DE102009021876A1

DE102009021876A1 - Verfahren zur Analyse des Neuritenwachstums

Info

Publication number: DE102009021876A1
Application number: DE200910021876
Authority: DE
Inventors: Jonathan Dr. West; Jean-Philippe Frimat; Julia Sisnaiske; Jan Prof. Dr. Hengstler; Christoph van Dr. Thriel
Original assignee: LEIBNIZ INST fur ANALYTISCHE; Leibniz Institut fuer Analytische Wissenschaften ISAS eV; Forschungsgesellschaft fuer Arbeitsphysiologie und Arbeitsschutz eV
Current assignee: LEIBNIZ INST fur ANALYTISCHE; Leibniz Institut fuer Analytische Wissenschaften ISAS eV; Forschungsgesellschaft fuer Arbeitsphysiologie und Arbeitsschutz eV
Priority date: 2009-05-19
Filing date: 2009-05-19
Publication date: 2010-11-25

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Analyse des Neuritenwachstums beschrieben, bei welchem ein Substrat mit einem Rastermuster bereitgestellt wird, welches erste Bereiche aufweist, auf denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen anlagern können, wobei die ersten Bereiche jeweils von zweiten Bereichen umgeben sind, auf denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen nicht anlagern können, wobei Neuronen oder neuronenähnliche Zellen auf den ersten Bereichen des Substrates angelagert werden und anschließend die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen einer oder mehreren oder keiner Testsubstanz(en) ausgesetzt werden und währenddessen und/oder danach die Neuritenauswüchse aus den Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen analysiert werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse des Neuritenwachstums.
In der Biologie werden Zellkompartimente, die die Fähigkeit besitzen, sich mit Gehirnzellen zu verbinden, Neuriten genannt. Im Nachfolgenden bezeichnet ein Neurit folgendes:
Neuriten, Axonen, Dendriten, intermediäre Segmente, terminale Segmente, Filipoden und/oder Wachstumskegel. Der Begriff ”neurale Zelle” umfasst die Vielfalt der Gehirnzellen von Menschen, Mäusen und anderen Säugetieren.
Die funktionelle Integrität des Nervensystems ist einerseits durch verschiedene Typen von Nervenzellen (z. B. Neuronen, Glia-Zellen) und andererseits durch die Interaktion zwischen diesen verschiedenen Gehirnzellen garantiert. Die strukturelle und funktionelle Grundlage dieser Zusammenschaltung sind Axone und Dendriten, welche die Informationen von einem Neuron zum anderen transportieren. Diese Netzwerke oder Schaltungen sind hochadaptiv und sowohl im sich entwickelnden Gehirn als auch im erwachsenen Gehirn werden fast kontinuierlich neue Synapsenverbindungen durch Axons und Dendriten angelegt. Fremdstoffe, wie Umweltchemikalien, Arzneimittel, chemische Arbeitsstoffe oder Drogen, können den Prozess der Zusammenschaltung entweder fördern (Neurogeneration) oder hemmen (Neurotoxizität). In verschiedenen Forschungszweigen (Medikamentenentwicklung, Regulationstoxikologie) werden verlässliche Werkzeuge und Auswahlprüfverfahren benötigt, um solche Effekte in einer standardisierten Umgebung zu detektieren.
Dabei spielt die Analyse des Neuritenwachstums eine wichti ge Rolle. Sogenannte ”neurite outgrowth assays” erfassen die Ausbildung von neuronalen Verbindungen durch Axone und Dendriten (zusammen als Neuriten bezeichnet). Diese Messverfahren werden vielfältig eingesetzt, da sie einfach zu handhaben sind und zu relativ geringen Materialkosten führen.
Das Neuritenwachstum kann anhand der Anzahl von Verbindungen zwischen den Zellen, der Neuritenwachstumsrate oder der Länge der Neuriten zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessen werden. Aus diesen Messungen kann dann ein Neuritenwachstumsindex ermittelt werden. Für die effiziente Entwicklung von der chemischen Leitstruktur (lead) zum Arzneimittel (drug-lead-discovery) können diese Verfahren durch den Einsatz von Robotertechnik und Mikrotiterplatten parallel genutzt und so die Produkte im Hochdurchsatzverfahren untersucht werden.
Bei den bisher bekannten Verfahren werden die Zellen zufällig und dicht kultiviert, wodurch hochspezifische Färbungen nötig sind, um die Neuritenverbindungen sichtbar zu machen. So ist beispielsweise ein selektiver Neuritenmarker (teurer Antikörper) verfügbar und die Firma Millipore Corporation, Massachussats, USA vertreibt ein sogenanntes ”Assay-Kit”, das Neuriten markiert, um sie mittels automatisierter Bildverarbeitung in einem Hochdurchsatzverfahren zu analysieren. Bei diesen Techniken variiert der Abstand zwischen benachbarten Zellen stark. Einerseits sind die Zellen, die sich berühren, zu dicht beieinander, andererseits sind Zellen durch große Distanzen voneinander getrennt, so dass unterschiedliche Gradienten für lösliche Faktoren vorliegen, die das Neuritenwachstum regulieren. Diese Distanzunterschiede erschweren es, substanzinduzierte Verhaltensänderungen der Zellen zu erkennen. Um diese Probleme zu bewältigen, sind umfangreiche Bilderfassungen in Kombination mit Mustererkennungsalgorithmen und statistische Prozeduren notwendig. Diese Verfahren bedürfen eines großen Aufwandes und können ggf. dazu führen, das wesentliche Effekte im Verhalten der interagierenden Zellen übersehen werden, die zusätzlichen Aufschluss über die Wirkung der Testsubstanz geben könnten. Ein Verfahren der vorbeschriebenen Art ist z. B. aus DE 600 23 905 T2 bekannt.
Aufgabe der Erfindung ist es demgegenüber, eine einfache aber effektive Möglichkeit zu schaffen, die Neuritenbildung bzw. das Neuritenwachstum zu analysieren.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Analyse des Neuritenwachstums gelöst, bei welchem ein Substrat mit einem Rastermuster bereitgestellt wird, welches erste Bereiche aufweist, auf denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen anlagern können, wobei die ersten Bereiche jeweils von zweiten Bereichen umgeben sind, auf denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen nicht anlagern können, wobei Neuronen oder neuronenähnliche Zellen auf den ersten Bereichen des Substrates angelagert werden und anschließend die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen einer oder mehreren oder keiner Testsubstanz(en) ausgesetzt werden und während dessen und/oder danach die Neuritenauswüchse aus den Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen analysiert werden.
Die Erfindung basiert auf der Anwendung von Zell-Patterning-Techniken, um ein räumlich standardisiertes Assay für die Messung des Neuritenwachstums während des Einwirkens von Testsubstanzen zu liefern. Dazu werden Substrate verwendet, die ein Rastermuster mit ersten und zweiten Bereichen aufweisen, wobei die ersten Bereiche Anlagerungsorte für die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen bilden und die diese ersten Bereiche umgebenden zweiten Bereiche so ausgebildet sind, dass eine Anlagerung von Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen nicht möglicht ist.
Dabei wird bevorzugt jeweils ein Substrat verwendet, welches erste Bereiche mit standardisierter Größe und Position aufweist, wobei besonders bevorzugt die ersten Bereiche äquidistant voneinander beabstandet sind. Durch diese Ausgestaltung sind die Abstände zwischen benachbarten Zellen einheitlich. Daraus ergeben sich zwei große Vorteile:
Zum einen entstehen homogene Gradienten löslicher Faktoren, die in die Formierung der Neuritenauswüchse involviert sind, und zum anderen können Neuritenauswüchse ohne Markierungsschritte beobachtet werden. Um statistisch abgesicherte Ergebnisse zu erhalten, muss eine große Anzahl von Nervenzellen und deren Neuritenauswüchse gemessen werden. Zell-Patterning-Techniken eignen sich für dieses Problem, indem sie hochparallele Testsysteme in der Form von Substraten mit einem Rastermuster (Zell-Arrays) mit hunderten von Stellen für die selektive Anlagerung von Neuronen zur Verfügung stellen. Jede dieser Stellen (erste Bereiche) kann eine oder mehrere Nervenzellen enthalten, wobei die Verbindung zwischen ersten Bereichen und nicht die Verbindung innerhalb erster Bereiche den Gegenstand der Messung darstellt.
Bevorzugt sind dabei die ersten Bereiche in einem hexagonalen Muster angeordnet, um gleiche Distanzen zwischen allen benachbarten Zellanlagerungsstellen (ersten Bereichen) bereitzustellen. Alternativ können die ersten Bereiche auch in einem linearen Muster angeordnet sein. Die ersten Bereiche sind bevorzugt rund ausgebildet und weisen einen Durchmesser zwischen 20 bis 200 μm auf. Dabei sind die ersten Bereiche bevorzugt in einem Abstand zwischen 50 bis 1.000 μm voneinander getrennt.
Bevorzugt werden Substrate verwendet, bei dem benachbarte erste Bereiche durch Pfade miteinander verbunden sind, an denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen anlagern können, wobei die Breite dieser Pfade bevorzugt zwischen 100 nm und 5 μm liegt.
Die Erfindung stellt ein neues Protokoll für die Messung des Neuritenwachstums zur Verfügung:
Die Zellen werden zunächst in einem Rastermuster auf ein Substrat angeordnet und nach einer Zeit werden die Neuritenauswüchse durch eine Auswahl von möglichen Methoden inklusive der Anzahl der Neuritenauswüchse pro lebensfähige Zelle, Anzahl der Neuritenauswüchse und/oder der Neuritenwachstumsraten gemessen. Zellmuster können mit oder ohne eine oder mehrere Testsubstanzen behandelt werden. Wenn die Zellmuster nicht einer Testsubstanz ausgesetzt werden, liefert dies eine experimentelle Kontrolle für die Bestimmung des relativen Effektes einer oder mehrerer interessierender Substanzen.
Bevorzugt werden Substrate verwendet, bei dem die ersten Bereiche eines oder mehrere der folgenden Materialien enthalten:
Zell-Adhäsions-Proteine, Laminin, Fibronectin, Kollagen und Vitronecitin, Peptid-Sequenzen, Poly-Lysin, hydrophiles Polystyren, Glas, aminierte Oberflächen, hydrophiles Poly-Dimethylsiloxan (PDMS).
Selbstverständlich sind auch andere Materialien geeignet, die für eine Zellanlagerung benutzt werden können.
Hinsichtlich der zweiten Bereiche, die eine Anlagerung von Zellen verhindern, werden vorzugsweise folgende Materialien verwendet:
Polyethylen-Glycol, Polyethylenoxid, Agarose, Albumin, hydrophobes Poly-Dimethylsiloxan (PDMS) und Poly-Acrylamid.
Ferner können auch andere Materialien verwendet werden, die eine Zellanlagerung verhindern oder zumindest unterdrücken.
Die ersten Bereiche des jeweiligen Substrates sind bevorzugt hydrophil und die zweiten Bereiche bevorzugt hydrophob ausgebildet.
Ferner können die ersten Bereiche eine freiliegende Fläche des betreffenden Substrates sein, welches selbst ein Standardgewebekultursubstrat ist einschließlich Polystyren, Polypropylen und Glas. Dabei können zellabweisende PDMS als dünnes Filmmuster auf Standardgewebekultursubstraten einschließlich Polystyren, Polypropylen und Glas gedruckt oder geprägt sein.
Ganz besonders bevorzugt ist vorgesehen, dass die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen ohne Fixation und Markierung auf dem Substrat angelagert und nachfolgend analysiert werden. Diese Verfahrensführung bietet eine besonders einfache, aber effektive Möglichkeit, das Neuritenwachstum zu bestimmen.
In bestimmten Fällen kann alternativ aber auch vorgesehen sein, dass die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen mittels Standardmethoden am Substrat fixiert werden und/oder dass die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen ganz oder teilweise markiert werden. Zu diesen Standardfixiermethoden gehören z. B. Formaldehyd und Glutaraldehydmethoden, die Markierung kann z. B. mit Giemsa oder anderen Gesamtzellfarbstoffen erfolgen. Dabei können Teile der Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen markiert werden einschließlich ihrer Zellkerne, ihres Cytoskeletts oder anderer cellulärer Kompartimente, ihrer Neuritenauswüchse oder Teile ihrer Neuritenauswüchse.
Die Markierungen können fluoreszent sein, wobei DAPI für die Zellkerneinfärbung, Phalloidin für die Actin-Anfärbung und fluoreszente Moleküle oder Partikel, welche an Antikörper oder Aptamere gebunden sind, verwendet werden können.
Das Neuritenwachstum kann durch eine oder mehrere der folgenden Messungen analysiert werden:
Anzahl der Neuriten, Anzahl der lebensfähigen Neuriten, Anzahl der Neuriten besitzenden Zellen, Anzahl der Neuriten pro Zelle, Neuritenlänge, Neuritenwachstumsrate, Neuritenverzweigung, Anzahl Neuriten pro lebensfähiger Zelle.
Die Messungen des Neuritenwachstums können kontinuierlich, periodisch oder am Ende der Expositionszeitdauer der Testsubstanz durchgeführt werden.
Das jeweilige Substrat kann in einer Kammer für Standardgewebekulturen oder Molekularanalysen angeordnet werden einschließlich 6-, 12-, 24-, 96-, 384-, 1.536-Well-Plates.
Dabei kann die Kammer selbst mit dem Substrat entsprechenden ersten Bereichen und zweiten Bereichen zur Anlagerung oder Nichtanlagerung von Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen versehen werden.
Das Zuführen oder Entfernen von Flüssigkeiten und insbesondere Testsubstanzen kann mittels Pipetten, automatisierter Systeme zur Handhabung von Flüssigkeiten oder mikrofluidischen Systemen erfolgen.
Die Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnung beispielhaft näher erläutert. Diese zeigt jeweils in stark vergrößerter schematischer Darstellung in
1 ein Substrat mit hexagonaler Anordnung der zur Anlagerung von Zellen geeigneten ersten Bereiche,
2 ein der 1 ähnliches Substrat mit durch Pfade miteinander verbundenen ersten Bereichen,
3a bis 3c einen Verfahrensablauf zur Herstellung eines Substrates durch Mikrokontaktdrucken,
4a bis 4c einen Verfahrensablauf zur Herstellung eines Substrates durch Prägetechnik,
5 ein Substrat mit hexagonaler Anordnung der ersten Bereiche, wobei jeder erste Bereich eine Neuronenzelle enthält und in
6 das Substrat nach 5 mit beispielhafter Darstellung des Neuritenwachstums.
In den 1 und 2 sind zwei verschiedene Substrattypen dargestellt, die sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als besonders geeignet herausgestellt haben.
In 1 ist ein Substrat dargestellt, welches mit 1 bezeichnete erste Bereiche aufweist, die hexagonal angeordnet sind. Diese ersten Bereiche 1 sind so beschaffen, dass sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen auf diesen anlagern können. Diese ersten Bereiche 1 weisen aufgrund der hexagonalen Anordnung einen äquidistanten Abstand auf und sind vorzugsweise rund ausgebildet. Sie haben beispielsweise einen Durchmesser zwischen 20 bis 200 μm und sind in einem Abstand von 50 bis 1.000 μm voneinander angeordnet. Die ersten Bereiche 1 sind von zweiten Bereichen 2 umgeben, die den Hintergrund bzw. die Substratgrundfläche bilden. Diese zweiten Bereiche 2 sind so beschaffen, dass sich auf ihnen Neuronen und neuronenähnliche Zellen nicht anlagern können.
In 2 ist ein Substrat dargestellt, das grundsätzlich demjenigen nach 1 entspricht, d. h. es sind hexagonal angeordnete erste Bereiche 1 vorgesehen, welche von zweiten Bereichen 2, d. h. der Substratgrundfläche umgeben sind. Zusätzlich sind benachbarte erste Bereiche 1 durch Pfade 3 miteinander verbunden, an denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen anlagern können. Die Breite dieser Pfade 3 liegt zwischen 100 nm und 5 μm.
Es versteht sich von selbst, dass auf einem Substrat eine Vielzahl von ersten Bereichen 1 und 2 vorgesehen sind. In den 1 und 2 ist beispielhaft jeweils nur eine einzige hexagonale Anordnung gezeigt.
Zur Herstellung eines solchen Substrates gibt es grundsätzlich verschiedenste Möglichkeiten. In der 3 ist eine erste Verfahrensabfolge dargestellt, nämlich der Prozess des Mikrokontaktdruckens für die Anordnung von Mustern aus dünnem PDMS. Dazu wird ein Stempel 4 mit einem dünnen PDMS-Flüssigkeitsfilm 5 kontaktiert, der auf einem ebenen Substrat, z. B. Glassubstrat 6, angeordnet ist (3a).
Der Stempel 4, der anschließend mit dem PDMS-Flüssigkeitsfilm 5 benetzt ist, wird abgehoben und mit einem Zellkultursubstrat 7 kontaktiert, um den PDMS-Flüssigkeitsfilm 5 auf das Substrat 7 zu übertragen (3b).
Nachfolgend wird der Stempel 4 entfernt und das so auf dem Zellkultursubstrat 7 erzeugte Muster (zweite Bereiche aus PDMS) wird thermisch gehärtet (3c).
Somit werden gemäß 3 zellabstoßende hydrophobe Materialien auf hydrophilen Substraten, wie Glas oder Polysteren, gedruckt, auf denen Zellen SiO gewöhnlich anlagern und wachsen können. Dazu wurde flüssiges PDMS in Chloroform (1:0, m/m) gelöst, ein Volumen von 500 μl auf das Glassubstrat 6 gegeben und bei 6.000 U/min für 30 s aufgeschleudert. Nach dem Verdunsten des Chloroform bleibt eine gleichförmige PDMS-Filmschicht 5 zurück. Die Benutzung des Stempels 4 mit dem flüssigen PDMS-Film 5 wurde durch einen Kontakt des Stempels 4 mit dem dünnen Film 5 für maximal 10 s erreicht. Der benetzte Stempel 4 wurde dann benutzt, um den PDMS-Film 5 auf Substrate 7 aus Glas oder Polysteren der Güteklasse/Gewebekultur für maximal 10 s zu drucken. Danach folgte ein Härtungsschritt bei 70°C für etwa 30 min, um das Dünnfilmmuster(Substrat) zu erzeugen.
Für eine Musterung in höherer Auflösung entfernt man überflüssiges PDMS durch einen ersten Kontaktdruck für maximal 10 s auf einen sogenannten ”Opfer”-Glasträger, gefolgt von einem zweiten Druckschritt, wiederum für maximal 10 s auf das Zellkultursubstrat 7. Eine hexagonale Anordnung erster Bereiche 1 auf dem Substrat mit gleichmäßig verteilten runden ersten Bereichen mit typischen Durchmessern von 70 μm und Abständen von 100 μm zwischen den einzelnen Stellen kann so erreicht werden.
Als Alternative zum Mikrokontaktdrucken kann eine in 4a bis c dargestellte Prägetechnik verwendet werden. Zunächst wird, wie beim Drucken (3), ein dünner Film aus PDMS 8 durch Aufschleudern oder ähnliches auf ein Substrat 9 aus Glas oder Polysteren abgeschieden. Das Substrat wird dann auf einer Wärmeplatte bei ca. 70°C platziert und ein Stempel 10 wird gegen das Substrat für etwa 1 min gepresst (Druck 0,15 Nmm^–2) und danach entfernt (4b). Darauf folgt ein weiterer Schritt für das thermische Härten (etwa 10 min). Dies ist in 4c dargestellt.
Die Zellen wurden auf ein Substrat gemäß 1, hergestellt entweder nach dem Verfahren gemäß 3 oder nach 4 in einem Serum-Protein enthaltenden Medium geimpft und über Nacht inkubiert. Nach dem Austausch des Mediums verbleiben adhärente Zellen als Muster an den frei liegenden Regionen des zugrundeliegenden Substrates angelagert. Um die Erfindung zu veranschaulichen wurden menschliche SH-SY5Y Neuroblastoma-Zellen benutzt und vor der Anlagerung auf dem Substrat durch Kultivierung in Trans-Retinolsäure für drei Tage in neuronenähnliche Zellen differenziert. Dadurch wurde für das Experiment ein zusätzlicher Vorteil durch die Synchronisierung der Zellen erreicht. Die Neuronenmuster wurden kultiviert, während dessen es zum Neuritenwachstum kam, was wiederum zu Verbindungen zwischen den Neuronen benachbarter erster Bereiche (Anlagerungsstellen) führte.
5 zeigt die Anordnung bzw. Anlagerung der neuronenähnlichen Zellen auf einem Substrat mit hexagonaler Anordnung der ersten Bereiche 1. Dabei sind die neuronenähnlichen Zellen mit Z bezeichnet.
In 6 sind die die neuronenähnlichen Zellen Z verbindenden Neuritenauswüchse bzw. Verbindungen dargestellt und mit V bezeichnet.
Die so auf einem Substrat angeordneten Neuronen bzw. neuronenähnlichen Zellen können verwendet werden, um Substanzeffekte auf das Wachstum von Neuriten zu untersuchen. Modellsubstanzen können verwendet werden, um die Eignung der Neuronenmuster für die Messung von erhöhten und verminderten Wachstumsraten zu bewerten. Z. B. verstärkt der Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF) das Neuritenwachstum, während Acrylamid es unterdrückt. Die Experimente beinhalten das Patterning von Neuronen gefolgt von der Kultivierung in Anwesenheit von interessierenden Substanzen. Parallel dazu wurden Neuronenmuster im normalen Medium ohne diese Substanzen kultiviert, um eine Kontrolle zu liefern. Nach einer Kultivierungszeit von z. B. zwei Tagen wurden die Neuritenauswüchse gemessen (z. B. Anzahl der Neuriten besitzenden Neuronen und/oder die Anzahl der Neuriten pro Neuronen). Die Messungen wurden mittels der Phasenkontrastmikroskopie durchgeführt, z. B. mit einem inversen Mikroskop IX 71 der Firma Olympus. Durch Vergleich mit der Kontrollprobe können die toxischen oder fördernden Effekte bestimmt werden. Darüber hinaus können Neuronenmuster, die erwünschten Konzentrationen der toxischen oder fördernden Modellsubstanzen ausgesetzt werden, die als negative bzw. positive Kontrollen dienen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- DE 60023905 T2 [0006]

Claims

Verfahren zur Analyse des Neuritenwachstums, bei welchem ein Substrat mit einem Rastermuster bereitgestellt wird, welches erste Bereiche aufweist, auf denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen anlagern können, wobei die ersten Bereiche jeweils von zweiten Bereichen umgeben sind, auf denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen nicht anlagern können, wobei Neuronen oder neuronenähnliche Zellen auf den ersten Bereichen des Substrates angelagert werden und anschließend die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen einer oder mehreren oder keiner Testsubstanz(en) ausgesetzt werden und während dessen und/oder danach die Neuritenauswüchse aus den Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen analysiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat verwendet wird, welches erste Bereiche mit standardisierter Größe und Position aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Bereiche äquidistant voneinander beabstandet sind.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Bereiche in einem hexagonalen Muster angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Bereiche in einem linearen Muster angeordnet sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Bereiche rund sind.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Bereiche einen Durchmesser zwischen 20 bis 200 μm aufweisen.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Bereiche in einem Abstand zwischen 50 bis 1.000 μm voneinander getrennt sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat verwendet wird, bei dem benachbarte erste Bereiche durch Pfade miteinander verbunden sind, an denen sich Neuronen und neuronenähnliche Zellen anlagern können.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Breite der Pfade zwischen 100 nm und 5 μm liegt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat verwendet wird, bei dem die ersten Bereiche eines oder mehrere der folgenden Materialien enthalten: Zell-Adhäsions-Proteine, Laminin, Fibronectin, Kollagen und Vitronecitin, Peptid-Sequenzen, Poly-Lysin, hydrophiles Polystyren, Glas, aminierte Oberflächen, hydrophiles Poly-Dimethylsiloxan (PDMS).
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat verwendet wird, bei dem die zweiten Bereiche eines oder mehrere der folgenden Materialien enthalten: Polyethylen-Glycol, Polyethylenoxid, Agarose, Albumin, hydrophobes Poly-Dimethylsiloxan (PDMS) und Poly-Acrylamid.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Bereiche hydrophil und die zweiten Bereiche hydrophob ausgebildet sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen ohne Fixation und Markierung auf dem Substrat angelagert und nachfolgend analysiert werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen mittels Standardmethoden am Substrat fixiert werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen ganz oder teilweise markiert werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Neuritenwachtstum durch eine oder mehrere der folgenden Messungen analysiert wird: Anzahl der Neuriten, Anzahl der lebensfähigen Neuriten, Anzahl der Neuriten besitzenden Zellen, Anzahl der Neuriten pro Zelle, Neuritenlänge, Neuritenwachtstumsrate, Neuritenverzwei gung, Anzahl Neuriten pro lebensfähiger Zelle.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen des Neuritenwachstums kontinuierlich, periodisch oder am Ende der Expositionszeitdauer der Testsubstanz durchgeführt werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat in einer Kammer für Standardgewebekulturen oder Molekularanalysen angeordnet wird einschließlich 6-, 12-, 24-, 96-, 384-, 1536-Well-Plates.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer für Standardgewebekulturen oder Molekularanalysen einschließlich 6-, 12-, 24-, 96-, 384-, 1536-Well-Plates selbst mit dem Substrat entsprechenden ersten Bereichen und zweiten Bereichen zur Anlagerung oder Nichtanlagerung von Neuronen oder neuronenähnlichen Zellen versehen wird.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass Flüssigkeiten und Testsubstanzen mittels Pipetten, automatisierter Systeme zur Handhabung von Flüssigkeiten oder mikrofluidischen Systemen zugeführt oder entfernt werden.