DE102009058169B4

DE102009058169B4 - Protein oder Polypeptid zur Bindung an Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen

Info

Publication number: DE102009058169B4
Application number: DE200910058169
Authority: DE
Inventors: Patentinhaber gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2012-06-28
Anticipated expiration: 2029-12-16
Also published as: WO2011072647A1; DE102009058169A1

Abstract

Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend e) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine Teilsequenz davon; oder f) eine von SEQ ID NO: 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, wobei das Protein oder Polypeptid mindestens einen lysinreichen Sequenzbereich umfasst und an Tubulin bindet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend

a) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine Teilsequenz davon; oder
b) eine von SEQ ID NO: 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz,

Mikrotubuli sind neben Mikrofilamenten und Intermediärfilamenten ein wichtiger Bestandteil der Zytoskelettstruktur eukaryontischer Zellen. Das Zytoskelett erfüllt nicht nur statische, strukturelle Aufgaben, es ist auch an der Entwicklung und der Funktion einzelner Zelltypen maßgeblich beteiligt. Grundbaustein der hohlzylindrisch aufgebauten Mikrotubuli sind Protofilamente, welche vornehmlich aus α- und β-Tubulin Heterodimeren gebildet werden. Im Zentrosom der Zelle wird zudem auch γ-Tubulin exprimiert, welches an der Bildung neuer Mikrotubuli im Zentrosombereich beteiligt ist. Mikrotubuli bilden das Gerüst für intrazelluläre Transportprozesse und sind an der Bildung des Spindelapparats während der Zellteilung maßgeblich beteiligt. Der Auf- und Abbauprozess der Mikrotubuli ist sehr dynamisch und wird durch das MTOC (microtubule organizing center) zentral gesteuert.
Ein intaktes Zytoskelett, insbesondere eine intakte Mikrotubulistruktur ist physiologisch von großer Bedeutung, um den korrekten Transport und eine gleichmäßige Verteilung verschiedener wichtiger Proteine und Zellorganellen zu gewährleisten. Defekte in der Funktionalität der Mikrotubulistrukturen oder deren assoziierten Proteinen können zu schwere Krankheiten wie beispielsweise Alzheimer führen. Zudem werden Chemotherapeutika, wie Vinblastin oder Paclitaxel gezielt eingesetzt, um den korrekten Aufbau von Mikrotubuli in Krebszellen zu stören. Eine unkontrollierte Zellteilung wird dadurch gehemmt. Für das bessere Verständnis der Zytoskelettstrukturen und dem möglichen Einfluss von Medikamenten auf Mikrotubuli ist es von erheblicher Bedeutung, Zytoskelettstrukturen, insbesondere Mikrotubulistrukturen und ihre Veränderungen in Zellen nachzuweisen.
Im Stand der Technik sind bereits spezifische Antikörper bekannt, die zum Nachweis von Tubulin in vitro oder in vivo verwendet werden können. WO 2007/095359 A2 offenbart beispielsweise den Nachweis von Tubulin in Zellen durch die Antikörper DM1-α, YL1-2 und 3A2. Dem Fachmann sind viele weitere tubulinspezifische Antikörper bekannt. Der Nachweis von Tubulin und damit auch Mikrotubulistruturen mit Hilfe von Antikörper hat jedoch grundsätzlich einen erheblichen Nachteil. Der Nachweis über Antikörper muss in der Regel in einem mehrschrittigen Verfahren durchgeführt werden. Hierzu wird zunächst ein tubulinspezifischer Primärantikörper an Tubulin gebunden. Dieser wird dann einem zweiten Schritt mit einem gegen den Primärantikörper gerichteten, chemisch markierten Sekundärantikörper über Fluorochrome oder andere chemische Markierungen detektiert. Zwar können spezifische Antikörper auch direkt chemisch markiert werden – beispielsweise mit einem fluoreszierenden Molekül oder einem Enzym – jedoch ist diese Methode sehr aufwendig, kostenintensiv und meist in ihrer Sensitivität unbefriedigend.
Es besteht daher die Notwendigkeit, ein schnelleres, jedoch auch hinsichtlich des Kostenaufwands und der Nachweisgenauigkeit optimiertes Nachweismittel für Tubulin, bzw. Mikrotubulistrukturen bereitzustellen.

1. Gelöst wird die obenstehende Aufgabe durch die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend
c) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine Teilsequenz davon; oder
d) eine von SEQ ID NO: 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz,

Unter einem lysinreichen Sequenzbereich ist ein Sequenzbereich zu verstehen, der mindestens einen Lysinrest, bevorzugt jedoch mehrere, in unmittelbarer Nähe angeordnete Lysinreste aufweist. Erfindungsgemäß handelt es sich um ein künstlich hergestelltes Polypeptid oder um ein isoliertes Protein oder einen daraus isolierten Unterabschnitt.
Überraschenderweise wurde in Laboruntersuchungen festgestellt, dass der peroxisomale Biogenesefaktor PEX14 mit hoher Affinität an Tubulin bindet. Die Untersuchungen zeigten, dass der Bindungsbereich des Proteins an Tubulin mindestens einen Sequenzabschnitt aufweist, der lysinhaltig ist. Dieser Sequenzabschnitt ist entscheidend an der Bindung des peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14 an Tubulin beteiligt. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid umfasst mindestens einen solchen lysinreichen Sequenzabschnitt. Vorteilhafterweise kann das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid biochemisch markiert werden und so unmittelbar als Biomarker zum Nachweis von Tubulinstrukturen eingesetzt werden. Ebenso ist auch die Kopplung an einen medizinischen Wirkstoff möglich, der in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid seinen Wirkort in der Zelle erreichen kann.
Die Erfindung betrifft auch ein Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4. Diese Sequenz betrifft die Aminosäuren 1–78 des N-terminalen Bereichs des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14.
Bevorzugt bildet das Protein oder Polypeptid eine dreidimensionale Struktur aus, welche mindestens drei α-Helices umfasst. Die Bindung an Tubulin ist optimal, wenn die drei α-Helices in etwa U-förmig angeordnet sind. Sie können durch eine vierte diagonale Helix stabilisiert werden. Ein Beispiel einer bevorzugt ausgebildeten dreidimensionalen Struktur des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids ist in abgebildet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liegt das Protein oder Polypeptid in seiner Bindung an Tubulin als Dimer vorliegt. Bevorzugt liegt das Protein oder Polypeptid an Glutathion-S-Transferase (GST) gekoppelt vor. GST fördert die Bildung von Dimeren fördert. Die Dimerisierung findet erfindungsgemäß bereits vor der Bindung an das Zielprotein Tubulin statt. Beispielsweise handlet es sich bei dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid um ein Fusionsprotein umfassend GST und die an Tubulin bindende Aminosäuresequenz.
Das Protein oder Polypeptid weist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine hohe Dissoziationskonstante auf. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid bindet damit mit hoher Affinität an Tubulin.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Protein oder Polypeptid mit mindestens einem heterologen Molekül gekoppelt. Das Protein oder Polypeptid kann dabei über den C- oder den N-Terminus der Aminosäurekette, sowie auch über Seitenketten einzelner Aminosäuren mit dem heterologen Molekül verknüpft sein. Eine Verknüpfung mit mehreren gleichartigen oder untereinander verschiedenen heterologen Molekülen ist möglich. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid als Fusionsprotein mit dem heterologen Molekül vorliegen.
Erfindungsgemäß kann das heterologe Molekül ein Markermolekül sein. Dieses kann fluoreszierende Eigenschaften aufweisen, wie z. B. FITC (Fluoreszeinisothiocyanat). Ein fluoreszierendes Markermolekül ist bevorzugterweise ein Polypeptid, beispielsweise GFP (green fluorescent Protein), YFP (yellow fluorescent Protein), CFP (cyan fluorescent Protein), BFP (blue fluorescent Protein) oder drFP583 (red fluorescent Protein). Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid als Fusionsprotein vorliegen, wobei es mit GFP oder YFP am C-Terminus der Aminosäurenkette verbunden ist. Erfindungsgemäß ist jedes andere fluoreszierende Polypeptid ebenfalls zur Kopplung an das Protein oder Polypeptid geeignet.
Des Weiteren kann das Markermolekül in einer anderen Ausführungsform der Erfindung auch ein nicht-fluoreszierendes Markermolekül sein. Als nicht-fluoreszierende Markermoleküle werden alle Markermoleküle bezeichnet, die kein fluoreszierende Markierung, sondern einen durch einen chemische Reaktion hervorgerufene farbige Reaktion auf dem Versuchsmedium erzeugen. Diese werden üblicherweise lichtmikroskopisch nachgewiesen. Insbesondere sind hier Peroxidasen, NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid), welches mit BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) farbig reagiert, oder DAB (Diaminobenzidin) zu nennen. Jeder andere histochemische Farbstoff ist ebenfalls als nicht-fluoreszierendes Markermolekül geeignet. Das nicht-fluoreszierende Markermolekül kann beispielsweise in Form eines Fusionsproteins zusammen mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid vorliegen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäß Protein oder Polypeptid an einen medizinischen Wirkstoff gekoppelt. Dieser kann erfindungsgemäß unmittelbar an das Protein oder Polypeptid gekoppelt sein oder über ein weiteres Molekül, z. B. einem so genannten Linker, mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Polypeptid verbunden sein. Ein Markermolekül kann bei einer besonderen Ausführungsform der Erfindung zusätzlich zu dem medizinischen Wirkstoff an das Protein oder Polypeptid gekoppelt sein. Ebenso ist es möglich, dass das zusätzliche Markermolekül nicht an das Protein oder Polypeptid selbst, sondern an den medizinischen Wirkstoff gekoppelt ist, welcher mit dem Protein oder Polypeptid verbunden ist.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Verwendung eines Proteins oder Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 als Biomarker zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen. Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid kann zur Herstellung eines Biomarkers verwendet werden. Dieser kann kostengünstig direkt mit einem Markermolekül markiert werden. So kann der Biomarker direkt und schnell zur Darstellung von Mikrotubulistrukturen eingesetzt werden. Dies ist nicht nur in der Grundlagenforschung zur weiteren Erforschung des Cytoskeletts und seiner assoziierten Proteine von Bedeutung, sondern insbesondere auch in der Diagnose von ungewöhnlichen Mikrotubulistrukturen aufgrund von Tumorbildungen oder anderen krankhaften Veränderungen von Zellen. Mit dem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid liegt ein kostengünstiger Biomarker vor, der eine spezifische Markierung von Tubulin gewährleistet. Der Biomarker lässt sich vorteilhafterweise sowohl in lebenden als auch in fixierten Zellen zur Darstellung von Mikrotubulistrukturen verwenden. Auch aufgereinigte Mikrotubulistrukturen können unabhängig von einer Zellumgebung detektiert werden. Er ist erfindungsgemäß ebenso dazu geeignet, den Mikrotubuli-Baustein Tubulin zu markieren. So findete der Biomarker ebenfalls Verwendung in Zelllysaten, ELISA-Assays oder membranbasierten Versuchen.
Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid kann zudem als Bestandteil eines Mikrotransporters zur Einbringung von Wirkstoffen in Zellen genutzt werden. Dabei kann die Shuttle-Funktion des Proteins oder Polypeptids genutzt werden. Durch seine Bindungseigenschaft an Tubulin können so medizinische oder andere Wirkstoffe zielgerichtet an ihren Wirkort, z. B. die Mikrotubuli einer Zelle transportiert werden. Das Protein oder Polypeptid kann somit auch zu therapeutischen Zwecken, beispielsweise in der Krebstherapie eingesetzt werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Biomarkers zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen. Erfindungsgemäß wird dazu zunächst ein Konstrukt erstellt, welches eine entsprechende Nukleinsäure kodierend für ein Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 umfasst. Zusätzlich umfasst das Konstrukt eine für ein Markermolekül kodierenden Nukleinsäure, sowie alle weiteren Faktoren, die zur korrekten Expression des Biomarkers benötigt werden, wie beispielsweise Promotoren oder Enhancer. Zur Expression des Konstrukts wird dieses in geeignete Empfängerzellen transfiziert. Als geeignete Empfängerzellen sind im Rahmen der Erfindung alle gängigen Klonierungszelllnien zu verstehen, insbesondere Zellen des Bakteriums Escherichia coli, jedoch sind auch Zellen pilzlicher Herkunft oder Algenzellen zur Klonierung geeignet. Nach Selektion erfolgreich transformierter Zellen und deren Vermehrung wird der Biomarker umfassend das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid sowie ein aus den Empfängerzellen aufgereinigt. Der Biomarker liegt dann beispielsweise in Form eines Fusionsproteins vor, welches zum direkten Nachweis von Tubulin eingesetzt werden kann.
Das Konstrukt kann erfindungsgemäß zusätzlich eine Nukleinsäure kodierend für einen Protein-Tag umfassen. Im Rahmen der Erfindung ist jeder Protein-Tag, der die Aufreinigung des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids ermöglicht geeignet Insbesondere ist hier der Protein-Tag Glutathion-S-Transferase (GST) zu erwähnen. Vorteilhafterweise fördert GST die Dimerisierung seiner fusionierten Proteine.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen, Das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid gekoppelt an ein Markermolekül wird in einem ersten Schritt zu lebenden Zellen, fixierten Zellen oder Zellfraktionen zugegeben. Im Falle von intakten Zellen wird vorausgesetzt, dass die Membran der Zellen durchlässig für das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid ist oder dafür durchlässig gemacht wurde. Anschließend wird eine Hybridisierung des erfindungsgemäßen Biomarkers an Tubulin durchgeführt. Dabei ist es unerheblich, ob das Tubulin als Bestandteil von Mikrotubulistrukturen oder als Protein frei in einer Lösung oder gebunden an eine Membran vorliegt. Das hybridisierte Protein oder Polypeptid wird nach entsprechenden Waschschritten je nach gewünschter Stringenz detektiert. Die Detektion kann in Form einer Visualisierung stattfinden. Die Detektion erfolgt bevorzugt mikroskopisch mit entsprechend dem Markermolekül angepassten Lichtquellen.
Die Erfindung betrifft zudem ein Kit zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen umfassend ein Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10. Das Kit umfasst das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid, welches bereits mit einem Markermolekül in Form eines Fusionsproteins verbunden ist. Alternativ wird das Protein oder Polypeptid separat zu einem Marker bereitgestellt. Das Kit umfasst diese Bestandteile erfindungsgemäß als einsatzbereite Lösungen oder in konzentrierter Form. Auch umfasst das Kit ein Anweisung für den Verwender. Optional sind zudem weitere Lösungen, beispielsweise Pufferlösungen in dem erfindungsgemäßen Kit enthalten.
Des Weiteren betrifft die Erfindung eine rekombinante eukaryontische Zelle, die mit einem Konstrukt transfiziert oder stabil transformiert ist, welches mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die für das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 kodiert. Die korrekte Expression des Konstrukts wird durch entsprechende Promotoren oder andere zusätzliche Faktoren gewährleistet. Das in die rekombinante eukaryontische Zelle transfizierte oder stabil transformierte Konstrukt umfasst gemäß einer Ausführungsform der Erfindung auch eins Nukleinsäure kodierend für ein Markermolekül, beispielsweise GFP oder YFP, die operativ mit der Nukleinsäure kodierende für das erfindungsgemäße Protein oder Polypeptid verbunden ist.
Ein zellbasiertes Screeningsystem für medizinische Wirkstoffe ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Das Screeningsystem kann beispielsweise in Form eines Kits vorliegen und umfasst erfindungsgemäß die oben beschriebenen rekombinanten eukaryontischen Zellen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Screeningverfahren für medizinische Wirkstoffe, in welchem die beschriebenen rekombinanten eukaryontischen Zellen zum Einsatz kommen. Dabei werden rekombinante eukaryontische Zellen umfassend mindestens ein Konstrukt mit einer Nukleinsäure kodierend für ein erfindungsgemäßes Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 bereitgestellt. Nach Zugeben mindestens eines medizinischen Wirkstoffes zu den rekombinanten eukaryontischen Zellen reagieren die Zellen mit diesem. Gegebenenfalls müssen die Zellen für den Wirkstoff entsprechend durchlässig gemacht werden. Der Einfluss des Wirkstoffs auf die in der Zelle vorhandenen Mikrotubulistrukturen, bzw. frei vorliegendes Tubulin wird anschließend ausgewertet. Bevorzugt erfolgt die Auswertung mikroskopisch. Beispielsweise ist jedoch auch eine Sortierung nach lebenden und abgestorbenen Zellen (z. B. durch FACS – fluorescent activated cell sorting) möglich.
Beispiel 1
Das Konstrukt GST-PEX14(1-78) und Fusionsproteine mit fluoreszierenden Proteinen (z. B. GST-eYFP-PEX14(1-78) Aminosäuren 1 bis 78 des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14 gekoppelt an Glutathion-S-Transferase und den Fluoreszenzmarker enhanced Yellow Fluorescent Protein) wurden in pGEX4T1-Vektoren kloniert. Die Expression erfolgte über Nacht bei 20°C mit 1 mM IPTG. Die GST-Fusionsproteine wurden mittels Glutathion-Sepharose 4B (GE Healthcare) nach Herstellerangaben aufgereinigt.
Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden eine humane Fibroblastenzelllinie, eine Astrozytenzelllinien (Ratte), primäre Nervenzellenkulturen des Rattenkleinhirns und der Spinalganglien des Huhns, sowie einzelne Trypanosomen genutzt:
Humane Fibroblasten:

GM5756T (SV-40 transformierte GM5756, Coriell Cell Repository, Camden NJ)
Medium:
DMEM High Glucose (PAA)
+ 10% FCS (Gibco)
+ Pen/Strep (Gibco)
+ 2 mM L-Glutamin (PAA)
Kultivierungsbedingungen:
37°C; 8,5% CO₂

Rollkulturen Körnerzellen bzw. Purkinjezellen:
Sagitalschnitte (400 μm) von Ratten (Postnataltag10) wurden als Rollkulturen für 16 Tage kultiviert und mit 4% Formaldehyd fixiert. Aufgrund der größeren Schichtdicke gegenüber den Monolayer-Kulturen wurden alle Inkubationszeiten des Färbeprotokolls verdoppelt.

(Meller, Krah, Theiss, 2005, Development Brain Research 160: 101–105)

Astrocyten:

aus Rattencortex isolierte Zelllinie.
(Theiss & heller, 2002, Cell & Tissue Research 310: 143–154)

Chicken DRG (dorsal root ganglion, Spinalganglion)
Aus Hühnchen (Embryonaltag 10) explantierte Spinalganglienneurone wurden für 3 Tage kultiviert und mit 4% Formaldehyd fixiert.

(Theiss & Meller, 2001, Journal of Neurocytology 30: 59–71)

Sämtliche Lösungen für die Detektion von Mikrotubulistrukturen der o. g. Zellen wurden in D'PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) angesetzt. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt.
Die Zellen wurden, soweit nicht anders angegeben, mit 3% Formaldehyd für 20 min oder 2% Glutaraldehyd für 30 min fixiert, anschließend mit 1% Triton-X100 für 5 min solubilisiert, worauf unspezifische Anbindungsstellen mit einer 3%-igen BSA-Lösung (bovines Serumalbumin) blockiert wurden. Zwischen diesen Inkubationsschritten wurde jeweils dreimal mit D'PBS gewaschen. Zwischen den folgenden Inkubationsschritten wurde jeweils dreimal für 5 Minuten mit 0,1% BSA in D'PBS gewaschen. Die Inkubationen mit dem Biomarker (10–1000 ng/μl) in 0,1% BSA erfolgten für 30 min. Für Marker ohne Fluoreszenzmarkierung erfolgte eine weitere Inkubation mit einem monoklonalen anti-GST-Primär- und einem fluoreszenzmarkierten Sekundär-Antikörper (Alexa 488 bzw. Alexa 594). Anschließend wurden die Zellen dreimal für 5 Minuten mit 0,1% BSA in D'PBS und zweimal mit D'PBS gewaschen und mit Mowiol-Einbettmedium auf Objektträgern eingedeckelt.
Zur weiteren Überprüfung der korrekten Markierung von Mikrotubuli wurden außerdem Doppelmarkierungen mit dem oben beschriebenen rekombinanten Protein sowie kommerziellen, spezifischen Tubulin-Antikörpern durchgeführt. Das Protokoll entspricht dem vorgestellten, wobei die Mikrotubuli mit Hilfe des Zweischrittverfahrens (Primär- und Sekundärantikörper) immunhistochemisch dargestellt wurden.
Das folgende Protokoll beschreibt die einzelnen Schritte des Nachweisverfahrens für Mikrotubuli:

1. Zellen 3x waschen mit D'PBS (Gibco)
2. Fixierung mit 4% Formaldehyd 4% Glutaraldehyd für 20 min
3. 2x waschen mit D'PBS
4. Permeabilisierung der Zellmembran mit 1% Triton-X100 für 5 min
5. 2x waschen mit D'PBS
6. Blockieren von unspezifischen Bindungen mit 3% BSA
7. Inkubation mit dem neuen Tubulin-Marker (0,2 μg/μl) bzw. Erstantikörper (1:200) in 0,1% BSA für 30 min
8. 3x für je 5 min Waschen mit 0,1% BSA
9. Inkubation mit Zweitantikörper (1:200) für 30 min
10. 3x für je 5 min Waschen mit 0,1% BSA
11. 2x waschen mit D'PBS
12. Deckgläschen auf Objektträger mounten (Mowiol)

Für die Verwendung des erfindungsgemäßen Biomarkers GST-eYFP-PEX14(1-78) entfallen die Schritte 8 und 9.
Bei Verwendung von GST-PEX14(1-78), also ohne fluoreszierenden Fusionsanteil, werden insgesamt drei Inkubationsschritte (GST-PEX14N, anti-GST-Erstantikörper, fluoreszenzmarkierter Zweitantikörper) entsprechend den Schritten 7 und 8 bzw. 9 und 10 durchgeführt.
Bei Fixierung mit Methanol wird an Stelle von Schritt 2 für 5 Minuten mit –20°C-kaltem Methanol-Fixationsreagenz (90% (v/v) Methanol, 10 mM MES pH6,9; 0,1 mM EGTA, 0,1 mM MgCl₂) inkubiert, die Permeabilisierung der Zellmembran (Schritte 3 und 4) ist nicht notwendig.
Soweit nicht anders angegeben wurde immer mit Formaldehyd fixiert und nach obigem Protokoll markiert. Bei der Färbung der Rollkulturen (Körnerzellen bzw. Purkinje-Zellen) wurden jedoch alle Inkubationszeiten verdoppelt.
Zum mikroskopischen Nachweis der Mikrotubulistrukturen wurde ein Zeiss LSM 510 meta konfokales Laserscanning Mikroskop verwendet. Zur Vergrößerung wurden die Objektive Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil, Plan-Neofluar 40x/1.3 Oil und Plan-Neofluar 10x/0.3 verwendet. Die Fluoreszenzmarkierung eYFP (enhanced Yellow Fluorescent Protein) wurde bei den Wellenlängen 514 nm (Anregung) und 530–600 nm (Emission) nachgewiesen. Für den Sekundärantikörper Alexa 594 (rot) wurden die Wellenlängen 543 nm (Anregung) und 585 nm (Emission) genutzt. Für Fluorescein wurden die Wellenlängen 488 nm (Anregung) und 505–550 nm (Emission) genutzt.
Zusammenfassend ist für die oben dargestellten Nachweisverfahren Folgendes festzuhalten:
Der erfindungsgemäße Biomarker PEX14(1-78) wurde in Form von GST-Fusionsproteinen rekombinant in E. coli exprimiert und mit Hilfe des GST-Tags aufgereinigt. Zur Fluoreszenzmarkierung wurde entweder zusätzlich ein eYFP-Fusionsanteil exprimiert (GST-eYFP-PEX14(1-78)), oder das aufgereinigte GST-PEX14(1-78) wurde an den exponierten Cystein-Resten des GST-Fusionsanteils spezifisch mit 5-Iodoaceto-Fluorescein (5-IAF) markiert.
Die getesteten Zellen wurden mit einem üblichen Protokoll für Immunofluoreszenz behandelt, wobei der erfindungsgemäße Biomarker wie ein Antikörper verwendet wurde, allerdings ohne Inkubation mit einem Zweitantikörper, da der Biomarker bereits fluoreszenzmarkiert war.
In allen getesteten Zellen konnten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Biomarkers Mikrotubuli mit einer sehr guten Qualität markiert werden. In allen Fällen wurde das humane PEX14(1-78) verwendet. Der Marker kann demnach speziesübergreifend verwendet werden, was insbesondere bei den evolutionär weit vom Menschen entfernten Trypanosomen erwähnenswert ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Marker sowohl als fluoreszierendes Fusionsprotein (GST-eYFP-PEX14(1-78)) als auch mit einem chemischen Fluoreszenzlabel (5-IAF) gleichermaßen verwendbar ist.
Zum Nachweis, dass es sich bei den markierten Strukturen tatsächlich um Mikrotubuli handelt. wurde in einigen Fällen die Mikrotubuli zusätzlich mit anti-Tubulin-Antikörper markiert. Die Doppelmarkierungen zeigen eine nahezu identische Markierung von Mikrotubuli mit dem neuen Marker und mit den Antikörpern.
Beispiel 2
Zur genaueren Charakterisierung der Bindungsbereiche von PEX14(1-78) an Tubulin wurde ein so genannter Peptide Scan durchgeführt. Peptide Scans werden zur Darstellung spezifischer Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt.
Zur Lokalisierung spezifischer Bindungsstellen wurde jedes zweite 15mer-Peptid von PEX14(1-78) synthetisiert und auf einer Zellulose-Membran fixiert, Kontrollversuche zeigten, dass die verwendeten Antikörper nicht mit den synthetischen Peptiden kreuzreagierten (Daten nicht dargestellt). Die auf der Membran fixierten 15-mer-Peptide wurden dann mit 1 nM reinem Tubulin inkubiert und mit Anti-Tubulin-Antikörpern hybridisiert.
Wie in dargestellt, hybridisierten einige der 15-mer-Peptide mit Tubulin und geben damit einen Hinweis auf den Bindungsbereich des PEX14(1-78) an Tubulin. Der Peptide Scan zeigt, dass Tubulin im Sequenzbereich der Aminosäuren 1–33 und 58–78 nicht bindet. Eine hohe Bindungsaffinität an Tubulin wurde jedoch insbesondere bei den Peptiden festgestellt, die Lysin an Position 34 des PEX14(1-78) enthalten. Ebenso konnte eine gute Bindung an Tubulin bei Peptiden festgestellt werden, die Phenylalanin an Position 52 des PEX14(1-78) enthalten. Die Intensität der Bindung war besonders stark bei Peptiden, die Phenylalanin an Position 52 und Lysinreste an den Positionen 54, 55 und 56 des PEX14(1-78) enthalten. Die Intensität der Hybridsierung der 15-mer-Peptide an Tubulin nahm ab, sobald kein Alanin, Threonin und Arginin in unmittelbarer Nähe zu Lysin (34) und Phenylalanin (52) vorhanden war. Dies zeigt, dass möglicherweise auch Alanin, Threonin und Arginin eine wichtige Rolle bei der Bindung des PEX14(1-78) an Tubulin spielen, womöglich sind sie für eine korrekte Faltung des Peptids oder für den freien Zugang von Lysin an Tubulin notwendig.
Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids sowie seiner Verwendung als Biomarker werden zusätzlich durch die folgenden bis verdeutlicht:
zeigt die dreidimensionale Struktur des erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids bezogen auf die aus dem humanen peroxisomalen Biogenesefaktor PEX14 stammenden Aminosäuren 20 bis 78. Wie aus der Darstellung ersichtlich ist, sind drei α-Helices U-förmig zueinander angeordnet. Eine vierte diagonale Helix stabilisiert die U-förmige Struktur.
zeigt Zellen aus dem Spinalganglion des Huhns (Gallus gallus). Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Biomarkerkonstrukts GST-eYFP-PEX14(1-78) (Aminosäuren 1 bis 78 des humanen peroxisomalen Biogenesefaktors PEX14 gekoppelt an Glutathion-S-Transferase und den Fluoreszenzmarker enhanced Yellow Fluorescent Protein) wurden Mikrotubulistrukturen in diesen Zellen fluoreszenzgefärbt. Auf dem rechten Bild ist ein Wachstumskegel mit hoher Auflösung sichtbar.
zeigt die Anfärbung von Mikrotubulistrukturen in Fibroblasten des Huhns (Gallus gallus) durch Hybridisierung des Biomarkerkonstrukts GST-eYFP-PEX14(1-78) an Tubulin.
zeigt die Anfärbung von Mikrotubulistrukturen an Astrozyten aus der Ratte (Rattus rattus) durch Hybdrisierung des Biomarkerkonstrukts GST-eYFP-PEX14(1-78) an Tubulin.
zeigt die Markierung von Mikrotubuli in humanen Fibroblasten (GM5756) mit GST-PEX14N, welches nach der Aufreinigung mit 5-IAF (5-Iodoaceto-Fluorescein, Sigma-Aldrich) nach Herstellerangaben an Cysteinen gelabelt wurde.
zeigt Mikrotubuli in humane Fibroblasten (GM5756), die mit GST-eYFP-PEX14(1-78) markiert wurden.
zeigt Mikrotubuli in einem Körnerzellen-Präparat (Ratte), die mit GST-eYFP-PEX14(1-78) markiert wurden.
zeigt Mikrotubuli in Trypanosomen (T. brucei), welche gleichzeitig mit GST-eYFP-PEX14(1-78) und mit Anti-Tubulin-Antikörpern, sowie einem roten Sekundärantikörper markiert wurden, Die linke Spalte zeigt die eYFP-Markierung, die mittlere Spalte zeigt die Markierung mit Anit-Tubulin-Antikörpern und rotem Sekundärantikörper. Die rechte Spalte zeigt die Überlagerung des ersten und des zweiten Nachweisverfahrens.
zeigt das Ergebnis der Hybridisierung von 1 nM reinem Tubulin an eine mit 15-mer-Peptiden aus PEX14(1-78) besetzte Membran. Die Detektion erfolgte mit Anti-Tubulin-Antikörpern (1:3000). Auf der rechten Seite sind die Aminosäuresequenzen der 15-mer-Peptide schematisch dargestellt. Eine starke Hybridisierung von Tubulin zeigt sich insbesondere bei den 15-mer-Peptiden A3, B3, C3, D3 und A4 – diese enthalten Lysin an der ursprünglichen Position 34 von PEX14(1-78). Eine starke Bindung an Tubulin zeigt sich auch bei den 15-mer-Peiltiden E4, A5, B5, C5, D5 und E5 – diese enthalten Phenylalanin an der ursprüngliche Position 52 von PEX14(1-78) und zudem 3 Lysinreste an den urprünglichen Positionen 54, 55 und 56.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Protein oder Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend e) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine Teilsequenz davon; oder f) eine von SEQ ID NO: 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, wobei das Protein oder Polypeptid mindestens einen lysinreichen Sequenzbereich umfasst und an Tubulin bindet.
Protein oder Polypeptid gemäß einem der vorangehenden Ansprüche umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4.
Protein oder Polypeptid gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Polypeptid eine dreidimensionale Struktur ausbildet, welche mindestens drei α-Helices umfasst.
Protein oder Polypeptid gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet dass das Protein oder Polypeptid in seiner Bindung an Tubulin als Dimer vorliegt.
Protein oder Polypeptid gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Polypeptid mit mindestens einem heterologen Molekül gekoppelt ist.
Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Molekül ein Markermolekül ist.
Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Markermolekül ein fluoreszierendes Markermolekül ist.
Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das fluoreszierenden Markermolekül ein Polypeptid ist.
Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein fluoreszierendes Polypeptid ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend GFP, YFP, CFP, BFP, drFP583 oder ein anderes fluoreszierendes Polypeptid.
Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Markermolekül ein nicht-fluoreszierendes Markermolekül ist, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Peroxidasen, NBT-BCIP, DAB oder ein anderes nicht-fluoreszierendes Markermolekül.
Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Molekül ein medizinischer Wirkstoff ist, welcher mittelbar oder unmittelbar mit dem Protein oder Polypeptid gekoppelt ist.
Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Polypeptid zusätzlich mit einem Markermolekül gekoppelt ist.
Verwendung eines Proteins oder Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 als Biomarker zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen.
Verwendung eines Proteins oder Polypeptids gemäß Anspruch 13 in lebenden Zellen oder fixierten Zellen oder Zellfraktionen oder membranbasierten Assays.
Verwendung eines Proteins oder Polypeptids gemäß Anspruch 11 als Bestandteil eines Mikrotransporters zur Einbringung von Wirkstoffen in Zellen.
Verfahren zur Herstellung eines Biomarkers zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen umfassend die folgenden Schritte: a) Klonieren eines Konstrukts umfassend eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 und eine für ein Markermolekül kodierenden Nukleinsäure in einen Vektor; b) Transfizieren des Vektors in eine Empfängerzelle, insbesondere in E. coli; c) Vermehren der transfizierten Zellen; d) Aufreinigen des Biomarkers aus den Empfängerzellen.
Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Konstrukt eine Nukleinsäure kodierend für einen Protein-Tag umfasst, insbesondere eine Nukleinsäure kodierend für den Protein-Tag Glutathion-S-Transferase, der mit der Nukleinsäure kodierend für das Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 operativ verbunden ist.
Verfahren zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen umfassend die folgenden Schritte: a) Zugeben eines Proteins oder Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 5 bis 10 zu lebenden Zellen oder fixierten Zellen oder Zellfraktionen; b) Durchführen einer Hybridisierung des Proteins oder Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 an Tubulin; c) Detektieren des hybridisierten Proteins oder Polypeptids.
Kit zur Detektion von Tubulin und/oder Mikrotubulistrukturen umfassend ein Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.
Rekombinante eukaryontische Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle mit einem Konstrukt transfiziert oder stabil transformiert ist, welches mindestens eine Nukleinsäure umfasst, die für das Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 kodiert.
Rekombinante eukaryontische Zelle gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Konstrukt eine für ein Markermolekül kodierende Nukleinsäure umfasst, die mit der Nukleinsäure kodierend für das Protein oder Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 operativ verbunden ist.
Zellbasiertes Screeningsystem für medizinische Wirkstoffe, umfassend rekombinante eukaryontische Zellen gemäß Anspruch 20 oder 21.
Screeningverfahren für medizinische Wirkstoffe umfassend folgende Schritte: a) Bereitstellen von rekombinanten eukaryontischen Zellen gemäß Anspruch 20 oder 21; b) Zugeben mindestens eines medizinischen Wirkstoffs; c) Auswerten des Reaktionsergebnisses.