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DE102008029833A1 - Verfahren zum frühen Nachweis einer Infektion mit MAP - Google Patents

Verfahren zum frühen Nachweis einer Infektion mit MAP Download PDF

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DE102008029833A1
DE102008029833A1 DE200810029833 DE102008029833A DE102008029833A1 DE 102008029833 A1 DE102008029833 A1 DE 102008029833A1 DE 200810029833 DE200810029833 DE 200810029833 DE 102008029833 A DE102008029833 A DE 102008029833A DE 102008029833 A1 DE102008029833 A1 DE 102008029833A1
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map
ifn
cells
infection
paratuberculosis
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DE200810029833
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Christian PD Dr. Menge
Rolf Prof. Dr. Bauerfeind
Hakan Bulun
Philip D. Dr. Bridger
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Justus Liebig Universitaet Giessen
Original Assignee
Justus Liebig Universitaet Giessen
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen und frühen Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in einer biolgischen Probe eines Säugetieres durch den Nachweis Interferongamma (IFN-γ) bildender Zellen nach Inkubation von pheripheren mononukleären Blutzellkulturen (PBMC) mit MAP-Antigenpräparationen bzw. Kontrollantigenen Mycobacterium avium ssp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei (M. phlei).

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen und frühen Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) bei Säugetieren durch den Nachweis von Interferon-gamma (IFN-γ) in biologischen Proben einschließlich Blut nach Inkubation von Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren.
  • Stand der Technik
  • Paratuberkulose, verursacht durch das Bakterium Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), ist eine chronische Darmerkrankung der Wiederkäuer, die vor allem durch eine progrediente, granulomatöse Entzündung der Dünndarmwand gekennzeichnet ist. Die Tiere infizieren sich meist innerhalb der ersten Lebenswochen, zeigen aber erst Jahre nach der Infizierung klinische Symptome. Ab einem unbekannten Zeitpunkt während der langen Inkubationszeit beginnen infizierte Tiere damit, den Erreger – meist intermittierend – mit dem Kot auszuscheiden und werden damit zur Ansteckungsquelle für andere Tiere. Die transplazentare Übertragung auf das Ungeborene wird als weiterer Ansteckungsweg diskutiert. Wegen fehlender Krankheitszeichen während der Inkubationszeit bleiben infizierte Tiere dem Tierhalter verborgen. Als weiterer gesundheitspolitischer Aspekt kommt hinzu, dass MAP im Verdacht steht, bei der als Morbus Crohn bezeichneten Erkrankung des Menschen, einer unheilbaren chronisch-entzündlichen Erkrankung des Verdauungstraktes, ursächlich beteiligt zu sein bzw. das Krankheitsgeschehen zu unterhalten. Zur Sanierung von infizierten Herden bzw. zur Paratuberkulose-Prophylaxe in den Beständen ist es deshalb wichtig, infizierte Tiere in einem möglichst frühen Stadium der Infektion zu erkennen (d. h. im Kälber- und Jungtieralter).
  • Für die Diagnose einer Paratuberkulose gibt es mehrere, in Fachkreisen bekannte Verfahren: Der sog. Goldstandard der Paratuberkulosediagnostik ist der Erregernachweis mittels kulturell-bakteriologischer Untersuchung von Tierkot oder des Ileocaecallymphknotens (Darmlymphknoten). Ein weiteres Verfahren weist MAP-spezifische DNS in Proben mittels PCR-Technologie nach. Diese beiden Methoden sind direkte Verfahren, um MAP-Infektionen bei Tieren aufzudecken.
  • Daneben gibt es indirekte Verfahren, beispielsweise durch den Nachweis von MAP-spezifischen Antikörpern im Blutserum der Tiere. Zum Beispiel werden erregerspezifische IgG-Antikörper mittels Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) nachgewiesen. Für diesen Zweck sind Testkits kommerziell erhältlich.
  • Es ist bekannt, dass eine MAP-Infektion bei Wiederkäuern in den frühen Infektionsphasen durch eine Zunahme von gegen MAP gerichteten T-Zellen im Blut gekennzeichnet ist. Die Quantifizierung von IFN-γ bei restimulierten Blutleukozyten wurde bereits als diagnostischer Ansatz zur Identifizierung junger MAP-infizierter Rinder verfolgt. Hierzu wurden Vollblutproben ohne vorhergehende Separation der Zellen mit MAP-Antigenen stimuliert und das von diesem heterogenen Zellgemisch insgesamt sezernierte IFN-γ mittels ELISA quantifiziert. Dieser Nachweis der zellulären Immunreaktionen liefert keine frühere Diagnose, als die Kotkultur oder die nach §17 TierSeuG zugelassenen Serum-ELISA und ist prinzipiell zur MAP-Frühdiagnostik von Jungtieren z. B. Kälbern nicht geeignet, da sich im Zellgemisch von Jungtieren zu viele Zellen befinden die unspezifisch auf Antigenstimulation mit IFN-γ Bildung reagieren.
  • Nachteile des Standes der Technik
  • Die derzeit verfügbaren diagnostischen Tests sind nur wenig sensitiv und spezifisch, insbesondere was den Nachweis zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion (d. h. von der Geburt bis zum 2. Lebensjahr des Tieres) angeht, so dass MAP-infizierte Tiere nicht ausreichend sicher identifiziert werden können.
  • Beim Erregernachweis mittels kulturell-bakteriologischer Untersuchung von Tierkot ist die Erregeranzucht sehr langwierig (mind. 8 Wochen), und falsch negative Befunde sind sehr häufig, da Erreger in frühen Phasen der Infektion noch nicht oder nur intermittierend ausgeschieden werden.
  • Eine halbwegs zuverlässige Aussage über den MAP-freien Status eines Einzeltieres ist daher erst nach mehrmaliger Beprobung und Untersuchung mit negativem Befund möglich. Die kulturell-bakteriologische Untersuchung des Ileocaecallymphknotens (Darmlymphknoten) hat neben der schon erwähnten langwierigen Anzuchtdauer den weiteren Nachteil, dass die Darmlymphknoten des Tieres für eine solche Untersuchung nur mittels Bauchhöhlenoperation zugänglich sind. Dieses Verfahren erscheint daher gegenwärtig nur bedingt praxistauglich.
  • Ähnliches gilt für den direkten MAP-Nachweis mittels der erwähnten PCR-Verfahren. Diese Diagnostik ist zwar weniger zeitaufwändig als die kulturellbakteriologische Untersuchung, aber oft auch noch weniger sensitiv.
  • Durch Besonderheiten bei der Erreger-Wirt-Interaktion wird die klinisch inapparente Phase zu Beginn der Infektion von der zellulären Immunantwort dominiert, während die humorale Immunantwort nur schwach ausgeprägt ist. Entsprechend weisen Systeme zum indirekten Erregernachweis mittels ELISA-Technik nur eine geringe Spezifität und/oder Sensitivität auf (bei ca. 50%), vor allem in der frühen Phase einer MAP-Infektion. Die Quantifizierung von IFN-γ bei restimulierten Blutleukozyten als Maß für die zelluläre Immunantwort ist im Stand der Technik bereits als diagnostischer Ansatz zur Identifizierung MAP-infizierter Rinder (ab 12 Monate) bekannt. Durch starke individuelle Unterschiede und häufig auftretende falschpositive Reaktionen gegen Mykobakterien-Antigen im Allgemeinen besonders im Kälberalter wird die Spezifität dieses Tests erheblich eingeschränkt.
  • Hieraus ergeben sich erhebliche Nachteile:
    Obwohl ein Tier schon lange infiziert sein kann, ist sein Infektionsstatus erst zu ermitteln, nachdem es selbst schon wieder ein oder mehrere Nachkommen geboren und diese möglicherweise bereits angesteckt hat.
  • Auch auf Bestandsebene kann mit den bisher verfügbaren diagnostischen Möglichkeiten die MAP-Freiheit nicht mit ausreichender Sicherheit festgestellt werden. Selbst wenn die serologische und bakteriologische Untersuchung der Tiere zu einem negativen Ergebnis führt, kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich die Nachzucht bereits mit dem Erreger infiziert hat.
  • Eine verlässliche Zusicherung der MAP-Freiheit von Tiere, welche in paratuberkulose-freie Bestände integriert werden sollen, ist derzeit unmöglich, ist aber im Hinblick auf die Verhinderung der Weiterverbreitung dieser Infektionskrankheit von sehr großer Bedeutung. Dies gilt insbesondere für die Zertifizierung von Zuchtvieh im Rahmen des innergemeinschaftlichen Verbringens und des Exports, die zukünftig von immer mehr Ländern (bislang u. a. von Österreich) verlangt werden.
  • Es besteht daher der Bedarf an einem sensitiven und spezifischen diagnostischen Nachweisverfahren, das eine Infektion mit MAP bereits in den frühen Infektionsphasen vor allem auch bei Tieren bis zum 2. Lebensjahr zuverlässig nachweist.
  • Aufgabe
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher es, die beschriebenen Nachteile im Stand der Technik zu beheben und ein zuverlässiges und sicheres Verfahren zum Nachweis einer MAP-Infektion bei adulten und insbesondere bei Säugetieren bis zum 2. Lebensjahr sowie einen dazu geeigneten Testkit bereitzustellen.
  • Lösung
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gemäß der Ansprüche x-y und einen Testkit gemäß der Ansprüche a–z gelöst.
  • Grundlage für die Entwicklung eines neuen Verfahrens war die Überlegung, dass MAP-infizierte Tiere in ihrem Blut einen messbaren Anteil T-Zellen (CD4+ und CD8+ T-Zellen) aufweisen, die sich spezifisch mit MAP-Antigen sensibilisieren lassen und dabei IFN-γ bilden, während Tiere, die nicht mit MAP infiziert sind, zwar CD4+ bzw. CD8+ T-Zellen besitzen, diese sich jedoch nicht mit MAP-Antigen stimulieren lassen. Es wurde jedoch gefunden, dass bei Verwendung von Vollblut innerhalb der Immunzellen Zellsubpopulationen vorliegen (v. a. bei Jungtieren), die unspezifisch auf eine Antigenstimulation mittels Mykobakterien-Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren und somit leicht falschpositive oder nicht interpretierbare Ergebnisse entstehen, die die Aussagekraft eines darauf aufbauenden Testsystems erheblich in Frage stellen. Dies wurde erfindungsgemäß im Verfahren zum Nachweis einer MAP-Infektion berücksichtigt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass auch bei Verwendung von Vollblut aus adulten Säugetieren und Säugetieren bis zum 2. Lebensjahr nur die spezifische IFN-γ-Bildung gemessen wird, innerhalb der Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren und damit keine falschpositiven oder nicht interpretierbaren Ergebnisse mehr entstehen. Damit steht ein spezifisches sowie sensitives Verfahren zum Nachweis auf eine Infektion mit MAP zur Verfügung, die bereits in den frühen Infektionsphasen beim adulten Säugetieren und vor allem auch bei Säugetieren bis zum 2. Lebensjahr zuverlässige Ergebnisse liefert und in der Diagnostik eingesetzt wird.
  • Die Spezifität und Sensitivität in den frühen Infektionsphasen beim adulten Säugetieren und vor allem auch bei Säugetieren bis zum 2. Lebensjahr wird dadurch erreicht, dass aus dem Vollblut erfindungsgemäß zunächst die mononukleären Zellen isoliert werden und anschließend die Messung und Quantifizierung des IFN-γ-Gehaltes gezielt innerhalb vorzugsweise der CD4+ aber auch CD8+ T-Zell-Subpopulationen erfolgt. Dabei ist zu beachten, dass der IFN-γ Nachweis getrennt und nur innerhalb der CD4+ Zellpopulationen oder der CD8+ Zellpopulationen erfolgt. Dies hat den Vorteil, dass nur das IFN-γ gemessen wird, dass von den Zellen, die spezifisch auf eine Antigenstimulation mittels Mykobakterien-Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren, gebildet wird. Die Messung von unspezifischer IFN-γ-Produktion anderer Zellpopulationen ist somit ausgeschlossen und es werden keine falschpositiven Ergebnisse erzeugt.
  • Die Spezifität und Sensitivität wird weiterhin durch die Auswahl bzw. die Herstellung des Antigens erreicht (z. B. Ganzzelllysat von MAP, beispielsweise des kommerziell erhältlichen K10-Stammes, ATCC-Nr. BAA-968 oder anderen geeigneten MAP-Stämmen), das eine optimale MAP-spezifische IFN-γ-Antwort in vitro auslöst. Dies hat den Vorteil, dass nur die Reaktion auf Antigen von MAP gemessen wird und keine falschpositiven Ergebnisse, die z. B. durch Mycobacterium avium subsp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei ausgelöst werden.
  • Erfindungsgemäß umfasst die biologische Probe eine Organ- oder Gewebeprobe, Kot- und Milchprobe, sowie bevorzugt Blut.
  • Erfindungsgemäß stammt die biologische Probe aus einem Säugetier inklusive einem Menschen, bevorzugt aus einem Wiederkäuer, insbesondere Rind, Schaf oder Ziege.
  • Im Einzelnen besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus folgenden Schritten:
    • 1. Isolierung und Kultivierung von Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren
    • 2. Stimulation der Zellen aus Schritt 1 mit MAP-spezifischem Antigen
    • 3. Restimulation der Zellen aus Schritt 2 durch Zugabe von Mitteln, die die IFN-γ Produktion beschleunigen und die eine vorzeitige Sekretion von IFN-γ aus den Zellen verhindern
    • 4. Markierung der Zellen aus Schritt 3 und des IFN-γ, zur Messung der Antigen-spezifischen IFN-γ Produktion
  • Ausführungsbeispiele
  • 1. Isolierung und Kultivierung von Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren
  • Die Isolierung der Zellen erfolgt aus einer Probe eines Säugetieres z. B. Organ-, Gewebe-, Kot- oder Milchprobe, vorzugsweise aus Blut insbesondere eines Rindes. Die Blutentnahme erfolgt gemäß allgemeinem Fachwissen z. B. durch Punktion der Vena jugularis eines Säugetieres, z. B. Rindes. Zur Gerinnungshemmung wird das Blut in geeigneten Gefäßen z. B. Spritzen gesammelt und mit einem gerinnungshemmenden Stoff z. B. 0,2 ml einer 3,8%igen Na3-Citrat-Lösung pro ml Vollblut versetzt. Alternativ erfolgt die Blutprobenentnahme z. B. in kommerziell erhältliche EDTA-Röhrchen.
  • Präparation von Antigenen z. B. MAP-spezifische Antigene
  • Die Präparation von MAP-spezifischen Antigenen erfolgt als Ganzzelllysat (WCS), wie es dem Fachmann bekannt ist, z. B. indem nach Anzucht von Bakterienzellen diese mit Ultraschall und mechanisch (z. B. durch Bead-bester) lysiert und anschließend gefiltert und in Lösung gebracht werden, wie z. B. bekannt aus J. Pollock (National animal Disease Center, IA, USA) „Antigen Preparation-NADC”. Alternativ erfolgt die Präparation von Mycobacterien-Antigen als Protein purified derivative (PPD), indem nach Anzucht von Bakterien unter geeigneten Kultivierungsbedingungen, die Suspension autoklaviert, die Proteine gefällt, gefiltert und anschließend in Lösung gebracht werden, wie dem Fachmann z. B. bekannt ist aus Haagsma und Angus in „Mycobacterium bovis Infection in Animals and Humans”. Diese Verfahren werden für die Präparation von MAP-spezifischen Antigenen verwendet, aber auch für die Präparation von Kontrollantigenen z. B. aus Mycobacterium avium subsp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei.
  • Zur Isolierung und Kultivierung von Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren, werden zunächst aus der Blutprobe die primären monozytären Zellen z. B. die primären bovinen monozytären Zellen (PBMC) isoliert z. B. über einen Ficoll®-Gradienten nach Gebrauchsanweisung des Herstellers. Dabei werden die monozytären Zellen aus der Blutprobe durch Herausfiltern (z. B. Gradientenzentrifugation) der Erythrozyten und Granulozyten gewonnen, so dass in der Zellsuspension nur Lymphozyten und Monozyten verbleiben. Ein Alternative ist eine Modifikation dieser Gebrauchsanweisung beschrieben in Menge et al. (C. MENGE, L. H. WIELER, T. SCHLAPP, G. BALJER (1999): Shiga toxin 1 from Escherichia coli blocks activation and Proliferation of bovine lymphocyte subpopulations in vitro. Infect. Immun. 67, 2209–17) isoliert.
  • Die Zellen (z. B. PBMC) werden anschließend in einer definierten Konzentration z. B. von 4 × 106 Zellen/ml in 12-Well Zellkulturplatten eingesetzt.
  • Innerhalb dieser primären monozytären Zellen (z. B. den primären bovinen monozytären Zellen (PBMC)) befinden sich Zellsubpopulationen, die auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren. Insbesondere sind dies die CD4+- und CD8+-T-Zellen.
  • 2. Stimulation der Zellen aus Schritt 1 mit MAP-spezifischen Antigenen
  • Die Stimulation der isolierten primären monozytären Zellen z. B. den primären bovinen monozytären Zellen (PBMC) aus Schritt 1 mit Antigenen z. B. den MAP-spezifischen Antigenen und ggf. mindestens eines Kontrollantigens in einem seperaten Ansatz erfolgt in einer geeigneten Konzentration von beispielsweise 5 μg PPD/ml Medium oder beispielsweise 1,5 μg WCS/ml PBMC Medium. Die Stimulation erfolgt z. B. im einem Zellkulturbrutschrank über einen Zeitraum von 100–200 h, vorzugsweise 120–160 h, ganz besonders bevorzugt 144 h bei geeigneten Standardbedingungen z. B. 37°C und 5% CO2 (z. B. Zellkultur-Brutschrank) Als Kontrollantigen wird z. B. eine Präparation aus Mycobacterium avium subsp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei verwendet und dieses als negative Kontrolle im Verfahren eingesetzt.
  • 3. Restimulation der Zellen aus Schritt 2 durch Zugabe von Mitteln, die die IFN-γ Produktion beschleunigen und die eine vorzeitige Sekretion von IFN-γ aus den Zellen verhindern
  • Die Restimulation der Zellen aus Schritt 2 erfolgt durch weitere Inkubation in Anwesenheit eines Mittels, das die IFN-γ Produktion beschleunigt, (z. B. Ionomycin und/oder Phorbol-Myristat-Acetat (PMA)) in geeigneter Konzentration und (gleichzeitig) eines Mittels, das die vorzeitige Sekretion von IFN-γ aus den Zellen verhindert (z. B. Brefeldin A) in geeigneter Konzentration über eine Zeitraum von 2–6 h vorzugsweise 4 h. Geeignete Konzentrationen an Ionomycin sind z. B. 1 μg/ml, an Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) z. B. 50 ng/ml.
  • Im Anschluss daran werden die Zellen geerntet und in einer definierten Konzentration in ein geeignetes Gefäß überführt z. B. 1–2 × 105 Zellen/Well in eine 96-Well Platte mit „V”-Form Boden.
  • 4. Markierung der Zellen aus Schritt 3 und des IFN-γ, zur Messung der Antigen-spezifischen IFN-γ Produktion
  • Um die IFN-γ-Bildung innerhalb der Zellen, im besonderen der Antigenspezifischen CD4+ und/oder CD8+ Zellen, aus Schritt 3 zu detektieren und quantitativ zu erfassen, werden die Zellsubpopulationen von Interesse (CD4+ und/oder CD8+ Zellen) als auch das intrazellulär befindliche IFN-γ markiert (z. B. mit geeigneten Antikörpern). Somit kann der IFN-γ Gehalt getrennt, entweder in CD4+ oder in CD8+ Zellen bestimmt werden. Dem Fachmann steht dazu für eine direkte Markierung eine Vielzahl an radioaktiven, fluoreszierenden, biolumineszierenden CD4-, CD8- und IFN-γ spezifischen Antikörpern zur Verfügung. Aber auch eine indirekte Markierung mittels radioaktiven, fluoreszierenden, biolumineszierenden Sekundärantikörpern, vorzugsweise mittels eines Biotin-Streptavidin Verstärkungsschrittes ist dem Fachmann bekannt. Der Fachmann kennt eine Vielzahl an geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen, darunter z. B. APC und PE, die auch für die Detektion im Durchflusszytometer geeignet sind.
  • Zunächst werden die Oberflächenantigene CD4 oder CD8 der Zellen aus Schritt 3 mit kommerziell erhältlichen monoklonalen CD4- oder CD8-spezifischen Antikörpern versetzt und markiert. Diese CD4- oder CD8-spezifischen Antikörper werden anschließend mit Sekundärantikörpern z. B. APC-konjugierten Sekundärantikörpern versetzt und detektiert. Bevorzugt erfolgt eine Vorinkubation mit Biotinkonjugierten Sekundärantikörpern, die anschließend mit APC-konjugiertem Streptavidin versetzt und markiert werden. Dies führt zu einer Signalverstärkung und somit zu einer sicheren Identifizierung der CD4- oder CD8 positiven Zellen. Anschließend werden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit kommerziell erhältlichen monoklonalen Antikörper gegen IFN-γ versetzt, um intrazellulär vorhandenes IFN-γ zu markieren. Antikörper, die an IFN-γ gebunden haben, werden mit Sekundärantikörpern, z. B. mit kommerziell erhältlichen PE-konjugierten Sekundärantikörpern detektiert.
  • Messung und Quantifizierung des IFN-γ-Gehaltes
  • Die Quantifizierung (IFN-γ[%] Titer) erfolgt z. B. im Durchflusszytometer, da hier einerseits die CD4+- oder CD8+-T-Zellen sowie innerhalb beider Populationen solche mit und ohne IFN-γ-Bildung deutlich voneinander unterschieden werden. Der Anteil IFN-γ-bildender Zellen an allen CD4+- bzw. CD8+-T-Zellen nach Inkubation mit MAP-Antigen im Vergleich zur Inkubation ohne Antigen oder mit Kontrollantigen z. B. MAA- bzw. M. phlei-Antigen wird als Parameter für die Bewertung der Blutproben gewählt.
  • Figure 00100001
  • Im Falle eines MAP-negativen Tieres ist der Quotient ca. 1,0. Im Falle eines MAP-positiven Tieres ist der Quotient >1,0.
  • Alternativ erfolgt die Quantifizierung IFN-γ[MFLI] Titer z. B. im Durchflusszytometer durch Abgrenzung der Zellen nach lymphozytärer Herkunft (Region 1) von denen monozytärer bzw. lymphoblastoider Herkunft (Region 2) und getrennter Analyse. Innerhalb der Region 2 wird die mittlere relative Fluoreszenzintensität (MFLI) des IFN-γ-Signals aller CD4+ (oder CD8+)-Zellen bestimmt. Die MFLI nach Inkubation mit MAP-Antigen im Vergleich zur Inkubation ohne Antigen oder mit Kontrollantigen z. B. Antigen aus Mycobacterium avium subsp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei wird als Parameter für die Bewertung der Blutproben gewählt.
  • Figure 00100002
  • Im Falle eines MAP-negativen Tieres ist der Quotient ca. 1,0. Im Falle eines MAP-positiven Tieres ist der Quotient >1,0.
  • Dem Fachmann ist mit Hilfe der vorangestellten Beschreibung möglich, dieses Prinzip des Nachweises von MAP mit geringfügigen Änderungen und Anpassungen, die im Rahmen seines Fachwissens liegen, auch auf den Nachweis anderer Krankheitserreger z. B. Infektionen mit Tierseuchen- oder Zoonoseerregern anzuwenden.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft einen einfach zu handhabenden Testkit zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in einer biologischen Probe, der Materialien zur Messung der spezifischen IFN-γ-Bildung aus Zellen, die auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren, umfasst.
  • Der Testkit umfasst eine Antigenpräparation von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), alternativ als negative Kontrolle auch zusätzlich eine Antigenpräparation von Mycobacterium avium ssp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei (M. phlei).
  • In der erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst der Testkit weiterhin Antikörper zur Bindung und Markierung der Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren, z. B. radioaktive, fluoreszierende, biolumineszierende CD4-, CD8 spezifische Antikörper, weiterhin Antikörper, die IFN-γ binden und z. B. radioaktiv, fluoreszierend oder biolumineszierend markiert sind. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Testkit Sekundärantikörper zur Bindung an die Antikörper, die an Zellen binden, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren und Sekundärantikörper zur Bindung an die Antikörpern, die IFN-γ binden. Diese Sekundärantikörper sind dem Fachmann bekannte radioaktiv, fluoreszierend oder biolumineszierend markierte Sekundärantikörper zur Bindung der CD4-, CD8- und IFN-γ spezifischen Antikörper, die insbesondere zur Analyse mittels Durchflusszytometrie geeignet sind.
  • Auf Grund der Lehre der vorliegenden Erfindung sowie auf Grund des allgemeinen Fachwissens in diesem technischen Gebiet ist dem Hersteller des erfindungsgemäßen Kits bekannt, wie er die einzelnen Komponenten des Kits, z. B. Puffer herstellt, formuliert und lagert.
  • Abbildungen
  • 1 zeigt beispielhaft die Auswertung einer Messung zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) durch den Nachweis Interferon-gamma (IFN-γ) bildender T-Zell-Subpopulationen in Blut nach Inkubation von peripheren mononukleären Blutzellkulturen (PBMC) mit MAP-Antigenpräparationen. Dargestellt ist der IFN-γ[MFLI] Titer (normalisiert anhand der Proben die nach Inkubation mit M. phlei gemessen wurden; y-Achse) CD4+ Lymphoblasten von 3 MAP-infizierten Tieren (in der Grafik gezeigt durch ausgefüllte Symbole) und 3 MAP-negativen Tieren (in der Grafik gezeigt durch offene Symbole) nach Inkubation ohne Antigen (Med) oder mit Antigenpräparationen) von MAA (WCS-MAA) und MAP (WCS-MAP) (x-Achse).
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - C. MENGE, L. H. WIELER, T. SCHLAPP, G. BALJER (1999): Shiga toxin 1 from Escherichia coli blocks activation and Proliferation of bovine lymphocyte subpopulations in vitro. Infect. Immun. 67, 2209–17 [0026]

Claims (13)

  1. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in einer biologischen Probe eines Säugetieres dadurch gekennzeichnet, dass die spezifische IFN-γ-Bildung aus Zellen, die auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren, gemessen wird.
  2. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Infektion bereits in den frühen Infektionsphasen beim adulten Säugetier und beim Säugetier bis zum 2. Lebensjahr nachweisbar ist.
  3. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) gemäß Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst 1. Isolierung und Kultivierung von Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren 2. Stimulation der Zellen aus Schritt 1 mit MAP-spezifischen Antigen 3. Restimulation der Zellen aus Schritt 2 durch Zugabe von Mitteln, die die IFN-γ Produktion beschleunigen und die eine vorzeitige Sekretion von IFN-γ aus den Zellen verhindern 4. Markierung der Zellen aus Schritt 3 und des IFN-γ, zur Messung der Antigen-spezifischen IFN-γ Produktion
  4. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Organ-, Gewebe-, Kot- oder Milchprobe, sowie Blut ist.
  5. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das MAP-spezifische Antigen eine Präparation von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) ist.
  6. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das MAP-spezifische Antigen Mycobacterium avium subsp. avium (MAA) und/oder Mycobacterium phlei (M. phlei) ist
  7. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung der Zellen mittels Antikörper erfolgt
  8. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Antigen-spezifischen IFN-γ Produktion im Durchflusszytometer erfolgt
  9. Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel die die IFN-γ Produktion beschleunigen Ionomycin und/oder Phorbol-Myristat-Acetat sind und Mittel die eine vorzeitige Sekretion von IFN-γ aus den Zellen verhindern Brefeldin A ist.
  10. Testkit zum Nachweis einer Infektion mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) einer biologischen Probe dadurch gekennzeichnet, dass er Materialien zur Messung der spezifischen IFN-γ-Bildung aus Zellen, die auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren, umfasst.
  11. Testkit gemäß Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, dass er eine Antigenpräparation von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), Antikörper zur Bindung an Zellen, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren und Antikörper zur Bindung von IFN-γ umfasst.
  12. Testkit gemäß Anspruch 10 und 11 dadurch gekennzeichnet, dass er eine Antigenpräparation von Mycobacterium avium subsp. avium (MAA) oder Mycobacterium phlei (M. phlei) umfasst.
  13. Testkit gemäß Anspruch 10 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass er Sekundärantikörper zur Bindung an die Antikörper, die an Zellen binden, die spezifisch auf eine Stimulation mittels MAP-spezifischen Antigenen mit IFN-γ-Bildung reagieren und Sekundärantikörper zur Bindung an die Antikörpern, die IFN-γ binden, umfasst.
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