizinische Behandlung, die zielgerichtete Gabe von Antibiotika und die operative Sanierung des infektiösen Herdes sind nötig, um eine Genesung zu erreichen. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine Sepsis-induzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20% aller Sepsispatienten nachgewiesen.
• Es besteht unter vielen Medizinern Einigkeit darüber, dass die Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992] keiner spezifischen Definition von Sepsis entsprechen. So zeigte eine von der European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71% der befragten Ärzte trotz langjähriger klinischer Erfahrungen Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis hatten [Poeze et al., 2003]. Der Versuch, eine einheitliche Terminologie durchzusetzen, fand in der klinischen Umsetzung variable Akzeptanz. Insbesondere die Fortschritte im Verständnis der Pathophysiologie der Sepsis veranlasste verschiedene Experten, nach einer entsprechenden Modifikation der bisherigen Definitionen zu suchen. Die Definitionen von Sepsis, schwerer Sepsis und septischem Schock wurden bestätigt und als nützlich für Kliniker und Forscher beurteilt. Allerdings wurden die diagnostischen Kriterien der Sepsis erheblich erweitert, um dem klinischen Aspekt der Infektabwehr gerecht zu werden. Die internationale Sepsis-Konferenz 2001 schlug außerdem ein neues Konzept (PIRO genannt) zur Beschreibung der Sepsis vor, welches sich aus den Kriterien Prädisposition, Infektion, Immunantwort (Response) und Organdysfunktion zusammensetzt [Levy et al., 2003]. Trotz einer neuen Definition der SIRS/Sepsis mit dem Akronym PIRO [Opal et al., 2005] wird in den meisten Studien immer noch die ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 benutzt [Bone et al., 1992], um ihre Patienten zu klassifizieren.
• Mehrere Ansätze zur Diagnosestellung von SIRS und Sepsis wurden entwickelt. Diese Ansätze können in 3 Gruppen geteilt werden.
• Der erste Gruppe enthält Score-Systeme wie beispielsweise APACHE, SAPS und SIRS welche die Patienten auf der Basis einer Vielzahl physiologischer Indices stratifizieren können. Während in einigen Studien für den APACHE II Score ein diagnostisches Potential nachgewiesen werden konnte, haben andere Studien gezeigt, dass APACHE II und SAPS II nicht zwischen Sepsis und SIRS differenzieren können [Carrigan et al., 2004].
• Die zweite Gruppe enthält Proteinmarker, die aus Plasma und Serum nachgewiesen werden. Solche sind zum Beispiel CA125, S100B, Copeptin, Glycin N-acyltransferase (GNAT), Protachykinin und/oder seine Fragmente, Aldose 1-Epimerase (Mutarotase), Chp, Carbamoylphosphat Synthetase 1, LASP-1 (Brahms Diagnostika GmbH Deutschland), IL-1 Ra, MCP-1, MPIF-1, TNF-R1, MIG, BLC, HVEM, IL-15, MCP-2, M-CSF, MIP-3b, MMP-9, PARC, ST-2; IL-6, sIL-2R, CD141, MMP-9, EGF, ENA-78, EOT, Gro-beta, IL-1b, Leptin, MIF, MIP-1a, OSM, Protein C, P-Selectin, und HCC4 (Molecular Staging, Inc., USA) oder CD 14 Antigen, Lipopolysaccharid-Bindungsstellen auf den Proteinen Alkalische Phosphatase und Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor (Mochida Pharm Co, Ltd. Japan). Trotz der großen Menge von patentierten Biomarkern konnten sich nur wenige im klinischen Alltag durchsetzen. Von diesen scheinen Procalcitonin (PCT, BRAHMS) und das C-reaktive Protein (CRP, Eli Lilly) die Marker zu sein, die am besten zwischen infektiösen und nicht infektiösen Ursachen der SIRS unterscheiden können.
• Procalcitonin ist ein 116 Aminosäuren langes Peptid das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Dieser Marker ist im Laufe der Zeit zunehmend als neuer Infektionsmarker auf Intensivstationen eingesetzt worden [Sponholz et al., 2006]. Dieser Marker gilt als Infektionsmarker und dient dazu, den Schweregrad der Sepsis festzulegen, wobei die Dynamik der Werte wichtiger ist als die Absolutwerte selbst, um z. B. bei Herzchirurgie-Patienten zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Komplikation zu unterscheiden [Sponholz et al., 2006]. Trotz der weitgehenden Akzeptanz des Biomarkers PCT konnte in internationalen Studien gezeigt werden, dass die erreichten Sensitivitäten und Spezifitäten des Sepsismarkers PCT vor allem bei der Abgrenzung einer systemischen bakteriellen SIRS, also Sepsis, von einer nicht -bakteriellen SIRS noch immer unzureichend sind [Ruokonen et al., 1999; Suprin et al. 2000; Ruokonen et al., 2002; Tang et al., 2007a]. Die Meta-Analyse von Tang und Kollegen [Tang et al., 2007a], in der 18 Studien berücksichtigt wurden, zeigt, dass PCT nur schlecht geeignet ist, um SIRS von Sepsis zu diskriminieren. Darüberhinaus betonen die Autoren, dass PCT eine sehr schwache diagnostische Genauigkeit mit einem Odd Ratio (OR) von 7.79 hat. Als Regel benennen die Autoren, dass ein OR < 25 nicht aussagekräftig, zwischen 25 und 100 hilfreich und im Falle von mehr als 100 hoch genau ist [Tang et al., 2007a].
• C-reaktives Protein (CRP) ist ein 224 Aminosäuren langes Protein, das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Die Messung von CRP soll dazu dienen, um den Krankheitsverlauf sowie die Wirksamkeit der gewählten Therapie zu verfolgen.
• In mehreren Berichten wurde beschrieben, dass im intensivmedizinischen Bereich PCT ein besser geeigneter diagnostischer Marker als CRP ist [Sponholz et al., 2006; Kofoed et al., 2007]. Darüber hinaus wird PCT als besser geeignet als CRP angesehen, um eine nicht infektiöse versus infektiöse SIRS sowie bakterielle versus virale Infektion zu unterscheiden [Simon et al., 2004].
• Die dritte Gruppe enthält Biomarker oder Profile, die auf Transkriptom-Ebene identifiziert wurden. Diese molekularen Parameter sollten eine bessere Korrelation der molekularen inflammatorischen/immunologischen Wirtsantwort mit dem Schweregrad der Sepsis ermöglichen, aber auch Aussagen zur individuellen Prognose liefern. Nach derartigen Biomarkern wird derzeit von verschiedenen wissenschaftlichen Gruppen und kommerziellen Organisationen intensiv gesucht, wie zum Beispiel Veränderungen der Cytokinkonzentrationen im Blut verursacht durch Bakterienzellwandbestandteile wie Lipopolysaccharide [Mathiak et al., 2003], oder Verwendung von Genexpressionsprofilen in einer Blutprobe zur Bestimmung von Unterschieden bei überlebenden und nicht-überlebenden Sepsispatienten [Pachot et al., 2006]. Genexpressionsprofile oder Klassifikatoren sind für die Bestimmung des Schwergrads von Sepsis [ WO 2004/087949 A2 ], die Unterscheidung zwischen einer lokalen oder systemischen Infektion [ DE 10 2007 036 678 A1 ], die Identifizierung der Infektionsquelle [ WO 2007/124820 A2 ] oder von Genexpressionssignaturen für die Unterscheidung zwischen mehreren Ätiologien und Pathogen-assoziierten Signaturen [Ramilo et al., 2007] geeignet. Allerdings besteht aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensitivität der Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992], der aktuell verfügbaren Proteinmarker sowie aufgrund des Zeitbedarfs des Nachweises der Infektionsursache durch Blutkultur ein dringender Bedarf für neue Verfahren, die die Komplexität der Erkrankung berücksichtigen. Viele Geneexpressionsstudien, die entweder einzelne Gene und/oder Kombinationen von Genen, die als Klassifkatoren benannt sind, verwenden sowie zahlreiche Beschreibungen von statistischen Verfahren zur Ableitung eines Score und/oder Index [ WO 03/084388 A2 ; US 6 960 439 A ] gehören zum Stand der Technik. Biomarker-Sets zum Nachweis von Sepsis werden in der WO 2006/113529 A2 beschrieben.
• Es besteht heute ein Konsens dahingehend, dass komplexe Erkrankungen sinnvoll nur über mehrere Parameter beschrieben werden können.
• In zunehmendem Maße finden molekulare Signaturen Eingang in die klinische Diagnostik, insbesondere bei komplexen Erkrankungen, die mit herkömmlichen Biomarkern nicht erfasst werden können, aber auch zur Beurteilung von Risiken für die Patienten und zur Identifizierung von Respondern beim Einsatz von Medikamenten und Therapien. Nachfolgende Aufzählung soll den aktuellen Stand und die Einsatzgebiete der Genexpressionsdiagnostik verdeutlichen.
• 1) Die Microarray-basierte, 70 Gene umfassende Signatur namens MammaPrint (Agendia, NL) erlaubt es, eine Prognose über das Rezidiv- und Metastasierungsrisiko von Frauen mit Brustkrebs zu treffen. Dabei wird untersucht, ob das Risiko, in den nächsten Jahren entfernte Metastasen zu entwickeln, als hoch oder niedrig eingestuft werden kann und sie von einer Chemotherapie profitieren würden. Die Zulassung dieses Tests durch die FDA brachte die Entwicklung von Richtlinien für eine neue Klasse von diagnostischen Tests, sog. IVDMIA (in vitro diagnostic multivariate index assay) mit sich. Die MammaPrint-Signatur wird auf einem Mikroarray in den Laboren des Herstellers gemessen und berechnet.
• 2) An Formalin-fixierten Gewebeproben wird mittels des Oncotype DX-Multigen-Assays (Genomic Health, USA) die Wahrscheinlichkeit des Wiederauftretens von Brustkrebs in Patientinnen beurteilt, sowie das Ansprechen der Patientinnen auf Chemotherapie geprüft. 21 Gene werden als „Recurrence-Score” zusammengefasst. Die Messung findet in den Räumen der Firma statt, es kommt ebenfalls die TaqMan-PCR Technologie zum Einsatz.
• 3) Der AlloMap Genexpressionstest der Firma XDx (USA) wird zur Überwachung eventueller Abstoßungsreaktionen bei Patienten mit Herztransplantation eingesetzt, die ca. 30% der Patienten innerhalb eines Jahres zeigen. Bislang waren zur Diagnose mehrere Biopsien notwendig. Der Test basiert auf 11 quantitativen PCR-Assays (zusätzlich 9 Kontrollen und Referenzen) unter Nutzung der TaqMan Technologie (Hoffman-La Roche) in den Räumen des Herstellers. Das Probenmaterial ist Blut. Bereits zwei Monate nach der Transplantation sind die Messergebnisse zuverlässig und sagen das Ausbleiben von Abstoßungsreaktionen für die nächsten 80 Tage voraus.
• Eine Gemeinsamkeit dieser Tests ist, dass die addressierte diagnostische Fragestelllung Untersuchungszeiten bis zum Vorliegen des Ergebnisses von mehreren Tagen erlaubt. Für diagnostische Tests in der Indikation Sepsis dagegen, muß die Information innerhalb eines einzigen Arbeitstages vorliegen.
• Mehrere Anwendungen von Genexpressionsprofilen sind in dem Stand der Technik bekannt.
• Pachot und Kollegen demonstrieren den Nutzen von Expressionssignaturen für die Verlaufsbeurteilung von Patienten mit septischem Schock. Hier finden sich molekulare Unterschiede, die die Wiederherstellung eines funktionierenden Immunsystems in den Überlebenden wiederspiegeln. 28 Markergene mit Funktionen im innaten Immunsystem zeigen innerhalb des ersten Tages nach Diagnose des septischen Schocks mit hoher Sensitivität (100%) und Spezifität (88%) an, ob die Immunparalyse reversibel ist und damit das Überleben des Patienten ermöglicht. Allerdings war in der Untersuchung das Patientenkollektiv zu klein (38) um ein robustes Profil zu erstellen und eine Validierung dieses Datensatzes durch einen unabähngigen Datenatz ist bislang nicht erfolgt. Der Stand der Technik enthält zahlreiche Studien zur Identifikation von Genexpressionsmarkern [Tang et al., 2007b] oder Genexpressionsprofilen für die Feststellung einer systemischen Infektion [Johnson et al., 2007].
• Tang und Kollegen [Tang et al., 2007b] suchten in einer bestimmten Blutzellpopulation, den Neutrophilen, nach einer Signatur, welche eine Unterscheidung von Patienten mit SIRS und Sepsis ermöglicht. 50 Marker aus dieser Zellpopulation genügen um die Immunantwort auf eine systemische Infektion wiederzugeben und neue Erkenntnisse zur Pathophysiologie und den beteiligten Signalwegen zu ermöglichen.
• Die Klassifikation von Patienten mit und ohne Sepsis gelingt mit hoher Sicherheit (PPV 88% bzw. 91% in Trainings- und Testdatensatz). Die Anwendbarkeit für die klinische Diagnose ist allerdings dadurch begrenzt, dass im Blut diese Signatur von Signalen aus anderen Blutzelltypen überlagert werden kann. Bezüglich der Anwendbarkeit ist die Präparation dieser Blutzellpopulation mit erheblich erhöhtem Aufwand verbunden. Die Aussagekraft der in dieser Studie publizierten Ergebnisse ist für praktische Anwendungen jedoch limitiert, weil die Patientenauswahl sehr stark heterogen war. Es wurden Patienten in die Studie eingeschlossen, die stark unterschiedliche Begleiterkrankungen wie z. B zu 11% bis 16% Tumorerkrankungen aufwiesen oder sehr stark unterschiedlichen therapeutischen Maßnahmen unterlagen (z. B. 27% bis 64% Vasopressor-Therapie), wodurch die Genexpressionsprofile stark beeinflusst wurden.
• Johnson und Kollegen [Johnson et al., 2007] beschreiben an einem Kollektiv von Traumapatienten, dass sich die Ausprägung einer Sepsis bereits bis zu 48 Stunden vor der klinischen Diagnose anhand molekularer Veränderungen messen lässt. Die Traumapatienten wurden über mehrere Tage untersucht. Ein Teil der Patienten entwickelte eine Sepsis. Nichtinfektiöse SIRS-Patienten wurden mit prä-septischen Patienten verglichen. Die identifizierte Signatur aus 459 Transkripten setzt sich aus Markern der Immunantwort und Entzündungsmarkern zusammen. Probenmaterial war Vollblut, die Analysen wurden auf einem Mikroarray durchgeführt. Unklar ist, ob sich diese Signatur auch auf andere Kollektive septischer bzw. prä-septischer Patienten ausdehnen lässt. Eine Klassifikation und der diagnostische Nutzen dieser Signatur wurde nicht gezeigt.
• Weiterhin werden im Stand der Technik andere Signaturen beschrieben, beispielsweise die Antwort des Wirtes auf eine Infektion.
• Die Spezifität der Wirtsantwort auf unterschiedliche Erreger ist bisher in mehreren experimentellen Systemen untersucht worden. In keiner Studie jedoch wurden Genexpressionsprofile und/oder Signaturen von Sepsis-Patienten beschrieben.
• Das Ziel von Feezor und Kollegen [Feezor et al., 2003] war es, Unterschiede zwischen Infektionen mit gram-negativen und gram-positiven Erregern zu identifizieren. Blutproben von drei verschiedenen Spendern wurden ex vivo mit E. coli-LPS und Hitze-inaktiviertem S. aureus stimuliert. Mittels Microarraytechnologie wurden Genexpressionsuntersuchungen durchgeführt. Die Arbeitsgruppe fand sowohl Gene, die nach S. aureus-Stimulation hochreguliert und nach LPS-Stimulation herunterreguliert waren, als auch Gene die nach LPS-Behandlung stärker exprimiert wurden als nach der Zugabe von Hitze-inaktivierten S. aureus-Keimen. Gleichzeitig wurden viele Gene durch gram-positive und gram-negative Stimulation in gleichem Maße hochreguliert. Dies betrifft zum Beispiel die Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6. Die differentiell exprimierten Gene wurden leider nicht namentlich veröffentlicht, so dass lediglich ein indirekter Vergleich anderen Ergebnissen möglich ist. Neben der Genexpression wurden von Feezor et al. auch die Plasmakonzentrationen einiger Zytokine untersucht. Dabei korrelierten die Genexpressionsdaten nicht zwangsweise mit den Plasmakonzentrationen. Bei der Genexpression wird die Menge an mRNA vermessen. Diese ist jedoch vor der Proteinsynthese posttranskriptionaler Regulation unterworfen, woraus die beobachteten Unterschiede resultieren können.
• Die interessanteste Publikation zu diesem Thema wurde von einer texanischen Forschungsgruppe um Ramilo [Ramilo et al., 2007], veröffentlicht. Hier wurden ebenfalls Genexpressionsuntersuchungen an humanen Blutzellen durchgeführt, die Unterschiede in der molekularen Wirtsreaktion auf verschiedene Pathogene aufdeckten. Dazu wurden pediatrische Patienten mit akuten Infektionen, wie z. B. akuten Atemwegserkrankungen, Harnwegsinfektionen, Bakteriämien, lokalen Abszessen, Knochen- und Gelenkinfektionen sowie Meningitis untersucht. Microarrayexperimente wurden mit RNA-Proben durchgeführt, die aus peripheren mononuklearen Blutzellen von jeweils zehn Patienten mit E. coli- bzw. S. aureus-Infektion isoliert wurden. Die Identifizierung der Erreger erfolgte mittels Blutkultur. Anhand des Trainingsdatensatzes wurden 30 Gene identifiziert, durch deren Verwendung die verursachenden pathogenen Keime mit hoher Genauigkeit diagnostiziert werden konnten.
• Trotz der zahlreichen publizierten Studien und der darin beschriebenen individuellen Signaturen, die den Stand der Technik begründen, erlaubt keine davon eine diagnostische Ausage über Sepsis und/oder Sepsis-ähnliche Zustände. Keine dieser Publikationen bietet die Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Robustheit der hier offenbarten Erfindung. Diese Studien sind darauf konzentriert, den aus wissenschaftlicher Sicht ”besten” Multigenbiomarker (Klassifikator) zu identifizieren, jedoch nicht, wie in der vorliegenden Erfindung, den für eine spezifische klinische Fragestellung optimalen Multigenbiomarker [Simon et al., 2005].
• Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, mit dem eine schnelle und zuverlässige Aussage über einen pathophysiologischen Zustand, beispielsweise Sepsis, möglich ist.
• Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt verfahrenstechnisch durch die Merkmale des Anspruchs 1.
• Bezüglich einer Verwendung wird die Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 4 und 11 gelöst.
• Ein Kit gemäß Anspruch 14 löst die Aufgabe ebenfalls.
• In allgemeiner Form betrifft die vorliegende Erfindung ein System, das folgende Elemente umfaßt:
• • Set von Genaktivitätsmarkern
• • Referenzgene als interne Kontrolle für die Normalisierung der Genaktivitätsmarkersignale in Vollblut
• • Detektion hauptsächlich über Real-Time-PCR oder andere Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren
• • Verwendung eines Algorithmus, um die Einzelergebnisse der Genaktivitätsmarker zu einem gemeinsamen numerischen Wert, Index oder auch Score, umzuwandeln
• • Darstellung dieses numerischen Wertes auf einer entsprechend eingeteilten Skala
• • Kalibrierung, d. h. Einteilung der Skala entsprechend der intendierten Anwendung durch vorherige Validierungsexperimente.
• Das System liefert eine Lösung für das Problem der Feststellung von Krankheitszuständen wie z. B. die Unterscheidung von infektiösem und nicht-infektiösem Multiorganversagen aber auch für andere in diesem Kontext relevante Anwendungen und Fragestellungen.
• Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; Fokus einer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven und/oder gram-negativen Bakterien; wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
• a) Isolierung von Probennukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe;
• b) Bestimmung von Genaktivitäten mittels einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines für die Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder den Verlauf von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten charakteristischen Multigenbiomarkers;
• c) Bestimmung von Genaktivitäten wenigstens eines internen Referenzgens, auf die die unter b) bestimmten Genaktivitäten bezogen, insbesondere normalisiert, werden;
• d) Bilden eines Index-Wertes aus den einzelnen bestimmten normalisierten Genaktivitäten des Multigenbiomarkers, der den pathophysiologischen Zustand anzeigt.
• In einem bevorzugten Verfahren ist das wenigstens eine Referenzgen ein Housekeepinggen, wobei das Housekeepinggen insbesondere ausgewählt ist aus Polynukleotiden der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 676 bis SEQ-ID NO: 686 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon.
• Bevorzugt werden als Polynukleotidsequenzen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente verwendet.
• Der Index wird vorzugsweise mittels statistischer Verfahren wie überwachte Klassifikationsverfahren aus dem Bereich des maschinellen und statischen Lernens wie z. B. (diagonale, lineare, quadratische) Diskriminanzanalyse, Super vector machines, verallgemeinerte partielle kleinste Quadrate, k-nächste Nachbarn, random forests, k-nächste Nachbar ermittelt. Für eine lineare Diskriminanzanalyse kann beispielsweise folgende Formel verwendet werden:

  
• Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays als Hilfsmittel zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.
• Bevorzugt ist der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index oder Score gebildet wird.
• Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, erfasst werden.
• Bei der Erfassung der Genaktivitäten auftretende differentielle Expressionssignale der in dem Multigenbiomarker enthaltenen Polynukleotidsequenzen können vorteilhaft und eindeutig einem pathophysiologischen Zustand, einem Verlauf und/oder Therapiemonitoring zugeordnet werden.
• Typischerweise wird aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands, insbesondere der Sepsis oder des sepsisähnlichen Zustandes, ist.
• Dieser Index oder Score kann auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt werden, um dem behandelnden Arzt eine schnelles diagnostisches Hilfsmittel in die Hand zu geben.
• Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme eingesetzt.
• Zur Erstellung der Genaktivitätsdaten werden vorteilhaft solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente verwendet, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 aufweisen.
• Die Erfindungsgemäß betrifft ferner die Verwendung wenigstens eines Polynukleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 152 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Herstellung eines Assays zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.
• Der pathophysiologische Zustand ist vorteilhaft ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischer Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; lokaler/systemischer Infektion; Verbesserung/Verschlechterung eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Sepsis; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung nach gram-positiv und/oder gram-negativ.
• Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA, ist.
• Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, enthaltend mindestens einen Multigenbiomarker, welcher eine Mehrzahl von Polynukleotidsequenzen umfasst, die aus dem Pool von SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon ausgewählt sind, und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür, wobei der Multigenbiomarker spezifisch für einen pathophysiologischen Zustand eines Patienten ist und solche Zustände einschließt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; lokaler/systemischer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven oder gram-negativen Erregern.
• Die Polynukleotidsequenzen des Kits umfassen bevorzugt auch Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, Insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente.
• Als Multigenbiomarker für die Unterscheidung von SIRS/Sepsis oder von infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen werden vorzugsweise die Polynukleotidsequenzen mit den in Tab. 11 und 16 angegebenen SEQ-IDs eingesetzt. Als Multigenbiomarker für die Unterscheidung von Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung nach gram-positiven und/oder gram-negativen Bakterien, werden vorzugsweise die Polynukleotidsequenzen mit den in Tab. 20 und 21 angegebenen SEQ-IDs eingesetzt.
• Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, als Teil eines integrierten Systems (In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay, IVDMIA) eine potenzielle infektiöse Komplikation in Patienten mit SIRS oder möglichen Sepsis einzuschätzen. Dieses System umfasst die Wahl der Patienten und die Bestimmung von deren Genexpressionssignalen in einem interpretierbaren Index, welchen der Arzt als Hilfsmittel zur Diagnose verwenden kann.
• Dieses System kombiniert die gemessenen Genexpressionsdaten von definierten Sequenzgruppen ausgewählt aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, sowie von Housekeepinggenen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Gene und/oder Genfragmente verwendet, die eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 oder zu den Housekeepinggenen aufweisen.
• Tab. 32 zeigt den hochrelevanten Sequenzpool, der für verschiedene klinische Fragenstellungen wichtig ist.
• Tab. 8, 11 und 16 zeigen eine bevorzugte Wahl von Sequenzen, die, wenn in das obengennantes System integriert, für die Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis essentiell sind.
• Die Wahl der Sequenzen aus dem hochrelevanten Sequenzpool ist von der klinischen Fragestellung abhängig.
• Die Anmelderin hat ein Verfahren entwickelt, das große Sequenzpools benutzt, um Zustände festzustellen und/oder zu unterscheiden oder definierte Untersuchungsfragen zu beantworten. Beispiele sind in folgenden Patentschriften zu finden: Unterscheidung zwischen SIRS, Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen [ WO 2004/087949 A2 ; WO 2005/083115 A2 ], Erstellung von Kriterien zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei Sepsis [ WO 2005/106020 A1 ], Unterscheidung zwischen nichtinfektiösen und infektiösen Ursachen eines Multiorganversagens [ WO 2006/042581 A1 ], in vitro Klassifizierung von Genexpressionsprofilen von Patienten mit infektiösem/nichtinfektiösem Multiorganversagen [ WO 2006/100203 A2 ], Feststellung der lokalen Ursachen eines Fiebers unklarer Genese [ WO 2007/144105 A2 ], Polynukleotide zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion [ DE 10 2007 036 678 A1 ].
• Die Erfindung betrifft Polynukleotidsequenzen, ein Verfahren und ferner Kits zur Erstellung von Multigenbiomarkern, die in einem und/oder mehreren Modulen Merkmale eines „In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay” (IVDMIA) aufweisen.
• Definitionen:
• Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden folgende Definitionen verwendet:
  Zustand: die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom” (SIRS), „sepsis”, „severe sepsis” und „septic shock” wie definiert in [Bone et al., 1992] und das PIRO Konzept [Levy et al., 2003].
• Multiorganversagen: Als Multiorganversagen bezeichnet man das gleichzeitig oder in rascher zeitlicher Abfolge auftretende Versagen von zwei oder mehr vitalen Organsystemen. Das Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) geht als initiale Organinsuffizienz dem MOV voraus [Zeni et al., 1997]. Man spricht heute vom Multiorganversagen wenn zwei oder mehr Organe gleichzeitig oder nacheinander Funktionstörungen aufweisen, wobei ein chronisch persistierendes Organversagen auszuschließen ist. Die Prognose des MOV hängt eng mit der Anzahl der beteiligten Organsysteme zusammen. Die Mortalität beträgt bei Versagen eines Organs innerhalb der ersten 24 Stunden 22%, nach 7 Tagen 41%. Beim Versagen von drei Organsystemen steigt die Mortalität am ersten Tag auf 80% und nach 4 Tagen auf 100% an [Knaus et al., 1985].
• Ein wichtiger Pathomechanismus für die Entstehung von MODS und MOV ist die Entwicklung eines systemischen Inflammationssyndromes (SIRS, [Bone et al., 1992]. MODS und MOV können sowohl infektiologischer als auch nicht-infektiologischer Genese sein.
• Fieber unklarer Genese: Fieber unklarer Genese (Fever of unknow origin, FUO) ist klinisch definiert als ein Fieber, bei dem die Temperatur über einen Zeitraum von mehr als 3 Wochen höher als 38,8°C ist, ohne dass nach einer einwöchigen Untersuchungszeit eine eindeutige Diagnose der Ursache vorliegt. In Abhängigkeit des Ursprungs wurden vier Klassen des FUO beschrieben: FUO klassischen, nosokomialen, immunschwachen oder HIV-bezogenen Ursprungs [Roth und Basello, 2003]. FUO wurde auch als ”eine eher bekannte Krankheit mit einem ungewöhnlichen Erscheinungsbild als eine seltene Störung” geschildert [Amin und Kauffman, 2003].
• Nur in 10% der Patienten mit postoperativem Fieber wird eine Infektion dokumentiert [Pile et al., 2006]. In den meisten Fälle geht die Temperatur des Patienten innerhalb von vier Tagen nach dem Eingriff zurück auf Normaltemperatur. Trotzdem entwickeln einige Patienten am oder nach dem fünften postoperativem Tag eine Infektion, wobei es sich in 12% der Fälle um eine Lungenentzündung handelt. Ebenso wird von Pile und Kollegen berichtet, dass es sich bei Fieber, welches zwei Tage nach dem Eingriff auftritt, mit hoher Wahrscheinlichkeit um eine Infektion handelt, wie z. B. eine Infektion der Harnwege und/oder des inneren Unterleibs (Peritonitis), Lungenentzündung oder eine durch einen intravenösen Katheder ausgelöste Infektion.
• Untersuchungsfrage: Eine klinische relevante Frage, die für die Behandlung eines Patientes wichtig ist, beispielsweise: Vorhersage des Krankheitsverlaufs, Therapieüberwachung, Fokus der Infektion, Überlebenschancen, Prädisposition, etc.
• Eine systemische Infektion ist eine Infektion, bei der sich die Erreger über die Blutbahn im gesamten Organismus ausgebreitet haben.
• SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome, nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer, nichtinfektiöser Zustand eines Patienten.
• Sepsis: Nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer infektiöser Zustand eines Patienten.
• Biologische Flüssigkeit: Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten der Säugetiere, einschließlich des Menschen, verstanden.
• Gen: Ein Gen ist ein Abschnitt auf der Desoxyribonukleinsäure (DNA), der die Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven Ribonukleinsäure (RNA) sowie regulatorische Elemente, welche diese Herstellung aktivieren oder inaktivieren, enthält. Als Gene im Sinne der Erfindung werden auch alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetische Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren (PNA)) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt somit ausdrücklich keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
• Genlocus: Genlocus (Genort) ist die Position eines Gens im Genom. Besteht das Genom aus mehreren Chromosomen, ist die Position innerhalb des Chromosoms gemeint, auf dem sich das Gen befindet. Verschiedene Ausprägungen oder Varianten dieses Gens werden als Allele bezeichnet, die sich alle an derselben Stelle auf dem Chromosom, nämlich dem Genlocus befinden. Somit beinhaltet der Begriff „Genlocus” einerseits die reine genetische Information für ein spezifisches Genprodukt und andererseits sämtliche regulatorische DNA-Abschnitte sowie sämtliche zusätzliche DNA-Sequenzen, welche mit dem Gen am Genlocus in irgendeinem funktionellen Zusammenhang stehen. Die letzteren schließen an Sequenzregionen an, die in der unmittelbar Nähe (1 Kb) aber außerhalb des 5-' und/oder 3'-Endes eines Genlocus liegen. Die Spezifizierung des Genlocus erfolgt durch die Accession-Nummer und/oder RefSeq ID des RNA-Hauptproduktes, welches von diesem Locus abstammt.
• Genaktivität: Unter Genaktivität wird das Maß der Fähigkeit eines Gens verstanden, transkribiert zu werden und/oder Translationsprodukte zu bilden.
• Genexpression: Der Vorgang, ein Genprodukt zu bilden und/oder Ausprägung eines Genotyps zu einem Phänotyp.
• Multigenbiomarker: Kombination von mehreren Gen-Sequenzen deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion ein kombiniertes Gesamtergebnis (z. B. eine Klassifikation und/oder ein Index) bilden. Dieses Ergebnis ist spezifisch für einen Zustand und/oder eine Untersuchungsfrage.
• Hybridisierungsbedingungen: Dem Fachmann wohl bekannte physikalische und chemische Parameter, welche die Etablierung eines thermodynamischen Gleichgewichtes aus freien und gebundenen Molekülen beeinflussen können. Im Interesse optimaler Hybridisierungsbedingungen müssen Zeitdauer des Kontaktes der Sonden- und Probenmoleküle, Kationenkonzentration im Hybridisierungspuffer, Temperatur, Volumen sowie Konzentrationen und -verhältnisse der hybridisierenden Moleküle aufeinander abgestimmt werden.
• Amplifikationsbedingungen: Konstante oder sich zyklisch verändernde Reaktionsbedingungen, welche die Vervielfältigung des Ausgangsmateriales in Form von Nukleinsäuren ermöglichen. Im Reaktionsgemisch liegen die Einzelbausteine (Desoxyribonukleotide) für die entstehenden Nukleinsäuren vor, ebenso wie kurze Oligonukleotide, welche sich an komplementäre Bereiche im Ausgangsmaterial anlagern können, sowie ein Nukleinsäure-Synthese-Enzym, Polymerase genannt. Dem Fachmann wohl bekannte Kationenkonzentrationen, pH-Wert, Volumen und die Dauer und Temperatur der einzelnen Reaktionsschritte sind von Bedeutung für den Ablauf der Amplifikation.
• Primer: Als Primer wird in der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bezeichnet, das als Startpunkt für Nukleinsäure-replizierende Enzyme wie z. B. die DNA-Polymerase dient. Primer können sowohl aus DNA als auch aus RNA bestehen (Primer3, siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT)
• Sonde: In der vorliegenden Anmeldung ist eine Sonde ein Nukleinsäurefragment (DNA oder RNA), das mit einer molekularen Markierung (z. B. Fluoreszenzlabel, insbesondere Scorpion^®, molecular beacons, Minor Groove Binding-Sonden, TaqMan^®-Sonden, Isotopenmarkierung, usw.) versehen werden kann und zur sequenzspezifischen Detektion von Ziel-DNA- und/oder Ziel-RNA-Molekülen eingesetzt wird.
• PCR: ist die Abkürzung für die englische Bezeichnung „Polymerase Chain Reaction” (Polymerase-Kettenreaktion). Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode, um DNA in vitro außerhalb eines lebenden Organismus mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA Polymerase zu vervielfältigen. PCR wird insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um kurze Teile – bis zu etwa 3.000 Basenpaare – eines interessierenden DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens oder auch um nicht kodierende DNA-Sequenzen handeln. Es ist dem Fachmann wohl bekannt, dass eine Reihe von PCR-Verfahren im Stand der Technik bekannt sind, welche alle durch den Begriff „PCR” mit umfasst sind. Dies gilt insbesondere für die „Real-Time-PCR” (vgl. auch die Erläuterungen weiter unten).
• PCR-Primer: Typischerweise benötigt eine PCR zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird. Derartige Primer sind dem Fachmann wohlbekannt, beispielsweise aus der Website „Primer3”, siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT.
• Transkript: Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird unter einem Transkript jegliches RNA-Produkt verstanden, welches anhand einer DNA-Vorlage hergestellt wird.
• Small RNA: Kleine RNAs im Allgemeinen. Vertreter dieser Gruppe sind insbesondere, jedoch nicht ausschließlich:
• a) scRNA (small cytoplasmatic RNA), welche eines von mehreren kleinen RNA-Molekülen im Cytoplasma eines Eukaryonten ist.
• b) snRNA (small nuclear RNA), eine der vielen kleinen RNA-Formen, die nur im Zellkern vorkommen. Einige der snRNAs spielen beim Spleißen oder bei anderen RNA-verarbeitenden Reaktionen eine Rolle.
• c) small non-protein-coding RNAs, welche die sogenannten small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), short interfering RNAs (siRNAs) und small double-stranded RNAs (dsRNAs) einschließen, welche die Genexpression auf vielen Ebenen, einschließlich der Chromatin-Architektur, RNA-Editierung, RNA-Stabilität, Translation und möglicherweise auch Transkription und Spleißen. Im Allgemeinen werden diese RNAs auf mehrfachem Wege prozessiert aus den Introns und Exons längerer Primärtranskripte, einschließlich proteincodierender Transkripte. Obwohl etwa nur 1,2% des Humangenoms Proteine codiert, wird ein großer Teil dennoch transkribiert. Tatsächlich bestehen ca. 98% der in Säugern und Menschen gefundenen Transkripte aus non-protein-coding RNAs (ncRNA) aus Introns von proteincodierenden Genen und den Exons und Introns von nicht proteincodierenden Genen, einschließlich vieler, welche anti-sense zu proteincodierenden Genen sind oder mit diesen überlappen. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) regulieren die sequenzspezifische Modifikation von Nukleotiden in Target-RNAs. Hierbei treten zwei Typen von Modifikationen auf, nämlich 2'-O-Ribosemethylierung und Pseudouridylierung, welche durch zwei große snoRNA-Familien reguliert werden, die einerseits box C/D-snoRNAs und andererseits box H/ACA snoRNAs genannt werden. Derartige snoRNAs weisen eine Länge von etwa 60 bis 300 Nukleotiden auf. miRNAs (microRNAs) und siRNAs (short interfering RNAs) sind noch kleinere RNAs mit im Allgemeinen 21 bis 25 Nukleotiden. miRNAs stammen aus endogenen kurzen Hairpin-Vorläuferstrukturen und benutzen gewöhnlich andere Loci mit ähnlichen – jedoch nicht identischen Sequenzen als Ziel translationaler Repression. siRNAs entstehen aus längeren doppelsträngigen RNAs oder langen Hairpins, oftmals exogenen Ursprungs. Sie haben gewöhnlich homologe Sequenzen an demselben Locus oder woanders im Genom zum Ziel, wo sie am sogenannten gene silencing, ein Phänomen, welches auch RNAi genannt wird, beteiligt sind. Die Grenzen zwischen miRNAs und siRNAs sind jedoch fließend.
• d) Zusätzlich kann der Begriff ”small RNA” auch sogenannte transposable Elemente (TEs) und insbesondere Retroelemente umfassen, welche ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „small RNA” verstanden werden.
• RefSeq ID: Diese Bezeichnung bezieht sich auf Einträge in der NCBI Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Diese Datenbank liefert nicht-redundante Referenz-Standards zu genomischer Information. Diese genomischen Informationen schließen unter anderem Chromosomen, mRNAs, RNAs und Proteine ein. Jede RefSeq ID stellt ein einzelnes, natürlich vorkommendes Molekül eines Organismus dar. Die biologischen Sequenzen, die eine RefSeq repräsentieren, sind von Gen Bank Einträgen (ebenfalls NCBI) abgeleitet, sind aber eine Zusammenstellung von Informationselementen. Diese Informationselemente stammen aus Primär-Forschung auf DNA-, RNA- und Proteinebene.
• Accession-Nummer: Eine Accession-Nummer stellt die Eintragsnummer eines Polynukleotides in der dem Fachmann bekannten NCBI-GenBank dar. In dieser Datenbank werden sowohl RefSeq ID's als auch weniger gut charakterisierte und redundante Sequenzen als Einträge verwaltet und der Öffentlichkeit zugänglich gemacht (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html). Abkürzungen

  AUC (area under curve)	Fläche unter der Kurve
  CRP	C-reaktives Protein
  CV (cross validation)	Kreuzvalidierung
  DLDA	diagonale lineare Diskriminanzanalyse
  (diagonal linear discriminant analysis)	Klasssifikationsverfahren
  GPLS (generalized partial least squares)	verallgemeinerte partielle kleinste
  	Quadrate (Klassifikationsverfahren)
  IQR (inter quartile range)	Abstand zwischen dem 75% und 25%
  	Perzentil
  kNN (k nearest neighbours)	k-nächste Nachbarn
  	(Klassifikationsverfahren)
  LDA (linear discriminant analysis)	lineare Diskriminanzanalyse
  	(Klassifikationsverfahren)
  MAD	Normalisierungsverfahren
  (Median of the absolute deviation
  of the Median)
  NPV (negative predictive value)	negativer prädikativer Wert (Anteil der
  	korrekt negativen Tests)
  OR	Odd Ratio
  PCT	Procalcitonin
  PPV (positive predictive value)	positiver prädikativer Wert (Anteil der
  	korrekt positiven Tests)
  RF (random forests)	Klassifikationsverfahren
  ROC (receiver operator characteristics)	Abbildung zur Darstellung von
  	Klassifikationsergebnissen
  Sensitivität	Anteil der korrekten Tests in der
  	Gruppe mit vorgegebenener
  	Erkrankung (infektiöse SIRS bzw.
  	Sepsis)
  Spezifizität	Anteil der korrekten Tests in der
  	Gruppe ohne vorgegebenene
  	Erkrankung (nicht-infektiöse SIRS)
  SVM (support vector machines)	Klassifikationsverfahren

• Für eine schnelle Diagnosik hat sich in der Praxis herausgestellt, dass Echtzeit- oder Real-Time-Amplifikationsverfahren die bevorzugten Verfahren sind. Daher werden im Folgenden die Grundlagen, welche dem Fachmann wohlbekannt sind, kurz im Hinblick auf ihre Bedeutung für die vorliegende Erfindung zusammengefaßt.
• Andere, dem Fachmann bekannten Verfahren, wie z. B. Sequenzierung, Mikroarray basierte Methoden, NASBA usw. sind ebenfalls möglich.
• Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist es möglich, spezifische Sequenzbereiche aus geringsten Ausgangsmengen von Nukleinsäuren in-vitro und zudem schnell zu amplifizieren, um sie so einer Analyse oder Weiterverarbeitung zugänglich zu machen. Ein doppelsträngiges DNA-Molekül wird durch Hitzeeinwirkung aufgeschmolzen (denaturiert). Die Einzelstränge dienen in der Folge als Matrize für die enzymatisch katalysierte Polymerisation von Desoxyribonukleotiden, wodurch wieder doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen. Die als Primer bezeichneten Oligodesoxyribonukleotide definieren dabei den zu kopierenden Sequenzabschnitt, indem sie an Orten komplementärer Sequenz mit der Ziel-DNA hybridisieren und als Starter für die Polymerisation dienen. Der Prozess exponentieller Produktbildung wird von verschiedenen Faktoren begrenzt. Im Laufe der PCR geht die Netto-Produktbildung daher schließlich auf Null zurück und die Gesamtmenge an PCR-Produkt erreicht einen Plateauwert.
• Geeignete PCR-Primer sind beispielsweise Primer mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 687 bis SEQ ID NO: 742. Es ist dem Fachmann jedoch bekannt, dass eine Vielzahl weiterer Primer zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
• Seit ihrer Einführung in das molekularbiologische Methodenspektrum wurde eine nahezu unüberschaubare Vielzahl von technischen Varianten entwickelt. Heute ist die PCR eine der wichtigsten Methoden in der molekularen Biologie und der molekularen Medizin. Heute findet sie Verwendung in einem überaus breiten thematischen Spektrum, z. B. beim Nachweis von Viren oder Keimen, bei der Sequenzierung, dem Verwandtschaftsnachweis, der Erstellung von Transkriptionsprofilen und der Quantifizierung von Nukleinsäuren [Valasek und Repa, 2005; Klein, 2002]. Zudem lassen sich mit Hilfe der PCR in einfacher Weise beliebige Sequenzabschnitte des Nukleinsäurebestandes eines Organismus klonieren. Die Vielzahl entwickelter PCR-Varianten ermöglicht u. a. eine zielgerichtete oder zufällige Veränderung der DNA-Sequenz sowie sogar die Synthese größerer, in dieser Form zuvor nicht existenter Sequenzabfolgen.
• Mit diesem klassischen Verfahren lassen sich hochsensitiv DNA und über die reverse Transkription (RT) auch RNA qualitativ nachweisen [Wong et al., 2005; Bustin 2002]. Eine Weiterentwicklung dieser Methode ist die Real-Time-PCR, die erstmals 1991 vorgestellt wurde und neben qualitativen Aussagen auch eine Quantifizierung ermöglicht.
• Real-Time-PCR, auch quantitative PCR (qPCR) genannt, ist eine Methode zur Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren in Echtzeit [Nolan et al., 2006]. In der Molekularbiologie gehört sie bereits seit einigen Jahren zu den etablierten Standardtechniken.
• Im Gegensatz zur PCR findet hier die Detektion bereits während der Amplifikation statt. Basierend auf Fluoreszenz-markierten Sonden, den Fluorophoren, kann die Amplifikation in Echtzeit verfolgt werden. In jedem Reaktionszyklus nehmen die fluoreszierenden PCR-Produkte und damit die Intensität der lichtinduzierten Fluoreszenz-Emission zu. Da die Zunahme der Fluoreszenz und die Menge an neusynthetisierten PCR-Produkten über einen weiten Bereich proportional zueinander sind, kann aus den gewonnenen Daten die Ausgangsmenge des Templates bestimmt werden. Eine gelelektrophoretische Auftrennung der Amplifikate ist nicht mehr erforderlich. Die Ergebnisse sind direkt verfügbar, was eine deutliche Zeitersparnis mit sich bringt. Da die Reaktionen in geschlossenen Gefäßen ablaufen, und nach dem Start der PCR keine weiteren Pipettierschritte erforderlich sind, reduziert sich das Kontaminationsrisiko auf ein Minimum. Als Fluorophore werden entweder nukleinsäure-bindende Fluoreszenzfarbstoffe wie SYBRGreen oder sequenzspezifische Fluoreszenzsonden wie Taq-Man-Sonden, LightCycler-Sonden und Molecular Beacons eingesetzt [Kubista et al., 2006]. SYBRGreen ist ein Farbstoff, dessen Fluoreszenz stark zunimmt, sobald das Molekül an doppelsträngige DNA bindet. Diese kostengünstige Lösung ist besonders bei der parallelen Durchführung mehrerer Reaktionen mit unterschiedlichen Primerpaaren geeignet. Nachteile liegen in der geringen Spezifität, da SYBRGreen sequenzunspezifisch an jede doppelsträngige DNA bindet, sowie darin, dass keine Multiplex-Messungen durchgeführt werden können. Mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse kann nach erfolgter PCR allerdings zwischen dem Zielprodukt und unspezifischer DNA differenziert werden: In Abhängigkeit der Nukleotidlänge und -zusammensetzung zerfällt jeder DNA-Doppelstrang bei einer für ihn charakteristischen Temperatur, der Schmelztemperatur, in seine zwei Einzelstränge. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung anhand der Fluoreszenzabnahme bei Zunahme der Temperatur möglich.
• Im Gegensatz dazu ist der Nachweis mit fluoreszenzbasierten Sonden hochspezifisch, aber auch sehr kostenintensiv. Beim TaqMan-Prinzip enthält der PCR-Ansatz neben den PCR-Primern eine sequenzspezifische TaqMan-Hybridisierungssonde, die über einen Quencher und einen Reporterfarbstoff verfügt. Die Sonde ist komplementär zu einer Sequenz, die zwischen den Primern liegt. In freier Lösung wird die Fluoreszenz durch die räumliche Nähe des Quenchers unterdrückt. Nach dem FRET-(Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)-Prinzip schluckt der Quencher die Fluoreszenzemission des angeregten Fluorophors. Hybridisiert diese Sonde jedoch mit der Zielsequenz, wird sie während der PCR von der Taq-Polymerase hydrolysiert, der Reporterfarbstoff wird räumlich vom Quencher entfernt und emittiert bei Anregung detektierbare Fluoreszenz. Beim LightCycler-Prinzip enthält der PCR-Ansatz neben den PCR-Primern zwei fluoreszenz-markierte Sonden (Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzfarbstoff). Ein nach außen hin messbares Fluoreszenzsignal entsteht nur bei unmittelbar benachbarter Hybridisierung der beiden Sonden mit der spezifischen Zielsequenz. Im Rahmen einer anschließenden Schmelzkurvenanalyse können sogar das Vorliegen und die Art einzelner Punktmutationen innerhalb der Hybridisierungsbereiche der Sonden detektiert werden. Ein weiteres Beispiel sind die Molecular Beacons. Diese Oligonukleotide enthalten am 5'- und 3'-Ende zueinander komplementäre Sequenzen, die in ungebundenem Zustand hybridisieren und eine Haarnadelstruktur bilden. Reporterfluorophor und Quencher, lokalisiert an beiden Enden, sind so in direkter Nachbarschaft. Erst wenn die Sonde am Templat bindet, werden die beiden Farbstoffe räumlich getrennt, so dass nach Anregung wieder Fluoreszenz messbar ist. Scorpion- und Sunrise-Primer bilden zwei weitere Modifikationen für sequenzspezifische Sonden [Whitcombe et al,. 1999].
• Die quantitative Bestimmung eines Templates kann mittels absoluter oder relativer Quantifizierung erfolgen. Bei der absoluten Quantifizierung findet die Messung anhand externer Standards, z. B. Plasmid-DNA in unterschiedlichen Verdünnungen, statt. Die relative Quantifizierung nutzt dagegen so genannte Housekeeping- oder Referenzgene als Referenz [Huggett et al., 2005]. Diese Referenzgene werden konstant exprimiert und bieten damit die Möglichkeit zur Normierung unterschiedlicher Expressionsanalysen. Die Auswahl der Housekeepinggene muss für jedes Experiment individuell erfolgen. Für die vorliegende Erfindung werden bevorzugt Housekeepinggene mit den Sequenzen der SEQ-ID NO: 676 bis SEQ-ID NO: 686 verwendet.
• Die generierten Experiment-Daten werden mit Hilfe der geräteeigenen Software ausgewertet. Für die grafische Darstellung wird die gemessene Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Zyklen aufgetragen. Die resultierende Kurve unterteilt sich dabei in drei Bereiche. In der ersten Phase, also zu Beginn der Reaktion, überwiegt noch das Grundrauschen, ein Signal des PCR-Produktes ist noch nicht nachweisbar. Die zweite Phase entspricht der exponentiellen Wachstumsphase. In diesem Segment verdoppelt sich das DNA-Template annähernd in jedem Reaktionsschritt. Entscheidend für die Auswertung ist der Zyklus, bei dem detektierbare Fluoreszenz auftritt und die exponentielle Phase der Amplifikation beginnt. Dieser Threshold-Cycle(CT)-Wert oder auch Crossing Point liefert die Basis für die Berechnung der Ausgangsmenge an vorhandener Ziel-DNA. So ermittelt die Software bei einer absoluten Quantifizierung die Crossing Points der unterschiedlichen Referenz-Verdünnungen und quantifiziert anhand der errechneten Standardkurve die Template-Menge. In der letzten Phase erreicht die Reaktion schließlich ein Plateau.
• Die quantitative PCR ist ein wichtiges Werkzeug für Genexpressionsstudien in der klinischen Forschung. Mit der Möglichkeit, mRNA exakt zu quantifizieren, lassen sich bei der Suche nach neuen Wirkstoffen die Auswirkungen bestimmter Faktoren auf Zellen analysieren, die Differenzierung von Vorläuferzellen in verschiedene Zelltypen beobachten oder die Genexpression in Wirtszellen als Antwort auf Infektionen nachverfolgen. Durch den Vergleich von Wildtyp- und Krebszellen auf RNA-Ebene können in der Zellkultur Gene identifiziert werden, die einen entscheidenden Einfluss auf Krebsentstehung haben. In der Routine-Labordiagnostik wird Real-Time-PCR vorrangig zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Viren und Bakterien eingesetzt. In der klinischen Routine, insbesondere im Bereich der Intensivmedizin, braucht der Arzt einen schnellen und eindeutigen Befund. Auf Basis der Real-Time-PCR können Tests durchgeführt werden, die noch am gleichen Tag das Ergebnis liefern. Hiermit begründet sich ein enormer Fortschritt für die klinische Diagnostik der Sepsis.
• Neben den hier beschriebenen technischen Varianten der PCR-Methode können auch sogenannte isothermale Amplifikationsverfahren wie beispielsweise NASBA oder SDA oder andere technische Varianten für die der Detektion vorausgehenden Vervielfältigung der Zielsequenz verwendet werden.
• Ein bevorzugtes Verfahren zur Wahl der Multigenbiomarkersequenzen umfaßt die folgenden Schritte:
• a. Patientenauswahl basiert auf dem extremen Gruppenverfahren;
• b. Generierung von mindestens einem Multigenbiomarker;
• c. Bestimmung finaler Multigenbiomarker.
• Ein bevorzugtes Verfahren des dem „in vitro Diagnostic multivariate index assay” ähnlichen Tests umfaßt die folgenden Schritte:
• a. Isolierung von Proben-Nukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe;
• b. Erfassung von Genaktivitäten mittels Sequenzen von wenigstens einem Zustands- und/oder Untersuchungsfragespezifischen Multigenbiomarkers;
• c. Erfassung von Genaktivitäten für wenigstens ein internes Referenzgen um die in b) erfassten Genaktivitäten zu normalisieren;
• d. Verwendung einer Interpretationsfunktion für die in c) normalisierten Genaktivitäten um einen Zustands- und/oder Untersuchungsfrage-spezifischen Index abzuleiten.
• Als technische Kontrolle werden zweckmäßig auch die Genaktivitäten von Kontrollgenen bestimmt, beispielsweise solchen mit den Sequenzen der SEQ ID NO: 670 bis SEQ ID NO: 675.
• Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt auch in einer Verwendung, bei welcher die Genaktivitäten mittels eines Hybridisierungsverfahrens, insbesondere auf wenigstens einem Mikroarray, bestimmt werden. Der Vorteil eines Mikroarrays liegt in der höheren Informationsdichte des Biochips im Vergleich zu den Amplifikationsverfahren. So ist es z. B. mühelos möglich, auf einem Mikroarray mehrere 100 Sonden bereitzustellen, um in einem einzigen Untersuchungsgang mehrere Fragestellungen gleichzeitig zu untersuchen.
• Die mittels der Erfindung erhaltenen Genaktivitätsdaten können auch vorteilhaft für die elektronische Weiterverarbeitung, z. B. zur Aufzeichnung in der elektronischen Krankenakte verwendet werden.
• Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen, einzeln oder in Teilmengen, als Multigenbiomarker in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS und Sepsis.
• Für die erfindungsgemäßen Verfahren (Arraytechnik und/oder Amplifikationsverfahren) wird die Probe ausgewählt aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.
• Es ist bevorzugt, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
• Offenbart werden hierzu Polynukleotidsequenzen von SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 aus Blut und Blutzellen sowie daraus abgeleitete Sonden, welche zur Erstellung von Multigenbiomarkern verwendet werden können (vgl. Tab. 32).
• Tab. 11 und 16 zeigen beispielhaft eine Sequenzauswahl für Multigenbiomarker für die Unterscheidung von infektiösen/nicht infektiösen Zuständen, und Tab. 20 und 21 zeigen beispielhaft eine Sequenzauswahl für Multigenbiomarker zur Unterscheidung von gram-positiven und gram-negativen Infektionen.
• Es ist dem Fachmann klar, dass die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
• Klassifikationsmethoden
• Die Theorie des Lernens spielt eine Schlüsselrolle auf dem Gebiet der Statistik, Datenanalyse und künstlichen Intelligenz mit zahlreichen Anwendungen in Ingenieurwissenschaften. Klassifikationsverfahren werden hauptsächlich bei 2 unterschiedlichen Aufgaben verwendet, bei der Abgrenzung von vorher unbekannten Klassen (unüberwachtes Lernen, class discovery) und bei der Zuordnung von bestimmten Daten/Proben/Patienten zu einer bereit definierten Klasse (Klassenvorhersage, class prediction) [Golub et al., 1999].
• In der Klassenvorhersage werden Daten/Proben/Patienten benutzt, die bereits existierenden bzw. definierten Klassen/Gruppen zugeordnet wurden (so genannter Trainingsdatensatz), um ein analytisches Verfahren (Klassifikationsalgorithmus) zu entwickeln, das die Unterschiede zwischen den Gruppen widerspiegelt. Unabhängige Proben (sogenannter Testdatensatz) werden verwendet, um die Trennungsgüte der Klassifikationsregel zu bewerten. Die Vorgehensweise kann in folgende Schritte eingeteilt werden:
• 1. Definiere einen idealen Daten/Proben/Patientensatz, um charakteristische Profile der zu detektierenden Gruppen zu bekommen.
• 2. Jede Gruppe wird dann geteilt, so dass 2 gleichwertige Teilmengen, ein Trainingsdatensatz und ein Testdatensatz, entstehen.
• 3. Profile für den Trainingsdatensatz enthalten idealerweise Daten, die eine maximale Differenz zwischen den Gruppen widerspiegeln.
• 4. Die Differenz zwischen den Gruppen wird mittels geeigneter Abstandsmaße quantifiziert und anhand eines Algorithmus bewertet. Dieser Algorithmus sollte zu einer Klassifikationsregel führen, die mit der höchsten Spezifität und Sensitivität die Daten in die richtige Klasse einordnet. Typische Vertreter solcher Algorithmen aus dem Bereich des überwachten Lernens sind die Diskriminanzanalyse (DA), Random Forests (RF), Generalized Partial Least Squares (GPLS), Support Vector Machines (SVM) oder k-Nearest Neighbors (kNN).
• 5. Abschließend wird die Güte der Klassifikationsregel am Testdatensatz geprüft.
• Definitionen:
• Diskriminanzanalyse (DA): Bei der linearen Diskriminanzanalyse erhalten wir eine lineare, bei der quadratischen Diskriminanzanalyse (QDA) eine quadratische Diskriminanzfunktion. Die Diskriminanzfunktion bestimmt sich aus der Kovarianzmatrix und den Gruppenmittelwerten. Im Fall der quadratischen Diskriminanzanalyse wird zusätzlich angenommen, dass auch die Kovarianzmatrix zwischen den Gruppen variiert [Hastie et al., 2001].
• Random Forests (RF): Die Klassifikation mittels Random Forests basiert auf der Kombination von Entscheidungsbäumen, [Breiman, 2001]. Der Ablauf des Algorithmus ist etwa folgendermaßen:
• 1. Wähle durch Ziehen mit Zurücklegen einen Trainingsdatensatz aus (Out-of-bag data).
• 2. An jedem Knoten des Entscheidungsbaums wähle zufällig Variablen aus. Berechne mit diesen Variablen die beste Aufteilung des Trainingsdatensatzes auf die Klassen.
• 3. Nachdem alle Entscheidungsbäume generiert wurden, fass die Klassenzuordnungen der einzelnen Entscheidungsbäume zu einer Klassenzuordnung zusammen.
• Generalized Partial Least Squares (GPLS): Bei dem Generalized Partial Least Squares [Ding und Gentleman, 2004] Verfahren handelt es sich um eine sehr flexible Verallgemeinerung des multiplen Regressionsmodells. Aufgrund der großen Flexibilität kann diese Methode auch in vielen Situationen angewendet werden, in denen das klassische Modell versagt.
• Support Vector Machine (SVM): Beim Support Vector Machine Klassifikator handelt es sich um einen verallgemeinerten linearen Klassifikator. Die Eingabedaten werden in einem höher dimensionalen Raum abgebildet und in diesem Raum wird eine optimale trennende (Hyper-)Ebene konstruiert. Diese im höherdimensionalen Raum linearen Schranken transformieren sich zu nichtlinearen Schranken im Raum der Eingabedaten, [Vapnik, 1999].
• k-nächsten Nachbarn (k-Nearest Neighbors, kNN): Bei der Methode der k-nächsten Nachbarn, wird die Klassenzugehörigkeit einer Beobachtung (eines Patienten) anhand der sich in seiner Umgebung befindlichen k-nächsten Nachbarn entschieden. Die Nachbarschaft wird dabei in der Regel mit Hilfe des euklidischen Abstands bestimmt und die Klassenzugehörigkeit dann anhand eines Mehrheitsvotums entschieden [Hastie et al., 2001].
• Im Folgenden ist ein generelles Konzept beschrieben, wie die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Dabei ist dem Fachmann wohbekannt, dass geringfüge Anpassungen der statistischen Verfahren erforderlich sein können, wenn andere Patientenkollektive und/oder andere Fragestellungen untersucht werden sollen. Für die Generierung des Trainings- und des Testsdatensatzes werden verschiedene statistische Verfahren (Diskriminanzanalyse und/oder Random Forests u. a.) sowie Strategien verwendet (einfache und mehrfache Kreuzvalidierung, zufällige Bootstrapstichproben u. a.)
• Basierend auf Mikroarray-Expressionsdaten sollte ein Verfahren zur Bestimmung eines Multigenbiomarkers entwickelt werden, der eine infektiöse Komplikation wie beispielsweise Sepsis widerspiegelt. Der Biomarker und der zugehörige Index-Wert, auch „Score” genannt, bilden die Grundlage eines sogenannten „in vitro Diagnostic multivariate Index Assays” [IVDMIA, FDA-Guidelines, 2003] zur Verbesserung der Diagnose systemischer Infektionen. Die aus dem Verfahren resultierende Klassifikationsregel sollte insbesondere eine Differenzierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mit – im Vergleich zum etablierten Biomarker Procalcitonin – verbesserter Sensitivität und Spezifität ermöglichen, ist jedoch nicht auf diese Fragestellung beschränkt.
• Zur Entwicklung eines solchen Multigenbiomarkers sind die folgenden Schritte notwendig: 1. Schritt: Trainingsdatensatz. Um den Zusammenhang zwischen einer Genexpression bestimmter Gene und der untersuchten Erkrankung aufzudecken, werden Populationen (Kohorten) definiert, die ihr Vorhanden- bzw. Nichtvorhandensein am deutlichsten repräsentieren. Bei der Diagnose einer infektiösen Komplikation werden üblicherweise Sepsis-Patienten (infektiös) und Patienten mit einer sogenannten sterilen SIRS (nichtinfektiös) in die Studie aufgenommen. Entsprechend dieser Festlegung wird ein Plan zur Sammlung bzw. Auswahl der zugehörigen RNA-Proben festgelegt. Von den ausgewählten Proben werden die Genexpressionsprofile auf einer geeigneten Plattform gemessen, vorverarbeitet und einer Qualitätskontrolle unterzogen. Systematische Messfehler werden korrigiert und Ausreißer eliminiert.
• 2. Schritt: Genvorauswahl. Bei der Generierung eines formalen Klassifikators auf der Basis von Mikroarray-Daten ist die Genvorauswahl ein Schlüsselschritt, da nur ein geringer Anteil der gemessenen Gene einen Beitrag zur Gruppenunterscheidung leistet. Auch die meisten Klassifikationsverfahren setzen eine Genselektion voraus. Durch eine präzise Genauswahl kann das Klassifikationsverfahren so einfach wie möglich gestaltet und eine Überanpassung an die Trainingsdaten (Overfitting) vermieden werden. Zur Vorauswahl der Klassifikationsgene werden geeignete Filteroptionen wie die Schwelle der statistischen Inferenz, der minimale akzeptierte Abstand zwischen den Gruppen, die minimale Signalintensität u. a. festgelegt. Nur Gene, die solche Bedingungen erfüllen, werden für die Klassifikation betrachtet.
• 3. Schritt: Klassifikationsverfahren. Verschiedene Klassifikationsverfahren werden bzgl. ihrer Trennfähigkeit hinsichtlich der zu differenzierenden pathophysiologischen Zustände getestet. Dazu werden Methoden der Cross-Validierung verwendet. Ein Klassifikationsverfahren mit dem kleinsten Klassifikationsfehler wird ausgewählt, wobei die kleinste notwendige Anzahl von Genen gleich mitbestimmt wird. Als sinnvolle Regel hat sich herausgestellt, dass die Anzahl der Gene immer kleiner sein soll als die Anzahl der Proben im Trainingsdatensatz, um eine Überanpassung zu vermeiden. Abschließend wird die resultierende Klassifikationsregel definiert.
• Patientenauswahl Die Patientenauswahl ist bei der Aufstellung des Trainingsdatensatzes bedeutsam. In einer Vorstudie im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde vorerst eine Sensitivität von ca. 75% im Trainings- und ca. 65% im Testdatensatz erreicht. Diese relativ geringe Klassifikationsgüte ließ sich aber nicht durch die schwache Optimierung des Klassifikators, sondern durch die nicht ausreichend präzise Auswahl von Sepsis-Patienten erklären. Dementsprechend wurden Sepsis-Patienten nach einer Peritonitis viel häufiger richtig klassifiziert als Sepsis-Patienten nach einer „VAP” (Ventilator-Associated Pneumonia). Tatsächlich liegt die infektiöse Komplikation nach einer Peritonitis an sich vor. Dagegen lässt sich bei VAP eine wirkliche Infektion von einer Kolonisation nur schwer unterscheiden [Mayhall, 2001].
• Um die Güte der Patientenauswahl zu bewerten, kann das Prinzip der sogenannten Extremgruppen nützlich sein. Danach werden in einer Studie nur solche Patientengruppen berücksichtigt, die den untersuchten Effekt möglichst deutlich abbilden. Dabei repräsentieren die ausgewählten Stichproben einen idealisierten Fall, in dem viele in der Praxis auftretende Effekte (z. B. die Häufigkeit der Erkrankung) nicht berücksichtigt werden. Von Liu [Liu et al., 2005] wurde vorgeschlagen, für den Trainingsdatensatz eines auf Mikroarrays basierten Klassifikators Extremgruppen zu bilden. Am Beispiel der Überlebensanalyse von Krebspatienten wurde gezeigt, dass die Anwendung von extremen Gruppen (Patienten, die nach kurzer Zeit gestorben sind vs. Patienten, die lange überlebt haben) zu einer besseren Vorauswahl von Klassifikationsgenen und einer höheren Klassifikationgüte geführt hat, auch wenn der Trainingdatensatz aus weniger Profilen (Patienten) bestand, als im üblichen Fall, wenn alle Patienten (auch mit mittleren Überlebenszeiten) berücksicht wurden.
• Im Folgenden wird ausgeführt, wie weit die Patientenauswahl die Generierung eines Multigenbiomarkers zur Diagnose der infektiösen Komplikation beeinflussen kann. In einer Studie der Anmelderin wurden Patienten, die nach einem schweren operativen Eingriff eine Sepsis entwickelt haben, untersucht. Es wurden Proben vom ersten Tag der Sepsis-Diagnose mit der Probe vom ersten post-operativen Tag verglichen. Die hier signifikant differentiell exprimierten Gene spiegeln aber einen Mischeffekt wider; die infektiöse Komplikation wird verdeckt durch Effekte wie Erholung nach dem operativen Stress oder die post-operative Behandlung. In der bereits erwähnten Pilotstudie wurden die Patienten mit einer klinischen (nicht immer mikrobiologisch gesicherten) Sepsisdiagnose in die Trainingspopulation eingeschlossen, was zu einer Durchmischung der beiden untersuchten Gruppen (Septiker und Kontrollen) führte und die Sensitivität verschlechterte. In dem Ausführungsbeispiel der US-Patentanmeldung Nr. 20060246495 wurde für die Auswahl der Sepsisgruppe ebenfalls die klinische Sepsisdiagnose verwendet. Darüber hinaus wurde die Schwere der Erkrankung zwischen der Gruppe der Sepsispatienten und der Kontrollgruppe der SIRS-Patienten nicht berücksichtigt. Dies kann der Grund der geringen Klassifikationsgüte und ihrer Abhängigkeit vom Klassifikationsalgorithmus sein. In die Studie von Johnson [Johnson et al., 2007] wurden Patienten nach einem Trauma in zwei Gruppen aufgeteilt, mit einer infektiösen Komplikation und ohne eine Infektion. Der Vorteil dieser Studie war, dass Patienten der beiden Gruppen sich in Komorbidität und Vorbehandlung wenig unterschieden. Die Vorauswahl ist aber nicht für alle Sepsispatienten repräsentativ und die Verallgemeinerung des hier aufgedeckten sepsisrelevanten Genexpressionsmusters auf Patienten mit anderem Hintergrund (auf andere Risikogruppen) ist nicht selbstverständlich. Im Allgemeinen muss davon ausgegangen werden, dass in Studien mit verschiedenen Risikogruppen auch verschiedene Klassifikatoren generiert werden müssen. In der Studie von Tang [Tang et al., 2007a] wurde das Prinzip der Extremgruppen indirekt angewandt, in dem nur Patienten mit einer mikrobiologisch gesicherten Sepsis-Diagnose im Trainingsdatensatz berücksichtigt wurden. Der Proben-Sammelplan führte aber zu einer kleinen Kontrollgruppe (ein Drittel der Proben: 14 aus 44). Dementsprechend wurde im Training eine Spezifität von 77% und in einem unabhängigen Testdatensatz (unter mehr realen Bedingungen) von lediglich 60% erreicht. Die Beschreibung der Patientengruppen in der SIRS-Lab Studie und der Studie von Tang [Tang et al., 2007a] lässt einen weiteren Einflussfaktor erkennen. Sie zeigt, dass die bzgl. des Infektionsfokus heterogenen Sepsisgruppen nicht ausbalanciert sind, sondern dass Gruppen mit verschiedenen Infektionsfoci unterschiedlich vertreten sind. Tatsächlich ist im Großteil der Fälle auf der Intensivstation (ITS) die Lunge (ca. 45–50%) oder der Abdomen (ca. 25%) der Fokus der Infektion bei einer Sepsisdiagnose. Dementsprechend sind diese Patientengruppen in den Untersuchungen überrepräsentiert, viele andere Foci kommen dann nur vereinzelt vor. Ähnlich sind in den Kontrollgruppen insbesondere postoperative und Traumapatienten vertreten und andere Risikogruppen sind nur durch einzelne Patienten vertreten. Die dargestellte Analyse zeigt, dass in allen Studien die ausgewählten Patientengruppen die infektiöse Komplikation nicht eindeutig abbilden, wodurch die Klassifikationsschwachen erklärt werden können. Andererseits wird aus der Zusammenfassung deutlich, dass es bei der infektiösen Komplikation kaum möglich ist, alle Einflussfaktoren bei der Auswahl der Patientengruppen zu berücksichtigen. Aus diesem Grund wird der folgende Weg zur Patientenauswahl für den Trainingsdatensatz vorgeschlagen.
• Allgemeines zu Material und Methoden der vorliegenden Erfindung:
• Patientenauswahl
• Die Auswahl der repräsentativen Stichproben stand im Mittelpunkt des beschriebenen Verfahrens. Es wurden in den Trainingsdatensatz Patienten mit einer mikrobiologischen gesicherten bzw. ausgeschlossenen Infektionsdiagnose aus jeweils zwei der am besten repräsentierten Sepsis- bzw. Kontrollsubgruppen eingeschlossen. Damit wird das Prinzip der Extremgruppen nicht nur für den Haupteffekt (infektiös vs. nicht infektiös) sondern auch für die Kontrolle der wichtigsten Einflussgrössen (Schichtung von Populationen) angewandt. Der Vorteil dieser Auswahl ist vorerst, dass man hier einen Klassifikator für die häufigsten Risiko bzw. Erkrankungsgruppen generiert. Darüber hinaus wird erwartet, dass sich ein Klassifikator, der die systemische Infektion für wenige aber sehr unterschiedliche Subgruppen widerspiegelt, sich auf weitere Patientengruppen anwenden lässt. Bei der Auswahl der Trainingsdaten wurde wie folgt vorgegangen. In die Patientendatenbank der Anmelderin wurden im Zeitrahmen von zweieinhalb Jahren 400 ITS-Patienten aufgenommen, bei denen ein Sepsis-Risiko vermutet wurde, und die zugehörigen klinischen Daten über den gesamten Aufenthalt detailliert dokumentiert. Die RNA-Proben wurden über ca. 7–14 Sepsis-relevante Tage gesammelt. In Annäherung an das PIRO-Konzept [Levy et al., 2003] wurden die Patienten retrospektiv nach folgenden Kriterien stratifiziert: (i) welche Indikation führte zur der Übernahme auf die Intensivstation (postoperative Komplikation, Trauma bzw. Polytrauma, akuter Sepsisverdacht), (ii) wurde eine infektiöse Komplikation diagnostiziert, was war der Infektionsfokus, (iii) wie war die Reaktion des Organismus (Anzahl der vorhanden SIRS-Kriterien, Schock-Behandlung, PCT-, CRP-Werte), (iv) wie schwer war die Erkrankung (SOFA, MODS-Score). Die Datenbankrecherche ergab, dass mit einer infektiösen Komplikation (Sepsis) insbesondere Patienten nach einer Pneumonie (40%) und nach einer Peritonitis (23%) in die Studie aufgenommen wurden. Ohne eine Infektion wurden insbesondere Patienten nach einem (Poly-)Trauma (9%) und nach einer Bypass-Operation (20%) eingeschlossen. Diese Daten entsprechen den epidemiologischen Studien der Deutschen Sepsisgesellschaft, womit die Sammlung als repräsentativ eingestuft wurde. Die Patientendaten dieser Gruppen wurden unabhängig von 2 Ärzten [nach ACCP/SCCM, 1992; Levy et al., 2003; Calandra und Cohen, 2005] geprüft und die finale Patientenauswahl festgelegt. Es wurden aus den beiden Sepsis-Gruppen 46 Patienten mit einer mikrobiologisch gesicherten Diagnose ausgewählt und der erste septische Tag bestimmt. Die Zusammenfassung der Schwere-Kriterien ergab, dass bei den Patienten an diesem Tag eine schwere Sepsis bzw. ein septischer Schock diagnostiziert wurde. Sie erreichten einen durchschnittlichen SOFA-Wert von 10, die Summe akuter Organdysfunktionen betrug etwa 3. Aus den beiden Risikogruppen (nach einer CPB-Operation und oder einem Trauma) wurden 59 Patienten ohne Zeichen einer Infektion ausgewählt und der erste Tag mit einer ähnlichen Schwere wie bei den Sepsis-Gruppen bestimmt. Auf diese Weise wurden 105 Patienten primär in die Studie eingeschlossen; nach der Qualitätskontrolle der zugehörigen Mikroarray-Experimente wurde die Gruppe auf 96 Patienten mit guter Qualität der Genexpressionsmessung eingeschränkt. Eine Aufstellung zu wichtigen klinischen und Labor-Parametern für die ausgewählten Patienten findet sich beispielhaft, jedoch ohne Einschränkung hierauf, in Tab. 1. Tabelle 1: Klinische und Labor-Parameter von beipielhaft ausgewählten Patienten, zusammengefasst nach den klinischen Gruppen.

  	Peritonitis	Pneumonia	CPB	Trauma
  Anz. Patienten	25	18	35	18
  Mortalität	64.0%	44.4%	20.0%	0.0%
  Geschlecht [m/w]	15/10	16/2	21/14	13/5
  Alter* [J]	68 (14)	70 (11)	70 (12)	28 (19)
  SIRS-Kiterien*	3 (2)	3 (0.75)	3 (1)	3 (1.75)
  SOFA Score*	10 (4)	11 (2.75)	7 (3)	10 (5)
  Anz. ODF*	3 (1)	3.5 (1)	3 (1)	2 (2)
  PCT* [ng/ml]	21.1 (35.5)	4.2 (6.4)	3.3 (10.0)	1.2 (6.1)
  CRP* [mg/l]	167.9 (92)	250 (119)	67.4 (49)	19.1 (27.5)
  WBC* [no/l]	12900 (8400)	12600 (5650)	14600 (7300)	9350 (4350)

• Generierung des Klassifikators
• Auf dem Weg zur Klassifikatorentwicklung wurden folgende Schritte durchgeführt:
  1. Schritt: Qualitätskontrolle: Aus der vom Expertenwissen bestätigten Vorauswahl aus einem Patientenkollektiv wurden die zugehörigen Genexpressionsdaten verschiedenen Ähnlichkeitsanalysen unterworfen, um untypische Hybridisierungsergebnisse auszuschließen [Buneß et al., 2005], wodurch die finale Trainingsdatenmatrix generiert wurde.
• 2. Schritt: Normalisierung bzw. Vorverarbeitung der Daten: Verglichen wurden verschiedene Verfahren der Background-Korrektur und der Normalisierung. Am besten zeigten sich Verfahren mit einer Varianz stabilisierenden Transformation [Rocke und Durbin, 2001]. Als bestes Normalisierungsverfahren stellte sich die Normalisierung mittels Box-Cox [Box und Cox, 1964], mit anschießender Median und MAD Standardisierung, heraus. Sein Vorteil, nämlich die Normalisierung einzelner Profile (gegenüber der Normalisierung der gesamte Datenmatrix nach z. B. Huber [Huber et al., 2003], wurde insbesondere beim Bootstrap gezielt verwendet.
• 3. Schritt: Filter: Es wurde ein Filter verwendet, um die besten Klassifikatorgene zu identifizieren. Der Filter bestand aus folgenden Schritten:
  (i) Auswahl von einer bestimmten Anzahl an Transkripten mit dem geringsten Variationskoeffizienten, wobei nur Transkripte mit einer positiven mittleren Signalintensität berücksichtigt wurden. (ii) Anschließend wurde für diese Transkripte der Wilcoxon-Test für den Vergleich infektiös vs. nicht infektiös durchgeführt. Die Transkripte wurden mittels der p-Werte angeordnet, wobei alle Transkripte mit einem p-Wert <= 0.001 als gleichwertig betrachtet werden und diese mittels dem Abstand zwischen infektiöser und nicht infektiöser Gruppe angeordnet werden. Der Abstand zwischen den beiden Gruppen wurde mittels des Hodges-Lehmann Schätzer [Hollander und Wolfe, 1973] bestimmt.
• 4. Schritt: Klassifikation: Die besten der ausgewählten Transkripte wurden dann zur Klassifikation eingesetzt. Im Klassifikationsschritt wurden verschiedene lineare und nicht lineare Verfahren [Hastie et al., 2001] miteinander verglichen: DLDA, LDA, RF, GPLS, SVM und kNN.
• 5. Schritt: Interne Validierung: Um die Güte der Klassifikation zu beurteilen wurde die 10-fach Kreuzvalidierung verwendet, wobei die Kreuzvalidierung mehrfach (20- bzw. sogar 1000-mal) wiederholt wurde.
• 6. Schritt: Auswahl der Transkripte: Die finale Auswahl der Transkripte für den Klassifikator erfolgte unter zu Hilfenahme von Bootstrap. Bootstrapping ist in der Statistik eine Methode des Resampling; dabei werden wiederholt Statistiken auf der Grundlage lediglich einer Stichprobe x = (x(1), ..., x(n)) berechnet. Dafür werden im einfachsten Fall B Bootstrap-Stichproben x(b) = (x*(1), ..., x*(n)), b = 1, ..., B, dadurch generiert, dass jeweils n mal aus der gegebenen Stichprobe ein Wert mit Zurücklegen gezogen wird [Efron, 1979].
• So wurden aus dem ursprünglichen Trainingsdatensatz bestimmte für die jeweilige Fragestellung geeignete Bootstrap-Stichproben gezogen und für jede dieser Stichproben – wie oben beschrieben – die optimalen Transkripte bestimmt. Im finalen Klassifikator finden sich solche Transkripte, die bei häufigen, z. B. 5000 Wiederholungen am häufigsten ausgewählt wurden.
• Bestimmung des finalen Klassifikators
• Die Betrachtung der Abhängigkeit der Klassifikationsergebnisse von der Anzahl der Gene bestätigte das Resultat von Baker und Kramer [Baker und Kramer, 2006], nämlich, dass sich die Ergebnisse mit 5, 10, 25, 40 und 50 Genen wenig unterschieden. In 1 wird der Klassifikationsfehler für die lineare Diskriminanzanalyse (LDA) dargestellt. Da die Kurve ihr Minimum bei etwa 12 Merkmalen erreicht, wurden im weiteren die mit dieser Anzahl von Genen erreichten Ergebnisse dargestellt. In Tab. 2 wurden die Ergebnisse der verschiedenen Klassifikationsverfahren, die mittels 20 Wiederholungen einer 10-fach Kreuzvalidierung gewonnen wurden, zusammengefasst. Tabelle 2: Mittels 20-fach CV (Kreuzvalidierung) geschätzte Sensitivität und Spezifität bei simultaner Betrachtung von 12 Transkripten

  	DLDA	LDA	RF	GPLS	SVM	5-NN
  Sensitivität	95.3	95.3	95.3	93.0	97.7	90.7
  Spezifität	84.9	94.3	90.6	94.3	92.5	96.2

• Aus Tab. 2 geht hervor, dass die geschätzte Sensitivität im Bereich von 95%, die geschätzte Spezifität – mit Ausnahme bei DLDA – im Bereich von über 90% liegen. Am vielversprechendsten sind die Ergebnisse mittels LDA und SVM. Im Fall dieser beiden Klassifikationsverfahren wurden jeweils nur wenige Patienten überwiegend falsch klassifiziert, so dass eine Missklassifikationsrate von höchstens 5% erreicht wird. Aufgrund der großen Komplexität der SVM-Methode und dem dadurch entstehenden Rechenaufwand, den die Optimierung eines SVM-Klassifikators verursachen würde, sowie der besseren biologischen Interpretierbarkeit eines Klassifikators auf der Basis der LDA hat sich die Anmelderin dazu entschieden, den Klassifikator auf der Basis der LDA zu entwickeln. Die aus der LDA resultierende Klassifikationsregel wurde in einen Score umgerechnet. Der Score ist für ein beispielhaftes Kollektiv von 96 Patienten in 2 dargestellt. Ein Wert > 10 zeigt an, dass eine Infektion (also Sepsis) sehr wahrscheinlich ist. Ein Wert zwischen +10 und –10, dass ein gewisses Risiko für eine Sepsis besteht. Ein Wert < –10 schließlich deutet darauf hin, dass eine Infektion sehr unwahrscheinlich ist.
• Zusammenfassend ergibt sich folgendes Bild: Aus dem Generierungsprozess des Klassifikators werden die Vorteile der Gruppenauswahl deutlich: Die geschätzte Anzahl der Klassifikationsgene ist klein, wodurch eine Überanpassung (overfitting) an die Trainingsdaten unwahrscheinlich ist. Die einzelnen Klassifikationsverfahren unterscheiden sich dabei nur geringfügig (Dass die diagonale lineare Diskriminanzanalyse [DLDA] als Klassifikationsverfahren die geringste Klassifikationsgüte liefert, ist dadurch zu erklären, dass in der DLDA die Korrelation zwischen den Genen nicht berücksichtigt wird, was zum Infomationsverlust führt). Eine Erhöhung der Genanzahl verbessert das Ergebnis nicht. Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass die Gruppen im Trainingsdatensatz sich gut trennen lassen, also deutliche Distanzen aufweisen.
• Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen und unter Bezug auf das Sequenzprotokoll, das ebenfalls ein Teil dieser Beschreibung ist, näher erläutert, ohne dass dies eine Einschränkung der Erfindung bedeutet.
• Ergebnisse
• Die Güte der erfindungsgemäßen Multigenbiomarker wurde mit den etablierten Biomarkern PCT und CRP verglichen, wofür die zugehörigen ROCs für den Trainingsdatensatz berechnet wurden (3). Man erhält als AUC (Area Under the Curve): AUC(PCT) = 0.326, AUC(CRP) = 0.656, AUC(PCT & CRP) = 0.940, AUC(Multigenbiomarker) = 0.997. Anhand dieser ROC-Kurven wird die sehr hohe Sensitivität bei ähnlich hoher Spezifität für den deutlich. Durch die gezielte Auswahl der Klassikationsgene wurde also von dem Multigenbiomarker eine bessere Klassifikationsgüte erreicht als von den etablierten Markern PCT und CRP, auch für die Trainingsdaten, die nach dem Prinzip der Extremgruppen scharfe Unterschiede repräsentieren.
• Im nächsten Schritt wurden die Genexpressionsdaten der Patientendatenbank der Anmelderin, die nicht im Trainingsdatensatz verwendet wurden, einer Klassifikation unterzogen. Die 4a zeigt die Verteilung der Score-Werte in Abhängigkeit von der klinischen Diagnose. Zum Vergleich wird in der 4b die Verteilung der PCT- und CRP-Werte für den gleichen Datensatz dargestellt. Während die Index-Werte bzw. die Scores mit der klinischen Diagnose übereinstimmen, zeigt insbesondere die PCT-Verteilung, dass eine schwere SIRS eher als Sepsis und eine unkomplizierte Sepsis eher als nicht infektiös eingestuft wird. Eine unspezifische Verteilung zeigen die Marker CRP und WBC (Leukozytenanzahl).
• Die Güte der erfindungsgemäßen Multigenbiomarker bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde an Expressionsdaten von weiteren Patienten eines fremden Sammelzentrums untersucht. Auch hier stimmten die klinische und molekularbiologische Einstufung in 90% der Fälle überein.
• In 5 wird abschließend die Score-Kurve im Verlauf der Erkrankung für einzelne Patienten dargestellt. Auch hier spiegelt der Multigenbiomarker der vorliegenden Erfindung die klinische Diagnose wider.
• In die Validierungsanalyse wurden Patientenprofile der Patientendatabank der Anmelderin eingeschlossen, deren Expressionsprofile nicht im Trainingsdatensatz vertreten waren. Aufgrund des fehlenden Golden Standards für die Diagnose der Sepsis wurde dieser unabhängige Testdatensatz in geschichteten Subgruppen untersucht. Dabei wurden Patientenprofile nach der Schwere der Erkrankung aufgeteilt und klassifiziert (vgl. 4). Tatsächlich wurden Patienten mit einer unkomplizierten SIRS fast ausschließlich als nicht infektiös eingestuft. Patienten mit einer schweren SIRS (SIRS mit zusätzlicher Multiorgandysfunktion (MOD)) wurden überwiegend als nicht infektiös erkannt. Patienten mit einer unkomplizierten Sepsis wurden überwiegend als systemisch infektiös klassifiziert. Die infektiöse Komplikation wurde am häufigsten unter den Patienten mit einer schweren Sepsis bzw. einem septischen Schock bestimmt. Dieser Befund konnte an einer Patientengruppe, die in einem unabhängigen Zentrum rekrutiert und diagnostiziert wurden, bestätigt werden (6).
• Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeipielen sowie anhand der Zeichnung.
• Es zeigt:
• 1 einen Verlauf des Klassifikationsfehlers der LDA in Abhängikeit von der Anzahl von Klassifikationsgenen; (a) Klassifikationsfehler bei der Verwendung von 5–200 Genen, (b) Auschnitt für 8–20 Gene;
• 2 einen Score (a) und seine Verteilung für den Trainingsdatensatz (b);
• 3 die Güte eines Multigenbiomarkers im Vergleich zu etablierten monomolekularen Biomarkern PCT und CRP bzw. ihrer Kombination (via LDA);
• 4 eine Verteilung der Biomarker-Werte in Abhängigkeit von der klinischen Diagnose, (a) Multigenbiomarker-Score, (b) PCT, CRP und WBC;
• 5 einen Verlauf des Score für drei Patienten (die graue Fläche markiert die Tage der Sepsisdiagnose;
• 6 eine Verteilung der Scores für Expressionsdaten eines fremden Sammelzentrums;
• 7 eine schematische Darstellung des Mikroarray-Designs und der drei Replikate;
• 8 eine Darstellung der auf dem Mikroarray repräsentierten Signalwege;
• 9 ein Beispiel eines qPCR-Laufs (Marker EPC1);
• 10 eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-wertes für 12 Marker und die Einteilung in vier Bereiche; auf diese Skala wird das Klassifikationsergebnis projiziert;
• 11 eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-Wertes und die Einteilung in vier Bereiche; auf diese Skala wird das Klassifikationsergebnis projiziert;
• 12 eine Darstellung der Expressionsunterschiede zwischen den Patientengruppen: Boxplots der Marker erstellt aus 31 Patientenproben (19 mit Sepsisdiagnose, 12 mit SIRS); die Legende erklärt die verwendeten Gensysmbole;
• 13 eine Boxplot der normalisierten Real-Time-PCR-Daten für den Biomarkerkandidaten CDKN1C (SEQ-ID NO: 104) zur Unterscheidung von gram-positiver und gram-negativer Infektion;
• 14 einen Boxplot der normalisierten Real-Time-PCR-Daten für den Biomarker CTSL zur Unterscheidung von gram-positiver und gram-negativer Infektion;
• 15 einen Boxplot der normalisierten Real-Time-PCR-Daten für den Biomarker kandidaten METTL7B (SEQ-ID NO: 145) zur Unterscheidung von gram-positiver und gram-negativer Infektion; und
• 16 einen Boxplot für den nicht-kodierenden Marker mit der SEQ-ID NO: 207; auf der y-Achse ist der mittlere Ct-Wert während der Real-Time-Amplifikation dargestellt.
• Ausführungsbeispiele
• Beispiel 1: Sepsis/SIRS-Abgrenzung
• Es soll ein Verfahren zur Bestimmung von Multigenbiomarkern offenbart werden. Die aus dem Verfahren resultierende Klassifikationsregel soll eine Differenzierung von SIRS- und Sepsis-Patienten erlauben. Eine weitere Klassifikationsregel soll die Unterscheidung zwischen dem Fokus der Infektion Pneumonie und Peritonitis ermöglichen.
• Experimenteller Ansatz
• In genomweiten Genexpressionsuntersuchungen des Blutes nichtseptischer und septischer Patienten wurden Transkripte identifiziert, welche unbeeinflusst von der Heterogenität der Patienten bedingt durch Alter, Komorbiditäten und Medikationen die molekularen Unterschiede zwischen Gruppen von Sepsispatienten widerspiegeln. Abhängig vom untersuchten Patientenkollektiv ist die Anzahl der zur erfolgreichen Klassifikation benötigten Biomarker unterschiedlich.
• Man geht davon aus, dass in heterogenen Kollektiven mehr Biomarker analysiert werden müssen als in sehr gut definierten Gruppen. Im Sinne möglichst robuster klinischer Diagnostik wird von einem Pool an signifikanten Biomarkern ausgegangen. Je nach diagnostischer Fragestellung werden dann Biomarker ausgewählt und das Klassifikationsverfahren auf diversen technischen Genexpressionsplattformen optimiert. An zwei Beispielen soll das Potenzial der Biomarkerkandidaten verdeutlicht werden:
• a) Messung differenzieller Genexpression zwischen SIRS- und Sepsis-Patienten auf einem Mikroarray
• b) Klassifikation von SIRS- und Sepsis-Patienten mit Genexpressionssignalen ausgewählter Oligonukleotidsonden, generiert auf dem Mikroarray
• zu a:
• Charakteristik des verwendeten-Arrays:
• • mittels Spottingtechnologie hergestellter Oligonukleotid-Mikroarray
• • 484 genspezifische Oligonukleotide sind in 3 Replikaten aufgebracht
• • davon adressieren 344 Oligonukleotide Genexpressionsbiomarker
• • 84 Oligonukleotide adressieren Kontrollen (neg. and pos.)
• • 56 Oligonukleotide adressieren Referenzgene
• 7 zeigt eine schematische Darstellung des fokussierten Sepsis-Mikroarrays. Gespottet auf epoxy-silanisierte Glasträgern (Nexterion E-Slides, Hersteller Schott, BRD), ist jedes genspezifische Oligonukleotid dreifach repräsentiert. Die drei identischen Sub-Arrays werden mit einer Patientenprobe hybridisiert. Neben den markerspezifischen Oligonukleotiden sind auch Sonden für Kontrollen (Überwachung des gesamten Probenvorbereitungs- und Hybridisierungsprozesses) auf dem Array vertreten.
• Biologische Plausibilität der eingesetzten Biomarker:
• Die auf dem Array adressierten Markergene sind mit hoher Signifikanz den in 8 dargestellten Signalwegen in der menschlichen Zelle und den damit verbundenen Funktionalitäten zugeordnet. Eine hohe Relevanz für immunologische und inflammatorische Prozesse und damit auch die Sepsis ist gegeben. Für die wissensbasierte Analyse der Biomarkerpopulation auf dem fokussierten Sepsis-Array wurde die Software Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, USA, www.ingenuity.com), verwendet, um den funktionellen Kontext der identifizierten Marker zu verdeutlichen. Basierend auf dem gesamten öffentlich verfügbaren Datenbankwissen über die Gene und Genprodukte werden die Marker in funktionelle Netzwerke eingeordnet, welche dann Relevanz für physiologische und pathologische Vorgänge haben können. Die Marker sind mit hoher Signifikanz an immunologischen und entzündlichen Prozessen beteiligt, was von funktioneller Seite einen engen Zusammenhang zur Sepsis vermuten lässt. Damit ist biologische Plausibilität, eine Grundvoraussetzung für Biomarker, gegeben.
• Patientenkollektiv für die Auswertung:
• Im Großteil der Fälle auf der Intensivstation (ITS) ist die Lunge (ca. 45–50%) oder der Abdomen (ca. 25%) der Fokus der Infektion bei einer Sepsisdiagnose. Daher wurden im Rahmen der Multigenbiomarker-Entwicklung Patienten mit Pneumonie bzw. Peritonitis ausgewählt. Im Fall der SIRS wurden Herz-Patienten ausgewählt, welche den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen darstellen. Auf diese Weise wurden 12 Patienten mit schwerer Pneumonie, 18 Patienten mit schwerer Peritonitis und 19 Herz-Patienten (OP: cardiopulmonaler Bypass) mit schwerer SIRS identifiziert. Für die Analysen wurde von diesen Patienten jeweils der erste Tag der Diagnose ausgewählt. In nachfolgender Tab. 3 ist das Patientenkollektiv für die Klassifikator-Validierung auf dem Sepsis-Array dargestellt. Tabelle 3: Patientenkollektiv für die Validierung des Klassifikators auf dem fokussierten Sepsis-Array (klinische Daten siehe Beschreibung Gesamtkollektiv von 96 Patienten)

  Nr.	Spezifikation	Patient
  1	Peritonitis	1021
  2	Peritonitis	6008
  3	Peritonitis	6008
  4	Peritonitis	6023
  5	Peritonitis	6023
  6	Peritonitis	6023
  7	Peritonitis	6025
  8	Peritonitis	6035
  9	Peritonitis	6073
  10	Peritonitis	6075
  11	Peritonitis	6084
  12	Peritonitis	6118
  13	Peritonitis	6127
  14	Peritonitis	6132
  15	Peritonitis	6138
  16	Peritonitis	6040
  17	Peritonitis	6065
  18	Peritonitis	6096
  19	CPB	814
  20	CPB	2038
  21	CPB	2042
  22	CPB	2043
  23	CPB	8001
  24	CPB	8002
  25	CPB	8009
  26	CPB	8010
  27	CPB	8032
  28	CPB	8039
  29	CPB	8068
  30	CPB	8096
  31	CPB	8102
  32	CPB	8111
  33	CPB	8112
  34	CPB	8116
  35	CPB	7072
  36	CPB	7073
  37	CPB	7134
  38	Pneumonie	877
  39	Pneumonie	1015
  40	Pneumonie	6032
  41	Pneumonie	6085
  42	Pneumonie	6141
  43	Pneumonie	8089
  44	Pneumonie	6070
  45	Pneumonie	6104
  46	Pneumonie	6109
  47	Pneumonie	6007
  48	Pneumonie	6048
  49	Pneumonie	6063

• Hybridisierung:
• 4 μg totalRNA aus Patientenblut wurde mittels reverser Transkription (SuperscriptII, Invitrogen, USA) in einem Reaktionsvolumen von 30 μl??? in cDNA umgeschrieben. Als Primer wurde ein PolydT-Primer (18mer eingesetzt). Aminoallyl-dUTP wurde der Reaktion zugesetzt und somit 80% der dTTP Menge im mRNA-Strang anhand des AA-dUTP substituiert (Tab. 4). Tabelle 4: Pipettieransatz für die Proben für die cDNA-Synthese. 4 μg totalRNA sowie 2,5 μg OligodT Primer wurden vorgelegt. Mit RNAse-freiem Wasser wurde auf 30 μl Gesamtvolumen aufgefüllt.

  Reaktionsansatz
  Bestandteile	Proben
  5 × RT Puffer	6 μl
  50 × dNTP	0,6 μl
  0,1 M DTT	3 μl
  RNase Out	0,4 μl
  Superscript II	2 μl
  Total RNA	4 μg
  RNAase-freies Wasser	auf 30 μl

• Alle Proben werden für 2 h bei 42°C inkubiert. Nach diesen 2 h werden die entstandenen mRNA/cDNA Duplexe in einzel-strängige cDNA alkalisch hydrolisiert (Zugabe von je 20 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) und je 20 μl 1 N NaOH mit einer Inkubationszeit von 30 min bei 65°C). Zur Neutralisation der einzelsträngigen cDNA werden je 50 μl 1 M Tris-HCl (pH 7,4) zugegeben. Anschließend werden alle Proben mit 400 μl RNase freiem H₂O versetzt und mittels Microcon YM-30 Säulen (AMICON, USA) aufgereinigt. Dazu gibt man die gesamten Proben auf jeweils eine Säule, die bei 11000 × g für 10 min zentrifugiert wird. Nach zweimaligen waschen mit 450 μl RNase freien H₂O und dazwischenliegende Zentrifugationsschritten bei 11000 × g für 10 min, werden die Säulen umgedreht auf ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß gestülpt und für 3 min bei 15000 × g zentrifugiert. Als Eluat erhält man nun aufgereinigte einzelsträngige cDNA mit einem Volumen von ca. 20–40 μl, welche in der Speedvac zur Trockene reduziert wird.
• Markierung der cDNA mit Fluoreszenzfarbstoffen
• Zur Detektion der Hybridisierungssignale werden fluoreszierende Farbstoffe eingesetzt. Für die Analysen wurde ein Fluoreszenzfarbstoff von Dyomics verwendet (Hersteller: Dyomics GmbH, Jena, BRD). DY-647 (Cy5-Analoga) werden als N-Hydroxylsuccinimid-Ester (NHS-Ester) erworben und für die Fluoreszenzmarkierung eingesetzt. Die chemische Kopplung der Farbstoffe erfolgt an den eingebauten AA-dUTPs.
• Die cDNA wird in 10 μl H₂O gelöst und mit je 5 μl auf zwei Röhrchen aufgeteilt. Die gelösten Proben werden bei 42°C für 5 min inkubiert. Anschließend werden jeder Probe jeweils 3 μl Bicarbonatpuffer zugesetzt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird in DMSO (Hersteller SIGMA-Aldrich, BRD) gelöst. Pro Probe werden 75 μg Farbstoff eingesetzt.
• Diese lichtempfindliche Reaktion erfolgt im Dunkeln für 1 h. Nach dieser Zeit werden die Proben mit H₂O auf ein Endvolumen von 30 μl aufgefüllt. Die Proben werden mit jeweils 80 μl H₂O und 100 μl Membran-Binding-Solution zusammenpipettiert und mittels Promega Kit (Promega Wizard-SV Gel and PCR CleanUP System, PROMEGA, USA) aufgereinigt, nach den Angaben des Herstellers.
• Im letzten Schritt werden die Säulen für 1 min bei 16000 × g trocken zentrifugiert und zweimal mit 50 μl H₂O (je 1 min, 10000 × g) eluiert. Danach wird jede Probe mit 10 μl Cot-1-DNA (Invitrogen, USA) und 400 μl H₂O versetzt. Die Konzentration der markierten Proben erfolgt mittels Microcon YM-30 (10000 × g; 10 min Zentrifugation). Die Säulen werden umgedreht auf ein neues Röhrchen gestülpt und bei 15000 × g für 3 min zentrifugiert. Das Volumen des cDNA/Cot-1-DNA-Gemisches wird auf 32 μl eingestellt. Das fluoreszenzmarkierte cDNA/Cot-1-DNA-Gemisch (32 μl) wird mit 58 μl Hybridisierungsgemisch (Tab. 5) versetzt.
• Nach dreiminütiger Denaturierung bei 98°C wird das Gemisch in die Hybridisierungskammern des TECAN-Hybridisierungsautomaten (HS-400, Hersteller Tecan, Österreich) einpipettiert. Das enthaltene Formamid setzt die Schmelztemperatur des Hybrids herab und ermöglicht somit eine gute Hybridisierung. Durch die Zugabe von 10%igem SDS wird die Benetzung der Biomoleküle am Glasobjektträger verbessert. Die Hefe-t-RNA/Poly-A-Mix sorgt dafür, dass es keine unspezifischen Bindungen und Hintergrundrauschen gibt. Demzufolge bindet Poly(A) an das Poly(T)-Ende der markierten cDNA, wobei die Hefe-t-RNA alle unspezifischen Sequenzen blockiert. Tabelle 5: Das Hybridisierungsgemisch für eine Probe.

  Bestandteile der Hybridisierungsgemisch	Volumina
  Formamid	21,60 μl
  20 × SSC	15,66 μl
  10% SDS	2,70 μl
  Hefe-t-RNA/polyA-Mix (je 10,0 μg/μl)	14,40 μl
  RNase freies H2O	3,64 μl

• Das Programm an der Hybridisierungsstation ist in der nachfolgenden Tab. 6 dargestellt. Tabelle 6: Das Programm der standardisierten und kontrollierten Hybridisierung am Tecan Gerät.

  Programm	Lösungen	Temperatur	Anzahl & Dauer der Durchgänge
  1. Waschschritt	Hybridisierungs-Lösung (0,3% SDS, 3,5 × SSC, 24% Formamid)	42,0°C	2 Durchgänge; Zeit 1 min; Aufsaugzeit: 30 sek
  2. Probeninjektion		42,0°C
  3. Hybridisierung		42,0°C	Agitationsfrequenz: Medium; Zeit: 10 h
  4. Waschschritt 1	Waschlösung 1 (2 × SSC/0,03% SDS)	25,0°C	2 Durchgänge; Zeit 1 min; Aufsaugzeit: 30 sek
  5. Waschschritt 2	Waschlösung 2 (1 × SSC)	25,0°C	2 Durchgänge; Zeit: 1 min; Aufsaugzeit: 30 sek
  6. Waschschritt 3	Waschlösung 3 (0,2 × SSC)	25,0°C	1 Durchgang; Zeit: 1 min; Aufsaugzeit: 30 sek
  7. Slide Trocknung		30,0°C	Zeit: 2 min 30 sek; Abschließende Trocknung mit 2,5 bar Stickstoffzufuhr

• Die Arrays werden zu Beginn mit Hybridisierungslösung gewaschen und anschließend mit den Proben inkubiert. Der Prozess wird für zehn Stunden bei einer Temperatur von 42°C in Hybridisierungskammern des Tecan Gerätes HS-400 mit konstanter Agitation des Hybridisierungsgemisches auf der Array Oberfläche durchgeführt. Zum Schluss werden die Arrays in drei automatisierten Schritten gewaschen und getrocknet.
• Nach zehn Stunden werden alle nicht gebundenen Moleküle durch anschließende Waschschritte vom Mikroarray entfernt. Die fertigen Arrays müssen zur Auswertung eingescannt (AxonB Scanner, GenePix-Software, Axon Technologies, USA) werden. Die resultierenden gpr-files werden biostatistisch ausgewertet.
• Auswertung
• Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version 2.6.1 durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht.
• 1. Qualitätskontrolle der Rohdaten:
• Aus der vom Expertenwissen bestätigten Vorauswahl aus 46 Patienten wurden die zugehörigen Genexpressionsdaten verschiedenen Ähnlichkeitsanalysen unterworfen, um untypische Hybridisierungsergebnisse auszuschließen [Buneß et al., 2005].
• 2. Normalisierung der Daten:
• Verglichen wurden verschiedene Verfahren der Background-Korrektur und der Normalisierung. Am besten zeigten sich Verfahren mit einer Varianz stabilisierenden Transformation [Rocke und Durbin, 2001]. Als bestes Normalisierungsverfahren stellte sich die Normalisierung mittels Box-Cox [Box und Cox, 1964], mit anschießender Median und MAD Standardisierung, heraus. Sein Vorteil, nämlich die Normalisierung einzelner Profile (gegenüber der Normalisierung der gesamten Datenmatrix nach z. B. Huber [Huber et al., 2003], können insbesondere beim Bootstrap gezielt verwendet werden.
• 3. Statistischer Vergleich der Gruppen:
• Die Expressionswerte der untersuchten Transkripte wurden mit dem Wilcoxon-Ranksummen-Test nach dem Infektionsstatus (infektiös vs. nicht infektiös) verglichen. Die Transkripte wurden aufsteigend nach dem erreichten p-Wert angeordnet, wobei alle Transkripte mit einem p-Wert <= 0.001 als gleichwertig betrachtet und diese mittels dem Abstand zwischen infektiöser und nicht infektiöser Gruppe angeordnet wurden. Der Abstand zwischen den beiden Gruppen wurde mittels des Hodges-Lehmann Schätzer bestimmt.
• 4. Klassifikation:
• Aus Tab. 7 wurden 14 Transkripte ausgewählt, die die Patientengruppen in einem Klassifikationstest nach ihrem Infektionszustand am besten trennen konnten. Als bestes Klassifikationsverfahren (d. h. das Verfahren, das in einer einfachen Kreuzvalidierung den kleinsten Klassifikationsfehler lieferte) wurde die lineare Diskriminanzanalyse [Hastie et al., 2001] gewählt. Dafür wurde die Funktion lda aus dem Packet MASS der Software R verwendet. Für die p = 14 Gen-Marker wurden die Gewichte (w₀, ..., w_p) der Diskriminanzfunktion f_LD, die durch die Formel

  

  definiert ist, aus den normalisierten Expressionsdaten berechnet, wobei nacheinander eine Probe weggelassen wurde. Diese Probe wurde nachhinein klassifiziert, wofür in der vorangegangenen Formel für (x₁, ..., x_p) die ct-Werte der Probe eingesetzt wurden. Die Gewichte der Diskriminanzfunktion wurden so berechnet, dass ein positiver Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation bedeuten. Die Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion, die aus allen Proben berechnet wurden, sind in Tab. 7 zusammengefasst.
• zu b):
• Klassifikationsergebnisse:
• Die verwendeten Expressionssignale entstammen dem obigen Datensatz. In der Klassifikation wurden bei einer einfachen Kreuzvalidierung eine Sensitivität von 96% und eine Spezifität von 95% erreicht. Das entspricht einer Fehlerrate von 96%, also einer Falschklassifikation von 2 Proben. Die Gewichte der zugehörigen Diskriminanzfunktion sind in Tab. 7 zusammengefasst. Tabelle 7: Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion als Ergebnis der Klassifikation

  Wichtungfaktor	Gensymbol	SEQ-ID	Ermittelte Werte
  w0	-	-	9,5
  w1	KIAA0146	261	3,6
  w2	FGL2	615	–3,9
  w3	CCR2	529, 530	–2,7
  w4	HLA_DPA	613	–26,1
  w5	CD59	571, 572, 573, 574	16
  w6	EPC1	280	23,5
  w7	TLR5	431	–5,2
  w8	CLU	575, 576	15,4
  w9	MME	443, 444, 445, 446	–11,3
  w10	IGKCem	633	0,5
  w11	NSMAF	527	13,7
  w12	CCR2	529, 530	23,9
  w13	BZRP	601, 602	–20,6
  w14	CD82	470, 471	–14,4

• Tab. 8 zeigt die differenzielle Genexpression in den Patientengruppen, gemessen auf dem Mikroarray. Tabelle. 8: Differentielle Genexpression zwischen den Patientengruppen; p-Werte für die Analysen 1 und 2: grau unterlegt sind die Marker, die für die jeweilige Analyse einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen aufzeigen; Analyse1 (nichtinfektiöse vs. infektiöse Ursache des Multiorganversagens): CPB Patienten vs. septische Patienten mit Fokus Peritonitis bzw. Pneumonie; Analyse2 (Fokus der Infektion, Unterscheidung von Fokus Peritonitis von Fokus Pneumonie): 18 septische Patienten mit Fokus Peritonitis vs. 12 Patienten mit dem Fokus Pneumonie

  Analyse 1: infektiös/nichtinfektiös			Analyse 2: Pneumonie/Peritonitis als Fokus bei septischen Patienten
  Seq-ID	p-Wert	Hodge-Lehmann Schätzer	Seq-ID	p-Wert	Hodge-Lehmann Schätzer
  530	0	–0,516	236	0,000014	0,962
  546	0	0,241	356	0,000056	–0,62
  588	0	0,219	540	0,000244	0,339
  613	0	–0,645	540	0,000319	0,399
  340	0,000002	0,411	215	0,001067	0,335
  530	0,000002	–0,505	235	0,001067	–0,405
  626	0,000009	–0,404	161	0,001333	–0,492
  599	0,000027	–0,412	364	0,001653	–0,361
  600	0,000027	–0,412	365	0,001653	–0,361
  527	0,000044	–0,231	18	0,00204	0,172
  546	0,00005	0,244	413	0,00204	0,349
  621	0,000056	0,233	414	0,00204	0,349
  436	0,000062	0,157	415	0,00204	0,349
  615	0,000062	–0,331	416	0,00204	0,349
  324	0,00007	0,158	12	0,003054	0,318
  619	0,000097	–0,365	13	0,003054	0,318
  620	0,000097	–0,365	162	0,003054	0,372
  518	0,000108	–0,336	272	0,003054	–0,358
  628	0,000134	–0,182	571	0,003054	0,203
  438	0,000166	–0,298	572	0,003054	0,203
  439	0,000166	–0,298	573	0,003054	0,203
  501	0,000184	0,17	574	0,003054	0,203
  519	0,000184	0,394	636	0,003054	0,396
  296	0,000226	0,17	233	0,00448	–0,247
  408	0,00025	0,201	538	0,00448	–0,272
  409	0,00025	0,201	539	0,00448	–0,272
  410	0,00025	0,201	175	0,005386	0,199
  411	0,00025	0,201	204	0,005386	0,452
  412	0,00025	0,201	465	0,005386	0,296
  504	0,00025	0,382	61	0,006447	–0,239
  57	0,000277	0,147	62	0,006447	–0,239
  183	0,000277	0,293	325	0,006447	–0,291
  42	0,000306	–0,145	326	0,006447	–0,291
  207	0,000306	0,135	538	0,006447	–0,286
  515	0,000306	–0,147	539	0,006447	–0,286
  516	0,000306	–0,147	635	0,006447	0,267
  259	0,000338	–0,259	167	0,007681	0,415
  179	0,00041	0,197	178	0,007681	0,227
  180	0,00041	0,197	327	0,009114	–0,233
  552	0,000452	–0,296	328	0,009114	–0,233
  631	0,000452	0,201	384	0,009114	–0,193
  454	0,000497	–0,251	443	0,009114	–0,449
  520	0,000497	0,135	444	0,009114	–0,449
  521	0,000497	0,135	445	0,009114	–0,449
  45	0,0006	0,206	446	0,009114	–0,449
  46	0,0006	0,206	18	0,010767	0,192
  47	0,0006	0,206	208	0,010767	–0,351
  48	0,0006	0,206	355	0,010767	–0,423
  424	0,0006	0,156	552	0,010767	–0,214
  425	0,0006	0,156	567	0,010767	0,257
  426	0,0006	–0,246	581	0,010767	0,236
  7	0,000658	0,177	35	0,01267	–0,135
  596	0,000658	0,204	36	0,01267	–0,135
  522	0,000721	–0,245	37	0,01267	–0,135
  523	0,000721	–0,245	38	0,01267	–0,135
  524	0,000721	–0,245	39	0,01267	–0,135
  525	0,000721	–0,245	40	0,01267	–0,135
  526	0,000721	–0,245	41	0,01267	–0,135
  529	0,000721	–0,286	368	0,01267	0,224
  530	0,000721	–0,286	369	0,01267	0,224
  249	0,000865	0,315	370	0,01267	0,224
  250	0,000865	0,315	371	0,01267	0,224
  470	0,000865	0,17	372	0,01267	0,224
  471	0,000865	0,17	373	0,01267	0,224
  601	0,000946	0,221	379	0,01267	–0,302
  602	0,000946	0,221	20	0,014847	–0,253
  420	0,001034	0,303	21	0,014847	–0,253
  421	0,001034	0,303	22	0,014847	–0,253
  168	0,001129	0,2	23	0,014847	–0,253
  197	0,001129	0,246	24	0,014847	–0,253
  611	0,001232	–0,247	25	0,014847	–0,253
  612	0,001232	–0,247	26	0,014847	–0,253
  376	0,001344	0,158	27	0,014847	–0,253
  430	0,001344	0,253	28	0,014847	–0,253
  542	0,001344	0,139	29	0,014847	–0,253
  543	0,001344	0,139	30	0,014847	–0,253
  544	0,001344	0,139	31	0,014847	–0,253
  545	0,001344	0,139	32	0,014847	–0,253
  387	0,001464	0,247	33	0,014847	–0,253
  388	0,001464	0,247	50	0,014847	–0,265
  423	0,001464	–0,324	51	0,014847	–0,265
  528	0,001594	0,324	52	0,014847	–0,265
  337	0,001886	0,202	53	0,014847	–0,265
  338	0,001886	0,202	54	0,014847	–0,265
  469	0,001886	–0,244	55	0,014847	–0,265
  302	0,002049	0,18	56	0,014847	–0,265
  441	0,002049	0,248	243	0,014847	–0,182
  568	0,002225	0,153	456	0,014847	0,241
  569	0,002225	0,153	457	0,014847	0,241
  295	0,002413	0,22	458	0,014847	0,241
  460	0,002413	–0,3	459	0,014847	0,241
  247	0,002835	0,173	177	0,017335	–0,121
  364	0,002835	0,287	270	0,017335	0,134
  365	0,002835	0,287	312	0,017335	0,184
  248	0,00332	0,333	313	0,017335	0,184
  350	0,00332	0,168	385	0,017335	0,265
  273	0,00359	0,216	405	0,017335	0,225
  581	0,00359	–0,269	406	0,017335	0,225
  594	0,003878	0,176	407	0,017335	0,225
  571	0,004187	0,256	438	0,017335	–0,282
  572	0,004187	0,256	439	0,017335	–0,282
  573	0,004187	0,256	583	0,017335	0,121
  574	0,004187	0,256	584	0,017335	0,121
  304	0,004518	0,152	58	0,02016	0,163
  401	0,004518	0,282	59	0,02016	0,163
  451	0,004518	0,184	199	0,02016	0,249
  452	0,004518	0,184	460	0,02016	–0,326
  561	0,004518	–0,179	533	0,02016	–0,186
  601	0,004518	0,24	593	0,02016	0,151
  602	0,004518	0,24	258	0,023364	0,28
  330	0,004871	0,17	297	0,023364	0,275
  331	0,004871	0,17	468	0,023364	0,219
  332	0,004871	0,17	518	0,023364	–0,261
  333	0,004871	0,17	615	0,023364	–0,19
  334	0,004871	0,17	621	0,026976	0,128
  335	0,004871	0,17	211	0,031043	0,158
  475	0,004871	–0,217	249	0,031043	–0,258
  476	0,004871	–0,217	250	0,031043	–0,258
  623	0,004871	0,23	434	0,031043	0,283
  221	0,005652	0,122	435	0,031043	0,283
  222	0,005652	0,122	437	0,031043	0,281
  223	0,005652	0,122	442	0,031043	–0,114
  462	0,005652	–0,132	473	0,031043	–0,118
  463	0,005652	–0,132	474	0,031043	–0,118
  464	0,005652	–0,132	619	0,031043	–0,187
  581	0,005652	–0,245	620	0,031043	–0,187
  64	0,006541	0,218	624	0,031043	–0,202
  65	0,006541	0,218	341	0,035598	0,15
  196	0,006541	0,192	342	0,035598	0,15
  509	0,006541	–0,207	563	0,035598	0,156
  510	0,006541	–0,207	564	0,035598	0,156
  511	0,006541	–0,207	595	0,035598	0,18
  512	0,006541	–0,207	163	0,040689	–0,18
  43	0,00703	0,195	164	0,040689	–0,18
  44	0,00703	0,195	165	0,040689	–0,18
  213	0,00703	0,091	166	0,040689	–0,18
  276	0,00703	0,232	359	0,040689	–0,223
  467	0,007551	–0,196	530	0,040689	–0,19
  645	0,007551	–0,179	637	0,040689	–0,161
  175	0,008695	0,147	638	0,040689	–0,161
  592	0,008695	0,143	639	0,040689	–0,161
  456	0,009321	–0,152	640	0,040689	–0,161
  457	0,009321	–0,152	641	0,040689	–0,161
  458	0,009321	–0,152	642	0,040689	–0,161
  459	0,009321	–0,152	15	0,046354	–0,22
  522	0,009321	–0,193	366	0,046354	–0,217
  523	0,009321	–0,193	502	0,046354	0,136
  524	0,009321	–0,193	503	0,046354	0,136
  525	0,009321	–0,193	586	0,046354	–0,194
  526	0,009321	–0,193	628	0,046354	–0,084
  422	0,009986	–0,175	159	0,052643	0,114
  535	0,009986	–0,309	387	0,052643	0,146
  609	0,009986	–0,154	388	0,052643	0,146
  258	0,010693	–0,198	422	0,052643	–0,199
  283	0,010693	0,177	514	0,052643	0,152
  215	0,012237	0,232	532	0,052643	–0,166
  218	0,012237	0,131	534	0,052643	–0,251
  616	0,012237	0,215	594	0,052643	0,174
  617	0,012237	0,215	6	0,059596	0,19
  618	0,012237	0,215	7	0,059596	–0,129
  19	0,013079	0,155	209	0,059596	0,169
  635	0,013079	0,173	220	0,059596	0,17
  263	0,01397	–0,252	261	0,059596	–0,148
  264	0,01397	–0,252	447	0,059596	–0,25
  443	0,01397	–0,297	448	0,059596	–0,25
  444	0,01397	–0,297	449	0,059596	–0,25
  445	0,01397	–0,297	450	0,059596	–0,25
  446	0,01397	–0,297	507	0,059596	0,189
  479	0,01397	0,169	508	0,059596	0,189
  405	0,014913	0,207	562	0,059596	0,138
  406	0,014913	0,207	581	0,059596	0,199
  407	0,014913	0,207	625	0,059596	–0,197
  235	0,015911	0,268	197	0,067266	0,134
  245	0,015911	0,131	281	0,067266	0,135
  305	0,015911	0,168	291	0,067266	0,48
  204	0,016966	0,227	453	0,067266	0,52
  440	0,016966	0,134	213	0,075691	0,082
  278	0,018079	0,181	236	0,075691	0,201
  290	0,021804	0,309	286	0,075691	–0,175
  314	0,021804	0,14	577	0,075691	0,131
  327	0,021804	0,169	578	0,075691	0,131
  328	0,021804	0,169	616	0,075691	–0,269
  399	0,021804	0,131	617	0,075691	–0,269
  400	0,021804	0,131	618	0,075691	–0,269
  598	0,021804	0,139	182	0,084927	0,142
  531	0,023182	–0,17	337	0,084927	0,119
  597	0,023182	0,14	338	0,084927	0,119
  161	0,026162	–0,243	522	0,084927	–0,169
  351	0,026162	0,181	523	0,084927	–0,169
  352	0,026162	0,181	524	0,084927	–0,169
  353	0,026162	0,181	525	0,084927	–0,169
  354	0,026162	0,181	526	0,084927	–0,169
  383	0,026162	–0,128	645	0,084927	0,197
  208	0,027769	0,285	255	0,095012	0,172
  227	0,029459	0,127	316	0,095012	–0,133
  228	0,029459	0,127	336	0,095012	–0,114
  229	0,029459	0,127	555	0,095012	0,115
  230	0,029459	0,127	556	0,095012	0,115
  231	0,029459	0,127	226	0,106	0,091
  402	0,033098	0,135	268	0,106	–0,135
  307	0,035055	0,135	296	0,106	0,097
  308	0,035055	0,135	404	0,106	0,13
  309	0,035055	0,135	528	0,106	0,2
  310	0,035055	0,135	550	0,106	0,132
  311	0,035055	0,135	551	0,106	0,132
  385	0,035055	0,156	566	0,106	0,186
  540	0,035055	0,241	232	0,117926	0,165
  322	0,037107	0,21	253	0,117926	0,356
  323	0,037107	0,21	429	0,117926	0,102
  593	0,037107	0,139	504	0,117926	–0,197
  20	0,039258	–0,177	202	0,130844	0,21
  21	0,039258	–0,177	218	0,130844	0,086
  22	0,039258	–0,177	242	0,130844	–0,125
  23	0,039258	–0,177	244	0,130844	–0,177
  24	0,039258	–0,177	280	0,130844	–0,219
  25	0,039258	–0,177	345	0,130844	0,181
  26	0,039258	–0,177	346	0,130844	0,181
  27	0,039258	–0,177	517	0,130844	0,102
  28	0,039258	–0,177	14	0,144784	0,148
  29	0,039258	–0,177	251	0,144784	0,095
  30	0,039258	–0,177	265	0,144784	0,124
  31	0,039258	–0,177	282	0,144784	0,166
  32	0,039258	–0,177	324	0,144784	0,07
  33	0,039258	–0,177	461	0,144784	0,091
  226	0,039258	0,091	478	0,144784	0,144
  329	0,039258	–0,141	541	0,144784	–0,174
  301	0,041511	0,141	601	0,144784	0,153
  325	0,041511	0,181	602	0,144784	0,153
  326	0,041511	0,181	613	0,144784	–0,162
  646	0,041511	0,09	200	0,159796	0,106
  647	0,041511	0,09	225	0,159796	0,12
  170	0,043871	0,388	237	0,159796	0,095
  472	0,043871	0,146	252	0,159796	0,158
  286	0,04634	0,188	262	0,159796	0,146
  555	0,04634	0,111	288	0,159796	0,047
  556	0,04634	0,111	304	0,159796	0,094
  61	0,054443	0,159	17	0,175903	–0,151
  62	0,054443	0,159	66	0,175903	0,112
  292	0,054443	0,114	187	0,175903	–0,127
  547	0,057388	–0,104	191	0,175903	0,186
  624	0,057388	–0,112	192	0,175903	0,186
  177	0,060461	0,13	193	0,175903	0,186
  200	0,060461	0,11	194	0,175903	0,186
  404	0,060461	0,109	224	0,175903	0,145
  540	0,060461	0,263	317	0,175903	–0,115
  541	0,060461	–0,14	318	0,175903	–0,115
  549	0,060461	–0,177	424	0,175903	–0,103
  627	0,060461	0,08	425	0,175903	–0,103
  219	0,067007	0,104	519	0,175903	0,166
  237	0,067007	0,077	534	0,175903	–0,143
  389	0,067007	–0,279	535	0,175903	–0,258
  542	0,067007	0,131	565	0,175903	0,144
  543	0,067007	0,131	579	0,175903	0,123
  544	0,067007	0,131	580	0,175903	0,123
  545	0,067007	0,131	43	0,193151	0,101
  312	0,070488	0,1	44	0,193151	0,101
  313	0,070488	0,1	64	0,193151	–0,089
  595	0,070488	0,095	65	0,193151	–0,089
  634	0,070488	0,204	314	0,193151	0,111
  35	0,074112	–0,087	374	0,193151	0,183
  36	0,074112	–0,087	646	0,193151	–0,061
  37	0,074112	–0,087	647	0,193151	–0,061
  38	0,074112	–0,087	205	0,211556	0,179
  39	0,074112	–0,087	210	0,211556	–0,131
  40	0,074112	–0,087	278	0,211556	0,108
  41	0,074112	–0,087	292	0,211556	0,086
  214	0,074112	0,128	367	0,211556	0,081
  632	0,074112	0,22	382	0,211556	0,08
  14	0,077884	0,138	505	0,211556	0,145
  156	0,077884	0,146	530	0,211556	–0,124
  157	0,077884	0,146	201	0,231155	0,121
  158	0,077884	0,146	227	0,231155	0,092
  243	0,077884	–0,107	228	0,231155	0,092
  505	0,077884	–0,189	229	0,231155	0,092
  622	0,077884	0,172	230	0,231155	0,092
  265	0,081808	0,12	231	0,231155	0,092
  291	0,081808	–0,302	298	0,231155	–0,069
  630	0,081808	0,178	383	0,231155	0,114
  505	0,085886	–0,167	467	0,231155	–0,08
  270	0,090124	0,105	501	0,231155	0,072
  427	0,090124	–0,147	609	0,231155	–0,097
  428	0,090124	–0,147	19	0,251953	–0,169
  547	0,090124	–0,101	303	0,251953	0,094
  553	0,090124	–0,123	454	0,251953	–0,169
  225	0,094525	0,112	462	0,251953	–0,085
  403	0,094525	0,119	463	0,251953	–0,085
  607	0,094525	0,171	464	0,251953	–0,085
  608	0,094525	0,171	475	0,251953	–0,128
  629	0,094525	0,083	476	0,251953	–0,128
  275	0,099092	0,093	254	0,273981	0,125
  380	0,099092	0,097	375	0,273981	0,056
  381	0,099092	0,097	389	0,273981	0,269
  587	0,10383	0,118	430	0,273981	–0,113
  186	0,108743	0,114	551	0,273981	0,118
  453	0,108743	0,21	587	0,273981	0,072
  211	0,113833	0,105	601	0,273981	0,121
  577	0,113833	0,116	602	0,273981	0,121
  578	0,113833	0,116	629	0,273981	0,039
  6	0,119105	0,121	1	0,297233	0,079
  182	0,119105	0,091	2	0,297233	0,079
  633	0,119105	0,233	3	0,297233	0,079
  483	0,124562	0,12	10	0,297233	0,086
  484	0,124562	0,12	189	0,297233	0,082
  485	0,124562	0,12	256	0,297233	0,106
  486	0,124562	0,12	257	0,297233	0,106
  487	0,124562	0,12	274	0,297233	–0,091
  488	0,124562	0,12	358	0,297233	0,128
  489	0,124562	0,12	431	0,297233	–0,178
  490	0,124562	0,12	455	0,297233	–0,074
  491	0,124562	0,12	479	0,297233	0,089
  492	0,124562	0,12	588	0,297233	–0,036
  493	0,124562	0,12	184	0,321727	–0,122
  494	0,124562	0,12	196	0,321727	–0,128
  495	0,124562	0,12	271	0,321727	–0,082
  496	0,124562	0,12	322	0,321727	–0,109
  497	0,124562	0,12	323	0,321727	–0,109
  498	0,124562	0,12	339	0,321727	0,092
  499	0,124562	0,12	390	0,321727	0,142
  500	0,124562	0,12	433	0,321727	0,072
  537	0,124562	0,17	440	0,321727	–0,085
  589	0,124562	–0,12	466	0,321727	0,069
  590	0,124562	–0,12	506	0,321727	0,085
  591	0,124562	–0,12	522	0,321727	–0,101
  199	0,130209	0,112	523	0,321727	–0,101
  341	0,130209	0,107	524	0,321727	–0,101
  342	0,130209	0,107	525	0,321727	–0,101
  382	0,130209	0,116	526	0,321727	–0,101
  506	0,130209	0,113	529	0,321727	–0,098
  517	0,130209	–0,149	530	0,321727	–0,098
  49	0,136047	0,141	546	0,321727	–0,089
  195	0,136047	0,173	582	0,321727	0,092
  387	0,136047	–0,093	599	0,321727	–0,06
  388	0,136047	–0,093	600	0,321727	–0,06
  461	0,136047	0,076	607	0,321727	0,139
  188	0,148314	–0,091	608	0,321727	0,139
  202	0,148314	–0,126	622	0,321727	0,153
  603	0,148314	–0,15	183	0,347446	–0,116
  604	0,148314	–0,15	216	0,347446	0,241
  605	0,148314	–0,15	351	0,347446	0,105
  606	0,148314	–0,15	352	0,347446	0,105
  167	0,15475	0,154	353	0,347446	0,105
  289	0,16139	0,069	354	0,347446	0,105
  1	0,168239	0,06	419	0,347446	–0,075
  2	0,168239	0,06	470	0,347446	0,056
  3	0,168239	0,06	471	0,347446	0,056
  299	0,168239	–0,136	9	0,374396	–0,117
  300	0,168239	–0,136	171	0,374396	–0,062
  319	0,168239	0,055	198	0,374396	–0,105
  320	0,168239	0,055	238	0,374396	0,089
  321	0,168239	0,055	239	0,374396	0,089
  191	0,175299	–0,088	285	0,374396	0,122
  192	0,175299	–0,088	585	0,374396	0,066
  193	0,175299	–0,088	156	0,402547	0,075
  194	0,175299	–0,088	157	0,402547	0,075
  253	0,175299	–0,245	158	0,402547	0,075
  262	0,175299	0,131	176	0,402547	–0,092
  566	0,175299	0,122	181	0,402547	–0,071
  357	0,182573	0,071	219	0,402547	0,075
  650	0,182573	0,086	240	0,402547	0,061
  159	0,190064	0,088	284	0,402547	–0,112
  240	0,190064	0,06	305	0,402547	–0,069
  280	0,197774	0,101	319	0,402547	0,064
  534	0,197774	–0,096	320	0,402547	0,064
  614	0,197774	0,086	321	0,402547	0,064
  260	0,205705	0,153	391	0,402547	0,094
  391	0,205705	–0,084	392	0,402547	0,094
  392	0,205705	–0,084	393	0,402547	0,094
  393	0,205705	–0,084	394	0,402547	0,094
  394	0,205705	–0,084	401	0,402547	–0,112
  306	0,21386	0,066	436	0,402547	0,052
  315	0,21386	0,072	589	0,402547	–0,081
  203	0,22224	0,086	590	0,402547	–0,081
  274	0,22224	0,096	591	0,402547	–0,081
  298	0,22224	0,07	633	0,402547	–0,221
  367	0,22224	0,061	45	0,431892	0,081
  390	0,22224	–0,097	46	0,431892	0,081
  466	0,22224	–0,084	47	0,431892	0,081
  533	0,22224	0,07	48	0,431892	0,081
  162	0,230849	0,134	266	0,431892	0,137
  176	0,239686	0,046	267	0,431892	0,159
  356	0,239686	–0,178	277	0,431892	0,078
  551	0,239686	–0,106	290	0,431892	0,177
  212	0,248754	–0,087	395	0,431892	0,041
  358	0,248754	–0,069	396	0,431892	0,041
  254	0,258055	0,108	397	0,431892	0,041
  267	0,258055	0,142	398	0,431892	0,041
  297	0,258055	–0,085	420	0,431892	0,108
  433	0,258055	0,058	421	0,431892	0,108
  234	0,267589	0,079	432	0,431892	0,103
  345	0,267589	0,117	515	0,431892	–0,043
  346	0,267589	0,117	516	0,431892	–0,043
  532	0,267589	–0,092	631	0,431892	–0,077
  473	0,277356	–0,067	4	0,462387	0,052
  474	0,277356	–0,067	5	0,462387	0,052
  538	0,277356	0,087	234	0,462387	–0,071
  539	0,277356	0,087	245	0,462387	0,076
  563	0,277356	–0,067	247	0,462387	0,042
  564	0,277356	–0,067	289	0,462387	0,053
  210	0,287359	0,072	295	0,462387	0,035
  251	0,287359	–0,041	360	0,462387	0,074
  294	0,287359	0,074	361	0,462387	0,074
  429	0,287359	0,062	362	0,462387	0,074
  232	0,297598	–0,114	363	0,462387	0,074
  261	0,297598	0,05	376	0,462387	0,066
  288	0,297598	0,042	441	0,462387	0,08
  154	0,308072	0,093	505	0,462387	–0,1
  236	0,308072	0,08	513	0,462387	–0,086
  252	0,308072	–0,064	546	0,462387	–0,062
  442	0,308072	–0,046	276	0,494013	0,07
  63	0,318782	–0,083	329	0,494013	0,046
  272	0,318782	–0,086	423	0,494013	0,11
  395	0,318782	–0,046	483	0,494013	0,078
  396	0,318782	–0,046	484	0,494013	0,078
  397	0,318782	–0,046	485	0,494013	0,078
  398	0,318782	–0,046	486	0,494013	0,078
  513	0,318782	–0,069	487	0,494013	0,078
  187	0,329728	0,065	488	0,494013	0,078
  244	0,329728	0,051	489	0,494013	0,078
  277	0,329728	–0,089	490	0,494013	0,078
  610	0,329728	0,122	491	0,494013	0,078
  12	0,340909	0,078	492	0,494013	0,078
  13	0,340909	0,078	493	0,494013	0,078
  15	0,340909	–0,073	494	0,494013	0,078
  339	0,340909	–0,109	495	0,494013	0,078
  377	0,340909	0,088	496	0,494013	0,078
  386	0,340909	–0,063	497	0,494013	0,078
  431	0,340909	0,094	498	0,494013	0,078
  242	0,352326	0,037	499	0,494013	0,078
  375	0,352326	0,066	500	0,494013	0,078
  480	0,363976	0,069	630	0,494013	0,154
  481	0,363976	0,069	49	0,526711	–0,051
  482	0,363976	0,069	57	0,526711	0,06
  281	0,375859	–0,072	263	0,526711	0,07
  579	0,375859	–0,089	264	0,526711	0,07
  580	0,375859	–0,089	402	0,526711	–0,04
  4	0,387973	0,067	451	0,526711	0,061
  5	0,387973	0,067	452	0,526711	0,061
  432	0,387973	0,087	527	0,526711	0,06
  190	0,400318	–0,062	570	0,526711	0,06
  343	0,400318	0,058	596	0,526711	0,048
  344	0,400318	–0,054	610	0,526711	–0,14
  418	0,400318	0,057	626	0,526711	–0,073
  538	0,400318	0,062	214	0,56045	–0,04
  539	0,400318	0,062	276	0,56045	0,077
  50	0,412891	–0,057	343	0,56045	–0,065
  51	0,412891	–0,057	509	0,56045	0,079
  52	0,412891	–0,057	510	0,56045	0,079
  53	0,412891	–0,057	511	0,56045	0,079
  54	0,412891	–0,057	512	0,56045	0,079
  55	0,412891	–0,057	542	0,56045	0,032
  56	0,412891	–0,057	543	0,56045	0,032
  163	0,412891	0,057	544	0,56045	0,032
  164	0,412891	0,057	545	0,56045	0,032
  165	0,412891	0,057	571	0,56045	0,046
  166	0,412891	0,057	572	0,56045	0,046
  636	0,412891	0,11	573	0,56045	0,046
  206	0,42569	0,043	574	0,56045	0,046
  282	0,42569	–0,05	8	0,595155	–0,066
  360	0,42569	0,064	347	0,595155	0,037
  361	0,42569	0,064	348	0,595155	0,037
  362	0,42569	0,064	349	0,595155	0,037
  363	0,42569	0,064	380	0,595155	0,067
  582	0,42569	0,05	381	0,595155	0,067
  201	0,438713	–0,052	399	0,595155	0,045
  233	0,451957	0,054	400	0,595155	0,045
  269	0,451957	–0,046	632	0,595155	–0,089
  379	0,451957	–0,066	644	0,595155	0,053
  465	0,451957	0,047	34	0,630785	–0,062
  570	0,451957	–0,043	168	0,630785	0,017
  571	0,451957	0,061	217	0,630785	0,078
  572	0,451957	0,061	283	0,630785	0,032
  573	0,451957	0,061	302	0,630785	–0,029
  574	0,451957	0,061	315	0,630785	–0,034
  585	0,451957	0,06	426	0,630785	0,033
  238	0,465419	–0,047	568	0,630785	0,026
  239	0,465419	–0,047	569	0,630785	0,026
  256	0,465419	0,06	575	0,630785	–0,114
  257	0,465419	0,06	576	0,630785	–0,114
  276	0,465419	–0,054	592	0,630785	0,026
  366	0,465419	0,055	207	0,667254	0,022
  384	0,465419	0,07	221	0,667254	–0,041
  10	0,479097	–0,05	222	0,667254	–0,041
  184	0,479097	0,046	223	0,667254	–0,041
  217	0,479097	–0,04	248	0,667254	0,084
  575	0,479097	–0,1	259	0,667254	0,056
  576	0,479097	–0,1	294	0,667254	0,029
  160	0,492987	0,047	330	0,667254	0,043
  189	0,492987	0,041	331	0,667254	0,043
  220	0,492987	0,059	332	0,667254	0,043
  255	0,492987	0,056	333	0,667254	0,043
  413	0,492987	–0,058	334	0,667254	0,043
  414	0,492987	–0,058	335	0,667254	0,043
  415	0,492987	–0,058	403	0,667254	0,044
  416	0,492987	–0,058	469	0,667254	–0,037
  625	0,492987	0,055	531	0,667254	–0,046
  550	0,507086	–0,071	60	0,704507	0,033
  551	0,507086	–0,071	185	0,704507	–0,019
  557	0,507086	0,035	203	0,704507	–0,074
  558	0,507086	0,035	287	0,704507	0,051
  559	0,507086	0,035	377	0,704507	–0,073
  560	0,507086	0,035	387	0,704507	0,086
  643	0,507086	0,043	388	0,704507	0,086
  17	0,521389	0,048	472	0,704507	–0,031
  198	0,535892	0,044	520	0,704507	–0,014
  533	0,535892	–0,037	521	0,704507	–0,014
  637	0,535892	0,029	533	0,704507	–0,033
  638	0,535892	0,029	547	0,704507	0,039
  639	0,535892	0,029	186	0,742446	–0,02
  640	0,535892	0,029	279	0,742446	0,018
  641	0,535892	0,029	293	0,742446	0,084
  642	0,535892	0,029	301	0,742446	–0,027
  34	0,550592	0,054	357	0,742446	–0,029
  317	0,550592	–0,023	427	0,742446	0,032
  318	0,550592	–0,023	428	0,742446	0,032
  648	0,550592	–0,05	575	0,742446	–0,037
  649	0,550592	–0,05	576	0,742446	–0,037
  284	0,565483	–0,033	648	0,742446	–0,072
  293	0,565483	–0,053	649	0,742446	–0,072
  554	0,565483	–0,023	42	0,78101	–0,022
  60	0,580562	–0,059	155	0,78101	0,022
  478	0,595822	0,042	275	0,78101	0,025
  507	0,595822	0,03	306	0,78101	–0,023
  508	0,595822	0,03	350	0,78101	0,031
  205	0,611259	–0,052	378	0,78101	0,039
  355	0,611259	–0,093	386	0,78101	0,036
  378	0,611259	–0,029	408	0,78101	0,019
  8	0,626866	0,027	409	0,78101	0,019
  303	0,626866	0,036	410	0,78101	0,019
  316	0,626866	–0,019	411	0,78101	0,019
  562	0,626866	0,031	412	0,78101	0,019
  9	0,658572	–0,048	542	0,78101	–0,047
  18	0,674658	–0,025	543	0,78101	–0,047
  216	0,674658	–0,055	544	0,78101	–0,047
  347	0,674658	0,019	545	0,78101	–0,047
  348	0,674658	0,019	650	0,78101	0,029
  349	0,674658	0,019	188	0,82009	0,04
  468	0,674658	0,022	260	0,82009	–0,012
  536	0,674658	–0,036	299	0,82009	–0,043
  11	0,690891	0,039	300	0,82009	–0,043
  434	0,690891	–0,053	307	0,82009	–0,027
  435	0,690891	–0,053	308	0,82009	–0,027
  565	0,690891	–0,033	309	0,82009	–0,027
  172	0,707264	0,025	310	0,82009	–0,027
  173	0,707264	0,025	311	0,82009	–0,027
  174	0,707264	0,025	344	0,82009	0,028
  224	0,707264	0,024	418	0,82009	0,026
  246	0,707264	0,037	548	0,82009	–0,027
  271	0,723771	–0,021	549	0,82009	0,018
  171	0,740405	–0,018	554	0,82009	0,011
  567	0,740405	–0,022	598	0,82009	0,031
  586	0,757158	–0,019	11	0,859616	–0,011
  419	0,774024	–0,017	16	0,859616	–0,025
  66	0,790995	–0,012	246	0,859616	0,044
  447	0,790995	0,021	340	0,859616	0,027
  448	0,790995	0,021	480	0,859616	–0,018
  449	0,790995	0,021	481	0,859616	–0,018
  450	0,790995	0,021	482	0,859616	–0,018
  514	0,790995	–0,014	547	0,859616	–0,009
  548	0,790995	0,021	603	0,859616	0,025
  268	0,808064	–0,017	604	0,859616	0,025
  16	0,825223	0,018	605	0,859616	0,025
  209	0,825223	–0,018	606	0,859616	0,025
  241	0,825223	–0,016	627	0,859616	0,012
  437	0,825223	0,017	643	0,859616	0,013
  502	0,825223	–0,016	154	0,899475	–0,033
  503	0,825223	–0,016	169	0,899475	–0,022
  266	0,842464	0,032	179	0,899475	0,002
  374	0,859779	–0,008	180	0,899475	0,002
  644	0,859779	0,02	195	0,899475	0,033
  185	0,877161	–0,013	561	0,899475	0,014
  417	0,877161	0,01	614	0,899475	–0,012
  583	0,877161	–0,007	634	0,899475	0,032
  584	0,877161	–0,007	63	0,93959	–0,007
  279	0,8946	–0,013	190	0,93959	–0,022
  287	0,91209	–0,011	206	0,93959	0,011
  336	0,91209	–0,01	212	0,93959	0,028
  155	0,929622	–0,024	417	0,93959	–0,006
  169	0,929622	–0,013	536	0,93959	0,037
  178	0,929622	0,006	597	0,93959	0,009
  181	0,929622	0,009	160	0,979843	0,006
  368	0,929622	–0,024	172	0,979843	0,002
  369	0,929622	–0,024	173	0,979843	0,002
  370	0,929622	–0,024	174	0,979843	0,002
  371	0,929622	–0,024	241	0,979843	0,017
  372	0,929622	–0,024	273	0,979843	0,005
  373	0,929622	–0,024	477	0,979843	0,003
  58	0,964777	0,007	537	0,979843	0,01
  59	0,964777	0,007	557	0,979843	–0,001
  359	0,964777	0,005	558	0,979843	–0,001
  534	0,964777	–0,003	559	0,979843	–0,001
  18	0,982384	–0,002	560	0,979843	–0,001
  477	0,982384	0,003	611	0,979843	–0,011
  285	1	–0,002	612	0,979843	–0,011
  455	1	0,002	623	0,979843	0,003
  575	1	0,001	269	1	0
  576	1	0,001	553	1	–0,005

• Beispiel 2: Aufstellung eines Klassifikators zur Identifizierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mittels Real-Time-PCR
• Messung der Genexpression
• Es wurden Patienten mit Pneumonie bzw. Peritonitis als typische Sepsis-Vertreter und im Fall der SIRS Patienten mit einer schweren Herz-OP ausgewählt (Cardiopulmonaler Bypass, CPB), da diese den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen (siehe Tab. 9). Die Patienten wurden retrospektiv von einem Ärzte-Team der Uni-Klinik Jena in ihrer Diagnose validiert.
• Aus dem Blut der Patienten wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese wurde im Assay als Templat eingesetzt. Tabelle 9: Liste der untersuchten Patienten

  Patienten-ID	Sepsis		SIRS
  	Peritonitis	Pneumonie
  714	X
  6008	X
  6009	X
  6025	X
  6035	X
  6040	X
  6046	X
  6062	X
  6065	X
  6073	X
  6075	X
  6084	X
  6032		X
  6048		X
  6063		X
  6070		X
  6085		X
  6104		X
  6141		X
  814			X
  8001			X
  8002			X
  8009			X
  8010			X
  8012			X
  8068			X
  8096			X
  8102			X
  8111			X
  8112			X
  8116			X

• Die Marker zur Klassifizierung (Tab. 10) wurden aus dem Biomarkerpool (siehe Beispiel 1) ausgewählt und zeigen starke differenzielle Genexpression in Patientengruppen mit und ohne diagnostizierte Sepsis.
• Zur Quantifizierung von Genexpression sind verschiedene Methoden verfügbar. Relative Quantifizierung von Genexpression bedeutet eine Aussage zur Abundanz des Targettranskriptes beispielsweise bezogen auf einen Kalibrator. Das kann ein aus den Expressionswerten konstant exprimierter Gene (sog. Referenzgene oder Housekeepinggene) ermittelter Bezugswert sein. Für jeden Organismus und jedes Gewebe sind solche Referenzgene spezifisch und müssen für die jeweilige Studie sorgfältig ausgewählt werden. Ausgehend von den Genexpressionsprofilen aus dem Vollblut der Sepsis- und Kontrollpatienten wurden die stabilsten Gene mit der geringsten Variabilität ausgewählt und in der quantitativen PCR zur Normalisierung eingesetzt. Tabelle 10: Markergene, die für die Klassifizierung verwendet wurden

  Marker	Beschreibung (NCBI-Datenbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
  BZRP	Benzodiazepine receptor
  CD82	CD82 molecule
  CD59	CD59 molecule
  FGL2	Fibrinogen-related protein
  HLA-DPA1	Major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1
  CPVL	Carboxypeptidase vitellogenetic-like gene
  MME	Metallomembrane endopeptidase
  IL7R	Interleukin 7 receptor
  CCR2	Chemokine (C-C motif) receptor 2
  EPC1	Enhancer of polycomb homolog 1 (Primerpaar 6)
  KIAA0146
  C4orf18	Chromosome 4 open reading frame 18
  MON2	= KIAA1040, MON2 homolog
  NSMAF	Neutral sphingomyelinase (N-SMase) activation associated factor
  TLR5	Toll-like receptor 5
  CLU	Clusterin
  IGKCem	Immunglobulin kappa constant
  ZFANDA	Zinc finger AN-type domain 2A
  UBC (housekeeper)	Ubiquitin
  ITGAL (housekeeper)	Integrin, alpha L
  SNAPC (housekeeper)	Small nuclear RNA activating complex
  IL18 (housekeeper)	Interleukin 18
  CASP8 (housekeeper)	Caspase 8

• Tab. 11 ist eine Liste der in der Real-Time PCR verwendeten Primer und deren Seq IDs. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich, die Tabelle stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar. Tabelle 11: Liste der verwendeten Primer. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich.

  Marker und Referenzgene	Primer für quantitative PCR (Seq ID)
  BZRP (Seq ID 601, 602)	Forward	687
  	Reverse	688
  CD82 (Seq ID 470, 471)	Forward	689
  	Reverse	690
  CD59 (Seq ID 571, 572, 573, 574)	Forward	691
  	Reverse	692
  FGL2 (Seq ID 615)	Forward	693
  	Reverse	694
  HLA-DPA1 (Seq ID 613)	Forward	695
  	Reverse	696
  CPVL (Seq ID 619, 620)	Forward	697
  	Reverse	698
  MME (Seq ID 443, 444, 445, 446)	Forward	699
  	Reverse	700
  IL7R (Seq ID 541)	Forward	701
  	Reverse	702
  CCR2 (Seq ID 529, 530)	Forward	703
  	Reverse	704
  EPC1 (Seq ID 280)	Forward	705
  	Reverse	706
  KIAA0146 (Seq ID 261)	Forward	707
  	Reverse	708
  C4orf18 (Seq ID 611, 612)	Forward	709
  	Reverse	710
  MON2 (Seq ID 248)	Forward	711
  	Reverse	712
  NSMAF (Seq ID 527)	Forward	713
  	Reverse	714
  TLR5 (Seq ID 431)	Forward	715
  	Reverse	716
  CLU (Seq ID 575, 576)	Forward	717
  	Reverse	718
  IGKCem (Seq ID 401)	Forward	719
  	Reverse	720
  ZFANDA (Seq ID 290)	Forward	721
  	Reverse	722
  UBC (Seq ID 678)	Forward	723
  	Reverse	724
  ITGAL (Seq ID 676, 677)	Forward	725
  	Reverse	726
  SNAPC (Seq ID 679)	Forward	727
  	Reverse	728
  IL18 (Seq ID 680)	Forward	729
  	Reverse	730
  CASP8 (Seq ID 681, 682, 683, 684, 685, 686)	Forward	731
  	Reverse	732

• Experimentelle Ausführung
• Blutabnahme und RNA-Isolation:
• Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen und die RNA isoliert.
• Reverse Transkription:
• Von jeder Patienten-Probe wurden 4 μg der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) in einem 20 μl-Ansatz (enthält 1 μl 10 mM dNTP-Mix von Fermentas und 1 μl 0,5 μg/μl Oligo(dT)-Primer) umgeschrieben. Die RNA wurde anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden nicht aufgereinigt, sondern mit Wasser auf 50 μl aufgefüllt.
• Real-Time-PCR
• Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG-Kit der Firma Invitrogen. Die Patienten-cDNA wurde 1:100 mit Wasser verdünnt und davon jeweils 1 μl in die PCR eingesetzt. Es wurde pro Marker eine PCR-Platte (BIORAD) mit allen 31 Patienten und No-Template-Controls (NTC) in 3-facher Ausführung pipettiert.

  PCR-Ansatz pro well (10 μl)	2 μl Templat-cDNA 1:100
  	1 μl forward primer, 10 mM
  	1 μl reverse primer, 10 mM
  	1 μl Fluorescein Reference Dye
  	5 μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG

• Es wurde ein Mastermix ohne Templat hergestellt, dieser wurde in 9 μl-Aliquots in die PCR-Platte gesteppt und dazu wurden jeweils die Patienten-cDNAs pipettiert.
• Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:

  
• Verwendet wurde das iQ^TM5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware. Die Ergebnisse eines solchen qPCR-Laufs sind in 9 gezeigt. Mit Hilfe der Auswertungssoftware wurden für jeden der 18 Marker und 5 Housekeeper solche Abbildungen generiert, aus denen sich dann die entsprechenden Ct-Werte ableiten ließen. Die Ct-Werte werden vom Programm automatisch im Bereich des linearen Anstiegs der Kurven berechnet. Im Beispiel von EPC1 lagen die Ct-Werte für die Sepsis-Patienten im Bereich von 25,08–27,71 und für die SIRS-Patienten im Bereich von 28,08–35,91.
• Datenanalyse:
• Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version 2.6.1 durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht.
• Daten-Vorverarbeitung:
• Die gemessenen Expressionssignale wurden im Excel-Format abgespeichert und über die 3-fach-Bestimmungen gemittelt. Der Marker MON2 mit 15 fehlenden Werten und die Patienten 6065 und 8111 mit 13 bzw. einem fehlenden Wert wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Damit enthielt der Trainingsdatensatz 18 infektiöse (62%) und 11 nicht infektiöse (38%) Proben. Zum Normalisieren wurden aus den 5 gemessenen die 3 stabilsten Housekeepergene bestimmt. Anschließend wurde für jeden Patienten wurde der Mittelwert der 3 ausgewählten Housekeeper-Gene von den Marker-Genen subtrahiert.
• Klassifikation:
• Um die Gen-Marker nach ihrer Trennungsgüte anzuordnen, wurde der Wilcoxon Ranksummen-Test durchgeführt, in dem die Patientengruppen mit und ohne eine infektiöse Komplikation verglichen wurden. Danach wurden Gene mit p < 0.001 nach dem Hodge-Lehmann-Schätzer angeordnet, die restlichen nach dem p-Wert selbst.
• Für die Klassifikation wurde die lineare Diskriminanzanalyse [Hastie et al., 2001] mit einer einfachen Kreuzvalidierung verwendet. Die Berechnung erfolgte unter der Verwendung der Funktion lda aus der R-Bibliothek MASS. Für p Marker wurden die Gewichte (w₀, ..., w_p) der Diskriminanzfunktion f_LD, die durch die Formel

  

  definiert ist, aus den Trainingsdaten berechnet, wobei nacheinander eine Probe weggelassen wurde. Diese Probe wurde nachhinein klassifiziert, wofür in der vorangegangenen Formel für x_l die Ct-Werte der Probe eingesetzt wurden. Die Gewichte der Diskriminanzfunktion wurden so berechnet, dass ein positiver Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation bedeuten. Die Klassifikationsprozedur wurde für eine aufsteigende Anzahl von Markern wiederholt.
• Anschließend wurde die Vorgehensweise für alle Trainingsdaten durchgeführt und zwei weiteren unabhängigen Proben wurden klassifiziert. Die Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion für die aufsteigende Anzahl der Marker und die zugehörigen Score-werte für die unabhängigen Proben 790 und 933 (die grau unterlegten Werte wurden in 12 graphisch dargestellt) sind in Tab. 12 zusammengefasst.
• Ergebnisse
• Bei der Klassifikation wurden zuerst die 2 besten Marker verwendet, danach wurde schrittweise der nächste Marker zugefügt. Bei der einfachen Kreuzvalidierung wurde in fast allen Fällen keine Probe falsch klassifiziert. Lediglich bei der Verwendung von 13, 14 und 17 Markern wurde bei der einfachen Kreuzvalidierung eine nicht infektiöse Probe falsch klassifiziert. Damit wurden eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 91% für den Trainingsdatensatz erreicht.
• Die zwei unabhängigen Proben 933 und 790 wurden beide überwiegend korrekt klassifiziert. Für die korrekte Klassifikation (d. h. einen negativen Score-Wert) der nicht-infektiösen Probe 933 benötigte man 2 und mehr Marker. Für die infektiöse Probe 790 benötigte man 6 und mehr Marker-Gene, um einen positiven Score-Wert zu erreichen (vgl. Tab. 12). Die Klassifikation wurde mit mehr als 14 Markern instabil. In 10 sind die Score-Werte für die Klassifikation mit 12 Markern für die Proben 933 und 790 abgebildet. Es wird eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-Wertes und die Einteilung in 4 Bereiche gezeigt. Liegt der berechnete Score über 6,5, so hat der Patient mit einer 95%igen Wahrscheinlichkeit eine Sepsis (infektiös). Liegt der Score unter –6,5, so ist die Wahrscheinlichkeit, keine Sepsis zu haben, für den Patienten ebenfalls 95% (nicht infektiös). Auf diese Skala wurde das Klassifikationsergebnis für 12 Marker für zwei vom Klassifikationsdatensatz unabhängige Testproben projiziert. Der Score der Probe 933 nahm den Wert von –36,58 an und der Patient wurde als nicht infektiös klassifiziert; der Score der Probe 790 nahm den Wert von 7,44 an und wurde als infektiös klassifiziert.
• Die Experimente lieferten Expressionssignale in guter Qualität, so dass die zugehörige Datenmatrix zur Aufstellung des Klassikators verwendet werden konnte. Mittels der gemessenen Signale konnten die Trainingsdaten nach der infektiösen Komplikation so gut wie vollständig getrennt werden. Ebenfalls 2 unabhängige Testdaten wurden richtig klassifiziert. Für eine robuste Klassifikationsgüte im Trainings- und Testdatensatz benötigte man 6 bis 14 Klassifikationsmarker.
• Tab. 13a zeigt die Rohdaten (Ct-Werte) aus den qPCR-Assays, wobei in Tab. 13b die Gewichte der linearen Diskriminanzfunktion für aufsteigende Anzahl von Markern und die zugehörigen Score-Werte für die unabhängigen Proben 790 und 933 gezeigt sind.
• 
• 
• 
• Beispiel 3: Aufstellung eines Klassifikators zur Identifizierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mittels konventioneller PCR
• Messung der Genexpression
• Es wurden Patienten mit Pneumonie bzw. Peritonitis als typische Sepsis-Vertreter und im Fall der SIRS Patienten mit einer schweren Herz-OP ausgewählt (Cardiopulmonaler Bypass, CPB), da diese den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen (siehe Tab. 14).
• Aus dem Blut der Patienten wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese wurde im Assay als Template eingesetzt. Tabelle 14: Liste der untersuchten Patienten

  Patienten-ID	Sepsis		SIRS
  	Peritonitis	Pneumonie
  714	X
  6008	X
  6009	X
  6025	X
  6035	X
  6040	X
  6046	X
  6062	X
  6065	X
  6073	X
  6075	X
  6084	X
  6032		X
  6048		X
  6063		X
  6070		X
  6085		X
  6104		X
  6141		X
  814			X
  8001			X
  8002			X
  8009			X
  8010			X
  8012			X
  8068			X
  8096			X
  8102			X
  8111			X
  8112			X
  8116			X

• Die Marker zur Klassifizierung wurden aus dem Biomarkerpool (siehe Beispiel 1) ausgewählt und zeigen starke differenzielle Genexpression in Patientengruppen mit und ohne diagnostizierte Sepsis.
• Tab. 15 enthält eine Auflistung der Genprodukte der Genexpressionsmarker, die für die Klassifizierung verwendet wurden, sowie ihre Beschreibung. Tab. 16 ist eine Liste der in der PCR verwendeten Primer und die dazugehörigen Seq-IDs. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich, die Tabelle stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar. Tabelle 15: Genprodukte der Genexpressionsbiomarker, die für die Klassifizierung verwendet wurden, sowie ihre Beschreibung

  Marker	Beschreibung (NCBI-Datenbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
  BZRP	Benzodiazepine receptor
  CD82	CD82 molecule
  FGL2	Fibrinogen-related protein
  HLA-DPA1	Major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1
  CPVL	Carboxypeptidase vitellogenetic-like gene
  MME	Metallomembrane endopeptidase
  IL7R	Interleukin 7 receptor
  CCR2	Chemokine (C-C motif) receptor 2
  EPC1	Enhancer of polycomb homolog 1
  KIAA0146
  C4orf18	Chromosome 4 open reading frame 18
  MON2	= KIAA1040, MON2 homolog
  NSMAF	Neutral sphingomyelinase (N-SMase) activation associated factor
  TLR5	Toll-like receptor 5
  CLU	Clusterin
  UBC (Referenzgen)	Ubiquitin
  ITGAL (Referenzgen)	Integrin, alpha L
  SNAPC (Referenzgen)	Small nuclear RNA activating complex

  Tabelle 16: Liste der verwendeten Primer. Für jede Zielsequenz sind mehrere Primerkombinationen möglich, die Tabelle stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar.

  Marker und Referenzgene	Primer für quantitative PCR
  BZRP (Seq ID 601, 602)	forward	687
  	reverse	688
  CD82 (Seq ID 470, 471)	forward	689
  	reverse	690
  FGL2 (Seq ID 615)	forward	693
  	reverse	694
  HLA-DPA1 (Seq ID 613)	forward	695
  	reverse	696
  CPVL (Seq ID 619, 620)	forward	697
  	reverse	698
  MME (SEQ ID 443, 444, 445, 446)	forward	699
  	reverse	700
  IL7R (Seq ID 541)	forward	701
  	reverse	702
  CCR2 (Seq ID 529, 530)	forward	703
  	reverse	704
  EPC1 (Seq ID 280)	forward	705
  	reverse	706
  KIAA0146 (Seq ID 261)	forward	707
  	reverse	708
  C4orf18 (Seq ID 611, 612)	forward	709
  	reverse	710
  MON2 (Seq ID 248)	forward	711
  	reverse	712
  NSMAF (Seq ID 527)	forward	713
  	reverse	714
  TLR5 (Seq ID 431)	forward	715
  	reverse	716
  CLU (Seq ID 575, 576)	forward	717
  	reverse	718
  UBC (Seq ID 678)	forward	723
  	reverse	724
  ITGAL (Seq ID 676, 677)	forward	725
  	reverse	726
  SNAPC (Seq ID 679)	forward	727
  	reverse	728

• Experimentelle Ausführung
• Blutabnahme und RNA-Isolation:
• Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen und die RNA isoliert.
• Reverse Transkription:
• Von jeder Patienten-Probe wurden 4 μg der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) in einem 20 μl-Ansatz (enthält 1 μl 10 mM dNTP-Mix von Fermentas und 1 μl 0,5 μg/μl Oligo(dT)-Primer) umgeschrieben. Die RNA wurde anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden nicht aufgereinigt, sondern mit Wasser auf 50 μl aufgefüllt.
• PCR:
• Die Patienten-cDNA wurde 1:500 (bzw. bei 4 Markern 1:50, SNAPC, EPC1, KIAA0146 und MON2) mit Wasser verdünnt und davon jeweils 1 μl in die PCR eingesetzt. Es wurde pro Marker eine PCR-Platte (96 wells, Nerbe Plus) mit allen 31 Patienten und No-Template-Controls (NTC) in 3-fach-Bestimmung pipettiert.

  PCR-Ansatz pro well (13 μl)	1 μl Templat cDNA 1:500 oder 1:50
  	0,5 μl forward primer, 10 mM
  	0,5 μl reverse primer, 10 mM
  	1,3 μl 10 × Puffer I
  	0,05 μl Accuprime Taq-Polymerase
  	9,7 μl Wasser

• Es wurde ein Mastermix ohne Templat hergestellt, dieser wurde in 12 μl-Aliquots in die PCR-Platte gesteppt und dazu wurden jeweils die Patienten-cDNA pipettiert (siehe Zusammensetzung des PCR-Reaktionsansatzes).
• Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:

  
• Verwendet wurde ein Mastercycler Gradient der Firma Eppendorf.
• Detektion der PCR-Produkte:
• Es wurde eine 1,1-fache SYBR Green-Lösung hergestellt. Dazu wurden zu 8,9 ml Wasser 100 μl einer 100 × SYBR Green-Stammlösung (hergestellt aus einer 10.000 × SYBR Green-Stammlösung der Firma BMA, BioWhittaker Molecular Applications) pipettiert und gemischt. Im Anschluß an die PCR wurden von dieser Lösung je 90 μl in jeden PCR-Ansatz gegeben und dieses Gemisch dann in eine schwarze Platte (96 wells, Greiner) überführt. Im Anschluß daran wurde diese Platte in einem Fluoreszenz-Meßgerät (TECAN GENios) bei 485 nm Anregungswellenlänge/535 nm Emmissionswellenlänge gemessen.
• Datenanalyse:
• Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version 2.6.1 durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht.
• Daten-Vorverarbeitung:
• Die gemessenen Expressionssignale (siehe Tab. 16) wurden im Excel-Format abgespeichert, über die 3-fach-Bestimmungen gemittelt und für jeden Marker wurden die NTC-Werte abgezogen. Patient 6065 mit 15 fehlenden Werten wurde aus der Analyse ausgeschlossen. Einzelne fehlende Werte wurden mit dem knn-Algorithmus ersetzt (dafür wurde die Funktion pamr.knnimpute aus der R-Bibliothek pamr verwendet). Die gemittelten Signale wurden log-2 transformiert. Zum Normalisieren wurde für jeden Patienten von den zugehörigen Marker-Genen der Mittelwert der 3 Housekeepergene subtrahiert.
• Klassifikation:
• Um die Genmarker nach ihrer Trennungsgüte anzuordnen, wurde der Wilcoxon Ranksummen-Test durchgeführt, in dem die Patientengruppen mit und ohne eine infektiöse Komplikation verglichen wurden. Danach wurden Gene mit p < 0.001 nach dem Hodge-Lehmann-Schätzer angeordnet, die restlichen nach dem p-Wert selbst.
• Für die Klassifikation wurde die lineare Diskriminanzanalyse [Hastie et al., 2001] verwendet (für die Berechnung wurde die Funktion lda im R-Packet MASS genutzt). Die geschätzten Gewichte (w₀, w₁, ..., w_p) der linearen Diskriminanzfunktion f_LD mit p Markern wurden in Tab. 17 zusammengefasst. Für eine Messung mit den Werten (x₁, ..., x_p) wurde der zugehörige Score nach der Formel

  

  berechnet. Ein positiver Wert der Funktion führte zu einer Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion zu einer Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation.
• Im ersten Schritt wurde die Trennbarkeit des Trainingsdatensatzes mittels einfacher Kreuzvalidierung geprüft. Anschließend wurden zwei unabhängige Proben klassifiziert, von jeweils einer der beiden untersuchten Patienten-Gruppen (Patient 933 und 790). Dafür wurden die Roh-Messsignale in gleicher Weise vorverarbeitet wie die Trainingsdaten.
• Ergebnisse
• Die Anordnung der Gene und die zugehörigen Werte sind in 11 zusammengefasst. Es werden die Expressionsunterschiede zwischen den Gruppen: Boxplots der 15 Marker erstellt aus 31 Patienten-Proben (19 mit Sepsis-Diagnose, 12 mit SIRS) dargestellt. Mittels der Boxplots wurde Gen für Gen die Verteilung der Ct-Werte pro Gruppe dargestellt. Diese Ct-Werte wurden von jeder Patientenprobe mittels Real-Time PCR an der cDNA der Patienten (Biorad IQ5) generiert und über die Ct-Werte von drei Referenzgenen normalisiert. An der x-Achse sind der p-Wert und der Hodge-Lehmann-Schätzer des Wilcoxon Rank-Summen-Tests angegeben. Bei der Klassifikation wurden bei der einfachen Kreuzvalidierung 1 eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 83% erreicht, was einer Falschklassifikation von 2 nicht infektiösen Proben entspricht.
• Die zwei unabhängigen Proben wurden beide korrekt klassifiziert. 12 zeigt eine schematische Darstellung des abgeleiteten Score-Wertes und die Einteilung in 4 Bereiche. Liegt der berechnete Score über 6,5, so hat der Patient mit einer 95%igen Wahrscheinlichkeit eine Sepsis. Liegt der Score unter –6,5, so ist die Wahrscheinlichkeit, keine Sepsis zu haben, für den Patienten ebenfalls 95%. Auf diese Skala wurde das Klassifikationsergebnis projiziert. Der Score der Probe 933 nahm den Wert von –38,7 an und wurde als nicht infektiös klassifiziert; der Score der Probe 790 nahm den Wert von 9,1 an und wurde als infektiös klassifiziert.
• Tab. 18a enthält die Rohdaten aus den Fluoreszenzmessungen mit SYBR Green am TECAN GENios. Tab. 18b zeigt die Rohdaten der unabhängigen Patienen-Proben sowie die Legende für die Gennamen und deren Zuordnung zu den SeqIDs. Tabelle 17: Koeffizienten der linearen Diskriminanzfunktion

  Bezeichnung	Seq ID	Wert
  w0	-	5,16
  w1	601, 602	–34,31
  w2	443, 445, 446, 446	0,72
  w3	615	–1,93
  w4	613	–1,30
  w5	619, 620	–11,25
  w6	541	1,03
  w7	529, 530	28,05
  w8	261	3,31
  w9	280	3,42
  w10	611, 612	–1,91
  w11	248	1,61
  w12	470, 471	–9,74
  w13	527	4,03
  w14	431	–13,20
  w15	575, 576	27,28

• 
• 
• Beispiel 4: Erregertyp-Gram⁺ vs. Gram^–-Differenzielle Genexpression in septischen Patienten mit gram-negativen und gram-positiven Sepsiserregern sowie Identifizierung und partielle Validierung der Biomarkerkandidaten für eine diagnostische Anwendung.
• In genomweiten Genexpressionsanalysen auf Mikroarrayplattformen wurden Biomarker identifiziert, welche in septischen Patienten mit Infektionen gram-negativer und gram-positiver Bakterien unterschiedlich stark exprimiert werden. Ausgehend von dieser Biomarkerliste mit 114 Markern wurde für drei Marker gezeigt, dass sich diese Genexpressionsunterschiede mittels quantitativer PCR darstellen lassen. Für diese 3 Marker wurden genspezifische Primer identifiziert und ihre Genaktivität mittels quantitativer PCR bestimmt.
• Messung der Genexpression
• Auswahl des Patientenkollektivs:
• Aus der umfangreichen Patientendatenbank wurden Patientengruppen mit nachgewiesener (Identifizierung durch Blutkultur) gram-negativer und gram-positiver Infektion ausgewählt. Die für die Untersuchungen ausgewählten Patienten litten alle unter einer schweren Sepsis bzw. Septischem Schock. Die Sepsis ging in den meisten Fällen von einer Pneumonie (Lungenentzündung) oder einer Tracheobronchitis (Entzündung der Bronchien) aus (siehe Tab. 19). Tabelle 19: Liste der untersuchten Patienten. Nicht unterlegt: Patienten mit gram-negativer Infektion; hellgrau unterlegt: Patienten mit gram-positiver Infektion.

  	Einordnung	Infektionsherd (Fokus bei Sepsis)
  6104.001	Schwere Sepsis	Pneumonie (wahrscheinlich)
  7120.005	Septischer Schock	Pneumonie (definitiv); Intraabdominelle Infektion (wahrscheinlich)
  6058.001	Schwere Sepsis	Pneumonie (definitiv)
  6047.003	Schwere Sepsis	Pneumonie (wahrscheinlich); Tracheobronchitis (wahrscheinlich)
  6103.001	Septischer Schock	Pneumonie (wahrscheinlich)
  7023.001	Septischer Schock	Pneumonie (wahrscheinlich)
  7040.001	Septischer Schock	tiefe chir. Wundinfektion (definitiv); Pneumonie (wahrscheinlich)
  1015.002	Septischer Schock	Pneumonie (definitiv)
  6070.002	Schwere Sepsis	Pneumonie (wahrscheinlich); Tracheobronchitis (wahrscheinlich)

• Diese Patienten wurden in einer pangenomischen Genexpressionsstudie auf der Illumina-Plattform (www.Illumina.com) analysiert.
• Durchführung Genexpressionsanalyse auf Illumina-Plattform:
• Für die Illumina-Probenvorbereitung wird der „Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit” von Ambion (Ambion, USA) nach den darin enthaltenen Vorschriften verwendet. Die Vorbereitung der Hybridisierung erfolgt mit dem „Illumina Gene Expression System”.
• Die einzelnen Schritte sind nachfolgend prinzipiell beschrieben:
• • Reverse Transkription (Erststrang cDNA-Synthese)
• Es werden 50–500 ng RNA in ein Microzentrifugenröhrchen geben und auf 11 μl mit Nuklease-freiem Wasser aufgefüllt.
• Folgender Reaktionsmix wird zusammenpipettiert:

  1 μl	T7 Oligo (dT) Primer
  2 μl	10X First Strand Buffer
  4 μl	dNTP Mix
  1 μl	RNase Inhibitor
  1 μl	Array Script

• Von dem Mix werden 9 μl zur RNA-Probe gegeben und anschließend 2 Stunden bei 42°C inkubiert. An den Poly-A-Überhang am 3' Ende der mRNA lagert sich das T7 Oligo(dT)-Nukleotid komplementär an, sodass die mRNA unabhängig von ihrer Sequenz mit Hilfe von ArrayScript in cDNA umgeschrieben wird. Nach den 2 Stunden Inkubation wird das Reaktionsgefäß wieder auf Eis gelegt.
• • Illumina: Zweitstrang cDNA-Synthese
• Folgender Reaktionsmix wird auf Eis vorbereitet:

  63 μl	Nuclease free H2O
  10 μl	10X Second Strand Buffer
  4 μl	dNTP Mix
  2 μl	DNA Polymerase
  1 μl	RNase H

• Zu der Probe werden 80 μl vom Zweitstrang cDNA-Reaktionsmix gegeben und anschließend wird 2 Stunden bei 16°C im Thermocycler inkubiert. Während der Zweitstrangsynthese durch DNA-Polymerase wird gleichzeitig die RNA durch RNase H abgebaut.
• • In Vitro Transkription (IVT, zur cRNA-Synthese)
• Bei Raumtemperatur wird folgender Mix vorbereitet:

  2,5 μl	T7 10X Reaction Buffer
  2,5 μl	T7 Enzyme Mix
  2,5 μl	Biotin NTP Mix

• Der angesetzte Mix wird zur Probe gegeben und 14 h Stunden inkubiert. Der T7 Enzyme Mix enthält T7 RNA Polymerase, eine hoch Promotor-spezifische RNA-Polymerase, die ein DNA-Template benötigt. Das T7 Oligo(dT)-Nukleotid, welches für die Reverse Transkription verwendet wird, verfügt über eine T7-Promotor Sequenz, welche nun von der T7 RNA Polymerase erkannt wird. Es werden cRNA-Stränge (= Antisense RNA) synthetisiert, welche biotinyliertes UTP enthalten. Die In Vitro Transkription ist somit ein Amplifikations- und Markierungsschritt in einem. Anschließend an die Inkubation wird 75 μl Nuklease-freies Wasser hinzugegeben.
• Aufreinigung:
• Nach der Zweitstrang-cDNA-Synthese folgt ein Aufreinigungsschritt, durch welchen RNA, Primer, Enzyme und Salz entfernt werden. Ein weiterer Aufreinigungsschritt nach der In Vitro Transkription entfernt Enzyme, Salz, sowie nicht eingelagerte Nukleotide.
• Die Aufreinigung erfolgt über cDNA bzw. cRNA Filter Kartuschen, an welchen die Nukleinsäuren mittels cDNA- bzw. cRNA-Bindepuffer gebunden werden. Nach der Zugabe des Waschpuffers werden die Filterkartuschen trocken zentrifugiert und die Nukleinsäure wird mit RNase freiem Wasser in ein neues Reaktionsgefäß eluiert.
• Hybridisierung:
• Die Hybridisierung der cRNA an genspezifische Oligonukleotidsonden erfolgt auf sog. Beadarrays, welche auf Trägern, den Beadchips, angeordnet sind. Die benötigten Puffer, Lösungen und Hybridisierungskammern werden vom Hersteller in Form des Bead-Chip-Kits zur Verfügung gestellt (HumanWG-6 BeadChip-Kit, Illumina, www.illumina.com).
• 1,5 μg der jeweiligen cRNA-Probe wird auf 10 μl mit RNase freiem Wasser aufgefüllt. Zu der Probe werden 20 μl GEX-HYB-Lösung hinzugefügt. In die Befeuchtungspufferreservoirs der Hybridisierungskammer werden 200 μl GEX-HCB eingefüllt und die Bead Chips (Human WG-6 BeadChip, Illumina, www.illumina.com) werden in die Hybridisierungskammer eingesetzt. 30 μl Probe wird auf die Probenöffnung des Arrays aufgetragen. Die Hybridisierungskammer wird sorgfältig verschlossen und die Proben werden 16–20 Stunden bei 58°C inkubiert.
• Die Bead Chips werden in E1BC Waschlösung eingetaucht und im High-Temp Puffer bei 55°C gewaschen. Anschließend erfolgen ein Waschschritt bei Raumtemperatur mit E1BC-Lösung, ein Ethanolwaschschritt und ein weiterer Waschschritt mit E1BC. Es folgt ein Blockierschritt mit Block E1 Puffer und ein Markierungsschritt mit Block E1 + Streptavidin-Cy3, bei dem an die biotinylierten Nukleotide der cRNA das fluoreszenzmarkierte Streptavidin bindet. Es wird nochmals mit E1BC Puffer gewaschen und anschließend wird der Bead Chip durch Zentrifugation getrocknet (2 min bei 500 rpm). Anschließend kann der Bead Chip mit dem Bead Array Reader (Illumina Beadstation 500, www.illumina.com) eingescannt werden.
• Auswertung der Microarray-Daten:
• Mit dem Beadarray Reader wird der Bead Chip fluorometrisch ausgelesen. Der Scanner hat eine Auflösung von 0,8 μm und somit wird von jedem der 48687 auf einem Array platzierten Beadtypen die Fluoreszenz an mindestens 9 Pixeln gemessen. Jeder Beadtyp liegt in mindestens 5facher Redundanz vor. Mit dem von Illumina zur Verfügung gestellte Programm Bead Studio 2.0 werden die Fluoreszenzwerte eines Beadtypen gemittelt und als „Average Signal” ausgegeben. Neben den Beads, die als Sonde für humane Gentranskripte dienen, gibt es auch Beadtypen, die als Negativ-Kontrollen wirken. Deren Sequenzen hybridisieren nicht mit Transkripten aus dem Human-Genom.
• Mit Hilfe dieser Kontrollbeads wird das Hintergrundsignal ermittelt, welches von jedem gemittelten Signal abgezogen wird. Außerdem wird mit den Negativ-Kontrollen der Detektions-p-Wert jedes einzelnen Beadtypen ermittelt, der eine Auskunft darüber gibt, ob es sich um ein echtes Signal handelt oder ob die gemessene Intesität dem Hintergrund entspricht. Für die weiterführende Analyse werden nur die Beadtypen verwendet, bei denen mindestens einer der zehn Arrays einen Detektions-p-Wert unter 0,01 erreicht hat.
• Für die Korrektur der systematischen Messfehler wurde die vom Datenverarbeitungsprogramm Bead Studio 2.0 (Bestandteil der Illumina Beadstation 500) vorgeschlagene Normalisierung mittels Cubic Splines gewählt. Entsprechend der Empfehlungen [MAQC-Consortium, 2006] wurden zusätzlich folgende Korrekturschritte zugefügt. Die Daten wurden mit der Statistiksoftware weiter bearbeitet (http://www.r.project.org). Aus allen für die weitere Analyse ausgewählten Beadtypen wird der kleinste gemittelte Signal-Wert ermittelt. Dieses Minimum wird von jedem gemittelten Signal subtrahiert, so dass nun das kleinste gemittelte Signal den Wert 0 annimmt. Zu jedem gemittelten Signal wird außerdem die Konstante 16 addiert, bevor zur Basis 2 logarithmiert wird. Nach dem Logarithmieren erhält das kleinste gemittelte Signal den Wert 4. Gleichzeitig wird verhindert, dass das gemittelte Signal einen negativen Wert annehmen kann.
• Vergleicht man die Expressionsdaten von gram-positiven mit gram-negativen Proben, so wird das Verhältnis zwischen den Expressionswerten als „Fold Change” angegeben. Dieser Wert gibt an, um welchen Faktor das Transkript in der einen Probe anders exprimiert wurde als in der anderen Probe. Um den Logarithmischen Fold Change zu erhalten, wird die Differenz aus den Mittelwerten der normalisierten Daten beider Gruppen gebildet. Hier wird der Fold Change von gram-positiv bezüglich gram-negativ angegeben: log₂Fold Change = Mittelwert(normdata(gram+)) – Mittelwert(normdata(gram–)) log₂Fold Change = log₂(gram+/gram–)
• Die Zahl 2 wird mit dem Logarithmischen Fold Change potenziert, um einen Theoretischen Fold Change zu erhalten. Nimmt der Theoretische Fold Change einen Wert kleiner als eins an, so ergibt sich der Fold Change aus dem negativen Reziproken des Theoretischen Fold Changes. Im entgegengesetzten Fall entspricht der Fold Change dem Theoretischen Fold Change: Theoretischer Fold Change = 2^{log2 Fold Change} = 2^log2(gram+/gram–) = gram+/gram– Fold Change: wenn Theoretischer Fold Change < 1
  dann Fold Change = – 1 / Theoretischer Fold Change
  sonst Fold Change = Theoretischer Fold Change
• Ein positiver Fold Change bedeutet, dass das entsprechende Gen im Fall einer gram-positiven Infektion stärker exprimiert wird als bei einer gram-negativen Infektion.
• Für jeden Beadtyp wird außerdem der p-Wert für den t-Test und den Wilcoxon-Test berechnet. Unter der Annahme, dass die Nullhypothese des Tests richtig ist, gibt der p-Wert die Wahrscheinlichkeit an, dass der gemessene Wert durch Zufall zustande kommt. Ist diese Wahrscheinlichkeit geringer als eine vorgegebene Schranke, so wird angenommen, dass die Differenz nicht zufällig ist.
• In Tab. 20 sind die identifizierten Biomarker dargestellt: Tabelle 20: Differentielle Genexpression von Transkripten in gram-positiver und gram-negativer Sepsis, gemessen auf der Illumina-Genexpressionsplattform

  Symbol	Illumina Target ID	Fold Change Gram+ vs Gram–	p-Wert t-Test	p-Wert Wilcoxon-Test	Seq ID	Biologische Plausibilität
  FLJ42957	ILMN_10187	–2,066	0,06351	0,09524	67
  C22orf5	ILMN_10219	–1,572	0,00853	0,00794	68
  GZMH	ILMN_10239	2,385	0,18916	0,22222	69	ist an der Zelllyse in Zellvermittelter Immunantwort beteiligt; besitzt Peptidase- und Proteolyse-Aktivität; ist an Apoptose beteiligt
  	ILMN_105873	–1,441	0,00716	0,01587	70
  GPR137B	ILMN_10711	1,842	0,00413	0,00794	71
  	ILMN_107750	–2,114	0,00797	0,03175	72	Intron einer vermeintlichen Transkript-Variante von RNASET2
  	ILMN_109087	–2,060	0,09233	0,42063	73
  LOC728653	ILMN_109663	–1,549	0,00851	0,00794	74,75
  	ILMN_110605	1,441	0,12945	0,00794	76
  BC002942	ILMN_11132	–1,547	0,00218	0,00794	77
  ITIH4	ILMN_11142	–2,215	0,20823	0,15079	78	ist möglicherweise in Akute-Phase-Reaktionen involviert
  MAOA	ILMN_11566	–3,140	0,11311	0,30952	79	wichtige Funktion im Amin-Metabolismus des Zentralen Nervensystems; baut Neurotransmitter wie Dopamin ab
  SDHB	ILMN_12116	1,188	0,03632	0,00794	80	besitzt Elektronen-Transport-Aktivität;
  	ILMN_122129	–1,365	0,00993	0,01587	81
  	ILMN_123073	–1,324	0,01229	0,00794	82
  LOC113386	ILMN_12569	1,562	0,00377	0,00794	83
  LOC285908	ILMN_12575	–1,402	0,00485	0,01587	84
  F12	ILMN_12933	–2,010	0,52542	0,30952	85	aktiviert die Koagulationsfaktoren VII und XI; initiiert die Blutkoagulation und die Fibrinolyse
  RPS6KA5	ILMN_13156	–2,211	0,10517	0,09524	86	spielt eine essentielle Rolle bei der Transkriptionsaktivierung als Antwort auf TNF; reagiert auf oxidativen Stress
  GDI1	ILMN_13492	–1,530	0,04136	0,00794	87	verlangsamt das wegdissoziieren des GDP von RAB-Proteinen
  CMIP	ILMN_13851	–1,282	0,01492	0,00794	88
  VPS13D	ILMN_14155	–1,250	0,01823	0,00794	89
  LGALS3	ILMN_14333	2,182	0,33372	0,42063	90	bindet IgE; ist an Makrophagen-Aktivierung beteiligt
  C1orf74	ILMN_1469	1,307	0,00323	0,00794	91
  EIF1AY	ILMN_14704	4,963	0,14239	0,42063	92	initiiert die Translation
  PCOLCE2	ILMN_14782	2,020	0,07343	0,09524	93
  PRAM-1	ILMN_14804	–1,596	0,00938	0,03175	94	dieses Protein ähnelt FYB/SLAP-130, welches an T-Zell-Rezeptorvermittelten Signalwegen beteiligt ist
  PLAC8	ILMN_17809	2,203	0,04188	0,09524	95
  PAQR6	ILMN_18415	–1,532	0,01116	0,00794	96	Rezeptor-Aktivität
  NDE1	ILMN_18439	–1,416	0,02123	0,00794	97
  TOP3A	ILMN_1902	–1,337	0,01157	0,00794	98	katalysiert das vorrübergehende Brechen und das Wiederzusammenlagern einzelsträngiger DNA während der Transkription
  ARG1	ILMN_19494	–2,076	0,06063	0,09524	99	hydrolysiert Arginin und ist damit in den Harnstoffwechsel involviert
  LGALS2	ILMN_19736	2,221	0,14025	0,09524	100	bindet Galaktoside
  HBZ	ILMN_19775	–2,418	0,35974	0,42063	101	Sauerstoff-Transport-Aktivität
  CYP27A1	ILMN_2033	–2,616	0,04173	0,09524	102	oxidiert Cholesterol-Zwischenprodukte
  EIF2AK2	ILMN_20636	–1,643	0,02192	0,00794	103	bindet doppelsträngige RNA; ist an Protein-Synthese-Inhibition beteiligt
  CDKN1C	ILMN_20689	2,047	0,00736	0,00794	104	Negative Regulation der Zellproliferation; Zyklin-abhängige Protein-Kinase-Aktivität
  MNT	ILMN_21283	–1,278	0,03776	0,00794	105	wirkt als Transkriptionsrepressor; bindet an DNA-Bindeproteine
  MDFIC	ILMN_21649	1,158	0,04237	0,00794	106	ist an der Transkriptionsregulation viraler Genome beteiligt
  ZNFN1A1	ILMN_22185	2,287	0,12649	0,15079	107	interagiert mit Promotoren der B- und T-Zellentwicklung; besitzt DNA-bindende Fähigkeiten und ist an der Regulation der Transkription beteiligt
  KIAA0690	ILMN_22207	–1,631	0,00181	0,01587	108
  RPLP0	ILMN_22954	2,264	0,29058	0,30952	109	Komponente der 60S-Untereinheit von Ribosomen
  KIAA0367	ILMN_23214	–2,755	0,04168	0,03175	110
  FOXC1	ILMN_23624	–2,003	0,19170	0,30952	111	Transkriptionsfaktor; reguliert embrionale Entwicklung
  SYT11	ILMN_23967	–1,218	0,00016	0,00794	112	bindet Calcium-Ionen; besitzt Transporter-Aktivität
  DPEP2	ILMN_24146	–1,838	0,01433	0,00794	113	besitzt Proteolyse- und Peptidolyseaktivität; hydrolysiert u. a. den β-Laktamring einiger Antibiotika
  TPST1	ILMN_2477	–2,715	0,17087	0,22222	114	besitzt Transferase-Aktivität
  JUP	ILMN_2607	–2,825	0,08747	0,03175	115	Element des Zytoskelettes; ist an Zelladhäsion beteiligt
  ENTPD7	ILMN_26198	2,091	0,03844	0,00794	116	Hydrolase-Aktivität; Regulation der Erregungsübertragung
  VIPR1	ILMN_27565	–2,262	0,02954	0,03175	117	Rezeptor für kleine Neuropeptide
  UBE4B	ILMN_28085	–1,423	0,00118	0,00794	118	katalysiert den Zusammenbau von Ubiqutinketten und ermöglicht somit den Abbau von Proteinen
  TTLL4	ILMN_28183	–1,443	0,00312	0,01587	119	besitzt Ligase-Aktivität
  C5orf30	ILMN_28409	–2,177	0,10035	0,09524	120
  GBP1	ILMN_28413	2,512	0,03832	0,09524	121	bindet Guanin-Nukleotide; Expression von GBP1 wird durch Interferon induziert
  FLJ12700	ILMN_28810	–1,373	0,01685	0,00794	122
  KIAA1539	ILMN_29031	–1,233	0,01807	0,00794	123
  DVL2	ILMN_29320	–1,272	0,01430	0,00794	124	spielt möglicherweise eine Rolle in Signalwegen verschiedener Wnt-Gene
  SMCY	ILMN_29791	2,608	0,09136	0,30952	125	besitzt Zink-Finger-Domäne; bindet an DNA
  XAB2	ILMN_30213	–1,392	0,01287	0,00794	126	ist an Transkriptionsvorgängen beteiligt
  TMEM119	ILMN_30233	–2,336	0,07191	0,09524	127
  LOC644863	ILMN_33000	1,517	0,03096	0,00794	128
  DAAM2	ILMN_3540	–2,565	0,13476	0,22222	129	ist rho-abhängig; rekrutiert Profilin zur Membran und fördert Aktin-Polymerisierung; es wird für Transkriptionsaktivierung von Serum-Response-Faktoren benötigt
  LOC644037	ILMN_37144	2,015	0,16628	0,22222	130
  LOC400713	ILMN_37636	–1,410	0,00277	0,01587	131
  LOC644033	ILMN_39734	–2,027	0,05730	0,15079	132
  HEBP1	ILMN_4128	2,047	0,03781	0,05556	133	vermittelt Calcium-Mobilisierung und Chemotaxis von Monozyten und Dentritischen Zellen
  ZNF187	ILMN_4390	–2,114	0,47706	0,30952	134	besitzt Transkriptionafaktor-Aktivität
  SAMD4B	ILMN_5298	–1,420	0,01003	0,00794	135
  ADORA3	ILMN_5334	–2,056	0,29105	0,22222	136	interagiert mit G-Protein; schützt vor Herzschäden; ist möglicherweise in Zellproliferation und Zelltod verwickelt
  U2AF1L4	ILMN_5343	2,092	0,03842	0,00794	137	RNA-Bindung, spielt eine kritische Rolle in Splice-Vorgängen
  TNNT1	ILMN_537	2,161	0,17568	0,22222	138	ist an der Muskelentwicklung beteiligt
  TLR9	ILMN_5498	–1,478	0,00666	0,03175	404	aktiviert das angeborene Immunsystem nach Erkennung von unmethylierten CpG-Motiven
  GPC2	ILMN_6771	–1,470	0,00923	0,00794	139	Zelloberflächen Proteoglycan
  NLF2	ILMN_6857	–1,346	0,15084	0,00794	140
  THEDC1	ILMN_7113	–2,264	0,32089	0,30952	141	ist an der Fettsäuresynthese beteiligt
  INHBB	ILMN_7166	–2,198	0,07401	0,09524	142	besitzt Tumor-Suppressor-Aktivität; besitzt Cytokin-Aktivität
  SNFT	ILMN_7180	1,564	0,00625	0,01587	143	reagiert auf Erreger; Regulation der Transkription
  	ILMN_73408	–2,617	0,08397	0,05556	144
  METTL7B	ILMN_7370	3,082	0,00148	0,00794	145	Methaltransferase-Aktivität
  PPP1R10	ILMN_8464	–1,310	0,03765	0,00794	146	dieses Gen liegt in der Region des Haupthistokompatibilitätskomplex I; besitzt Transkriptionsregulator-Aktivität
  RPS4Y1	ILMN_8579	11,651	0,06490	0,09524	147	bindet RNA; Komponente der 40S-Untereinheit von Ribosomen und ist damit an der Protein-Synthese beteiligt
  PAIP1	ILMN_879	1,147	0,02433	0,00794	148	ist an Translationsinitiation und Proteinsynthese beteiligt
  CTSL	ILMN_8814	2,052	0,00248	0,01587	159	Cystein-Typ Endopeptidase-Aktivität; spielt eine wichtige Rolle im Protein-Katabolismus
  	ILMN_89024	–1,472	0,03363	0,00794	150
  KIAA1324	ILMN_9289	–2,497	0,09589	0,15079	151
  TAOK2	ILMN_9392	–1,359	0,00962	0,01587	152	reguliert die JNK-Kaskade positiv; reagiert auf Stress

• Die Genaktivität von drei Markern aus dieser Liste wurden mittels quantitativer PCR an der cDNA derselben Patienten gemessen, um die Daten mit einer anderen Methode zu reproduzieren.
• Die drei Marker sowie ein repräsentatives Primerpaar für die Quantifizierung mittel Real-Time-PCR sind in Tab. 21 dargestellt. Weiterhin werden zur relativen Quantifizierung sog. Referenzgene verwendet, welche im jeweiligen Gewebe konstant exprimiert sind. Die in diesem Experiment genutzten Referenzgene sind ebenfalls dargestellt. Tabelle 21: Markergene und Referenzgene für die PCR-Validierung

  Marker	Primer für qualitative PCR (Seq ID)
  CDKN1C
  	reverse: 734
  CTSL Seq ID 149	forward: 735
  	reverse: 736
  METTL7B Seq ID 145	forward: 737

  Referenzgene	Primer für quantitative PCR (Seq ID)
  SNAPC Seq ID 679	forward: 727
  	reverse: 728
  CASP8 Seq ID 681–686	forward: 731
  	reverse: 732
  ITGAL Seq ID 676, 677	forward: 725
  	reverse: 726

• Experimentelle Ausführung
• Blutabnahme und RNA-Isolation:
• Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen. Nach Abnahme des Vollblutes wurde die Gesamt-RNA der Proben unter Anwendung des PAXGene Blood RNA Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert.
• Reverse Transkription:
• Von jeder Patienten-Probe wurden 300 ng der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) in einem 20 μl-Ansatz umgeschrieben und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden anschließend mit Hilfe von Microcon-Säulchen aufgereinigt.
• Real-Time-PCR
• Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG-Kit der Firma Invitrogen. Für einen 10 μl-Ansatz wurden folgende Bestandteile pipettiert:

  5 μl	Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG, 2×
  1 μl	Primer forward (10 pmol/μl)
  1 μl	Primer reverse (10 pmol/μl)
  1 μl	Fluorescein (0,5 μM)
  1 μl	H2O, RNase frei
  1 μl	Template cDNA (6,67 ng/μl)

• Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:

  
• Verwendet wurde das iQ^TM5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware.
• Ergebnisse
• Die Ct-Werte der Real-Time-PCR wurden nach der Methode von Vandesompele normalisiert [Vandesompele et al., 2002]. Für die Vandesompele-Normalisierung wird zuerst die Relative Größe R für jedes Target (Interessierendes Gen (Gene of Interest) und Referenzgen) berechnet: R = E^min(Ct)-Ct
• Für die Effizienz E wird der idealisierte Wert 2 eingesetzt. Die Effizienz wird mit der Differenz aus dem kleinsten Ct-Wert aus allen Proben eines Gens und der jeweiligen Patientenprobe potenziert. Der Normalisierungsfaktor NF wird über das geometrische Mittel der Relativen Größen R der Referenzgene (Ref) berechnet:

  
• Für den Normalisierungsfaktor wird die dritte Wurzel aus dem Produkt der drei Referenzgene gezogen. Um die normalisierten Daten zu erhalten, wird der Quotient aus Relativer Größe R und dem Normalisierungsfaktor gebildet:

  
• In diesem Zusammenhang zeigt 13 die differenzielle Expression des Gens CDKN1C in septischen Patienten mit gram-positiver und gram-negativer Infektion. Im Boxplot sind die mittleren normalisierten Ct-Werte für jeweils 5 Patienten dargestellt. Ermittelt wurden diese Werte mit realtime-PCR an der cDNA der Patienten. 14 zeigt die differenzielle Expression des Gens CTSL in septischen Patienten mit gram-positiver und gram-negativer Infektion. Im Boxplot sind ebenfalls die mittleren normalisierten Ct-Werte für jeweils 5 Patienten dargestellt. Ermittelt wurden diese Werte mit realtime-PCR an der cDNA der Patienten.
• In 15 wird die differenzielle Expression des Gens METTL7B in septischen Patienten mit gram-positiver und gram-negativer Infektion gezeigt. Im Boxplot sind die mittleren normalisierten Ct-Werte für jeweils 5 Patienten dargestellt. Ermittelt wurden diese Werte mit realtime-PCR an der cDNA der Patienten.
• Tab. 22 zeigt Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte aus Triplikaten) aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN1C (Seq ID 104).
• Tab. 23 enthält nach Vandesompele [Vandesompele et al., 2002] normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN1C (Seq ID 104).
• In Tab. 24 sind Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte aus Triplikaten) aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (Seq ID 149) enthalten.
• Tab 25 zeigt nach Vandesompele [Vandesompele et al., 2002] normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (Seq ID 149).
• In Tab. 26 sind Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte aus Triplikaten) aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (Seq ID 145) enthalten.
• Tab. 27 zeigt nach Vandesompele [Vandesompele et al., 2002] normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (Seq ID 145).
• Tabelle 22: Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte) aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN1C (Seq ID 104). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

  
• Tabelle 23: Nach Vandesompele normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CDKN1C (Seq ID 104). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

  
• 
• Tabelle 24: Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte) aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (Seq ID 149). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

  
• Tabelle 25: Nach Vandesompele normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker CTSL (Seq ID 149). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

  
• 
• Tabelle 26: Rohdaten (Ct-Werte, Mittelwerte) aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (Seq ID 145). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

  
• Tabelle 27: Nach Vandesompele normalisierte Rohdaten aus den qPCR-Assays für den Marker METTL7B (Seq ID 145). Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

  
• 
• Signifikanz der Ergebnisse
• Mit dem Wilcoxon Test wurde anschließend überprüft, ob die Ergebnisse signifikant sind. Die aufgestellte Nullhypothese besagte, dass es keine signifikanten Unterschiede in den beiden Gruppen bezüglich der Genexpression gibt. Die Nullhypothese konnte bei allen 3 Targets widerlegt werden. Damit ist der Unterschied zwischen gram-positiven und gram-negativen Septikern bezüglich der Expression von CDKN1C (Seq ID 104), CTSL (Seq ID 149) und METTL7B (Seq ID 145) mit einer 95%igen Wahrscheinlichkeit nicht zufällig.
• Fold Change
• Um die x-fache Veränderung einer größeren Anzahl von Werten miteinander zu vergleichen, wurde aus den nach Vandesompele normalisierten Werten zuerst das geometrische Mittel jeder Gruppe gebildet. Der Fold Change bzw. die x-fache Veränderung der Genexpression berechnet sich dann aus dem Quotienten der nach Vandesompele normalisierten Ct-Werte der zu vergleichenden Gruppen. Die Effizienz der PCR wurde schon bei der Normalisierung einberechnet, sodass sie an dieser Stelle entfällt.
• Der Fold Change der Patienten berechnet sich somit wie folgt:

  
• Alle drei untersuchten Targets wiesen in der PCR-Analyse einen Fold Change_{Gram+ Vs Gram–} mit der gleichen Tendenz wie in der Microarrayauswertung auf. Dabei fällt auf, dass das Target METTL7B, welches bei Illumina den größten Fold Change erzielte nun auch in der PCR-Analyse den höchsten Wert annimmt.
• Tab. 28 zeigt medizinische Parameter der in die Analyse eingegangenen Patienten wie sie von Seiten der Klinik validiert wurden.
• Tabelle 28: Medizinische Parameter der in die Analyse eingegangenen Patienten. Hellgrau: Patienten mit gram-negativer Infektion, dunkelgrau: Patienten mit gram-positiver Infektion.

  
• 
• 
• Beispiel 5: Nicht-kodierende RNA-Differenzielle Genexpression eines Transkriptes ohne Protein-kodierende Funktion (sog. nicht-kodierende RNA) in SIRS- und Sepsis-Patienten mittels Real-Time-PCR.
• Messung der Genexpression
• Es wurden 5 Patienten mit Pneumonie als Sepsis-Vertreter und im Fall der SIRS 5 Patienten mit einer schweren Herz-OP ausgewählt (Cardiopulmonaler Bypass, CPB), da diese den Großteil der SIRS-Patienten auf einer ITS stellen (siehe Tab. 29). Die Patienten wurden retrospektiv von einem Ärzte-Team der Uni-Klinik Jena in ihrer Diagnose validiert.
• Aus dem Blut der Patienten wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese wurde im Assay als Templat eingesetzt. Tabelle 29: Liste der untersuchten Patienten

  Patienten-ID	Sepsis (Pneumonie)	SIRS
  6032	X
  6048	X
  6063	X
  6070	X
  6104	X
  8002		X
  8026		X
  8086		X
  8102		X
  2038		X

• Der Marker mit der Seq ID 207 (Accession-No. AA868082) für nichtkodierende RNA ist Bestandteil der oben angeführten Biomarkerliste.
• Tab. 30 zeigt ein Beispiel eines Primerpaares für die Amplifikation des nichtkodierenden Markers mit der Seq ID 207 in der Real-Time PCR. Es wurden 10 Patienten untersucht (5 Sepsis-Patienten, 5 SIRS-Patienten). Tabelle 30: Beispielhaftes Primerpaar für die quantitative PCR

  Seq ID	Primer
  207	forward	Seq-ID 739
  	reverse	Seq ID 740

• Experimentelle Ausführung
• Blutabnahme und RNA-Isolation
• Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen und die RNA isoliert.
• Reverse Transkription
• Von jeder Patienten-Probe wurden 4 μg der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der Reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) und den genspezifischen Primern in einem 20 μl-Ansatz umgeschrieben (10 mM dNTP-Mix und 2 μM genspezifische Primer (Seq ID 207) und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden mit Microcon-Säulchen aufgereinigt, die eluierte cDNA in der SpeedVac eingedampft und anschließend in 50 μl Wasser aufgenommen.
• Real-Time-PCR
• Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG-Kit der Firma Invitrogen. Die Patienten-cDNA wurde 1:100 mit Wasser verdünnt und davon jeweils 2 μl in die PCR eingesetzt. Alle Ansätze wurden in 3facher Ausführung pipettiert. PCR-Ansatz pro well (10 μl):

  2 μl	Template cDNA 1:100
  1 μl	forward primer, 10 mM
  1 μl	reverse primer, 10 mM
  1 μl	Fluorescein Reference Dye
  5 μl	Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG, 2×

• Es wurde ein Mastermix ohne Template hergestellt, dieser wurde in 8 μl-Aliquots in die PCR-Platte gesteppt und dazu wurden jeweils die Patienten-cDNAs pipettiert. Das sich daran anschließende PCR-Programm war folgendermaßen aufgebaut:

  
• Verwendet wurde das iQ^TM5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware.
• Ergebnisse
• Die mittels Real-Time-Assays gemessenen Expressionssignale wurden im Excel-Format abgespeichert und über die 3-fach-Bestimmungen gemittelt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tab. 31 gezeigt. Tabelle. 31 Ct-Werte aus den Real Time-Assays

  Patienten-ID	Ct-Werte (Mittelwerte)
  6032	22,33
  6048	22,62
  6063	20,99
  6070	26,82
  6104	22,59
  8002	23,92
  8026	23,28
  8086	23,18
  8102	23,95
  2038	22,93

• 16 zeigt einen Boxplot für den nicht-kodierenden Marker mit der Seq ID 207, erstellt aus 10 Patienten-Proben (5 mit Sepsis-Diagnose, 5 mit SIRS). Auf der y-Achse ist der mittlere Ct-Wert während der Real-Time-Amplifikation dargestellt. Es ist eine klare Trennung von Sepsis- und SIRS-Patienten erkennbar.
• Die folgende Tab. 32 stellt den Bezug zwischen der Sequenzprotokollnummer der einzelnen Polynukleotide und deren öffentlich zugänglichen Accession-Nummer her. Tabelle 32: Korrelation von Sequenznummer (Sequenzprotkoll) und Accession-Nummer

  Seq ID	Accession Nr	Seq ID	Accession Nr	Seq ID	Accession Nr
  1	NM_130850	230	NM_177534	459	NM_139049
  2	NM_130851	231	NM_177536	460	NM_006887
  3	NM_001202	232	AI214494	461	NM_014330
  4	NM_001795	233	AI217376	462	NM_001025159
  5	NM_001114117	234	AI218498	463	NM_004355
  6	NM_001817	235	AI221860	464	NM_001025158
  7	NM_002116	236	AI224886	465	NM_004330
  8	NM_002989	237	NM_014798	466	NM_000687
  9	NM_003151	238	NM_173607	467	NM_000576
  10	NM_004064	239	NM_001079519	468	NM_005389
  11	NM_005419	240	NM_001553	469	NM_004071
  12	NM_017455	241	AI273261	470	NM_002231
  13	NM_012428	242	AI281098	471	NM_001024844
  14	NM_003136	243	AI343613	472	NM_000211
  15	NM_004402	244	NM_001015072	473	NM_001001323
  16	NM_002947	245	AI364529	474	NM_001682
  17	NM_198256	246	NM_016073	475	NM_001946
  18	NM_005923	247	NM_203402	476	NM_022652
  19	NM_002758	248	NM_015026	477	NM_001803
  20	NM_002389	249	NM_016376	478	NM_000194
  21	NM_153826	250	NM_020740	479	NM_003897
  22	NM_172350	251	NM_022458	480	NM_002262
  23	NM_172351	252	AI539445	481	NM_007334
  24	NM_172352	253	NR_002768	482	NM_001114396
  25	NM_172353	254	AI554111	483	NM_004006
  26	NM_172354	255	NM_003627	484	NM_000109
  27	NM_172355	256	NM_000135	485	NM_004010
  28	NM_172356	257	NM_001018112	486	NM_004009
  29	NM_172357	258	NM_018725	487	NM_004007
  30	NM_172358	259	CR936786	488	NM_004011
  31	NM_172359	260	AI613016	489	NM_004012
  32	NM_172360	261	AI623567	490	NM_004021
  33	NM_172361	262	NM_001114086	491	NM_004022
  34	NM_002163	263	NM_001042552	492	NM_004023
  35	NM_002200	264	NM_001042553	493	NM_004013
  36	NM_032643	265	NM_181844	494	NM_004020
  37	NM_001098627	266	AI675585	495	NM_004014
  38	NM_001098628	267	NM_198524	496	NM_004015
  39	NM_001098629	268	NM_018034	497	NM_004016
  40	NM_001098630	269	AI732517	498	NM_004017
  41	NM_001098631	270	NM_001080450	499	NM_004018
  42	NM_015093	271	BC015667	500	NM_004019
  43	NM_000331	272	NM_016335	501	NM_000698
  44	NM_199161	273	NM_031953	502	NM_020070
  45	NM_000364	274	NM_013233	503	NM_152855
  46	NM_001001430	275	NM_080927	504	NM_005587
  47	NM_001001431	276	NM_032383	505	NM_004131
  48	NM_001001432	277	NM_031922	506	NM_001664
  49	NM_000258	278	NM_014801	507	NM_003701
  50	NM_003376	279	NM_152680	508	NM_033012
  51	NM_001033756	280	NM_025209	509	NM_172089
  52	NM_001025366	281	NM_017805	510	NM_003808
  53	NM_001025367	282	AI811413	511	NM_172087
  54	NM_001025368	283	AI820576	512	NM_172088
  55	NM_001025369	284	AI821631	513	NM_004938
  56	NM_001025370	285	NM_004145	514	NM_003824
  57	NM_002872	286	NM_004972	515	NM_003842
  58	NM_006094	287	AI888493	516	NM_147187
  59	NM_182643	288	NM_145294	517	NM_001244
  60	NM_016142	289	NM_012316	518	NM_006291
  61	NM_014887	290	NM_182491	519	NM_001924
  62	NM_033111	291	NM_001679	520	NM_003807
  63	NM_001076786	292	NM_016270	521	NM_172014
  64	NM_001085377	293	NM_018351	522	NM_033292
  65	NM_002387	294	NM_138775	523	NM_001223
  66	NM_001938	295	NM_004411	524	NM_033293
  67	NM_207436	296	NM_024893	525	NM_033294
  68	NM_012264	297	NM_020818	526	NM_033295
  69	NM_033423	298	H16790	527	NM_003580
  70	AI873192	299	NM_203487	528	NM_003358
  71	NM_003272	300	NM_020403	529	NM_000648
  72	DA920728	301	H18649	530	NM_000647
  73	AA454562	302	NM_000526	531	NM_001337
  74	NM_004992	303	NM_002697	532	NM_006664
  75	NM_001110792	304	NM_058182	533	NM_006072
  76	BF057027	305	NM_002125	534	NM_002984
  77	NM_033200	306	H65331	535	NM_002985
  78	NM_002218	307	NM_017893	536	NM_006274
  79	NM_000240	308	NM_032112	537	NM_138284
  80	NM_003000	309	NM_176792	538	NM_000565
  81	NM_004924	310	NM_176793	539	NM_181359
  82	AW025248	311	NM_176794	540	NM_003855
  83	NM_138781	312	NM_199189	541	NM_002185
  84	NM_181722	313	NM_018834	542	NM_173842
  85	NM_000505	314	H91663	543	NM_173841
  86	NM_004755	315	XM_001126561	544	NM_000577
  87	NM_001493	316	AL359596	545	NM_173843
  88	NM_030629	317	NM_023929	546	NM_000206
  89	NM_015378	318	NM_001105539	547	NM_001558
  90	NM_002306	319	NM_183421	548	NM_000878
  91	NM_152485	320	NM_183420	549	NM_002175
  92	NM_004681	321	NM_012173	550	NM_002173
  93	NM_013363	322	NM_022455	551	NM_002172
  94	NM_032152	323	NM_172349	552	NM_003954
  95	NM_016619	324	NM_000846	553	NM_003010
  96	NM_024897	325	NM_024790	554	NM_002754
  97	NM_017668	326	NM_001077204	555	NM_005922
  98	NM_004618	327	NM_007011	556	NM_006724
  99	NM_000045	328	NM_152924	557	NM_139033
  100	NM_006498	329	NM_022353	558	NM_139032
  101	NM_005332	330	NM_000028	559	NM_002749
  102	NM_000784	331	NM_000642	560	NM_139034
  103	NM_002759	332	NM_000643	561	NM_006301
  104	NM_000076	333	NM_000644	562	NM_005204
  105	NM_020310	334	NM_000645	563	NM_002755
  106	NM_199072	335	NM_000646	564	NM_006049
  107	NM_006060	336	NM_032663	565	NM_004180
  108	NM_015179	337	R12411	566	NM_001504
  109	NM_001002	338	NM_018376	567	NM_015991
  110	NM_015225	339	NM_004645	568	NM_031910
  111	NM_001453	340	NM_014155	569	NM_182486
  112	NM_152280	341	NM_017933	570	NM_000066
  113	NM_022355	342	NM_001100818	571	NM_203330
  114	NM_003596	343	NM_020777	572	NM_000611
  115	NM_021991	344	NM_005870	573	NM_203329
  116	NM_020354	345	NM_144609	574	NM_203331
  117	NM_004624	346	NM_001099225	575	NM_001831
  118	NM_006048	347	NM_016157	576	NM_203339
  119	NM_014640	348	NM_177556	577	NM_139208
  120	NM_033211	349	NM_001039705	578	NM_006610
  121	NM_002053	350	R43301	579	NM_005041
  122	NM_024910	351	NM_134261	580	NM_001083116
  123	NM_025182	352	NM_134260	581	NM_005252
  124	NM_004422	353	NM_002943	582	NM_002199
  125	NM_004653	354	NM_134262	583	NM_001001349
  126	NM_020196	355	CR613944	584	NM_017595
  127	NM_181724	356	NM_024034	585	NM_013432
  128	NM_007067	357	NM_020882	586	NM_002720
  129	NM_015345	358	AK091100	587	NM_000594
  130	BM822150	359	NM_024306	588	NM_014959
  131	BX110982	360	NM_032883	589	NM_170707
  132	BI830161	361	NM_001098796	590	NM_005572
  133	NM_015987	362	NM_001098797	591	NM_170708
  134	NM_001023560	363	NM_001098798	592	NM_000660
  135	NM_018028	364	NM_005151	593	NM_006238
  136	NM_020683	365	NM_001037334	594	NM_000308
  137	NM_024660	366	NM_173666	595	NM_000397
  138	NM_003283	367	NM_004826	596	NM_000906
  139	NM_152742	368	NM_053025	597	NM_004475
  140	NM_001007595	369	NM_053026	598	NM_006260
  141	NM_018324	370	NM_053027	599	NM_006597
  142	NM_002193	371	NM_053028	600	NM_153201
  143	NM_018664	372	NM_053031	601	NM_000714
  144	BX099079	373	NM_053032	602	NM_007311
  145	NM_152637	374	R70541	603	NM_002059
  146	NM_002714	375	NM_002461	604	NM_022557
  147	NM_001008	376	NM_182557	605	NM_022558
  148	NM_006451	377	NM_144604	606	NM_022556
  149	NM_145918	378	NM_013374	607	NM_024302
  150	AF086272	379	R94894	608	NM_001032278
  151	NM_020775	380	NM_021096	609	NM_152557
  152	NM_016151	381	NM_001003406	610	NM_014858
  153	NM_004519	382	NM_000245	611	NM_016613
  154	NM_153029	383	NM_017799	612	NM_001031700
  155	NM_016396	384	T78484	613	NM_033554
  156	NM_003743	385	NM_013305	614	NM_006516
  157	NM_147223	386	NM_014932	615	NM_006682
  158	NM_147233	387	NM_153334	616	NM_005962
  159	AA029887	388	NM_182895	617	NM_130439
  160	AA035428	389	NM_138278	618	NM_001008541
  161	NM_020808	390	NM_024721	619	NM_031311
  162	NM_012383	391	NM_003188	620	NM_019029
  163	NM_001042780	392	NM_145331	621	NM_002483
  164	NM_006757	393	NM_145332	622	BC012159
  165	NM_001042781	394	NM_145333	623	NM_006936
  166	NM_001042782	395	NM_004357	624	NM_001671
  167	NM_002727	396	NM_139029	625	XM_928029
  168	NM_012081	397	NM_139030	626	NM_002923
  169	NM_006806	398	NM_001039490	627	NM_016068
  170	AA398757	399	NM_002746	628	NM_003974
  171	NM_004273	400	NM_001040056	629	NM_003258
  172	NM_018555	401	BC018761	630	NM_001972
  173	NM_001079906	402	NM_001296	631	AB288083
  174	NM_001079907	403	NM_022117	632	EF492673
  175	AA412166	404	NM_017442	633	M20813
  176	AA417348	405	NM_001199	634	NM_001911
  177	AA417792	406	NM_006128	635	NM_000291
  178	NM_001512	407	NM_006129	636	NM_004969
  179	NM_018412	408	NM_000757	637	NM_022442
  180	NM_021908	409	NM_172210	638	NM_021988
  181	NM_015447	410	NM_172211	639	NM_001032288
  182	NM_015094	411	NM_172212	640	NM_199144
  183	NM_181806	412	M37435	641	NM_003349
  184	AA453996	413	NM_000574	642	NM_199203
  185	NM_003828	414	NM_001114544	643	AI623897
  186	NM_005999	415	NM_001114543	644	AK125136
  187	NM_032270	416	NM_001114752	645	NM_005909
  188	NM_018475	417	NM_000963	646	NM_015320
  189	AA493225	418	NM_001288	647	NM_032995
  190	AA495787	419	NM_001511	648	NM_001031715
  191	NM_172127	420	NM_001530	649	NM_022784
  192	NM_172128	421	NM_181054	650	NM_005720
  193	NM_001221	422	NM_001560	651	NM_005647
  194	NM_172115	423	NM_001766	652	NM_005578
  195	NM_144607	424	NM_002128	653	NM_001002259
  196	BX647243	425	NM_024817	654	NM_023925
  197	AA682790	426	NM_002133	655	NM_032156
  198	NM_014982	427	NM_002211	656	NM_014781
  199	NM_005688	428	NM_032571	657	NM_001083617
  200	AA708806	429	NM_002468	658	NR_003950
  201	NM_002006	430	NM_002649	659	NM_030799
  202	NM_005500	431	NM_003268	660	NM_001024947
  203	AA812763	432	NM_004049	661	H06263
  204	AA825968	433	NM_004347	662	NM_002103
  205	AA833528	434	NM_078471	663	NM_002430
  206	NM_145039	435	NM_203318	664	NM_032173
  207	AA868082	436	NM_005803	665	NM_153240
  208	NM_003357	437	NM_006016	666	W04695
  209	NM_001025468	438	NM_177551	667	NM_145716
  210	NM_002405	439	NM_006018	668	NM_018070
  211	AA923169	440	NM_006058	669	NM_001009955
  212	AA923246	441	NM_006206	670	NM_001101
  213	AA947111	442	NM_006378	671	NM_001084819
  214	NM_014714	443	NM_000902	672	NM_002046
  215	NM_001012706	444	NM_007287	673	NM_000570
  216	AI003843	445	NM_007288	674	NM_002123
  217	NM_003747	446	NM_007289	675	NR_003286
  218	AI041544	447	NM_002259	676	NM_002209
  219	NM_003485	448	NM_007328	677	NM_001114380
  220	NM_182536	449	NM_213657	678	NM_021009
  221	NM_014478	450	NM_213658	679	NM_003082
  222	NM_001040647	451	NM_012340	680	NM_001562
  223	NM_001040648	452	NM_173091	681	NM_001228
  224	AI149693	453	NM_013230	682	NM_033355
  225	NM_005220	454	NM_018643	683	NM_033356
  226	NM_018053	455	NM_022162	684	NM_001080124
  227	NM_001055	456	NM_002750	685	NM_033358
  228	NM_177529	457	NM_139046	686	NM_001080125
  229	NM_177530	458	NM_139047

• LITERATUR
• ACCP/SCCM (1992), Crit. Care Med 20, 864–74
• Alberti C, Brun-Buisson C, Goodman SV, Guidici D, Granton J, Moreno R, Smithies M, Thomas O, Artigas A, Le Gall JR; European Sepsis Group (2003) Influence of systemic inflammatory response syndrome and Sepsis on outcome of critically ill infected patients. Am J Respir Crit Care Med 168, 77–84.
• Amin K, Kauffman CA (2003), Fever of unknown origin. Postgrad med114(3), 69–75
• Baker SG, und Kramer B (2006), Identifying genes that contribute most to good classification in microarray. BMC Bioinformatics 7, 407
• Bone RC, Balk RA, Cerra FB, Dellinger EP, Fein AM, Knaus WA, Schein RM, Sibbald WJ, the ACCP/SCCM Consensus Conference Committee (1992) Definitions for Sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in Sepsis. Chest 101, 1656–1662
• Box GEP, Cox DR (1964) An analysis of transformations (with discussion). J Roy Stat Soc B 26, 211–252
• Buneß A, Huber W, Steiner K, Sültmann H, Poustka A (2005) ArrayMagic: two-colour cDNA microarray quality control and preprocessing. Bioinformatics 21, 554–556.
• Breiman L (2001) Random Forests. Machine Learning 45(1), 5–32
• Brun-Buisson C, Doyon F, Carlet J, Dellamonica P, Gouin F, Lepoutre A, Mercier JC, Offenstadt G, Regnier B (1995) Incidence, risk factors, and outcome of severe Sepsis and septic shock in adults. A multicenter prospective study in intensive care units. French ICU Group for Severe Sepsis. JAMA 274, 968–974
• Brun-Buisson C, Roudot-Thoraval F, Girou E, Grenier-Sennelier C, Durand-Zaleski I (2003) The costs of septic syndromes in the intensive care unit and influence of hospital-acquired Sepsis. Intensive Care Med 29, 1464–1471
• Bustin SA (2002) Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endicronol 29, 23–29
• Calandra T, Cohen J. (2005) International Sepsis Forum Definition of Infection in the ICU Consensus Conference. Critical Care Med 33(7), 1538–48.
• Carrigan SD Scott G Tabrizian M (2004) Toward resolving the challenges of Sepsis. Clin Chem 50(8), 1301–1314
• DE 10 2007 036 678 A1 Verwendung von Polynukleotiden zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion
• Ding BY and Gentleman R (2004) Classification using generalized partial least squares. Bioconductor Project Working Papers. Paper 5. http://www.begress.com/bioconductor/paper5 9
• Efron B (1979) Bootstrap Methods: Another Look at the Jackknife. The Annals of Statistics 7(1), 1–26
• FDA: In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays. Draft Guidance for Industry, Clinical Laboratories, and FDA Staff (2003) http://www.fda.gov/cdrh/oivd/guidance/1610.pdf
• Feezor RJ, Baker HV, Xiao W et al. (2004) Genomic and Proteomic Determinants of Outcome in Patients Untergoing Thoracoabdominal Aortic Aneurysm Repair. J Immun 172, 7103–7109
• Klein D (2002) Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. Trends Mol Med 8(6), 257–260
• Mayhall G (2001) Ventilator-Associated Pneumonia or Not? Contemporary Diagnosis. Emerging Infection Disease CDC 7(2)
• Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, et al. (1999) Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286, 531–537
• Hastie T, Tibshirani R, Friedman J. (2001) The Elements of Statistical Learning: Data Mining, Inference, and Prediction.Springer Series in Statistics.
• Hollander M., Wolfe D., (1973), Nonparametric statistical inference. New York: John Wiley & Sons.
• Huber W, von Heydebreck A, Sueltmann H, Poustka A, Vingron M (2003) Parameter estimation for the calibration and variance stabilization of microarray data. Stat Appl in Genetics and Mol Biology 2(1), Article 3
• Huggett J, Dheda K, Bustin S et al. (2005) Real-time RT-PCr normalisation; strategies and considerations Genes Immun 6(4), 279–284
• Increase in National Hospital Discharge Survey rates for septicemia – United States, 1979–1987. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990 39, 31–34
• Johnson SB, Lissauer M, Bochicchio GV, Moore R, Cross AS, Scalea TM. (2007) Gene Expression Profiles Differentiate Between Sterile SIRS and Early Sepsis Annals of Surgery 245(4), 611–621
• Knaus WA, Draper EA, Wagner DP, Zimmermann JE (1985) Prognosis in acute organ-system failure. Ann Surg 202, 658–693
• Kofoed K, Andersen O, Kronborg G, Tvede M, Petersen J, Eugen-Olsen J, Larsen K (2007), Use of plasma C-reactive protein, procalcitonin, neutrophils, macrophage migration inhibitory factor, soluble urokinase-type plasminogen activator receptor, and soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in combination to diagnose infections: a prospective study. Critical Care 11, R38
• Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M et al. (2006) The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med 27, 95–125
• Kumar A, Roberts D, Wood KE et al. (2006) Duration of hypothension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med 34(6), 1589–1596
• Le-Gall JR, Lemeshow S, Leleu G, Klar J, Huillard J, Rue M, Teres D, Artigas A (1995) Customized probability models for early severe Sepsis in adult intensive care patients. Intensive Care Unit Scoring Group. JAMA 273, 644–650
• Levy MM, Fink MP, Marshall JC, Abraham E, Angus D, Cook D, Cohen J, Opal SM, Vincent JL, Ramsay G et al. (2003) 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Intensive Care Med 29, 530–538
• Liu H, Li J, Wong L (2005) Use of extreme patient samples for outcome prediction from gene expresseion data. Bioinformatics 21(16), 3377–3384
• MAQC Consortium. The MicroArray Quality Control (MAQC) project shows inter- and intraplatform reproducibility of gene expression measurements. Nat Biotechnol 2006, 24:, 1151–61
• Mathiak G, Kabir K, Grass G, et al. (2003) Lipopolysaccharides from different bacterial sources elicit disparate cytokine responses in whole blood assays. Int J Mol Med 11(1), 41–44
• Marshall JC, Vincent JL, Fink MP et al. Measures, markers, and mediators: toward a staging system for clinical sepsis. A report of the Fifth Toronto Sepsis Roundtable, Toronto, Ontario, Canada, October 25–26, 2000 und Crit Care Med. 2003, 31: 1560–1567
• Mayhall CG (2001) Ventilator-Associated Pneumonia or Not? Contemporary Diagnosis. Emerg Infect Dis 7(2), 200–204
• Nolan T, Hands RE, Bustin SA (2006) Quantification of mRNA using realt-time RT-PCR. Nat Protoc 1(3), 1559–1582
• Opal SM, Lim Y-P, Siryaporn E, et al. (2005) Longitudinal studies of inter-alpha inhibitor proteins in severly septic patients: A potential clinical marker and mediator of severe sepsis. Clin Invest 35(2), 387–292
• Pachot A, Lepape A, Vey S, et al. (2006) Systemic transcriptional analysis in survivor and non-survivor septic shock patients: a preliminary study. Immunol Lett 106(1), 63–71. Epub 2006 May 17
• Pile JC (2006) Evaluating postoperative fever: a focused approach. Clev Clin J Med. 73 (supp. 1) 62–66
• Ramilo O, Allman W, Chung W, Mejias A, Ardura M, Glaser C, Wittkowski KM, Piqueras P, Bancherau J, Palucka K A, Chaussabel D, (2007) Gene expression patterns in blood leukocytes discriminate patients with acute infections. Blood 109, 2066–2077
• R Development Core Team (2006) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org
• Rocke DM, Durbin B. (2001) A model for measurement error for gene expression arrays. J Comput Biol 8, 557–569
• Roth AR, Basello DO, (2003) Approach to the adult patient with fever of unknown origin. Am Fam Phys 68(11) 2223–2228
• Ruokonen E et al. (1999) Procalcitonin concentrations in patients with neutropenic fever. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(4), 283–5
• Ruokonen E et al. (2002) Procalcitonin and neopterin as indicators of infection in critically ill patients. Acta Anaesthesiol Scand 46(4), 398–404
• Simon L, Gauvin F, Amre DK, Saint-Lois P, Lacroix J, (2004) Serum procalcitonin and C-reactive protein levels as marker of bacterial infection: A systematic review and meta analysis. Clin Infec Dis 39, 206–217
• Simon R. (2005) Roadmap for Developing and Validating Therapeutically Relevant Genomic Classifiers. J Clin Oncol 23, 7332–7341
• Sponholz C, Sakr Y, Reinhart K, Brunkhorst F, (2006) Diagnostic value and prognostic implications of serum procalcitonin after cardiac surgery: a systematic review of the literature, Critical Care 10, R145
• Suprin E et al. (2000) Procalcitonin: a valuable indicator of infection in a medical ICU? Intensive Care Med 26(9), 1232–1238
• Tang BMP, Eslick GD, Craig JC et al. (2007a) Accuracy of procalcitonin for sepsis diagnosis in critically ill patients: systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis 7, 210–217
• Tang BMP, McLean AS, Dawes IW, Huang SJ, Lin RCY (2007b) The Use of Gene-Expression Profiling to Identify Candidate Genes In Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 176(7), 676–684
• US 2006/0246495 A1 Diagnosis of sepsis
• US 6 960 439 B2 Identification, monitoring and treatment of disease and characterization of biological condition using gene expression profiles
• Vandesompele J, Preter De K, Pattyn F, et al. (2002) Accurate normalisation of real-time quantitative PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology 3(7), research0034.1–0034.11
• Valasek MA, Repa JJ (2005) The power of real-time PCR. Advan Physiol Educ 29, 151–159
• Vapnik V., (1999). The Nature of Statistical Learning Theory. Springer, New York.
• Whitcombe D, Theaker J, Guy SP et al. (1999) Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fouoreschence. Nat Biotechnol 17, 904–907
• WO 2006/100203 A2 Verwendung von Geneaktivitäts-Klassifikatoren für die in vitro Klassifizierung von Genexpressionsprofilen von Patienten mit infektiösem/nichtinfektiösem
• WO 2004/087949 A2 Verfahren zur Erkennung akuter, generalisierter entzündlicher Zustände (SIRS), Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen und systemischen Infektionen
• WO 2005/083115 A2 Verfahren zur Erkennung von Sepsis
• WO 2005/106020 A1 Verfahren zur Erstellung von Kriterien zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei Sepsis
• WO 2006/042581 A1 Verfahren zur Unterscheidung zwischen nichtinfektiösen und infektiösen Ursachen eines Multiorganversagens
• WO 2007/144105 A2 Verfahren zur Feststellung der lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genese
• WO 2007/124820 A2 Verfahren zur in vitro-überwachung postoperativer Veränderungen nach Lebertransplantation
• WO 2003/084388 A2 Early detection of sepsis
• Wong ML, Medrano JF (2005) Real-time PCR for mRNA quantification. Biotechniques 39(1) 1–11
• Zeni F, Freeman B, Natanson C (1997) Anti-inflammatory therapies to treat sepsis and septic shock: A reassessment. Crit Care Med 25(7), 1095–1100
• Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (15)

1. Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; Fokus einer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven und/oder gram-negativen Bakterien; wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Isolierung von Probennukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe; b) Bestimmung von Genaktivitäten mittels einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines für die Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder den Verlauf von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten charakteristischen Multigenbiomarkers; c) Bestimmung von Genaktivitäten wenigstens eines internen Referenzgens, auf die die unter b) bestimmten Genaktivitäten bezogen, insbesondere normalisiert, werden; d) Bilden eines Index-Wertes aus den einzelnen bestimmten normalisierten Genaktivitäten des Multigenbiomarkers, der den pathophysiologischen Zustand anzeigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Referenzgen ein Housekeepinggen ist, insbesondere ausgewählt aus Polynukleotiden der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NO: 676 bis SEQ-ID NO: 686, und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polynukleotidsequenzen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente zur Erfassung der Genexpressionsprofile verwendet werden.
4. Verwendung einer Mehrzahl von Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays als Hilfsmittel zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen ist, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index gebildet wird.
6. Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, erfasst werden.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands, insbesondere der Sepsis oder des sepsisähnlichen Zustandes, ist.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Index auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt wird.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme einsetzt.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen gemäß SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 aufweisen.
11. Verwendung mindestens eines Polynukleotids, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 152 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon, zur Herstellung eines Assays zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs des pathophysiologischen Zustands.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der pathophysiologische Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; lokaler/systemischer Infektion; Verbesserung/Verschlechterung eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Sepsis; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung nach gram-positiv und/oder gram-negativ.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA, ist.
14. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend mindestens einen Multigenbiomarker, welcher eine Mehrzahl von Polynukleotidsequenzen umfasst, die aus dem Pool von SEQ-ID NO: 1 bis SEQ-ID NO: 669 und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten davon ausgewählt sind, und/oder Primer und/oder Sonden und/oder Antisensenukleotide hierfür, wobei der Multigenbiomarker spezifisch für einen pathophysiologischen Zustand eines Patienten ist und solche Zustände einschließt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Überlebenswahrscheinlichkeit bei Sepsis; lokaler/systemischer Infektion; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Fokus einer Infektion; Ursachen eines pathophysiologischen Zustandes, insbesondere Klassifizierung einer Infektion nach gram-positiven oder gram-negativen Erregern.
15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotidsequenzen auch Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente umfassen.

Images