DE102015119006A1

DE102015119006A1 - Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen

Info

Publication number: DE102015119006A1
Application number: DE102015119006.0A
Authority: DE
Inventors: Thomas Moest
Original assignee: Nordmark Arzneimittel GmbH and Co KG
Current assignee: Nordmark Pharma De GmbH
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2017-05-11

Abstract

Für ein Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen bereitzustellen, und insbesondere ein Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Viren, Bakterien, Pilzen, nichtvegetativen Sporen von Bakterien und/oder nichtvegetativen Sporen von Pilzen bereitzustellen, wird ein solches Verfahren vorgeschlagen umfassen die Schritte: Bereitstellen einer Dispersion von Pankreatin in einem Lösungsmittel und anschließendes Erwärmen der Dispersion auf eine Temperatur von 70 bis 130°C.

Description

Einleitung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen umfassend die Schritte: Bereitstellen einer Dispersion von Pankreatin in einem Lösungsmittel und anschließendes Erwärmen der Dispersion auf eine Temperatur von 70 bis 130°C. Die Erfindung betrifft ferner Pankreatin, dadurch gekennzeichnet, dass die Keimbelastung einschließlich nichtvegetativer Sporen 100 KBE/g oder weniger ist und/oder und die Virenbelastung um 2 log Stufen oder mehr reduziert ist. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Lösungsmittels zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Viren und/oder nichtvegetativen Sporen.
Stand der Technik
Als Pankreatin bezeichnet man das extrahierte Gemisch der Enzyme der Pankreasdrüse, bestehend im Wesentlichen aus Lipasen, Amylase und Proteasen. Pankreatin wird als Wirkstoff an Menschen und Säugetiere verabreicht, die unter Verdauungsstörungen leiden, welche durch Enzymmangel hervorgerufen sind oder zumindest durch Enzymzufuhr gelindert werden können. Pankreatin wird insbesondere zur Behandlung von Verdauungsstörungen, die auf Pankreasinsuffizienz beruhen, wie Pankreatitis und zystische Fibrose, verabreicht. Pankreatin wird hautsächlich in getrockneter Form als orales Therapeutikum verwendet.
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Pankreatin dient tierisches Pankreas, hauptsächlich Schweinepankreas in frischem oder gefrorenem Zustand.
Im Hinblick auf die Empfindlichkeit der Enzyme sind Verfahren entwickelt worden, die eine möglichst schonende Gewinnung des Pankreatins ermöglichen sollen. Geeignete Verfahren werden zum Beispiel in den Dokumenten DE 32 48 588 A1 , EP 2 295 039 A1 , WO 2010/022808 A1 und EP 0 436 110 A1 beschrieben.
Ein typisches Verfahren zur Herstellung von Pankreatin ist in der internationalen Offenlegungsschrift WO2010/022808 beschrieben und wird nachstehend unter Bezugnahme auf 1 näher erläutert:
Pankreasdrüsen werden bereitgestellt 1 und dann zerkleinert 2 und nach der Zerkleinerung einer Autolyse 3 unterzogen. Durch Filtration 4 des durch Autolyse erhaltenen Zwischenproduktes wird ein Siebfiltrat gewonnen 5. Die Enzyme, die sich in dem Siebfiltrat befinden, werden anschließend ausgefällt 6, das entstandene Gemisch wird filtriert 7 und der Filterkuchen wird gewonnen 8. Der gewonnene Filterkuchen wird schließlich gemahlen 9, nach dem Mahlen vakuumgetrocknet 10 und nach dem Vakuumtrocknen erneut gemahlen 11, wodurch das Pankreatin erhalten wird 12. Die bei diesem Verfahren auftretenden Zwischenstufen fallen unter den Begriff Pankreatin im Sinne der vorliegenden Erfindung. Dies gilt insbesondere für alle nach Schritt 4 gewonnen Zwischenprodukte.
Da Pankreatin aus dem Gewebe von Tieren gewonnen wird, kann es eine erhebliche Belastung mit Mikroorganismen aufweisen. Es müssen daher bei der Herstellung des Pankreatins nicht nur enzymatisch inaktive Teile des Gewebes abgetrennt werden, sondern es muss auch Sorge getragen werden, dass möglichst wenig Mikroorganismen aus dem Gewebe im Extrakt, also dem Pankreatin, verbleiben. Letzteres gilt insbesondere für Krankheitserreger, aber auch für alle anderen Spezies von Mikroorganismen. Im Idealfall ist Pankreatin völlig frei von Mikroorganismen bei möglichst vollständigem Erhalt der enzymatischen Aktivität. Völlig frei von Mikroorganismen bedeutet im Sinne dieser Erfindung, dass die Mikroorganismen mit den gängigen Methoden nicht mehr nachweisbar sind. Obwohl bis heute kein Fall bekannt geworden ist, bei dem ein Patient durch Verabreichung von Pankreatin eine durch Mikroorganismen hervorgerufene Erkrankung erworben hat, verschärfen Gesundheitsbehörden die Bestimmungen zur Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen. Unabhängig davon, ob ein Mikroorganismus als Krankheitserreger bekannt ist oder nicht, wird verlangt, dass die Belastung mit Mikroorganismen aller Arten auf das niedrigstmögliche Niveau gesenkt wird, um maximale Sicherheit zu erreichen.
Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Viren und Bakterien sind bekannt. Dies kann durch Zugabe von Chemikalien geschehen, durch Erwärmen, wie in der EP 2 295 086 A1 oder der WO 2007/014896 A1 beschrieben oder durch Behandlung des Pankreatins mit hohen Drucken, wie in der EP 2 165 717 A1 beschrieben. Der Zusatz von Chemikalien führt zur Verunreinigung des Pankreatins und die zugesetzten Stoffe müssen gegebenenfalls mit großem Aufwand wieder entfernt werden. Die Wärmebehandlung kann nur dann mit genügend geringem Verlust der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden, wenn bestimmte Verfahrensbedingungen hinsichtlich des Wassergehalts und anderer Parameter eingehalten werden. Dies erfordert zusätzliche Verfahrensschritte zur Trocknung und zur Wärmebehandlung, was unerwünscht ist. Die Druckbehandlung benötigt einen gewissen apparativen Aufwand und wenigstens einen zusätzlichen Verfahrensschritt. Verfahren zur Reduktion der Belastung von Pankreatin mit nichtvegetativen Sporen sind bisher noch nicht beschrieben worden. Nichtvegetative Sporen können jedoch eine erhebliche mikrobielle Belastung des Pankreatins darstellen und sind besonders widerstandsfähig gegen praktisch alle Sterilisationsverfahren.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen bereitzustellen. Es ist insbesondere eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Viren, Bakterien, Pilzen, nichtvegetativen Sporen von Bakterien und/oder nichtvegetativen Sporen von Pilzen bereitzustellen. Bei diesem Verfahren soll darüber hinaus die Enzymaktivität so wenig wie möglich verringert werden und das Verfahren soll mit geringem Aufwand, insbesondere mit geringem apparativem und zeitlichem Aufwand durchführbar sein. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Pankreatin bereitzustellen, welches eine geringe Belastung mit Mikroorganismen, insbesondere Viren, Bakterien, Pilzen, nichtvegetativen Sporen von Bakterien und/oder nichtvegetativen Sporen von Pilzen aufweist und dabei eine hohe enzymatische Aktivität besitzt. Ferner ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mittel bereitzustellen, das geeignet ist, die Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen, insbesondere Viren, Bakterien, Pilzen, nichtvegetativen Sporen von Bakterien und/oder nichtvegetativen Sporen von Pilzen zu vermindern.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen umfassend die Schritte:

– Bereitstellen einer Dispersion von Pankreatin in einem Lösungsmittel und
– anschließendes Erwärmen der Dispersion auf eine Temperatur von 80 bis 130°C.

Pankreatin im Sinne der vorliegenden Erfindung ist jedes Material, das aus tierischem Pankreas stammende Enzyme mit lipolytischer, amylolytischer und/oder proteolytischer Aktivität enthält. Pankreasorgane selbst gehören jedoch nicht dazu. Bevorzugt enthält das Pankreatin Enzyme mit lipolytischer Aktivität, Enzyme mit amylolytischer Aktivität und Enzyme mit proteolytischer Aktivität. Insbesondere sind auch alle Zwischenprodukte, die bei der Herstellung von Pankreatin auftreten, Pankreatin im Sinne dieses Verfahrens. Natürlich ist auch das Endprodukt Pankreatin des Herstellungsverfahrens ein Pankreatin im Sinne dieses Verfahrens. Mikroorganismen in Sinne dieser Erfindung können alle Arten von Mikroorganismen sein, insbesondere handelt es sich aber um Bakterien, Viren, Pilze, Sporen von Bakterien und Sporen von Pilzen. Pilze und deren Sporen stellen in der Regel jedoch kein Problem bei der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen dar.
Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass die Menge wenigstens einer Spezies von Mikroorganismus nach der Anwendung des Verfahrens geringer ist als vor der Anwendung des Verfahrens. Lösungsmittel im Sinne dieser Erfindung sind Flüssigkeiten, die in der Lage sind, Pankreatin zu dispergieren. Da Pankreatin ein inhomogenes Gemisch aus verschiedensten Bestandteilen ist, das je nach Herkunft und Verarbeitung verschieden zusammengesetzt ist, ist nicht ausgeschlossen, dass sich Teile des Pankreatins im Lösungsmittel lösen. Das Lösungsmittel ist jedoch nicht dazu bestimmt, die Enzyme des Pankreatins zu lösen. Lösungsmittel sind daher Flüssigkeiten, die weitgehend inert in Bezug auf die im Pankreatin enthaltenen Enzyme sind und mit dem Pankreatin eine Dispersion zu bilden vermögen. Als Lösungsmittel im erfindungsgemäßen Verfahren können auch Gemische von Lösungsmitteln eingesetzt werden. Bevorzugt können auch Mischungen von Wasser und einem anderen Lösungsmittel, zum Beispiel wässrige Lösungsmittel, eingesetzt werden. Reines Wasser ist jedoch weniger bevorzugt, weil es die Aktivität der im Pankreatin enthaltenen Enzyme verringern kann. In der Regel werden jedoch kleinere Mengen Wasser durch das Pankreatin in das Lösungsmittel eingetragen. Wenn das Lösungsmittel Wasser enthält, ist es bevorzugt, dass der Wassergehalt 10 Volumenprozent oder weniger, bezogen auf die Lösungsmittelmenge, beträgt. Ebenfalls bevorzugt ist der Wassergehalt 1 Volumenprozent oder weniger, bezogen auf die Lösungsmittelmenge. Besonders bevorzugt ist der Wassergehalt 0,3 Volumenprozent oder weniger, bezogen auf die Lösungsmittelmenge. Am meisten bevorzugt ist der Wassergehalt 0,1 Volumenprozent oder weniger, bezogen auf die Lösungsmittelmenge.
Die Wassermenge im Lösungsmittel wird bevorzugt durch gravimetrische Bestimmung nach Entfernen des Wassers durch azeotrope Destillation oder Trockenmittel gemessen.
Das erfindungsgemäße Verfahren reduziert die Belastung des Pankreatins mit Mikroorganismen in einfacher Weise und mit geringem Aufwand, ohne die enzymatische Aktivität des Pankreatins stark zu beeinträchtigen. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es mit von Lösungsmitteln befeuchtetem Pankreatin durchgeführt werden kann, ohne dass die Lösungsmittel vorher entfernt werden müssen. Mit Lösungsmittel befeuchtetes Pankreatin fällt als Zwischenstufe bei der Herstellung von Pankreatin an. Die Entfernung solcher Lösungsmittel erfordert eine aufwendige Prozedur. Die direkte Verwendung einer solchen Zwischenstufe, wie sie bei der Herstellung von Pankreatin auftritt, zur Reduzierung der Belastung der Zwischenstufe mit Mikroorganismen führt zu einem Endprodukt mit verminderter Belastung mit Mikroorganismen. Ein solches Verfahren stellt gegenüber den bekannten Verfahren eine starke Vereinfachung dar.
Die Herabsetzung der Belastung des Pankreatins mit Mikroorganismen, bei gleichzeitigem weitgehendem Erhalt der enzymatischen Aktivität ist ein überraschender Effekt. Dies gilt insbesondere, da die bisher bekannten Verfahren zur Herabsetzung der Belastung des Pankreatins mit Mikroorganismen durch Wärmebehandlung stets nur an Feststoffen durchgeführt wurden (siehe EP 2 295 086 A1 und WO 2007/014896 A1 ). Im Zusammenhang mit den bisher bekannten Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen wird stets darauf hingewiesen, dass schon geringe Anteile von Lösungsmitteln oder Wasser im Pankreatin zur Deaktivierung der empfindlichen Enzyme führen (siehe 5 von EP 2 295 086 A1 und 3 von WO 2007/014896 A1 ). Umso überraschender ist es, dass mit dem vorliegenden Verfahren die Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen in Lösungsmitteln unter vollständigem oder weitgehendem Erhalt der Aktivität der Enzyme gelingt. Dies war nicht vorherzusehen.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, worin die Mikroorganismen ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Viren, Pilzen, Sporen von Bakterien und Sporen von Pilzen. Bakterien, Viren und Pilze sind die wesentlichen Mikroorganismen, die im menschlichen Körper Erkrankungen hervorrufen. Sie stellen gleichzeitig in Menge und Artenvielfalt die wesentliche Verunreinigung des tierischen Gewebes dar, aus dem Pankreatin gewonnen wird. Das Verfahren muss daher so gesteuert werden, dass solche Mikroorganismen abgetötet werden, ohne dass die enzymatische Aktivität herabgesetzt wird. Sporen von Bakterien und Pilzen sind eine Form derselben, in der die Bakterien und Pilze nicht vermehrungsfähig sind. Sie können jedoch bei Eintreten günstiger Lebensbedingungen in vegetative, also vermehrungsfähige Formen, überführt werden. Sporen von Bakterien und Pilzen sind daher ebenso problematisch wie Bakterien und Pilze selbst. Sporen zeichnen sich jedoch dadurch aus, dass sie besonders widerstandsfähig sind und noch unter sehr viel drastischeren Bedingungen überleben können als Viren, Bakterien und Pilze. Sporen von Bakterien und Pilzen überleben daher oft die Sterilisation von Pankreatin in großen Mengen unbeschadet. Es ist daher ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass es die Belastung von Pankreatin mit Sporen von Bakterien und Pilzen verringern kann.
Die derzeit geläufigen Verfahren zur Herstellung von Pankreatin führen weitgehend zur Abtötung von vegetativen Bakterien und Pilzen, die im Pankreatin enthalten sein mögen. Wie oben angemerkt, stellt die Belastung von Pankreatin mit Sporen von Pilzen in der Regel kein Problem dar. Handelsübliches Pankreatin ist jedoch mit Viren und insbesondere mit Sporen von Bakterien belastet. Besonders bevorzugt ist daher ein erfindungsgemäßes Verfahren wie hierin beschrieben zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Viren und Sporen von Bakterien. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wie hierin beschrieben zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Viren. Ganz besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wie hierin beschrieben zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Sporen von Pilzen.
Besonders bevorzugt ist ebenfalls ein erfindungsgemäßes Verfahren wie in diesem Dokument beschieben, worin die Mikroorganismen Krankheitserreger sind. Obwohl, wie vorstehend beschrieben, die Reduzierung der Belastung mit allen Mikroorganismen Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, ist es jedoch ein besonders wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass die Belastung des Pankreatins mit Krankheitserregern, insbesondere mit bekannten Krankheitserregern, reduziert wird.
Bevorzugt ist ebenfalls, dass das Erwärmen im erfindungsgemäßen Verfahren unter Sieden des Lösungsmittels erfolgt. Dies erlaubt eine unkomplizierte und genaue Einstellung der Reaktionstemperatur ohne starke lokale Temperaturspitzen, welche zur Deaktivierung der Enzyme führen könnten. In Lösungsmittelgemischen muss das am tiefsten siedende Lösungsmittel zum Sieden gebracht werden. In Lösungsmittelgemischen, in denen azeotrop siedende Gemische entstehen, wird das am tiefsten siedende azeotrope Gemisch zum Sieden gebracht. Dies kann auch der Fall sein, wenn nur ein Lösungsmittel verwendet wird, das mit im Pankreatin eventuell enthaltendem Wasser oder anderen Substanzen ein azeotropes Gemisch bildet.
Die Anwesenheit von Wasser beim Erwärmen von Pankreatin kann zur Deaktivierung der Enzyme des Pankreatins führen. Das Wasser wird daher bevorzugt entfernt. Dies kann vor der Wärmebehandlung zum Beispiel durch Verdampfen im Vakuum oder durch Wasser absorbierende Mittel oder durch Pervaporation geschehen. Wenn die im erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellte Dispersion Wasser enthält, wird das Wasser jedoch bevorzugt während des Erwärmens durch azeotrope Destillation entfernt. Dies ist die einfachste Methode, da sie nur geringen zusätzlichen Aufwand erfordert und es erlaubt das Wasser schnell und problemlos zu entfernen. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, worin die Dispersion Wasser enthält und worin das Wasser unter Sieden eines azeotropen Gemisches mittels kontinuierlicher Wasserabscheidung in einer Rückflusskolonne mit Kopfkühlung und einer Wasser absorbierenden Einlage als Füllkörper abgeschieden wird. Dieses Verfahren erlaubt es auch Lösungsmittel zu verwenden, bei denen wegen einer ungenügenden Mischungslücke unter den Verfahrensbedingungen keine oder keine genügende Entmischung von Wasser und Lösungsmittel im kondensierten Gemisch auftritt. Diese Verfahren ermöglicht es, auch sehr geringe Mengen von Wasser aus der Dispersion zu entfernen. Somit erlaubt diese Methode, nach anfänglichem azeotropen Entfernen des Wassers, das weitere Erwärmen und damit die Reduzierung der Belastung mit Mikroorganismen in einer wasserfreien Dispersion oder in einer Dispersion mit einer sehr geringen Restmenge von Wasser durchzuführen. Dies dient dem besonders weitgehenden Erhalt der enzymatischen Aktivität des Pankreatins, ohne aufwendige zusätzliche Maßnahmen durchführen zu müssen. Als Einlage wird bevorzugt Kieselgel verwendet. Andere Wasser absorbierende oder adsorbierende Mittel können ebenfalls verwendet werden.
Bevorzugt wird das Erwärmen im erfindungsgemäßen Verfahren über eine Zeitspanne von 0,1 bis 10 Stunden durchgeführt. Dies garantiert für gewöhnlich eine möglichst weitgehende Reduzierung der Belastung mit Mikroorganismen bei gleichzeitigem weitgehendem Erhalt der enzymatischen Aktivität. Besonders bevorzugt ist eine Zeitspanne von 0,5 bis 6 Stunden und am meisten bevorzugt eine Zeitspanne von 1 bis 4 Stunden.
Als Lösungsmittel sind polare und unpolare Lösungsmittel einsetzbar. Polare Lösungsmittel sind jedoch bevorzugt. Der Grund hierfür liegt darin, dass Pankreatin selbst, also das Gemisch der darin enthaltenen Enzyme und die anhaftenden Reste des tierischen Gewebes im Wesentlichen polar sind. Polare Lösungsmittel sind daher besser mit Pankreatin mischbar. Bei sehr unpolaren Lösungsmitteln besteht die Möglichkeit, dass ein Wasser enthaltendes Pankreatin eine flüssige oder halbflüssige Phase innerhalb der Lösungsmittelphase bildet. Dies würde zu einer Dispersion von Pankreatin in einer wässrigen Phase führen, die wiederum in der Lösungsmittelphase emulgiert ist. Daher würde eine Erwärmung des Pankreatins in einer Emulsion aus einem Pankreatin-Wasser-Gemisch im Lösungsmittel stattfinden. Eine solche Verfahrensweise könnte durch den intensiven Kontakt mit dem Wasser beim Erwärmen zu einer starken Deaktivierung der Enzyme des Pankreatins führen. Ob ein bestimmtes Lösungsmittel für ein bestimmtes Pankreatin geeignet ist, lässt sich jedoch leicht durch Vorversuche herausfinden. Bevorzugt werden im vorliegenden Verfahren Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von 8 oder mehr, besonders bevorzugt von 10 oder mehr und ganz besonders von 12 oder mehr eingesetzt. Bevorzugt wird Wasser jedoch nicht als Lösungsmittel verwendet.
Das verwendete Lösungsmittel kann zum Beispiel ausgesucht werden aus der Gruppe bestehend aus Alkanen, Alkenen, Alkinen, Aromaten, Carbonsäureestern, Ethern, Kohlenstoffdisulfid, Kohlenstoffdioxid halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ketone, Lactone, Lactame, Nitrile, Nitroverbindungen, insbesondere Nitromethan, Carbonsäureamide, insbesondere tertiäre Carbonsäureamide, Harnstoffderivate wie Tetramethylharnstoff oder Dimethylpropylenharnstoff, Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid, Sulfone wie Sulfolan, Kohlensäureester wie Dimethylkarbonat oder Ethylenkarbonat und Alkohole. Bevorzugt sind jedoch Alkohole. Ebenfalls bevorzugt sind Ketone.
Ganz besonders bevorzugt ist das Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, tert. Butanol, 2-Methyl-1-butanol, Butanon, 2-Pentanon, 3-Pentanon, 1,2-Propandiol und 1,3-Propandiol und deren Gemische. Diese Lösungsmittel erlauben die effektive Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen, ohne die enzymatische Aktivität wesentlich zu beeinflussen. Methanol und 1-Butanol sind jedoch toxisch und das Pankreatin muss daher nach dem Erwärmen im stärkeren Ausmaß von ihnen befreit werden, als dies bei anderen Lösungsmitteln erforderlich ist. Das Lösungsmittel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird deshalb bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 2-Butanol, tert.-Butanol, 2-Methyl-1-butanol, Butanon, 2-Pentanon, 3-Pentanon, 1,2-Propandiol und 1,3-Propandiol und deren Gemische.
Aceton und Isopropanol werden häufig bei der Gewinnung und Reinigung des Pankreatins verwendet. Die bei der Herstellung von Pankreatin anfallenden Zwischenprodukte, die dem vorliegenden Verfahren unterzogen werden können, sind daher meist mit zumindest einem diese Lösungsmittel in verschiedenem Ausmaß kontaminiert. Idealerweise wird im vorliegenden Verfahren das gleiche Lösungsmittel verwendet, das bereits während der Herstellung des Pankreatins oder seiner Zwischenprodukte verwendet wurde. Es ist außerdem bekannt, dass diese Lösungsmittel die enzymatische Aktivität des Pankreatins kaum beeinträchtigen. Aceton und Isopropanol sind daher besonders bevorzugte Lösungsmittel im vorliegenden Verfahren. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von Isopropanol.
Protische Lösungsmittel weisen eine schwache Azidität auf, die die Enzymstabilität nachteilig beeinflussen kann. Erhitzen in einem bevorzugt schwach alkalischen Milieu, in einem basischen Lösungsmittel oder in einem protischen oder aprotischen Lösungsmittel, dem ein basisches Lösungsmittel oder ein andere geeignete basische Verbindung zugesetzt wurde, kann die Enzyme in einem solchen Fall stabilisieren. Als basische Lösungsmittel in einem geeigneten Siedepunktsbereich können beispielsweise eingesetzt werden: Pyridin, Pyrrol, Piperidin, Dimethylaminoethanol, Trimethylamin, Diisopropylethylamin und weitere lineare oder heterocyclische Stickstoffverbindungen mit amin-, imin-, enamin-, Strukturen deren Siedepunkte im Bereich von 30 bis 200°C, bevorzugt in einem Bereich von 60 bis 150°C liegen. Nach dem Erhitzen werden die basischen Lösungsmittel abfiltriert, mit Standardlösungsmitteln wie z. B. Isopropanol oder Aceton ausgewaschen und/oder im Vakuum über einem sauren Basenabsorber getrocknet. Die Eignung eines basischen Lösungsmittels oder einer basischen Verbindung kann durch einfaches Ausprobieren und Messen der enzymatischen Aktivität bestimmt werden.
Der Siedepunkt des Lösungsmittels oder der Lösungsmittel kann im vorliegenden Verfahren durch Druckveränderung geeignet eingestellt werden. Soll die Dispersion auf eine Temperatur erwärmt werden, die oberhalb des Siedepunkts des Lösungsmittels liegt, kann der Druck entsprechend erhöht werden. Soll unter Sieden gearbeitet werden und der Siedepunkt des Lösungsmittels ist höher als die gewünschte Reaktionstemperatur, so kann der Druck erniedrigt werden. Es ist daher eine bevorzugte Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens, dass das Verfahren bei Drucken von 0,01 bis 100 bar durchgeführt wird, besonders bevorzugt bei 0,1 bis 20 bar. Ganz besonders bevorzugt ist ein Druck in einem Bereich von 1 bar bis 5 bar. Ebenfalls bevorzugt ist jedoch ein Druck von 0,8 bar bis 1,2 bar.
Bevorzugt ist jedoch ebenfalls ein erfindungsgemäßes Verfahren, dass bei einem Druck von mehr als 1 bar durchgeführt wird. Besonders bevorzugt ist ein solches Verfahren, bei dem das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, Aceton und Butanon. Ganz besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, worin als Lösungsmittel Aceton oder 2-Propanol verwendet wird und das bei einem Druck von mehr als 1 bar durchgeführt wird. 2-Propanol ist dabei gegenüber Aceton bevorzugt. Am meisten bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem 2-Propanol verwendet wird und worin das Erwärmen der Dispersion bei einem Druck in einem Bereich von 1 bar bis 5 bar erfolgt.
Anschließend an das Erwärmen wird die Dispersion in der Regel abgekühlt. Bevorzugt wird sie auf unter 80°C abgekühlt, besonders bevorzugt auf eine Temperatur unter 40°C, ganz besonders bevorzugt auf eine Temperatur im Bereich von 0°C bis 30°C und am meisten bevorzugt auf eine Temperatur im Bereich von 10°C bis 30°C.
Anschließend an das Erwärmen oder, wenn die Dispersion nach dem Erwärmen abgekühlt wurde, nach dem Abkühlen wird bevorzugt das Lösungsmittel entfernt. Hierzu kann die Dispersion zur Gewinnung des Pankreatins filtriert werden. Dies ist bevorzugt ein weiterer Schritt des vorliegenden Verfahrens. Das nach dem Filtrieren verbleibende Restlösungsmittel im Pankreatin wird bevorzugt ebenfalls entfernt. Dies geschieht bevorzugt durch Verdampfen des Lösungsmittels, insbesondere durch Anlegen eines Vakuums. Eine weitere bevorzugte Option ist die Zufuhr von Wärme während des Verdampfens des Lösungsmittels, was auch bevorzugt mit dem Anlegen eines Vakuums kombiniert wird. Bevorzugt wird der Filterkuchen nicht nur vom anhaftenden Lösungsmittel, sondern auch von eventuell enthaltenem Wasser und anderen flüchtigen Bestandteilen, soweit vorhanden gleichzeitig und durch Anwendung der gleichen Maßnahmen durch Verdampfen befreit. Bevorzugt ist daher ein erfindungsgemäßes Verfahren, worin das Pankreatin nach dem Erwärmen abfiltriert wird und anschließend im Vakuum vom anhaftenden Lösungsmittel und gegebenenfalls vorhandenem Restwasser befreit wird. Es ist weiterhin bevorzugt, wenn bei diesem Verfahren das Pankreatin bei einer Temperatur von 40 bis 70°C und einem Druck von 5 mbar bis 100 mbar von flüchtigen Bestandteilen ganz oder teilweise befreit wird. Flüchtige Bestandteile im Sinne dieser Erfindung schließen das oder die Lösungsmittel und Wasser ein.
Bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Lösungsmittel verwendet, das einen Siedepunkt bis zu 200°C, besonders bevorzugt von bis zu 150°C hat. Lösungsmittel mit einem solchen Siedepunkt können nach dem Ende des Erwärmens und gegebenenfalls nach Filtrieren durch Verdampfen leicht entfernt werden. Hochsiedende Lösungsmittel, die auf diesem Weg nicht oder nicht im genügenden Maße entfernt werden können, müssen durch andere, dem Fachmann bekannte Methoden entfernt werden. Dies kann zum Beispiel durch Auswaschen des hochsiedenden Lösungsmittels mit einem tiefer siedenden Lösungsmittel geschehen. Das tiefer siedende Lösungsmittel kann dann anschließend durch Filtration und folgende Verdampfung der im Filterkuchen verbliebenen tiefsiedenden Lösungsmittel entfernt werden.
Bevorzugt enthält das fertige Pankreatin weniger als 1%, besonders bevorzugt weniger als 0,5%, ganz besonders bevorzugt weniger als 0,3% und am meisten bevorzugt weniger als 0,1% flüchtige Bestandteile, bezogen auf die Gesamtmenge des Pankreatins einschließlich aller flüchtigen Bestandteile, was Lösungsmittel und Wasser einschließt. Diese Mengen werden als Gesamtwerte anhand des Trocknungsverlustes bestimmt. Dies geschieht gemäß der Methode wie in der „European Pharmacopoeia", 6. Auflage, Ergänzungsband (Supplement) 6.2, Seite 3813, linke Spalte unter dem Titel „Loss on drying" angegeben. Die darin erwähnte Methode wird in dem Band „European Pharmacopoeia", 6. Auflage, Band 1, Seiten 53 und 54, Punkt 2.2.32 näher ausgeführt.
Die Lipase-Aktivität des Pankreatins nach dem erfindungsgemäßen Verfahren beträgt bevorzugt zumindest 50% der Lipase-Aktivität des Pankreatins vor der Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, besonders bevorzugt zumindest 70% und ganz besonders bevorzugt zumindest 90%. Die Amylase-Aktivität des Pankreatins nach dem erfindungsgemäßen Verfahren beträgt bevorzugt zumindest 50% der Amylase-Aktivität des Pankreatins vor der Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, besonders bevorzugt zumindest 70% und ganz besonders bevorzugt zumindest 90%. Die Protease-Aktivität des Pankreatins nach dem erfindungsgemäßen Verfahren beträgt bevorzugt zumindest 50% der Protease-Aktivität des Pankreatins vor der Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, besonders bevorzugt zumindest 70% und ganz besonders bevorzugt zumindest 90%. Bevorzugt gilt dies gleichzeitig für die Lipase-Aktivität, die Amylase-Aktivität und die Protease-Aktivität des Pankreatins. Die enzymatischen Aktivitäten von Pankreatin werden gemäß der Monografie ”Pancreas powder”, veröffentlicht in der Pharmacopoeia Europaea 6.2, 01/2008:0350, bestimmt.
Ganz besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wie hierin beschrieben, bei dem die Keimbelastung einschließlich nichtvegetativer Sporen auf 100 KBE/g oder weniger reduziert wird. Die Bestimmung der Keimbelastung erfolgt mit der Methode bevorzugt gemäß Pharmacopoeia Europaea 2.6.12, kann jedoch auch mit der methodisch identischen, jedoch im Limit abweichenden, Methode gemäß United States Pharmacopeia Kap. 61 erfolgen. Diese erfasst sowohl die vegetative Form als auch die Sporen. Unter Keimbelastung ist dabei die Belastung mit Bakterien und Sporen von Bakterien zu verstehen.
Die virale Infektiosität des Pankreatins nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sollte um einen Faktor von 1 log10 oder mehr, vorzugsweise 3 log10 oder mehr, besonders bevorzugt 4 log10 oder mehr, im Vergleich zur viralen Infektiosität des Pankreatins vor dem erfindungsgemäßen Verfahren verringert worden sein. Dies gilt insbesondere auch für die virale Infektiosität von unbehüllten Viren. Beispielsweise sollte die Infektiosität von unbehüllten Viren im Pankreatin nach der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens um einen Faktor von 1 log10 oder mehr, vorzugsweise 3 log10 oder mehr, besonders bevorzugt 4 log10 oder mehr, im Vergleich zu dessen Infektiosität vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verringert sein. Die virale Infektiosität wird durch Endpunkttitration und anschließende Berechnung des Halbwertes der Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) gemäß der Spearman-Kärber-Formel berechnet (Bundesanzeiger, Nr. 84, 4. Mai 50 1994). Die so errechneten Virustiter werden als log10 TCID50 pro ml mit Konfidenzintervallen von 95% angegeben.
Bevorzugt ist ebenfalls ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die virale Belastung um 2 log Stufen reduziert wird. Die Reduktion der viralen Belastung wird gemäß der EG-Richtlinie CMMP/BWP/268/95, Anhang II) als logarithmischer Reduktionsfaktor angegeben, der die Differenz der Virustiter zwischen einer Kontrollprobe und den mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Proben ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich auch dadurch aus, dass es sich zwanglos in das Verfahren gemäß dem Stand der Technik integrieren lässt, wie es in 1 und vorstehend beschrieben ist. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Pankreatin umfassend die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge:

1. Bereitstellen von Pankreasdrüsen;
2. Zerkleinern der Pankreasdrüsen
3. Autolyse der zerkleinerten Pankreasdrüsen;
4. Filtration der bei der Autolyse entstandenen Dispersion;
5. Gewinnung des Siebfiltrats
6. Fällung der freigesetzten Enzyme
7. Filtration des Niederschlags
8. Gewinnung des Filterkuchens
9. Mahlung des Filterkuchens
10. Vakuumtrocknung des gemahlenen Filterkuchens
11.und Mahlung des vakuumgetrockneten Filterkuchens zum fertigen Pankreatin,

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Herstellung von Pankreatin umfassend die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge:

1. Bereitstellen von Pankreasdrüsen;
2. Zerkleinern der Pankreasdrüsen;
3. Autolyse der zerkleinerten Pankreasdrüsen;
4. Filtration der bei der Autolyse entstandenen Dispersion;
5. Gewinnung des Siebfiltrats;
6. Fällung der freigesetzten Enzyme;
7. Filtration des Niederschlags;
8. Gewinnung des Filterkuchens;
9. Redispergierung des Filterkuchens in einem Lösungsmittel;
10. Erwärmen der Dispersion auf eine Temperatur von 70 bis 130°C;
11. Filtration und gegebenenfalls Mahlen des erhaltenen Filterkuchens;
12. Vakuumtrocknung des gemahlenen Filterkuchens;
13. und Mahlung des vakuumgetrockneten Filterkuchens zum fertigen Pankreatin.

In dem vorstehend genannten Verfahren wird bevorzugt im Filterkuchen gemäß Schritt 8 noch vorhandenes Restwasser vor der Durchführung von Schritt 9 entfernt. Bevorzugt geschieht dies durch azeotrope Destillation.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Herstellung von Pankreatin umfassend die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge:

1. Bereitstellen von Pankreasdrüsen;
2. Zerkleinern der Pankreasdrüsen
3. Autolyse der zerkleinerten Pankreasdrüsen;
4. Filtration der bei der Autolyse entstandenen Dispersion;
5. Gewinnung des Siebfiltrats
6. Fällung der freigesetzten Enzyme
7. Filtration des Niederschlags
8. Gewinnung des Filterkuchens
9. Mahlung des Filterkuchens
10. Vakuumtrocknung des gemahlenen Filterkuchens
11. Redispergierung des Filterkuchens in einem Lösungsmittel;
12. Erwärmen der Dispersion auf eine Temperatur von 70 bis 130°C;
13. Filtration der Dispersion;
14. Mahlung des Filterkuchens
15. Vakuumtrocknung des gemahlenen Filterkuchens
16. und Mahlung des vakuumgetrockneten Filterkuchens zum fertigen Pankreatin.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist Pankreatin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Keimbelastung, einschließlich nichtvegetativer Sporen, 100 KBE/g oder weniger ist. Ein solches Pankreatin ist bisher unbekannt. Es bietet den Patienten eine höhere Sicherheit gegen infektiöse Krankheiten. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Pankreatins ist die Virenbelastung 10^–X oder weniger.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Lösungsmittels zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit nichtvegetativen Sporen. Dabei werden bevorzugt die in diesem Dokument für das erfindungsgemäße Verfahren als bevorzugt bezeichneten Lösungsmittel verwendet.
Beispiel:

Zur Untersuchung der Keimreduzierung in erwärmten Lösungsmitteln wurde zunächst die Keimbelastung eines Pankreatins bestimmt. Anschließend wurden y g des Pankreatins in z ml Lösungsmittel dispergiert. Anschließend an die Dispergierung wurde die hergestellte Dispersion erwärmt. Schließlich wurde nach dem Abkühlen und Entfernen des Lösungsmittels die Keimbelastung des so erhaltenen Pankreatins bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabellen 1 und 2 für zwei verschieden Ausgangsmaterialien dargestellt: Tabelle 1: Ausgangsmaterial 1: Feuchtigkeitsgehalt x %

Lösungsmittel	Zeit [Std]	Temperatur [oC]	Keimbelastung		Lipaseaktivität
Lösungsmittel	Zeit [Std]	Temperatur [oC]	KBE/g	[%]	[U/g]	[%]
Ausgangsmaterial	0	kA	15.000	100	107.215	100
2-Pentanol	1	119	3.500	23	87.551	82
2-Pentanol	4	119	100	1	85.110	79
Toluol	1	111	6.000	40	100.480	94
Toluol	4	111	1.000	7	91.810	86

Tabelle 2: Ausgangsmaterial 2: Feuchtigkeitsgehalt x %

Lösungsmittel	Zeit [Std]	Temperatur [oC]	Keimbelastung		Lipaseaktivität
Lösungsmittel	Zeit [Std]	Temperatur [oC]	KBE/g	[%]	[U/g]	[%]
Ausgangsmaterial	0	kA	96.000	100	104.475	100
1-Butanol	1	119	750	1	94.460	90
1-Butanol	4	119	500	1	78.645	75
2-Butanol	1	111	7.000	7	104.916	100
2-Butanol	4	111	1.950	2	104.194	100

kA: keine Angabe

Die enzymatischen Aktivitäten von Pankreatin wurden gemäß der Monografie ”Pancreas powder”, veröffentlicht in der Pharmacopoeia Europaea 6.2, 01/2008:0350, bestimmt. Die Bestimmung der Keimbelastung erfolgte nach der Methode gemäß Pharmacopoeia Europaea 2.6.12. Der Wassergehalt der eingesetzten Lösungsmittel lag im Bereich von 0,01 bis 0,2% Gew.-%.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 3248588 A1 [0004]
EP 2295039 A1 [0004]
WO 2010/022808 A1 [0004]
EP 0436110 A1 [0004]
WO 2010/022808 [0005]
EP 2295086 A1 [0007, 0014, 0014]
WO 2007/014896 A1 [0007, 0014, 0014]
EP 2165717 A1 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

„European Pharmacopoeia”, 6. Auflage, Ergänzungsband (Supplement) 6.2, Seite 3813, linke Spalte unter dem Titel „Loss on drying” [0031]
„European Pharmacopoeia”, 6. Auflage, Band 1, Seiten 53 und 54, Punkt 2.2.32 [0031]
Pharmacopoeia Europaea 6.2, 01/2008:0350 [0032]
Pharmacopoeia Europaea 2.6.12 [0033]
United States Pharmacopeia Kap. 61 [0033]
EG-Richtlinie CMMP/BWP/268/95, Anhang II [0035]
Pharmacopoeia Europaea 6.2, 01/2008:0350 [0043]
Pharmacopoeia Europaea 2.6.12 [0043]

Claims

Verfahren zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit Mikroorganismen umfassend die Schritte: – Bereitstellen einer Dispersion von Pankreatin in einem Lösungsmittel und – anschließendes Erwärmen der Dispersion auf eine Temperatur von 70 bis 130°C.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mikroorganismen ausgesucht sind aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Viren, Pilzen, Sporen von Bakterien und Sporen von Pilzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die Mikroorganismen Krankheitserreger sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin das Lösungsmittel einen Siedepunkt bis zu 200°C hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Erwärmen unter Sieden des Lösungsmittels erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Dispersion Wasser enthält und das Wasser durch azeotrope Destillation entfernt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Dispersion Wasser enthält und worin das Wasser unter Sieden eines azeotropen Gemisches mittels kontinuierlicher Wasserabscheidung in einer Rückflusskolonne mit Kopfkühlung und einer Wasser absorbierenden Einlage als Füllkörper abgeschieden wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Erwärmen über eine Zeitspanne von 0,5 bis 5 Stunden durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Lösungsmittel ein Alkohol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Lösungsmittel ein Keton ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, tert. Butanol, 2-Methyl-1-butanol, Butanon, 2-Pentanon, 3-Pentanon, 1,2-Propandiol und 1,3-Propandiol und deren Gemische.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 11, worin als Lösungsmittel 2-Propanol verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, insbesondere nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 7, worin das Verfahren bei Drucken von 0,01 bar bis 100 bar durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, insbesondere nach einem der Ansprüche 5, 6, 7 oder 12 worin das Verfahren unter einem Druck von mehr als 1 bar durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, Aceton und Butanon.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das Erwärmen der Dispersion bei einem Druck in einem Bereich von mehr als 1 bar bis 5 bar erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin das Pankreatin nach dem Erwärmen abfiltriert wird und anschließend im Vakuum vom anhaftenden Lösungsmittel und gegebenenfalls vorhandenem Restwasser befreit wird.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Pankreatin bei einer Temperatur von 40 bis 70°C und einem Druck von 5 mbar bis 100 mbar vom Lösungsmittel und von Wasser befreit wird.
Pankreatin, dadurch gekennzeichnet, dass die Keimbelastung, einschließlich nichtvegetativer Sporen, 100 KBE/g oder weniger ist.
Pankreatin, dadurch gekennzeichnet, dass die Belastung durch Viren 10^–X oder weniger ist.
Verwendung eines Lösungsmittels zur Reduzierung der Belastung von Pankreatin mit nichtvegetativen Sporen.