DE60316103T2

DE60316103T2 - aminoacyl-tRNA geunden an markierte p-aminophenylalanine oder tyrosine

Info

Publication number: DE60316103T2
Application number: DE60316103T
Authority: DE
Inventors: Takahiro Ishikawa-gun HOHSAKA; M 3-1-1 Sisido
Original assignee: Protein Express Co Ltd Choshi; ProteinExpress Co Ltd
Current assignee: Hohsaka Takahiro Jp; Ushio Denki KK
Priority date: 2002-07-18
Filing date: 2003-07-15
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2023-07-16
Also published as: EP1439210A1; JPWO2004009709A1; US20080220477A1; EP1439210A4; DE60316103D1; US20070117181A1; JP4362106B2; AU2003281613A1; CA2461654A1; US7385038B2; ATE372359T1; WO2004009709A1; EP1439210B1

Description

Die vorliegende Erfindung stellt eine Aminoacyl-tRNA bereit, die als nicht-natürliche Aminosäure eine markierte Aminosäure umfasst, in welcher eine Markierungsverbindung direkt oder über einen Spacer an eine Aminosäure gebunden ist, die über ein Aminosäureskelett mit einem aromatischen Ring, wie z.B. einem Benzolring, auf ihrer Seitenkette verfügt. Diese markierte Aminosäure wird in ein Protein eingeführt, indem ein Proteinsynthesesystem verwendet wird, wodurch ein funktionelles Protein mit Funktionen, die von den Markierungsverbindungen abstammen, mit hoher Reproduzierbarkeit bereitgestellt wird. Weiters betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Produktion von Aminoacyl-tRNA, das der markierten Aminosäure ermöglicht, sich wirkungsvoll an tRNA zu binden.
Hintergrund zum Fachgebiet
Wenn eine funktionelle Gruppe in eine Oberfläche eines Proteins eingeführt wird, werden spezifische Proteinreste im Allgemeinen chemischer Modifikation unterworfen. Diese chemische Modifikation ist einfach, und viele spezifische Reste können zur selben Zeit vorteilhaft modifiziert werden. Im Gegensatz dazu ist ein günstiges Ergebnis hinsichtlich der Reproduzierbarkeit der Modifikationsstelle und/oder der Regulation der Zahl an Modifikationen schwer zu erreichen. Aufgrund des Fortschritts in der modernen Gentechnik ist es möglich geworden, Aminosäurereste in einem Protein zu substituieren. Modifikation eines Proteinsynthesesystems hat die Einführung einer gewünschten nicht-natürlichen Aminosäure mit einem Aminosäureskelett in ein Protein und die Synthese eines Proteins, das eine funktionelle Gruppe trägt, mit hoher Reproduzierbarkeit ermöglicht.
Im Verfahren der Proteinsynthese wird eine Aminosäure zuerst an das 3'-Ende von tRNA gebunden und wird dann an ein Ribosom transferiert, wo Proteinsynthese stattfindet. Am Ribosom werden Codons in Aminosäuren translatiert. Verwendung von tRNA, die eine nicht-natürliche Aminosäure daran gebunden umfasst, ermöglicht die Einführung der nicht-natürlichen Aminosäure in ein Protein. P. G. Schults et al. und A. R. Chamberlin et al. haben von einem Verfahren berichtet, das ein Terminationscodon verwendet, um eine nicht-natürliche Aminosäure in ein Protein einzuführen, indem ein UAG-Terminationscodon als genetischer Code für eine nicht-natürliche Aminosäure zugewiesen wird [Science 244, 182 (1989); J. Am. Chem. Soc. 111, 8013 (1989)]. In diesem Verfahren, das ein Terminationscodon verwendet, können jedoch zwei oder mehrere Arten von nicht-natürlichen Aminosäuren in ein Proteinmolekül eingeführt werden, und die Ausbeute ist ungünstig niedrig.
Sisido et al. haben ein Verfahren entwickelt, das ein vierbasiges Codon verwendet, in welchem ein Codon aus 4 Basen besteht. Ein vierbasiges Codon wird in eine mRNA an der Stelle insertiert, wo eine nicht-natürliche Aminosäure eingeführt werden soll, eine Anticodon-Stelle von tRNA wurde durch entsprechende vier Basen ersetzt, und eine nicht-natürliche Aminosäure wird dann daran gebunden. Wenn Proteinsynthese unter Verwendung von modifizierter mRNA und des Anticodons im Ribosom durchgeführt wird, wird ein vierbasiges Codon-Anticodon-Paar an der Stelle gebildet, die mit einem vierbasigen Codon von mRNA ersetzt ist, und die nicht-natürliche Aminosäure, die an tRNA gebunden war, wird in eine verlängernde Peptidkette eingeführt. Hingegen wird an anderen Stellen ein Triplett (3 Basen) dekodiert und wie üblich translatiert, wodurch nicht-natürliche Aminosäuren nur an den Stellen eingefügt werden, die mit einem vierbasigen Codon im Endprotein benannt werden. Verweise können auf T. Hoshaka et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 9778-9779 (1996), und T. Hoshaka et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 34-40 (1999), gemacht werden (diese Dokumente sind in dieser Beschreibung durch Verweis zitiert).
Weiters haben Hirao et al. unter Verwendung eines künstlichen Basenpaars ein Proteinsynthesesystem entwickelt (ein Verfahren, das ein künstliches Basencodon verwendet) [I. Hirao et al., Nature Biotech. 20, 177-182 (2002)].
In diesen Verfahren kann eine nicht-natürliche Aminosäure durch chemische Aminoacylierung an tRNA gebunden werden, in welcher ein Dinucleotid am 3'-Ende von tRNA deletiert ist, und ein Dinucleotid, das eine nicht-natürliche Aminosäure daran gebunden umfasst, wird mithilfe einer RNA-Ligase anstelle des früheren Dinucleotids gebunden. Weiters kann mehr als eine nicht-natürliche Aminosäure durch das Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, und durch das Verfahren, das ein künstliches Basencodon verwendet, gleichzeitig in ein Protein eingeführt werden.
Einführung einer nicht-natürlichen Aminosäure in ein Protein hat nicht nur die Analyse von Proteinstrukturen und -funktionen ermöglicht, sondern die Produktion von künstlichen Proteinen mit einer bestimmten Art von künstlich hinzugefügten Funktionen. Mit der Verwendung von nicht-natürlichen Aminosäuren, die eine Vielzahl von Markierungssubstanzen an die Aminosäureskelette gebunden umfassen, können daher markierte Proteine erhalten werden, in welchen die Markierungssubstanzen eingeführt worden sind. Mit dem Verfahren gemäß jeglicher Art von Markierungssubstanz kann das markierte Protein detektiert und/oder direkt oder indirekt durch enzymatische chemische Verfahren oder enzymatische immunchemische Verfahren gereinigt werden, wenn z.B. die Markierungssubstanz ein enzymatisches Substrat oder eine Antigensubstanz ist. Dieses kann in einer großen Vielzahl von Anwendungen in technischen Bereichen verwendet werden, die mit medizinischen Wissenschaften, pharmazeutischen Wissenschaften, Polymerchemie, Biochemie oder dergleichen assoziiert sind.
Es sollte angemerkt werden, dass eine nicht-natürliche Aminosäure nicht immer durch einfache Bindung an tRNA in ein Protein eingeführt werden kann. Ein natürliches Proteinsynthesesystem kann jegliche von 20 Arten natürlich auftretender Aminosäuren in eine Polypeptidkette, unabhängig von ihrer Art, einführen. Daher wird davon ausgegangen, dass ein natürliches Proteinsynthesesystem über einen gewissen Grad der Zulässigkeit von nicht-natürlichen Aminosäuren verfügen kann. Jedoch kann eine Aminosäure mit einer Seitenkette mit einer sperrigen Molekularstruktur, wie z.B. 1-Pyrenylalanin oder Ferrocenylalanin, nicht durch das natürliche Proteinsynthesesystem in ein Protein eingeführt werden. In einem natürlichen Proteinsynthesesystem weist das Ribosom zwei Stellen zur Einführung von tRNA auf. tRNA, die an ein Polypeptid gebunden ist, wird in eine dieser eingeführt; und tRNA, die eine nicht-umgesetzte Aminosäure trägt, wird in die andere Stelle eingeführt. tRNA, die eine sperrige Aminosäure trägt, kann nicht in das Ribosom eingeführt werden. Daher wird tRNA, die eine sperrige Aminosäure trägt, so abgeleitet, dass sie nicht in der Lage ist, in ein Protein eingeführt zu werden.
Unter Markierungsverbindungen haben Fluoreszenzsubstanzen insbesondere hohe Nützlichkeit als Markierungen für ein Protein. Weiters kann eine Lumineszenzsubstanz im sichtbaren Lichtbereich durch einen Detektor detektiert werden, der umfassend und häufig verwendet wird. Weiters ist schon eine Vielzahl von höchst empfindlichen Detektoren entwickelt worden und umfassend verwendet worden. Diese Fluoreszenzsubstanzen sind als Markierungsverbindungen zur Markierung von Zellen oder dergleichen nützlich, da sie von den Interferenzwirkungen nicht betroffen sind, die durch Fluoreszenzemission in Zellen verursacht sind. Wenn diese Fluoreszenzsubstanzen als Markierungsverbindungen für nicht-natürliche Aminosäuren verwendet werden, ist es jedoch aufgrund ihrer großen Molekulargewichte schwierig, sie durch ein Verfahren, das ein Proteinsynthesesystem verwendet, in die Proteine einzuführen. Verbindungen, die über eine Vielzahl von Funktionen, wie z.B. Enzymreaktivität, Antigenität, Proteinbindungseigenschaft oder intermolekulare Interaktivität, verfügen, zusätzlich zu Fluoreszenz- und Lumineszenzeigenschaften, sind auch als Markierungsverbindungen nützlich. Die Möglichkeit, dass eine Markierungsverbindung in ein Protein eingeführt wird, ist ungünstig durch das Verfahren, das ein Proteinsynthesesystem verwendet, aufgrund ihres Molekulargewichts eingeschränkt. Es ist notwendig, dieses Problem im Fachgebiet zu lösen.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Aminoacyl-tRNA bereit, die markierte Aminosäure umfasst, die mithilfe eines Proteinsynthesesystems in ein Protein eingeführt werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein funktionelles Protein bereit, das über Funktionen verfügt, die von einer Markierungsverbindung stammen, worin die zuvor genannten Funktionen nach Einführung der markierten Aminosäure erhalten werden.
Weiters stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur wirksamen Gewinnung eines markierten Aminosäure-tRNA-Konjugats bereit. Dieses Verfahren ermöglicht der markierten Aminosäure, über ein Proteinsynthesesystem in ein Protein eingeführt zu werden.

1. Aminoacyl-tRNA, worin ein markiertes p-Aminophenylalanin oder Tyrosin und tRNA mit einem Anticodon, das zu einem Codon komplementär ist, das dazu entworfen wurde, für das markierte p-Aminophenylalanin oder Tyrosin zu kodieren, aneinander gebunden sind und worin eine Markierungsverbindung über den aromatischen Ring in der Seitenkette an das p-Aminophenylalanin oder Tyrosin gebunden ist.
2. Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 1, worin das markierte p-Aminophenylalanin oder Tyrosin mit einer fluoreszierenden Substanz mit einer Anregungswellenlänge und einer Emissionswellenlänge im sichtbaren Lichtbereich markiert ist.
3. Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 2, worin die fluoreszierende Substanz eine chemische Verbindung ist, die 4,4-Difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen oder ein Salz davon als Grundskelett umfasst.
4. Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 3, worin die fluoreszierende Substanz 4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure oder ein Salz davon ist.
5. Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 1, worin das markierte p-Aminophenylalanin durch folgende Formel 1 dargestellt ist:
6. Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 1, worin das markierte p-Aminophenylalanin durch Formel 11 dargestellt ist:
7. Verfahren zur Synthese der Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 1, worin pdCpA an p-Aminophenylalanin oder Tyrosin gebunden wird, das pdCpA-p-Aminophenylalanin- oder -Tyrosinkonjugat mit einer Markierungsverbindung umsetzen gelassen wird, um ein markiertes p-Aminophenylalanin- oder Tyrosin-pdCpA-Konjugat herzustellen, und das Entstandene an tRNA(-CA) gebunden wird.
8. Verfahren zur Synthese eines funktionellen Proteins, umfassend ein markiertes p-Aminophenylalanin oder Tyrosin, worin die markierte Verbindung unter Einsatz der Aminoacyl-tRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 über ein zellfreies Proteinsynthesesystem oder ein Proteinsynthesesystem in lebenden Zellen eingeführt wird.
9. Verfahren zur Synthese eines funktionellen Proteins nach Anspruch 8, worin ein Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, ein Verfahren, das ein Terminationscodon verwendet, oder ein Verfahren, das ein künstliches Basencodon umfasst, als Proteinsynthesesystem verwendet wird.
10. Verfahren zur Synthese eines funktionellen Proteins nach Anspruch 9, worin ein Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, als Proteinsynthesesystem verwendet wird.

Die markierte Aminosäure kann über ein Proteinsynthesesystem in ein Protein eingeführt werden, um ein markiertes Protein zu synthetisieren.
Der hierin verwendete Begriff „Aminosäure" bezieht sich, wie gemeinhin verwendet, auf eine natürliche oder nicht-natürliche Verbindung mit einer Carboxylgruppe und einer Aminogruppe in einem Molekül. Die Aminosäuren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind p-Aminophenylalanin und Tyrosin. Der Begriff „markierte Aminosäure" bezieht sich auf eine Aminosäure, die an eine Markierungsverbindung gebunden ist. Das hierin verwendete „Aminosäureskelett" umfasst eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe und einen Abschnitt, der diese in einer Aminosäure verbindet.
Der hierin verwendete Begriff „Spacer" bezeichnet einen Abschnitt, der eine Aminosäuregruppierung und eine Markierungsverbindung in einem markierten Aminosäuremolekül verbindet. Genauer, wenn die Aminosäureseitenkette nicht direkt an eine Markierungsverbindung im markierten Aminosäuremolekül gebunden ist und ein oder mehrere Atome zwischen der Aminosäureseitenkette und der Markierungsverbindung gegenwärtig sind, sind die Aminosäuregruppierung und die Markierungsverbindung der markierten Aminosäure miteinander über einen Spacer verbunden. Der Spacer kann zumindest eines von C-, O-, N- und S-Atomen in seinem Rückgrat um fassen. Das Rückgrat des Spacers umfasst 2 bis 10, vorzugsweise 3 bis 8 und am bevorzugtesten 5, 6 oder 7, linear gebundene Atome, die oben genannt sind, und die lineare Struktur kann eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Weiters kann ein Spacer 1 bis mehrere, vorzugsweise 1 bis 5 und noch bevorzugter 1 bis 3, zyklische Strukturen, wie z.B. Benzolringe und/oder Cyclohexylringe, umfassen. Alternativ dazu kann eine Kombination von zyklischen Strukturen, wie z.B. Benzolringe und Cyclohexylringe, oder eine Kombination einer zyklischen Struktur und der zuvor genannten linearen Struktur ausreichend sein. Spezifische Beispiele dafür umfassen Polyolefine, wie z.B. Polyethylen, Polypropylen, Polyisobuten, Polystyrol, Polyvinyl und Polyvinylchlorid, Polyether, wie z.B. Polyoxyethylen, Polyethylenglykol und Polyvinylalkohol, Polyamid, Polyester, Polyimid, Polyurethan und Polycarbonat.
Manche Markierungsverbindungen sollen über einen Spacer an Aminosäuren gebunden werden, um ihre Funktionen in den Proteinen, in welche sie eingeführt worden sind, wirksamer zu zeigen. In einigen Formen von Markierungsverbindungen kann z.B. sterische Hinderung Richtung Markierungssubstanz im Protein verringert werden, wenn sie über einen Spacer gebunden sind.
Weiters weist die markierte Aminosäure gemäß der vorliegenden Erfindung einen aromatischen Ring auf der Seitenkette ihrer Aminosäuregruppierung auf, und eine Markierungsverbindung ist direkt oder über einen Spacer an den aromatischen Ring gebunden.
Bindung zwischen einer Aminosäure mit einem aromatischen Ring und einer Markierungsverbindung und Bindung zwischen einer Aminosäure mit einem aromatischen Ring und einer Markierungsverbindung über einen Spacer kann unter Verwendung der Bindung zwischen adäquaten funktionellen Gruppen durchgeführt werden. Eine Markierungsverbindung ist direkt oder über einen Spacer an die Amino- oder Hydroxylgruppe der Aminosäure gebunden, die in Peptidverlängerung zum Zeitpunkt der Proteinsynthese nicht involviert ist. Beispiele für Substanzen, die als Reagenzien für die Markierung von Aminogruppen verwendet werden können, umfassen z.B. Succinimidester, Isothiocyanat, Sulfonylchlorid, NBD-Halogenid und Dichlortriazin. Zum Beispiel wird Succinimidester direkt oder über einen Spacer in eine Markierungsverbindung eingeführt, andererseits wird eine Aminogruppe in einen aromatischen Ring einer Aminosäure eingeführt, und dann können die Aminosäure und die Markierungsverbindung durch Amidbindungen aneinander gebunden werden. Ein Beispiel für eine Aminosäure, die einen aromatischen Ring umfasst, in welchen eine Aminogruppe eingeführt worden ist, ist Aminophenylalanin. Eine funktionelle Gruppe, die in einem solchen Fall verwendet wird, kann in geeigneter Weise ausgewählt und eingeführt werden, und es kann ebenfalls ein Bindungsverfahren in geeigneter Weise ausgewählt werden. In diesem Fall ermöglicht die Durchführung einer Amidbindungsbildung bei etwa pH 5 eine selektive Reaktion mit einer Aminogruppe auf der Seitenkette von Aminophenylalanin, sogar wenn eine andere Aminogruppe im Aminosäuremolekül gegenwärtig ist. Alternativ dazu kann eine andere Aminogruppe mit Boc oder dergleichen geschützt werden und die Schutzgruppe nach der Reaktion der Aminogruppe auf der Seitenkette entfernt werden. Dieses Verfahren kann durch Verweis auf z.B. „Shin Seikagaku Jikken Kouza 1, Tampakushitsu VI, Kouzou Kinou Soukan (New biochemical experimentation 1, Protein VI, Correlation between Structure and Function) durchgeführt werden.
Um markierte funktionelle Proteine herzustellen, indem die markierte Aminosäure der vorliegenden Erfindung auf die nachstehend beschriebene Proteinsynthese angewendet wird, soll eine spezifische Gruppe, die für Bindung an tRNA notwendig ist, an die Aminosäure gebunden werden. Zum Beispiel kann künstliche Aminoacyl-tRNA, wenn ein Dinucleotid (pdCpA) an eine Carboxylgruppe der Aminosäure gebunden ist, hergestellt werden, indem tRNA, der an ihrem 3'-Terminus ein CA-Dinucleotid fehlt (tRNA(-CA)), an die Aminosäure gebunden wird.
Wenn ein aromatischer Ring ein Benzolring ist, ist ein Spacer oder eine Markierungsverbindung vom Standpunkt höherer Wirksamkeit der Einführung in das Ribosom vorzugsweise an seiner Para- oder Metaposition davon an das Aminosäureskelett an den Ring gebunden. Die Paraposition ist besonders bevorzugt.
Wie oben erwähnt ist eine Markierungsverbindung an eine funktionelle Gruppe eines aromatischen Rings direkt oder über einen Spacer gebunden. Im Fall von Aminophenylalanin sind Para-Aminophenylalanin oder Meta-Aminophenylalalin bevorzugt.
Die markierte Aminosäure der vorliegenden Erfindung weist Eigenschaften ihrer Markierungssubstanz auf. Dementsprechend können durch die Auswahl einer Markierungsverbindung mit gewünschten Funktionen gewünschte Funktionen der markierte Aminosäure verliehen werden. In der vorliegenden Beschreibung werden Proteine, die Funktionen aufweisen, die von Markierungsverbindungen stammen, als „funktionelle Proteine" bezeichnet.
Beispiele für die Markierungsverbindung die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfassen eine Farbstoffverbindung, eine Fluoreszenzsubstanz, eine chemi- oder biolumineszierende Substanz, ein Enzymsubstrat, ein Coenzym, eine Antigensubstanz und eine proteinbindende Substanz, die Fachleuten bekannt sind. Verbindungen, die für Proteinsynthesesysteme verwendet werden, haben ein Molekulargewicht von 1.500 oder weniger, vorzugsweise 1.000 oder weniger und am bevorzugtesten 500 oder weniger. Beispiele für Fluoreszenzsubstanzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen alle bekannten Fluoreszenzsubstanzen, einschließlich Rhodamin, Fluorescein (FITC) Texas-Rot, Acridinorange, SYBR-Grün, Cy3, Cy5, einer BODIPY-Verbindung, und ein Derivat davon.
Beispiele für Fluoreszenzsubstanzen, die in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt verwendet werden, umfassen eine chemische Verbindung, die 4,4-Difluor-4-bora-3a,4a,-diaza-s-indacen als Grundskelett umfasst, ein Salz davon, oder ein Derivat davon (diese Verbindungen, ein Salz davon oder ein Derivat davon werden hierin im Allgemeinen als BODIPY-Verbindungen bezeichnet). Eine Reihe von Substanzen mit verschiedenen Fluoreszenzeigenschaften, z.B. BODIPY^® FL, BODIPY^® TR, BODIPY^® R6G, BODIPY^® 558/568 und BODIPY^® 576/589, werden von Molecular Probe, Inc. (Oregon, USA), oder anderen Unternehmen verkauft. Es versteht sich, dass Fluoreszenzsubstanzen nicht auf die derzeit kommerzialisierten beschränkt sind.
Eine Chemi- oder Biolumineszenzsubstanz, wie z.B. Luciferin oder Lumigen oder ein Derivat davon, kann auch als Markierungsverbindung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eine Fluoreszenzmarkierungsverbindung hat vorzugsweise eine Anregungswellenlänge und eine Emissionswellenlänge im sichtbaren Lichtbereich (etwa 400 bis 700 nm). Eine Verbindung mit einer hohen Emissionsintensität in einer wässrigen Lösung ist besonders bevorzugt. Eine Vielzahl von BODIPY-Verbindungen hat Anregungs- und Emissionswellenlängen innerhalb des sichtbaren Lichtbereichs. Zum Beispiel wird BODIPY FL bei 488 nm angeregt und zeigt intensive Emission innerhalb des sichtbaren Lichtbereichs. Daher kann es durch die Verwendung eines Argonlasers angeregt werden. Deshalb kann BODIPY FL einfach unter Verwendung eines üblichen bestehenden Geräts mit hoher Empfindlichkeit detektiert werden.
Eine adäquate Substanz kann z.B. aus Coenzymen, Antigensubstanzen und Substanzen ausgewählt werden, von denen bekannt ist, dass sie sich an ein spezifisches Protein gemäß einer Funktion binden, die an das Targetprotein übertragen werden soll, und die ausgewählte Substanz kann als Markierungsverbindung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein Substrat für ein spezifisches Enzym (z.B. ein Substrat für alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase) kann unter Verwendung von Färbung, die durch das Enzym verursacht ist, detektiert werden.
Proteine, die mit einer Antigensubstanz oder einer Substanz markiert sind, von der bekannt ist, dass sie sich an ein spezifisches Protein bindet, sind hinsichtlich ihrer Nützlichkeit für ein indirektes Detektionsverfahren, das einen Antikörper oder ein Bindungsprotein verwendet, und für eine Erleichterung der Reinigung von Vorteil. Zum Beispiel kann sich ein funktionelles Protein, das mit Biotin markiert ist, durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung mithilfe von Biotin an Avidin oder Streptavidin binden. Mit der Verwendung dieser Funktion kann ein Detektionssystem für eine spezifische Substanz über Bindung an Avidin oder Streptavdin, die mit einer Fluo reszenzverbindung oder dergleichen markiert ist, durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung oder chemisch geschaffen werden. Zusätzlich können verschiedene Farbstoffe und eine große Anzahl an Substanzen, die durch biochemische, chemische oder immunchemische Detektionsverfahren detektiert werden können, als Markierungsverbindungen verwendet werden. Dies ist für Fachleute verständlich.
Ein besonderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein BODIPY-FL-markiertes Aminophenylalalinderivat (BODIPY FL-AF) mit einer Struktur bereit, die in Formel I gezeigt ist, worin eine kommerzialisierte BODIPY-Fluoreszenzfarbstoffverbindung, 4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen- 3-propionsäure (BODIPY^®-FL), an einen aromatischen Ring auf der Seitenkette von Aminophenylalanin gebunden ist. Dies kann mithilfe eines Proteinsynthesesystems in ein Protein eingeführt werden, und das resultierende Protein weist Fluoreszenzeigenschaften von BODIPY auf (d.h. intensive Emission im sichtbaren Lichtbereich). Daher kann es einfach detektiert werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt BODIPY-markierte Aminosäuren bereit, in welchen BODIPY-FL über einen Abschnitt, der eine -CO-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH-Struktur aufweist, die von einem BODIPY-FL-X als Spacer stammt, an eine Aminosäure gebunden ist, wenn ein Derivat einer BODIPY-Verbindung, 6-((4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino)hexansäure (BODIPY^®-FL-X), als Markierungsverbindung verwendet wird.
Zum Beispiel, wenn para-Aminophenylalanin als Aminosäure verwendet wird, kann BODIPY-FL-X-Aminophenylalanin (BODIPY-FL-X-AF), durch Formel II dargestellt, erhalten werden.
Zusätzlich zu BODIPY-FL-X-Aminophenylalanin (BODIPY-FL-X-AF) sind BODIPY R6G-AF, BODIPY 576/589-AF und BODIPY 558/568-AF ebenfalls bevorzugt markierte Aminosäuren in der vorliegenden Erfindung. BODIPY FL-AF und BODIPY 558/568-AF sind besonders bevorzugt.
Aminoacyl-tRNA, an welche die markierte Aminosäure der vorliegenden Erfindung gebunden ist, kann für das Proteinsynthesesystem verwendet werden. Daher muss die markierte Aminosäure eine Stelle für die Bindung an tRNA aufweisen, und ein Beispiel für die Bindungsstelle ist ein Dinucleotid (pdCpA). In einem solchen Fall ist pdCpA zuvor an eine Aminosäure gebunden, und ein Aminosäure-pdCpA-Konjugat kann mit einer geeigneten Markierungsverbindung markiert werden.
Zum Beispiel wird AF-pdCpA, das durch Bindung von pdCpA an Aminophenylalanin hergestellt wird, als Aminosäure verwendet, und diese Aminosäure wird an BODIPY FL-X gebunden. Dies kann ein markiertes Aminosäure-pdCpA-(BODIPY-FL-X-AF-pdCpA-)Konjugat bereitstellen, das eine Struktur aufweist, die durch Formel III dargestellt ist:
In dieser Verbindung ist Aminophenylalanin-pdCpA (AF-pdCpA) über einen Spacer, der eine Stelle umfasst, die über eine -CO-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH-Struktur verfügt, die wie oben beschrieben vom BODIPY-FL-X abstammt, an eine Markierungsverbindung BODIPY FL gebunden. Diese markierte Aminosäure kann auch über ein Proteinsynthesesystem in ein Protein eingeführt werden, und das resultierende Protein weist Fluoreszenzeigenschaften von BODIPY-FL auf (d.h. intensive Emission im sichtbaren Lichtbereich). Daher kann es einfach detektiert werden.
Dementsprechend ist BODIPY FL-X besonders zur Synthese der markierten Aminosäure der vorliegenden Erfindung als Markierungsverbindung nützlich, die den Spacer der vorliegenden Erfindung umfasst.
Das zuvor genannte BODIPY FL-AF oder BODIPY FL-X-AF ist besonders als markierte Aminosäure der vorliegenden Erfindung bevorzugt, da sie Fluoreszenzeigenschaften von BODIPY FL aufweist und durch ein Proteinsynthesesystem wirkungsvoll in ein Protein aufgenommen wird. Zum Beispiel, wenn es mit BODIPY-FL-markiertem Lysin, d.h. BODIPY-FL-K oder BODIPY-FL-X-K, verglichen wird, ist die Wirksamkeit von BODIPY FL-AF oder BODIPY FL-X-AF der Einführung in ein Protein signifikant hoch. Eine Verweis kann auf die nachstehenden Beispiele gemacht werden.
Inkorporation der markierten Aminosäure der vorliegenden Erfindung in ein Protein kann ein funktionelles Protein bereitstellen, das die zuvor genannte markierte Aminosäure in einem gewünschten Proteinmolekül umfasst. Das Protein kann ein beliebiges Protein sein, wie z.B. ein Enzym oder ein Protein, das in der Lage ist, sich an ein spezifisches Molekül, wie z.B. einen Antikörper oder Streptavidin, zu binden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Synthese des zuvor genannten funktionellen Proteins bereit. Synthese eines funktionellen Proteins in einem Proteinsynthesesystem erfordert die Herstellung einer Aminoacyl-tRNA, worin eine markierte Aminosäure der vorliegenden Erfindung und ein Anticodon, das zu einem Codon komplementär ist, das entworfen ist, um insbesondere für die markierte Aminosäure zu kodieren, aneinander gebunden werden. Ein solche Aminoacyl-tRNA kann z.B. auf die folgende Art synthetisiert werden. Eine Aminogruppe der Aminosäure wird mit Boc oder dergleichen geschützt, die geschützte Aminosäure wird an ein Dinucleotid (pdCpA) gebunden, das Entstandene wird der Entschützung unterworfen, wie z.B. Entfernung von Boc, das resultierende Aminosäure-pdCpA-Konjugat wird mit einer Markierungsverbindung umsetzen gelassen, um eine Markierungsverbindung über eine funktionelle Gruppe, die in einen aromatischen Ring eingeführt wurde, daran zu binden, und das resultierende markierte Aminosäure-pdCpA-Konjugat wird durch Flüssigkeitschromatographie gereinigt. Separat wird tRNA, der ein CA-Dinucleotid am 3'-Terminus fehlt (tRNA(-CA)), hergestellt, und das markierte Aminosäure-pdCpA-Konjugat wird mithilfe einer Ligase an die tRNA(-CA) gebunden. Daher kann Aminoacyl-tRNA von Interesse erhalten werden. Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung des markierten Aminosäure-pdCpA-Konjugats, worin eine Aminosäure an pdCpA gebunden ist, und wird dann mit einer Markierungsverbindung umsetzen gelassen, um ein markiertes Aminosäure-pdCpA-Konjugat zu erhalten. In herkömmlichen Verfahren wird eine Aminosäure mithilfe einer Aminoacyl-tRNA-Synthase an tRNA gebunden und dann mit einer markierten Verbindung umsetzen gelassen. Oder eine markierte Aminosäure wird einmal synthetisiert, das synthetisierte Produkt dann an pdCpA konjugiert und das Entstandene weiter an tRNA gebunden. In einem Verfahren zur Markierung eines Aminosäure-tRNA-Konjugats ist es jedoch schwierig, eine α-Aminogruppe von einer Seitenkettenaminosäure für Markierung zu unterscheiden. Die Entfernung eines nicht umgesetzten Aminosäure-tRNA-Konjugats ist ebenfalls schwierig.
Dementsprechend sind die Ausbeute des markierten Target-Aminosäure-tRNA-Konjugats und die Wirksamkeit der Einführung einer markierten Aminosäure in ein Protein signifikant verschlechtert. Im Allgemeinen erkennt eine Aminoacyl-tRNA-Synthase eine Anticodon-Stelle einer tRNA. Dementsprechend kann tRNA, die im Verfahren verwendet wird, das ein vierbasiges Codon verwendet, die im Verfahren verwendet wird, das ein künstliches Basencodon verwendet, oder im Verfahren verwendet wird, das ein Terminationscodon verwendet, nicht aminoacyliert werden. Nur natürlich auftretende Aminosäuren können mit diesem Verfahren markiert werden. Andererseits ist es notwendig, mehrere Verfahren durchzuführen, bis die Targetverbindung nach Bindung der Markierungsverbindung in einem Verfahren erhalten wird, worin eine markierte Aminosäure einmal synthetisiert wird, das synthetisierte Produkt dann an pdCpA gebunden wird und das Entstandene weiter an tRNA gebunden wird. Dementsprechend wird die Ausbeute pro Menge der verwendeten Markierungsverbindung signifikant gering, und daher ist dies besonders problematisch, wenn eine teure Substanz wie z.B. ein Fluoreszenzmaterial zur Markierung verwendet wird. Weiters kann eine Markierungssubstanz durch eine Säure oder Base, die als Reakti onsreagens verwendet wird, ungünstig abgebaut werden, wenn die markierte Aminosäure an pdCpA gebunden ist.
Im Verfahren zur Herstellung des markierten Aminosäure-tRNA-Konjugats der vorliegenden Erfindung wird eine Aminosäure mit einer Markierungsverbindung im letzten Schritt der Reaktion umgesetzt. Daher kann ein markiertes Aminosäure-pdCpA-Konjugat wirkungsvoll synthetisiert werden. Im Fall von Aminophenylalanin kann eine α-Aminogruppe vorteilhaft separat von einer Seitenkettenaminogruppe markiert werden, wenn eine Aminogruppe an einen aromatischen Ring der Seitenkette gebunden ist. Das markierte Aminosäure-pdCpA-Konjugat kann vollständig und einfach getrennt und aus dem nicht-umgesetzten Aminosäure-pdCpA durch Flüssigkeitschromatographie gereinigt werden. Da die Aminosäure mit einer Markierungsverbindung im letzten Schritt markiert wird, können die Konjugate einfach mit einer Vielzahl von Markierungsmitteln synthetisiert werden.
Die markierte Aminoacyl-tRNA, die durch ein solches Verfahren hergestellt wird, kann in einem zellfreien Translationssystem oder einem Proteinsynthesesystem in lebenden Zellen produziert werden. Das Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, das Verfahren, das ein künstliches Basencodon verwendet, oder das Verfahren, das ein Terminationscodon verwendet, wird vorzugsweise als zellfreies Translationssystem verwendet. Verweise können auf Science 244, 182 (1989), und J. Am. Chem. Soc. 111, 8013 (1989), betreffend das Verfahren, das ein Terminationscodon verwendet, I. Hirao et al., Nature Biotech. 20, 177-182 (2002), betreffend das Verfahren, das ein künstliches Basencodon verwendet, und T. Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 9778-9779 (1996), und T. Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc. 121, 34-40 (1990), betreffend das Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, gemacht werden. Ein Verfahren, in welchem Aminoacyl-tRNA und mRNA durch Mikroinjektion in Zellen injiziert wird, ist ein bekanntes Verfahren zur Gewinnung eines Proteins, das eine nicht-natürliche Aminosäure umfasst, durch ein Proteinsynthesesystem in lebenden Zellen (Science 268, 439 (1995)). Mit diesem Verfahren kann das funktionelle Protein der vorliegenden Erfindung in einer lebenden Zelle exprimiert werden.
Das Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, ist manchmal von Vorteil, da eine gewünschte Anzahl an markierten Aminosäuren in ein vorgegebenes Proteinmolekül an seinen gewünschten Positionen eingeführt wird.
Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung ein funktionelles Protein, das durch das zuvor genannte Verfahren synthetisiert wird. Ein solches funktionelles Protein weist Eigenschaften auf, die von einer Markierungsverbindung abstammen, die in einem Molekül enthalten sind. Daher ist eine große Anzahl an Anwendungen durch die Verwendung solcher Eigenschaften möglich.
Zum Beispiel wird ein markiertes Protein mit einer Aminosäure, die mit einer Fluoreszenzverbindung markiert ist, durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gewonnen, das resultierende Protein ist an eine Substanz gebunden, die in der Lage ist, sich daran zu binden, und Fluoreszenzpolarisierung des Konjugats wird gemessen, wodurch eine Substanz detektiert wird, die in der Lage ist, sich an das zuvor genannte Protein zu binden. Alternativ dazu wird dieses Protein mit einem Chip oder einer Platte umsetzen gelassen, an welche eine Substanz gebunden worden ist, die in der Lage ist, sich daran zu binden. Fluoreszenz wird nach Waschung beurteilt oder abklingende Fluoreszenz wird in gewaschenem Zustand beurteilt. Daher kann eine Substanz, die in der Lage ist, das zuvor genannte Protein zu binden, detektiert werden. Weiters kann die Molekularbewegung oder Bindung an ein spezifisches Protein des zuvor genannten Proteins direkt durch unimolekulare Fluoreszenzdetektion beobachtet werden. Das Protein ist auch an eine Zelle gebunden, und eine Zelle, die über einen Rezeptor des Proteins verfügt, wird durch Durchflusszytometrie getrennt. Alternativ dazu wird das Protein in eine Zelle eingeführt, und die Proteinverteilung in der Zelle kann untersucht werden. Das funktionelle Protein der vorliegenden Erfindung kann auf eine Vielzahl von Fachgebieten angewendet werden, wie z.B. Detektion von Fluoreszenzveränderungen oder Untersuchung von der Bindung an andere Substanzen oder Bindungsstellen durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie. In den nachstehenden Beispielen sind BODIPY-FL-markierte Derivate von Streptavidin und Anti-Lysozym-Kamel-Antikörper als Beispiel für das funktionelle Protein der vorliegenden Erfindung dargestellt.
Diese Beschreibung umfasst Teile oder alle Inhalte, die in der Beschreibung und/oder den Zeichnungen der japanischen Patentanmeldung Nr. 2002-209736 offenbart sind, die ein Prioritäts-Dokument der vorliegenden Anmeldung ist.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Flussdiagramm, das BODIPY-FL-X-AF-pdCpA (BFLXAF-pdCpA) zeigt, das durch HPLC isoliert wurde.
2 zeigt systematisch die Synthese von BODIPY-FL-X-AF-tRNA.
3 zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzdetektion (rechts) und von Western-Blotting (links) von Streptavidin, das nach Einführung von BODIPY FL-X-AF, BODIPY FL-AF, BODIPY FL-X-K oder BODIPY FL-K in Streptavidin durch das Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, erzeugt wurde.
4 zeigt die Ergebnisse von Lysozymquantifizierung durch Testen der Fluoreszenz des Anti-Lysozymantikörpers (Kamelantikörper), in welchen BODIPY FL-X-AF eingeführt worden ist. Die rechte Seite der Zeichnung zeigt eine Reaktion in einem Diagramm.
5A zeigt Strukturformeln von BODIPY FL-AF, BODIPY R6G-AF, BODIPY 558/568-AF und BODIPY 576/589-AF, 5B zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzdetektion von Streptavidin, das nach separater Einführung davon in Streptavidin durch das Verfahren erzeugt wurde, das ein vierbasiges Codon verwendet, und 5C zeigt die Ergebnisse des Western-Blottings davon.
6A zeigt Strukturformeln von Biotin-Lys, Biotin-X-Lys, Biotin-AF und Biotin-X-AF, 6B zeigt die Ergebnisse von Fluoreszenzdetektion des grünfluoreszierenden Proteins, das durch separates Einführen davon in grünfluoreszierendes Protein durch das Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, erzeugt wurde, und 6C zeigt die Ergebnisse von Western-Blotting davon mit streptavidingebundener alkalischer Phosphatase.
Die besten Arten zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird hierin nachstehend detailliert unter Verweis auf die folgenden Beispiele beschrieben, obwohl die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Synthese von BODIPY-FL-AF-pdCpA, BODIPY-FL-X-AF-pdCpA BODIPY-FL-K-pdCpA und BODIPY-FL-X-K-pdCpA
Synthese von AF-pdCpA
Di-boc-aminophenylalanincyanomethylester (1,1 μmol) wurde zu 5 μl einer Lösung von pdCpA-tetra-n-butylammonium (0,044 μmol/μl) in DMF hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang umsetzen gelassen. Nachdem der Reaktionsfortschritt durch HPLC nachgewiesen wurde, wurden 1,4 ml Diethylether zur Reaktionslösung hinzugegeben. Das Entstandene wurde gerührt und bei 15.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Präzipitat wurde durch Hinzufügung von 20 μl Acetonitril gelöst. 1,4 ml Diethylether wurden dazu gegeben und das Entstandene gerührt, gefolgt von 5-minütiger Zentrifugation bei 15.000 U/min. Der Überstand wurde entfernt, das Präzipitat durch erneute Hinzufügung von 20 μl Acetonitril gelöst, 1,4 ml Diethylether wurden hinzugegeben und das Gemisch gerührt, gefolgt von 5-minütiger Zentrifugation bei 15.000 U/min. Der Überstand wurde entfernt, gefolgt von Trocknung unter reduziertem Druck.
Trifluoressigsäure (100 μl) wurde zum Entstandenen unter Eiskühlung hinzugegeben, das Gemisch wurde unter leichtem Rühren gelöst und das Produkt auf Eis 10 min lang stehen gelassen. Trifluoressigsäure wurde unter reduziertem Druck entfernt, 1,4 ml Diethylether wurden hinzugegeben, das Gemisch gerührt und zentrifu giert und der Überstand entfernt. Das Produkt wurde weiters zweimal mit Diethylether gewaschen. Nach Trocknung unter reduziertem Druck wurde das Produkt in 40 μl DMSO gelöst.
Synthese von BODIPY-FL-AF-pdCpA und BODIPY-FL-X-AF-pdCpA
Ein Mikroliter (1 μl) DMSO-Lösung, die 0,1 M BODIPY FL-SE oder BODIPY FL-X-SE (Molecular Probes) enthielt, 7 μl DMSO und 16 μl von 0,1 M Pyridin-HCl (pH 5,0) wurden zu 8 μl einer Lösung von AF-pdCpA in DMSO hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 37 °C 12 Stunden lang umsetzen gelassen. Anteile, die eine Targetsubstanz enthielten, wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Eluent: ein linearer Gradient von 0,1 % Trifluoressigsäure mit Methanol, siehe HPLC-Flussdiagramm) gewonnen, und das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Zentrifugalkonzentrators entfernt. Ein Teil des Entstandenen wurde mit 0,1 M NaOH hydrolysiert, und das freigesetzte pdCpA wurde durch HPLC quantifiziert, wodurch die Konzentration der gewonnenen Targetsubstanz bestimmt wurde. Die Targetsubstanz wurde in DMSO auf eine Konzentration von 2,2 mM gelöst.
Synthese von BocLys-pdCpA
α-Boc-ε-Nps-Lysincyanomethylester (1,1 μmol) wurde zu 5 μl einer Lösung von pdCpA-Tetra-n-butylammonium (0,044 μmol/μl) in DMF hinzugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur 2 Stunden lang umsetzen gelassen. Nachdem der Reaktionsfortschritt durch Umkehrphasen-HPLC nachgewiesen wurde (Eluent: ein linearer Gradient von 0,1 % Trifluoressigsäure mit Methanol), wurden 1,4 ml Diethylether zur Reaktionslösung hinzugegeben. Das Entstandene wurde gerührt und bei 15.000 U/min 5 min lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Präzipitat wurde durch Hinzufügung von 20 μl Acetonitril gelöst, es wurden 1,4 ml Diethylether hinzugegeben und das Entstandene gerührt, gefolgt von Zentrifugation bei 15.0000 U/min 5 Minuten lang. Der Überstand wurde entfernt, das Präzipitat wurde durch Hinzufügung von 20 μl Acetonitril wieder gelöst, es wurden 1,4 ml Diethylether hinzugege ben, und das Gemisch wurde gerührt, gefolgt von Zentrifugation bei 15.000 U/min 5 Minuten lang. Der Überstand wurde entfernt und das Entstandene unter reduziertem Druck getrocknet.
Das Entstandene wurde in 200 μl einer Lösung, die 40 mM Natriumthiosulfat und 50 mM Natriumacetat (pH 7,4) enthielt, gelöst und die Lösung bei Raumtemperatur 1 Stunde lang stehen gelassen. Ein Peak an Interesse wurde durch Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt und ein Lösungsmittel unter Verwendung eines Zentrifugalkonzentrators entfernt. Das Entstandene wurde in DMSO auf eine Konzentration von 3 mM gelöst.
Synthese von BODIPY-FL-K-pdCpA und BODIPY-FL-X-K-pdCpA
Ein Mikroliter (1 μl) DMSO-Lösung, die 0,1 M BODIPY FL-SE oder BODIPY FL-X-SE (Molecular Probes) enthielt, 5 μl DMSO und 10 μl von 0,1 M NaHCO₃ wurden zu 5 μl DMSO-Lösung hinzugefügt, die 3 mM BocLys-pd-CpA enthielt, und das Gemisch wurde auf Eis 30 Minuten lang umsetzen gelassen. Das Entstandene wurde mit der Hinzufügung von 1,5 μl von 1 M Essigsäure neutralisiert und dann mit 0,1 % TFA verdünnt. Anteile, die eine Targetsubstanz enthielten, wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Eluent: ein linearer Gradient von 0,1 % Trifluoressigsäure mit Methanol) gewonnen. Das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Zentrifugalkonzentrators entfernt und das Entstandene in 50 μl Dioxan gelöst. Eine wässrige Lösung von 4 M HCl (50 μl) wurde hinzugefügt und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang stehen gelassen. 2 M Ammoniumacetat (50 μl) wurden hinzugefügt, und Anteile, die eine Targetsubstanz enthielten, wurden durch Umkehrphasen-HPLC gewonnen. Das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Zentrifugalkonzentrators entfernt. Ein Teil des Entstandenen wurde mit 0,1 M NaOH hydrolysiert, und freigesetztes pdCpA wurde durch Umkehrphasen-HPLC quantifiziert, wodurch die Konzentration der gewonnenen Targetsubstanz bestimmt wurde. Die Targetsubstanz wurde in DMSO auf eine Konzentration von 2,2 mM gelöst.
Synthese von Aminoacyl-tRNA
Vier Mikroliter (4 μl) von 5 × Ligationspuffer (275 mM HEPES-Na, pH 7,5, 75 mM MgCl₂, 16,5 mM DTT und 5 mM ATP), 2,5 μl von 200 μM tRNA(-CA), 2 μl einer Lösung von Aminoacyl-pdCpA in DMSO, 0,4 μl von 0,1 % BSA, 1,2 μl von T4-RNA-Ligase (25 Einheiten/μl) und 9,9 μl Wasser wurden gemischt, und das Gemisch wurde bei 4 °C 2 Stunden lang umsetzen gelassen. 3 M AcOK (pH 4,5, 10 μl) und 70 μl Wasser wurden dazu hinzugegeben, und eine äquivalente Menge von Phenol/Chloroform (1/1) (gesättigt mit 0,3 M AcOK (pH 4,5)) wurde dazu zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt und zentrifugiert. Die obere Phase wurde gewonnen, es wurde ein gleiches Volumen an Chloroform hinzugefügt und das Gemisch gerührt, gefolgt von Zentrifugation. Die obere Phase wurde gewonnen, und 300 μl Ethanol wurden dazu hinzugefügt, das Gemisch wurde leicht gemischt, und das Entstandene wurde dann bei –20 °C 1 Stunde lang stehen gelassen. Das Gemisch wurde bei 15.000 U/min bei 4 °C 30 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und 200 μl von 70 % EtOH, das bei –20 °C aufbewahrt wurde, wurden zum Entstandenen hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugation bei 15.000 U/min bei 4 °C 5 s lang. Der Überstand wurde entfernt, und das Entstandene wurde unter reduziertem Druck getrocknet. Das Produkt wurde in 20 μl von 1 mM Kaliumacetat (pH 4,5) gelöst.
Die obige Synthesereaktion ist in 2 schematisch dargestellt, indem die Synthese von BODIPY-FL-X-AF-tRNA als Beispiel genommen wurde.
Einführung von BODIPY-FL-markiertem Aminophenylalanin oder Lysin in die Tyr83-Position von Streptavidin
Ein Mikroliter (1 μl) von HEPES-KOH (55 mM, pH 7,5), 210 mM Kaliumglutamat, 6,9 mM Ammoniumacetat, 1,7 mM Dithiothreit, 1,2 MM ATP, 0,28 mM GTP, 26 mM Phosphoenolbrenztraubensäure, 1 mM Spermidin, 1,9 % Polyethylenglykol-8000, 35 μg/ml Folsäure, 12 mM Magnesiumacetat, 0,1 mM von 20 Arten von Aminosäuren und mRNA (8 μg/μl) von Streptavidin, die eine T7-Markierung am N-Terminus und eine His-Markierung am C-Terminus enthält und bei der das Codon an der Tyr83-Position durch CGGG ersetzt wurde, das für die zuvor genannte markierte Aminosäure kodiert (Seq.-ID Nr. 1), 2 μl von E.-coli-Extrakt (Promega) und 1 μl der oben genannten Aminoacyl-tRNA-Lösung wurden mit einer Reaktionslösung (10 μl) gemischt. Das Entstandene wurde 1 Stunde lang Translation bei 37 °C unterworfen. Wasser (9 μl) und ein 2 x Probenpuffer (10 μl) wurden zu 1 μl Translationslösung hinzugegeben, das Gemisch 5 min lang auf 95 °C erhitzt, und 5 μl davon wurden 15 % SDS-PAGE unterworfen. Nach Beendigung von SDS-Page wurde das resultierende Gel unter Verwendung eines Fluoreszenzscanners (Fluorlmager 595, Molecular Dynamics, Anregungsstrahl: 488 nm, Emissionsfilter: 530 DF 30) beobachtet. Dieses Gel wurde Western-Blotting unter Verwendung des Anti-T7-Markierungsantikörpers unterworfen. Wenn Translation mit der Hinzufügung von BODIPY-FL-AF-tRNA und BIODIPY-FL-X-AF-tRNA durchgeführt wurde, wurde durch Western-Blotting eine Bande an derselben Position beobachtet wie im Fall eines Wildtyp-Streptavidins, und diese Bande emittierte Fluoreszenz. Daher wurde nachgewiesen, dass BODIPY FL-AF (BFLAF) und BODIPY FL-X-AF (BFLXAF) in das Streptavidin eingeführt wurden. Obwohl Einführung von BODIPY FL-K (BFLK) und BODIPY FL-X-K (BFLXK) in Streptavidin ebenfalls nachgewiesen wurde, waren die Proteinwerte darin, die durch Western-Blotting und einen Fluoreszenzscanner detektiert wurden, viel geringer als jene in den Fällen von BODIPY FL-AF und BODIPY FL-X-AF. Die Ergebnisse von Western-Blotting und Fluoreszenzdetektion sind in 3 dargestellt.
Test der Fluroeszenzpolarisierung
mRNA (Seq.-ID Nr. 2), die für den Anti-Lysozymantikörper (der von einem Kamel stammt) kodiert, der BODIPY FL-X-AF an seinem N-Terminus umfasst und mit einer T7-Markierung und einer His-Markierung am N-Terminus bzw. C-Terminus markiert ist, wurde zur Durchführung von Translation auf dieselbe Weise verwendet wie im Fall von Streptavidin in Gegenwart von BODIPY-FL-X-AF-tRNA. Zum Zwecke der Bildung von Disulfidbindung wurden 2 mM oxidiertes Glutathion anstelle von Dithiothreit hinzugegeben. Das Produkt wurde durch eine Metallchelatsäule (TALON, Clontech) gereinigt, und der Grad der Fluoreszenzpolarisierung wurde getestet, während Lysozym zum Eluat unter Verwendung eines BEACON 2000 (Panvera) hinzugegeben wurde. Als Ergebnis wurde ein Anstieg des Grads der Fluoreszenzpolarisierung gemeinsam mit der Hinzufügung von Lysozym beobachtet. Dieses Phänomen war aufgetreten, weil das Antigenlysozym an den Anti-Lysozymantikörper, der an seinem N-Terminus BODIPY FL-X-AF umfasste, gebunden war, und dies hemmte Molekularbewegungen, wodurch der Grad der durch BODIPY FL-X-AF gezeigten Fluoreszenzpolarisierung erhöht wurde. Die Testergebnisse sind in 4 dargestellt.
Synthese von BODIPY-R6G-AF-pdCpA, BODIPY-558/568-AF-pdCpA und BODIPY-576/589-AF-pdCpA
Fünf Mikroliter (5 μl) von DMSO-Lösung, die 0,1 M BODIPY R6G-SE, BODIPY 558/568-SE oder BODIPY 576/589-SE (Molecular Probes) enthielten, 15 μl DMSO und 20 μl von 0,1 M Pyridin-HCl (pH 5,0) wurden zu 10 μl einer Lösung von AF-pdCpA in DMSO hinzugegeben, und das Gemisch wurde bei 37 °C 48 Stunden lang umsetzen gelassen. Anteile, die eine Targetsubstanz enthielten, wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Eluent: ein linearer Gradient einer 0,1 % Trifluoressigsäure mit Methanol) gewonnen, und das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Zentrifugalkonzentrators entfernt. Die Targetsubstanz wurde in 0,1 % Trifluoressigsäure gelöst, ein Teil des Entstandenen wurde mit 0,1 M NaOH hydrolysiert, und freigesetztes pdCpA wurde durch HPLC quantifiziert, wodurch die Konzentration der gewonnenen Targetsubstanz bestimmt wurde. Die Targetsubstanz wurde in DMSO auf eine Konzentration von 2,2 mM gelöst.
Synthese von BioAF-pdCpA und BioX-AF-pdCpA
Fünf Mikroliter (5 μl) von DMSO-Lösung, die 0,1 M Biotin-SE oder Biotin-X-SE (Sigma), enthielten, 5 μl DMSO und 20 μl von 0,1 M Pyridin-HCl (pH 5,0) wurden zu 10 μl einer Lösung von AF-pdCpA in DMSO hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei 37 °C 24 Stunden lang umsetzen gelassen. Anteile, die eine Targetsubstanz enthalten, wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Eluent: ein linearer Gradient von 0,1 % Trifluoressigsäure mit Methanol) gesammelt, und das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Zentrifugalkonzentrators entfernt. Ein Teil des Entstandenen wurde mit 0,1 M NaOH hydrolysiert, und das freigesetzte pdCpA wurde durch HPLC quantifiziert, wodurch die Konzentration der gewonnenen Targetsubstanz bestimmt wurde. Die Targetsubstanz wurde in DMSO auf eine Konzentration von 2,2 mM gelöst.
Synthese von BioK-pdCpA und BioX-K-pdCpA
Zwei Mikroliter (2 μl) von DMSO-Lösung, die 0,1 M Biotin-SE oder Biotin-X-SE (Sigma) in 0,1 M DMSO (2 μl) enthielten, 2 μl DMSO und 8 μl von 0,1 M NaHCO₃ wurden zu 4 μl einer DMSO-Lösung hinzugefügt, die 3 mM BocLys-pdCPA enthielt, und das Gemisch wurde auf Eis 30 min umsetzen gelassen. Das Entstandene wurde durch Hinzufügung von 1,2 μl 1 M Essigsäure neutralisiert und dann mit 0,1 % TFA verdünnt. Anteile, die eine Targetsubstanz enthielten, wurden durch Umkehrphasen-HPLC gewonnen (Eluent: ein linearer Gradient von 0,1 % Trifluoressigsäure mit Methanol), und das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Zentrifugalkonzentrators entfernt. Trifluoressigsäure (100 μl) wurde unter Eiskühlung hinzugegeben, und das Gemisch wurde gelöst und die Lösung unter Eiskühlung 5 min stehen gelassen. Trifluoressigsäure wurde unter reduziertem Druck entfernt, 200 μl Wasser wurden dazu hinzugefügt, und ein Teil des Entstandenen wurde mit 0,1 M NaOH hydrolysiert, und freigesetztes pdCpA wurde durch Umkehrphasen-HPLC quantifiziert, wodurch die Konzentration der gewonnenen Targetsubstanz bestimmt wurde. Nach Zentrifugalkonzentration wurde die Targetsubstanz in DMSO auf eine Konzentration von 2,2 mM gelöst.
Einführung von BODIPY-R6G-, BODIPY-558/568- und BODIPY-576/589-markiertem Aminophenylalanin in die Tyr83-Position von Streptavidin
Ähnlich wie im Fall der Einführung von BODIPY-FL-markiertem Aminophenylalanin oder Lysin wurden Translation, SDS-PAGE und Western-Blotting durchgeführt. Fluo reszenzdetektion wurde unter Verwendung eines Emissionsfilters 590 DF 30 (Anregungsstrahl 514 nm) durchgeführt. Wenn Translation mit der Hinzufügung von Aminoacyl-tRNA durchgeführt wurde, an welche BODIPY R6G-AF (BR6GAF), BODIPY 558/568-AF (B558AF) oder BODIPY 576/589-AF (B576AF) gebunden worden waren, wurde durch Western-Blotting eine Bande an derselben Position beobachtet wie im Fall eines Wildtyp-Streptavidins, und diese Bande emittierte Fluoreszenz. Daher wurde die Einführung dieser markierten Aminophenylalanine in das Streptavidin nachgewiesen. Die Ergebnisse von Western-Blotting und Fluoreszenzdetektion sind in 5 dargestellt.
Einführung von biotin-markiertem Aminophenylalanin oder Lysin in den N-Terminus eines grünfluoreszierenden Proteins
mRNA eines grünfluoreszierenden Proteins, die an ihrem N-Terminus eine T7-Markierung und an ihrem C-Terminus eine His-Markierung umfasste und bei der das Codon am N-Terminus durch CGGG ersetzt wurde, das für die zuvor genannte Aminosäure kodierte (Seq.-ID Nr. 3), und Aminoacyl-tRNA, an welche biotinmarkiertes Aminophenylalanin oder Lysin gebunden worden war, wurden zur Durchführung von Translation und SDS-Page auf ähnliche Weise wie im Fall von Streptavidin verwendet. Wenn die Fluoreszenz des grünfluoreszierenden Proteins detektiert wurde, wurde ein Probenpuffer verwendet, der kein β-Mercaptophanol enthielt, und Erwärmung wurde bei 50 °C 5 min lang durchgeführt. Western-Blotting unter Verwendung des Anti-T7-Markierungsantikörpers wurde auf ähnliche Weise durchgeführt wie im Fall von Streptavidin. Western-Blotting unter Verwendung der streptavidingebundener alkalischer Phosphatase wurde unter Verwendung einer gemischten Lösung von 2 μg/ml Streptavidin (Sigma) und 1 μg/ml biotinmarkierter alkalischer Phosphatase (Calbiochem) durchgeführt. Wenn eine Translation mit Hinzufügung von Aminoacyl-tRNA durchgeführt wurde, an welche biotinmarkierte Aminosäure gebunden worden war, wurde durch Western-Blotting eine Bande an derselben Position wie im Fall eines grünfluoreszierenden Proteins vom Wildtyp unter Verwendung des Anti-T7-Antikörpers beobachtet (Daten sind nicht dargestellt), eine Fluoreszenzbande, die vom grünfluoreszierenden Protein stammt, wurde beobachtet, und eine Bande wurde durch Western-Blotting unter Verwendung von streptavidingebundener alkalischer Phosphatase detektiert. Daher wurde Einführung von biotinmarkiertem Aminophenylalanin oder Lysin in das Protein nachgewiesen. Die Ergebnisse von Western-Blotting und Fluoreszenzdetektion sind in 6 dargestellt.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die markierte Aminosäure, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, wird wirkungsvoll in einem Proteinsynthesesystem verwendet, und Nutzung davon ermöglicht einem Protein, das über Funktionen verfügt, die von einer Markierungsverbindung stammen, wirkungsvoll in einem Proteinsynthesesystem synthetisiert zu werden. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein neues Mittel zur wirkungsvollen Synthese eines funktionellen Proteins bereit.
Freier Text des Sequenzprotokolls
Seq.-ID Nr. 1 repräsentiert künstliche mRNA eines BODIPY-FL-markierten Streptavidins, das mit einer T7-Markierung und einer His-Markierung fusioniert ist, worin eine Sequenz, die aus Resten 64 bis 96 besteht, für die T7-Markierung kodiert, eine Sequenz bestehend aus Resten 112 bis 589 für Streptavidin kodiert, eine Sequenz bestehend aus Resten 590 bis 607 für die His-Markierung kodiert und eine Sequenz bestehend aus Resten 358 bis 361, CGGG, für BODIPY FL-X-AF kodiert.
Seq.-ID Nr. 2 repräsentiert künstliche mRNA eines BODIPY-FL-markierten Anti-Lysozymkamelantikörpers, der mit einer T7-Markierung und einer His-Markierung fusioniert ist, worin eine Sequenz, die aus Resten 64 bis 96 besteht, für die T7-Makreirung kodiert, eine Sequenz bestehend aus 116 bis 514 für den Anti-Lysozymkamelantikörper kodiert und eine Sequenz bestehend aus den Resten 515 bis 532 für die His-Markierung kodiert und eine Sequenz bestehend aus den Resten 100 bis 103, CGGG, für BODIPY FL-X-AF kodiert.
Seq.-ID Nr. 3 repräsentiert künstliche mRNA eines biotin-FL-markierten grünfluoreszierenden Proteins, das mit einer T7-Markierung und einer His-Markierung fusioniert ist, worin eine Sequenz, die aus den Resten 64 bis 96 besteht, für die T7-Markierung kodiert, eine Sequenz bestehend aus den Resten 116 bis 826 für das grünfluoreszierende Protein kodiert, eine Sequenz bestehend aus den Resten 827 bis 844 für die His-Markierung kodiert und eine Sequenz bestehend aus den Resten 100 bis 103, CGGG, für die biotinmarkierte Aminosäure kodiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Aminoacyl-tRNA, worin ein markiertes p-Aminophenylalanin oder Tyrosin und tRNA mit einem Anticodon, das zu einem Codon komplementär ist, das dazu entworfen wurde, für das markierte p-Aminophenylalanin oder Tyrosin zu kodieren, aneinander gebunden sind und worin eine Markierungsverbindung über den aromatischen Ring in der Seitenkette an das p-Aminophenylalanin oder Tyrosin gebunden ist.
Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 1, worin das markierte p-Aminophenylalanin oder Tyrosin mit einer fluoreszierenden Substanz mit einer Anregungswellenlänge und einer Emissionswellenlänge im sichtbaren Lichtbereich markiert ist.
Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 2, worin die fluoreszierende Substanz eine chemische Verbindung ist, die 4,4-Difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen oder ein Salz davon als Grundskelett umfasst.
Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 3, worin die fluoreszierende Substanz 4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure oder ein Salz davon ist.
Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 1, worin das markierte p-Aminophenylalanin durch folgende Formel I dargestellt ist:
Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 1, worin das markierte p-Aminophenylalanin durch Formel 11 dargestellt ist:
Verfahren zur Synthese der Aminoacyl-tRNA nach Anspruch 1, worin pdCpA an p-Aminophenylalanin oder Tyrosin gebunden wird, das pdCpA-p-Aminophenylalanin- oder -Tyrosinkonjugat mit einer Markierungsverbindung umsetzen gelassen wird, um ein markiertes p-Aminophenylalanin- oder Tyrosin-pdCpA-Konjugat herzustellen, und das Entstandene an tRNA(-CA) gebunden wird.
Verfahren zur Synthese eines funktionellen Proteins, umfassend ein markiertes p-Aminophenylalanin oder Tyrosin, worin die markierte Verbindung unter Einsatz der Aminoacyl-tRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 über ein zellfreies Proteinsynthesesystem oder ein Proteinsynthesesystem in lebenden Zellen eingeführt wird, worin dieses Verfahren nicht ein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers ist.
Verfahren zur Synthese eines funktionellen Proteins nach Anspruch 8, worin ein Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, ein Verfahren, das ein Terminationscodon verwendet, oder ein Verfahren, das ein künstliches Basencodon umfasst, als Proteinsynthesesystem verwendet wird.
Verfahren zur Synthese eines funktionellen Proteins nach Anspruch 9, worin ein Verfahren, das ein vierbasiges Codon verwendet, als Proteinsynthesesystem verwendet wird.