DE102009014586A1

DE102009014586A1 - Verwendung von Alginit als Filtrierhilfsmittel in der Bio- und Lebensmitteltechnologie

Info

Publication number: DE102009014586A1
Application number: DE200910014586
Authority: DE
Inventors: Martin Prof. Bertau; Ines Pieper
Original assignee: Bergakademie Freiberg
Current assignee: Tnr Terra Natural Resources De GmbH
Priority date: 2009-03-24
Filing date: 2009-03-24
Publication date: 2010-09-30

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Alginit als Filtrierhilfsmittel in der Biotechnologie, der Lebensmitteltechnologie und -verfahrenstechnik, z. B. der Brauereitechnologie. Aufgabe der Erfindung ist es, aus Ganzzellbiotransformationen resultierende Reaktionsmedien, aus Reaktionen mit Mikroorganismen resultierende Reaktionsmedien (einschließlich Lebensmitteltechnologie) sowie aus Enzymreaktionen resultierende Reaktionsmedien schnell, einfach, kostengünstig und effektiv aufzuarbeiten. Die technische Aufgabe wird dadurch gelöst, dass Alginit als Filtrierhilfsmittel bei der Aufarbeitung dieser Reaktionsmedien eingesetzt wird.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Alginit als Filtrierhilfsmittel und Additiv in der Biotechnologie, der Lebensmitteltechnolgie und -verfahrenstechnik, z. B. der Brauereitechnologie. Die Erfindung wird angewendet bei der Aufarbeitung von biotechnologischen Fermentationen und Biotransformationen, bei der Aufarbeitung von Reaktionsgemischen aus Ganzzellprozessen und Enzymreaktionen sowie zur Klärung von Umsetzungen mit Mikroorganismen (Pilzen, Bakterien), z. B. bei der Bier- und Weinherstellung.
Alginit ist ein kerogenhaltiges Sedimentgestein und findet insbesondere als Bodenverbesserungsmittel Anwendung. Dabei ist die komplexe Wirkungsweise auf die einzigartige Zusammensetzung von Alginit zurückzuführen. Weitere Einsatzgebiete liegen auf medizinischem und therapeutischem Gebiet, z. B. als Bestandteil von Salben und kosmetischen Produkten und als Mittel in der Rheumatherapie. Alginit lässt sich nicht synthetisch herstellen.
Die Aufarbeitung von Reaktionsmedien aus Ganzzell-Biotransformationen sowie enzymatischen Reaktionen, insbesondere mit Enzymen technischer Reinheit, die Klärung von Reaktionen mit Mikroorganismen und die Aufarbeitung von Reaktionsgemischen aus Enzymreaktionen bereitet oft Probleme und erfordert mehrstufige Prozesse.
Gegenwärtig sind zur Aufarbeitung von Ganzzellkatalysatoren enthaltenden Biotransformations-Reaktionsmedien diverse Methoden bekannt. Ein allgemeines Problem dabei besteht in dem Auftreten von Emulsionen beim Extraktionsvorgang, einhergehend mit sehr langen, wirtschaftlich nicht akzeptablen Aufarbeitungszeiten, insbesondere Extraktions- und Filtrationszeiten. Als typisches Beispiel hierfür kann die Veröffentlichung von G. Jörg, K. Leppchen, T. Daussmannm, M. Bertau, Chem. Ing. Techn. 2004, 76, 1739–1742 angegeben werden, wonach die zentrale Komplikation bei der extraktiven Aufarbeitung der Hochzelldichte-Ganzzellbiotransformation die Bildung stabiler Gele und Schleime im Kontakt mit dem organischen Lösungsmittel darstellt. Daraus resultieren die Notwendigkeit einer nachgeschalteten destillativen Reinigung des Produkts und starke Ausbeuteverluste beim Downstream-Processing, einhergehend mit verringerter Gesamtökonomie des Verfahrens und hohen Produktionskosten.
In der DE 103 29 819 B4 ist ein Verfahren zur extraktiven Isolierung von organischen Komponenten aus Zellsuspensionen und zellfreien Medien beschrieben, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass vor der Extraktion der Zellsuspension oder dem Zellkulturmedium zum enzymatischen Abbau der von den Hefezellen ausgeschiedenen Bioemulgatoren eine Hydrolasekomponente aus mindestens einer Protease und/oder Glycosylase zugesetzt wird und nach einem anschließenden Inkubationsschritt die Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel erfolgt. Mit diesem Verfahren konnte das Problem der Gelbildung durch die aus dem Ganzzellkatalysator stammenden Bioemulgatoren, die von den Mikroorganismen in das Medium abgegeben werden, zurückgedrängt werden. Nachteilig ist allerdings die Notwendigkeit einer weiteren enzymatischen Komponente, insbesondere wenn diese nur in aufwändiger Weise zugänglich ist. Ein weiteres Problem stellt das Auftreten von Nebenreaktionen, verursacht durch die zugegebenen Proteasen, dar.
Nach DE 10 2005 031 536 B4 werden der Zellsuspension oder dem zellfreien Kulturmedium nach der Biotransformation Bakterien zugesetzt, die in der Zellsuspension oder im zellfreien Kulturmedium enthaltene emulgierende Substanzen abbauen, wobei Bakterien, die zum Abbau der emulgierenden Substanzen zugesetzt werden, sich von den Bakterien, die zur Biotransformation eingesetzt werden, unterscheiden und die Auswahl der zum Abbau der emulgierenden Substanzen eingesetzten Bakterien durch den zur Biotransformation verwendeten Mikroorganismus und das zu isolierende Produkt bestimmt wird. Nachteilig sind der erhebliche Zeitaufwand und die Vielzahl der zu realisierenden Verfahrensschritte.
Nach EP 1 870 390 B1 wird ein Verfahren zur Aufarbeitung von Reaktionsmedien, die Ganzzellkatalysatoren, eine wässrige Komponente und eine organische Komponente mit dem anzureichernden Produkt enthalten, beschrieben, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem ersten Schritt der pH-Wert auf kleiner 4 eingestellt wird, in einem zweiten Schritt das Reaktionsmedium in Anwesenheit eines Filterhilfstoffes, vorzugsweise in dem Reaktionsmedium, filtriert wird und danach optional das in der organischen Komponente enthaltene Produkt weiter angereichert oder aufgereinigt wird. Als Filterhilfsstoffe können alle bekannten Filterhilfsstoffe verwendet werden Bevorzugt sind jedoch Filterhilfsstoffe ausgewählt aus der Gruppe Cellulose, Kieselgel, Kieselgur, Perlit, Cristobalit, Filterquarzkies, Aktivkohle, Holzkohle, Holzmehl, Filterhilfsstoffe auf Kunstharzbasis sowie Gemische derselben. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass bei einem pH-Wert von kleiner als 4 gearbeitet werden muss. pH-Werte von kleiner 4 sind für die Gewinnung von stereoisomerenreinen β-Hydroxy-estern prohibitiv, da bei diesen pH-Werten bereits partielle Racemisierung sowie Dehydratisierung stattfinden.
Aufgabe der Erfindung ist es, aus Ganzzellbiotransformationen resultierende Reaktionsmedien, aus Reaktionen mit Mikroorganismen resultierende Reaktionsmedien sowie aus Enzymreaktionen resultierende Reaktionsmedien schnell, einfach, kostengünstig und effektiv aufzuarbeiten.
Die technische Aufgabe wird dadurch gelöst, dass Alginit als Filtrierhilfsmittel bei der Aufarbeitung von Reaktionsmedien aus Ganzzellbiotransformationen, von Reaktionsmedien die aus Reaktionen mit Mikroorganismen resultieren sowie von Reaktionsmedien aus Enzymreaktionen verwendet wird. Überraschenderweise wurde gefunden, dass durch die Verwendung von Alginit als Filtrierhilfsmittel die Phasentrennzeit t_P bei der extraktiven Aufarbeitung von Fermentationen und Biotransformationen (Ganzzellprozesse und enzymatische Umsetzungen) extrem verkürzt wurde. Dabei wurden die Phasentrennzeiten auf bis zu 30 s verkürzt, wodurch sich die mit Alginit behandelten Reaktionsgemische für eine kontinuierliche Extraktion (t_P max. 60 s) eignen. Dabei kann der Alginit roh eingesetzt werden, wird aber zweckmäßigerweise vordem Einsatz gewaschen, z. B. mit Wasser. Die Korngrößenverteilung hat keinen Einfluß auf die Eignung von Alginit als Filtrierhilfsmittel, zweckmäßigerweise beträgt sie ≤ 1,0 mm. Aufgrund der überraschend guten Filtrationseigenschaften in Gegenwart von Alginit können nach der Filtration weitere Aufreinigungsschritte wie die Deemulgierung oder auch Wasserdampfdestillation eingespart werden. Zudem entfällt der Verfahrensschritt Biomasseseparation, was Alginit sehr interessant für Anwendungen in der Lebensmittel- und Biotechnologie macht. Dabei kann Alginit beispielsweise auch in Form von Filterpatronen bzw. als Füllung von Filterpatronen eingesetzt werden. Die Vorzüge der Anwendung von Alginit als Filtrierhilfsmittel in der Bio- und Lebensmitteltechnologie soll anhand der nachfolgenden Beispiele verdeutlicht werden:
Beispiel 1 (Allgemeine Versuchsvorschrift zur Herstellung der Reaktionsmischung für die Aufarbeitungsversuche; 64,6 mM Substratkonzentration)
Für die Reduktion von 2-Cyclohexanoncarbonsäure-ethylester (1) zu (1R,2S)-cis-2-Hydroxycyclohexancarbonsäure-ethylester (2) in einer Ganzzellbiotransformation mit Saccharomyces cerevisiae wird wie folgt verfahren:
In einen mit 1,0 l Leitungswasser gefüllten Fermenter werden 60 g (Trockenmasse) Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) der Firma Fala, F-Strasbourg und 100 g Saccharose gegeben. Nach 30 min. Inkubation bei 30,0°C werden zu der belüfteten Kultur (2,0 l Luft pro Liter Reaktionsmedium und Minute) 10,0 ml 2-Cyclohexanoncarbonsäure-ethylester (1) (entspricht 11 g bzw. 64,6 mmol) kontinuierlich innerhalb von 20 h zugegeben, wobei der pH-Wert bei 6,3 gehalten wird. Die Reaktion wird mittels Gaschromatographie überwacht.
Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel nach Stand der Technik)
1. Wasserdampfdestillation
Das Reaktionsgemisch wird in einem 4 l-Rundkolben mit Wasserdampfdestillationsaufsatz und einer 4 l-Vorlage unter Rühren auf 90°C erhitzt. Dann beginnt man mit dem Einblasen von Dampf.
2. Extraktion
Anschließend werden die 2600 ml Wasserdampfdestillat in einem 4/Rührkolben mit 750 g Kochsalz versetzt, welches durch Rühren gelöst wird. Man extrahiert dreimal mit je 370 g (500 ml) t-Butyl-methylether je min. 60 Minuten.
3. Destillation des Rohprodukts
Danach werden die vereinigten organischen Phasen in einer Destillationsapparatur (bzw. Rotationsverdampfer) vorgelegt. Nach Trocknung über MgSO₄ wird der t-Butylmethylether bei Normaldruck oder bei leicht vermindertem Druck, z. B. 500–600 mbar, abdestilliert.
4. Feindestillation
Im Anschluss daran wird das Rohprodukt über eine Destillationskolonne (Sdp.: 120–125°C (20 mm Hg) feindestilliert.
Das Produkt, (1R,2S)-cis-2-Hydroxycyclohexancarbonsäure-ethylester (2), wird nach dieser Vorschrift in 66% Ausbeute erhalten und erfüllt folgende Spezifikationen:
Beispiel 3 (Vergleichsbeispiel nach DE 103 29 819 )
1. Zentrifugation
Das Reaktionsgemisch wird für jeweils 20 min bei 3000 × g und 20000 × g zentrifugiert, um die Hefezellen vollständig abzutrennen. Der Überstand wird abgenommen und das Pellet dreimal gewaschen und zentrifugiert. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt.
2. Inkubation des zellfreien Mediums mit Enzym
Die Kulturbrühe wird zur Produktisolation mit 60 kU/l Pronase E versetzt, 5 h bei 30°C inkubiert.
3. Extraktion
Die in Arbeitsschritt 2 erhaltene Reaktionsmischung wird dreimal mit je 370 g (500 ml) t-Butyl-methylether während je min. 60 Minuten extrahiert. Danach werden die vereinigten organischen Phasen in einer Destillationsapparatur (bzw. Rotationsverdampfer) vorgelegt. Nach Trocknung über MgSO₄ wird der t-Butyl-methylether bei Normaldruck oder bei leicht vermindertem Druck, z. B. 500–600 mbar, abdestilliert.
Das Produkt, (1R,2S)-cis-2-Hydroxycyclohexancarbonsäure-ethylester (2), wird nach dieser Vorschrift in 80% Ausbeute erhalten und erfüllt folgende Spezifikationen:
1. Zentrifugation
Das Reaktionsgemisch wird für jeweils 20 min bei 3000 × g und 20000 × g zentrifugiert, um die Hefezellen vollständig abzutrennen. Der Überstand wird abgenommen und das Pellet dreimal gewaschen und zentrifugiert. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt.
2. Vorkultur von Bacillus subtilis
Für die Herstellung der Vorkulturen wird ein Vereinzelungsausstrich von B. subtilis auf Hefenährbouillon-Agar hergestellt und für 48 h bei 30°C kultiviert. Von der bewachsenen Agarplatte wird eine einzelne Kolonie in die Vorkultur, eine Hefenährbouillon, überführt. Die Vorkultur wird bei 30°C und 150 U/min kultiviert bis die optische Dichte bei 600 nm 0,8 Absorptionseinheiten entspricht.
3. Inkubation des zellfreien Mediums mit B. subtilis
Für die Inkubation des zellfreien Mediums wird das 1,6fache Volumen an Vorkultur B. subtilis bei 3000 × g zentrifugiert. Die Zellen werden geerntet und dem zellfreien Medium zugeben, so dass die Konzentration an Trockengewicht B. subtilis im zellfreien Medium 0,044% (m/v) beträgt. Die Inkubation des zellfreien Mediums mit B. subtilis erfolgt sauerstofflimitiert für 48 h bei 30°C und 100 U/min. Für die Schaffung sauerstofflimitierten Bedingungen werden die Inkubationsgefäße luftdicht abgeschlossen, so dass nur der restliche Sauerstoff über dem Medium genutzt werden kann. Unter diesen Bedingungen ist das Wachstum der Bazillen und damit auch die Synthese eigener, störender Bioemulgatoren reduziert, und dennoch werden die Bioemulgatoren der Hefe als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle verwertet.
4. Extraktion
Die in Arbeitsschritt 3 erhaltene Reaktionsmischung wird dreimal mit je 370 g (500 ml) t-Butyl-methylether während je min. 60 Minuten extrahiert. Danach werden die vereinigten organischen Phasen in einer Destillationsapparatur (bzw. Rotationsverdampfer) vorgelegt. Nach Trocknung über MgSO₄ wird der t-Butyl-methylether bei Normaldruck oder bei leicht vermindertem Druck, z. B. 500–600 mbar, abdestilliert.
Das Produkt, (1R,2S)-cis-2-Hydroxycyclohexancarbonsäure-ethylester (2), wird nach dieser Vorschrift in 80% Ausbeute erhalten und erfüllt folgende Spezifikationen:
Beispiel 5 (erfindungsgemäßes Beispiel)
1. Filtration
Das Reaktionsgemisch wird mit 25 g Alginit (mit Wasser gewaschen, Korngröße ≤ 5,0 mm) versetzt, 2 min. bei 120 UpM gerührt und über einen Büchnertrichter filtriert.
2. Extraktion
Man extrahiert dreimal mit je 370 g (500 ml) t-Butyl-methylether während je min. 10 Minuten. Danach werden die vereinigten organischen Phasen in einer Destillations apparatur (bzw. Rotationsverdampfer) vorgelegt, und bei Normaldruck oder bei leicht vermindertem Druck, z. B. 500–600 mbar, wird der t-Butyl-methylether abdestilliert.
Das Rohprodukt ist chemisch rein, i. e. frei von Verunreinigungen und bedarf keiner weiteren Reinigungsschritte!
Das Produkt, (1R,2S)-cis-2-Hydroxycyclohexancarbonsäure-ethylester (2), wird nach dieser Vorschrift in 80% Ausbeute erhalten und erfüllt folgende Spezifikationen:
Beispiel 6 (erfindungsgemäßes Beispiel)
1. Filtration
Das Reaktionsgemisch wird über einen Büchnertrichter filtriert, der mit 25 g befeuchtetem (1 g Wasser/g Alginit) Alginit (mit Wasser gewaschen, Korngröße ≤ 5,0 mm) belegt ist.
2. Extraktion
Man extrahiert dreimal mit je 370 g (500 ml) t-Butyl-methylether während je min. 10 Minuten. Danach werden die vereinigten organischen Phasen in einer Destillationsapparatur (bzw. Rotationsverdampfer) vorgelegt, und bei Normaldruck oder bei leicht vermindertem Druck, z. B. 500–600 mbar, wird der t-Butyl-methylether abdestilliert.
Das Rohprodukt ist chemisch rein, i. e. frei von Verunreinigungen und bedarf keiner weiteren Reinigungsschritte!

Das Produkt, (1R,2S)-cis-2-Hydroxycyclohexancarbonsäure-ethylester (2), wird nach dieser Vorschrift in 80% Ausbeute erhalten und erfüllt folgende Spezifikationen:

Zusammenfassung der Ergebnisse

Bsp.	Verfahren	Arbeitsschritte	Ausbeute	Reinheit	Zeitaufwand
2	Vergleich (Stand der Technik)	4	66%	≥ 97%	16 h 45 min
3	Enzymatisch ( DE 103 29 819 )	3	80%	≥ 97%	7 h 35 min
4	Mikrobiell ( DE 10 2005 031 536 )	4	80%	≥ 97%	49 h 45 min
5	Alginit (Aufschlämmung)	2	80%	≥ 99%	2 h 35 min
6	Alginit (Filterbelegung)	2	80%	≥ 99%	2 h 35 min

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- DE 10329819 B4 [0005]
- DE 102005031536 B4 [0006]
- EP 1870390 B1 [0007]
- DE 10329819 [0015, 0032]
- DE 102005031536 [0032]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- G. Jörg, K. Leppchen, T. Daussmannm, M. Bertau, Chem. Ing. Techn. 2004, 76, 1739–1742 [0004]

Claims

Verwendung von Alginit als Filtrierhilfsmittel bei der Aufarbeitung von Flüssigphasen aus Fermentationen sowie Reaktionsmedien aus Ganzzellbiotransformationen, von Reaktionsmedien, die aus Reaktionen mit Mikroorganismen resultieren sowie von Reaktionsmedien aus Enzymreaktionen sowie ferner zur Aufarbeitung, Klärung und Filtration in der Lebensmitteltechnologie.