DE102008019712A1 - Biochip und Verfahren zum Herstellen eines solchen - Google Patents
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Abstract
Bei einem Verfahren zum Herstellen eines Biochips (1) werden eine erste DNA-Sequenz (2a) und eine zweite, sich davon durch mindestens eine Mutationsstelle (3) unterscheidende DNA-Sequenz (2b) bereitgestellt. Jede DNA-Sequenz (2a, 2b) wird in Sequenzabschnitte (4a, 4a', 4a", 4a, 4a', 4a") unterteilt, die jeweils mindestens eine Base aufweisen. Jeder Sequenzabschnitt (4a, 4a', 4a") der ersten DNA-Sequenz (2a) wird jeweils mit einem ihm zugeordneten Sequenzabschnitt (4b, 4b', 4b") der zweiten DNA-Sequenz (2b) verglichen. Auf einem Träger (5) wird mindestens ein Rezeptor (8) immobilisiert, der an jeder Stelle, an der ein Sequenzabschnitt (4a, 4a', 4a") der ersten DNA-Sequenz (2a) mit dem entsprechenden Sequenzabschnitt (4b, 4b', 4b") der zweiten DNA-Sequenz (2b) übereinstimmt, einen zu diesem Sequenzabschnitt (4b, 4b', 4b") komplementären Rezeptor-Abschnitt (6, 6') aufweist. Außerdem weist der Rezeptor (8) an jeder Stelle, an der ein Sequenzabschnitt (4a, 4a', 4a") der ersten DNA-Sequenz (2a) nicht mit dem entsprechenden Sequenzabschnitt (4b, 4b', 4b") der zweiten DNA-Sequenz (2b) übereinstimmt, einen Platzhalter (7) auf, der für keine der DNA-Basen Guanin, Cytosin, Adenin und Thymin bindungsspezifisch ist. Der Platzhalter (7) wird derart gewählt, dass der Abstand der an den Platzhalter (7) beidseits angrenzenden Basen des Rezeptors (8) etwa dem Abstand der Basen entspricht, die an die dem Platzhalter (7) zugeordneten, nicht übereinstimmenden Sequenzabschnitte (4a, 4a', ...
Description
- Die Erfindung betrifft einen Biochip, der einen Träger aufweist, auf dem mindestens ein Rezeptor immobilisiert ist. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen eines solchen Biochips.
- Ein derartiges Verfahren ist aus
US 6 197 503 B1 bekannt. Dabei wird ein Biochip hergestellt, indem auf einem Träger ein Rezeptor immoblisiert wird, der eine DNA-Sequenz aufweist, die für eine dazu komplementäre, nachzuweisende DNA-Sequenz bindungsspezifisch ist. Eine Probe, von der vermutet wird, dass sie die nachzuweisende DNA-Sequenz enthält, wird mit einem optischen Marker markiert, der dazu geeignet ist, an die DNA-Sequenz zu binden. Danach wird die so markierte Probe derart mit dem Biochip in Kontakt gebracht, dass die DNA-Sequenz an den Rezeptor bindet, wenn sie in der Probe enthalten ist. Dann wird die Trägeroberfläche gespült, um Bestandteile der Probe, die nicht an einen Rezeptor gebunden sind, zu entfernen. Anschließend wird die Trägeroberfläche mit einer optischen Anregungsstrahlung bestrahlt, die den Marker zu Aussendung einer Fluoreszenzstrahlung anregt. Diese wird mit Hilfe eines optischen Sensors detektiert, um die DNA-Sequenz nachzuweisen. - Insbesondere beim Nachweis von Bakterien kann es vorkommen, dass die zu untersuchende DNA-Sequenz eines Bakteriums mindestens eine Mutationsstelle aufweist, die dazu führt, dass die DNA-Sequenz nicht an den Rezeptor bindet. Derartige Mutation können bei Bakterien in zahlreichen Varianten, beispielsweise an unterschiedlichen Stellen des DNA-Strangs und/oder mit unterschiedlichen Basen an den Mutationsstellen des DNA-Strangs auftreten. Damit mit Hilfe des Biochips sowohl das unmutierte Bakterium als auch mögliche, Mutationen aufweisende Varianten des Bakteriums oder sogar eine Klasse von Bakterien mit ähnlich aufgebauter DNA untersucht werden können, müssen auf dem Biochip ein Vielzahl von unterschiedlichen, jeweils für eine Variante der DNA-Sequenz bindungsspezifischen Rezeptoren immobilisiert werden. Dabei muss für jede nachzuweisende Variante mindestens eine Messung durchgeführt werden. Der Nachweis einer Klasse von miteinander verwandten Bakterien ist deshalb mit einem erheblichen Aufwand verbunden. Ungünstig ist dabei vor allem, dass Bakterien oder Viren ständig neue Varianten bilden, so dass die Biochips, die zu deren Nachweis verwendet werden, entsprechend angepasst werden müssen.
- Aufgabe der Erfindung ist es, einen Biochip der eingangs genannten Art zu schaffen, der es ermöglicht, auf einfache Weise mehrere unterschiedliche, sich durch mindestens ein Mutationsstelle voneinander unterscheidende DNA-Sequenzen nachzuweisen. Außerdem besteht die Aufgabe, ein Verfahren zum Herstellen eine solchen Biochips bereitzustellen.
- Diese Aufgabe wird bezüglich des Verfahrens dadurch gelöst, dass zumindest eine erste DNA-Sequenz eines ersten DNA-Moleküls und eine zweite, sich von der ersten DNA-Sequenz durch mindestens eine Mutationsstelle unterscheidende DNA-Sequenz eines zweiten DNA-Moleküls bereit gestellt werden, dass jede DNA-Sequenz in Sequenzabschnitte unterteilt wird, die jeweils mindestens eine Base aufweisen, dass jeder Sequenzabschnitt der ersten DNA-Sequenz jeweils mit einem ihm zugeordneten Sequenzabschnitt der zweiten DNA-Sequenz verglichen wird, dass auf einem Träger mindestens ein Rezeptor immobilisiert wird, welcher Rezeptor an jeder Stelle, an der ein Sequenzabschnitt der ersten DNA-Sequenz mit dem entsprechenden Sequenzabschnitt der zweiten DNA-Sequenz übereinstimmt, einen zu diesem Sequenzabschnitt komplementären Rezeptor-Abschnitt aufweist, und welcher Rezeptor an jeder Stelle, an der ein Sequenzabschnitt der ersten DNA-Sequenz nicht mit dem entsprechenden Sequenzabschnitt der zweiten DNA-Sequenz übereinstimmt, einen Platzhalter aufweist, der für keine der DNA-Basen Guanin, Cytosin, Adenin und Thymin bindungsspezifisch ist, und dass der Platzhalter derart gewählt wird, dass der Abstand der an den Platzhalter beidseits angrenzenden Basen des Rezeptors etwa dem Abstand der Basen entspricht, die an die dem Platzhalter zugeordneten, nicht übereinstimmenden Sequenzabschnitte der ersten DNA-Sequenz und der zweiten DNA-Sequenz jeweils beidseits angrenzen.
- Bezüglich des Biochips wird die vorstehend genannte Aufgabe dadurch gelöst, dass der Rezeptor eine Basen-Sequenz hat, die mehrere, jeweils mindestens eine DNA-Base enthaltende Rezeptor-Abschnitte und mindestens einen Platzhalter aufweist, der für keine der DNA-Basen Guanin, Cytosin, Adenin und Thymin bin dungsspezifisch ist und derart gewählt ist, dass der Abstand von beidseits an den Platzhalter angrenzenden Basen des Rezeptors etwa dem Abstand entspricht, den zwei durch eine DNA-Base oder durch einen aus mindestens zwei DNA-Basen bestehenden Sequenzabschnitt einer DNA-Sequenz voneinander beabstandete DNA-Basen haben.
- Der Rezeptor weist also an der oder den Stellen, an der bzw. an denen die nachzuweisenden DNA-Sequenzen unterschiedlich sind, einen Platzhalter out, an den die DNA-Basen, die an der betreffenden Stelle oder den betreffenden Stellen der DNA-Sequenz angeordnet sind, nicht binden. In Erstreckungsrichtung der Rasenkette des Rezeptors hat der Platzhalter etwa die gleichen räumlichen Abmessungen wie die an den entsprechenden Stellen der nachzuweisenden DNA-Sequenzen angeordneten Basen. Somit können mehrere unterschiedliche DNA-Sequenzen, die sich durch mindestens eine Mutationsstelle voneinander unterscheiden, jeweils spezifisch an den Rezeptor binden. In vorteilhafter Weise ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Biochips möglich, mit nur einem einzigen Versuch zu überprüfen, ob in einer Probe mindestens eine der unterschiedlichen DNA-Sequenzen enthalten ist.
- Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist der Platzhalter mindestens eine Neutralbase auf, insbesondere Inosin. Unterschiedliche Varianten einer DNA-Sequenzenz können dann noch besser nachgewiesen werden. Durch den Einbau der Inosin-Base in den Rezeptor wird außerdem ein eventuell vorhandener Bereich, der eine Selbsthomologie des Rezeptors verursachen kann, aufgelöst, so dass der Rezeptor dann keine Sekundärstruktur mehr ausbildet.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist mindestens ein Sequenzabschnitte eine Anzahl von jeweils mindestens zwei und vorzugsweise jeweils vier DNA-Basen auf, wobei der Platzhalter eine dieser Anzahl entsprechende Anzahl von Neutralbasen hat. Dadurch wird berücksichtigt, dass gewöhnlich in drei aufeinander folgenden DNA-Basen einer DNA-Sequenz die Information für eine Aminosäure verschlüsselt ist.
- Vorteilhaft werden die DNA-Sequenzen derart gewählt, dass sie sich durch mindestens zwei Mutationsstellen voneinander unterscheiden und dass zwischen diesen Mutationsstellen eine Folge von mindestens drei und vorzugsweise mindestens vier aufeinander folgenden DNA-Basen vorhanden ist, die bei der ersten DNA-Sequenz und der zweiten DNA-Sequenz übereinstimmen. Der Rezeptor weist bevorzugt eine zu der Folge komplementäre Basenfolge auf. Durch die derart modifizierten Rezeptoren wird nun gewährleistet, dass die gesuchten DNA-Stränge mit deutlich höher Energie an die Rezeptoren binden als andere, ähnliche, nicht gesuchte Sequenzen. Der gesuchte DNA-Abschnitt stellt erfindungsgemäß den komplementäre Bereich zu den im Rezeptor vorhandenen Basen A, T, G und C dar.
- Nachfolgend sind Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigt
-
1 eine schematische Darstellung von DNA-Sequenzen zweier Moleküle und einer Basenfolge eines Rezeptors, wobei die DNA-Sequenzen nur teilweise dargestellt sind, -
2 ein erstes Ausführungsbeispiel eines Biochips, an dessen Rezeptor eine erste DNA-Sequenz hybridisiert ist. -
3 das erste Ausführungsbeispiel des Biochips, wobei jedoch an den Rezeptor eine zweite DNA-Sequenz hybridisiert ist, -
4 ein zweites Ausführungsbeispiel eines Biochips, an dessen Rezeptor eine dritte DNA-Sequenz hybridisiert ist, und -
5 das zweite Ausführungsbeispiel des Biochips, wobei jedoch an den Rezeptor eine vierte DNA-Sequenz hybridisiert ist. - Bei einem Verfahren zum Herstellen eines Biochips
1 werden DNA-Sequenzen2a ,2b von mindestens zwei, in der Zeichnung nicht näher dargestellten DNA-Molekülen bereitgestellt, die sich durch Mutationen voneinander unterscheiden. Eine erste DNA-Sequenz2a ist in einem ersten DNA-Molekül und eine zweite DNA-Sequenz2b in einem zweiten DNA-Molekül enthalten. - Die DNA-Sequenzen
2a ,2b können beispielsweise experimentell ermittelt werden, indem in den DNA-Molekülen enthaltene DNA-Ketten oder Abschnitte davon mit an sich bekannten Methoden analysiert werden. Es ist aber auch möglich, die DNA-Sequenzen aus einer Gen-Datenbank zu entnehmen. - In
1 ist erkennbar, dass sich die erste DNA-Sequenz2a und die zweite DNA-Sequenz2b an einer Mutationsstelle3 durch eine Folge von vier DNA-Basen GTCG bzw. CATA voneinander unterscheiden, wobei „A” Adenin, „G” Guanin, „C” Cytosin und „T” Thymin bedeuten. Im Übrigen stimmen die DNA-Sequenzen2a ,2b überein. - Zum Vergleichen der DNA-Sequenzen
2a ,2b werden diese jeweils in Sequenzabschnitte40 ,4a' ,4a'' ;4b ,4b ;4b'' unterteilt, die jeweils eine Länge von einer Base aufweisen. Ein erster Sequenzabschnitt40 der ersten DNA-Sequenz20 wird mit einem ersten Sequenzabschnitt4b der zweiten DNA-Sequenz2b verglichen. Dabei werden die ersten Sequenzabschnitte4a ,4b so gewählt, dass einander zugeordnete Sequenzabschnitte40 ,4b der DNA-Sequenzen2a ,2b möglichst gut übereinstimmen. - Wenn der erste Sequenzabschnitt
4a der ersten DNA-Sequenz2a mit dem ersten Sequenzabschnitt4b der zweiten DNA-Sequenz2b übereinstimmt, wird auf einem Träger5 ein erster, zu dem ersten Sequenzabschnitt4a komplementäre Rezeptor-Abschnitt6 immobilisiert. Wenn die ersten Sequenzabschnitte40 ,4b nicht übereinstimmen, wird auf dem Träger5 als erster Rezeptor-Abschnitt6 eine Inosin-Base immobilisiert. Der Träger5 kann beispielsweise aus Glas oder Silizium bestehen. - Danach wird ein zweiter Sequenzabschnitt
40' der ersten DNA-Sequenz2a mit einem zweiten Sequenzabschnitt4b' der zweiten DNA-Sequenz2b verglichen. Bei Übereinstimmung der zweiten Sequenzabschnitte4a' ,4b' wird an den ersten Abschnitt6 ein zweiter Rezeptor-Abschnitt6' gebunden, der zu den zweiten Sequenzabschnitten4a' ,4b' komplementär ist. Stimmen die zweiten Sequenzabschnitte4a' ,4b' dagegen nicht überein, wird an die erste Rezeptor-Base6 als zweiter Rezeptor-Abschnitt6' Inosin gebunden. An der Mutationsstelle3 wird also ein Platzhalter7 in den Rezeptor8 eingebaut. Das Binden des zweiten Rezeptor- Abschnitts6' an den ersten Rezeptor-Abschnitt6 erfolgt mit Hilfe eines an sich bekannten Syntheseschrittes. - Anschließend werden in entsprechender Weise weitere Sequenzabschnitte
40'' ,4b'' miteinander verglichen, wobei jeweils bei Übereinstimmung eine zu den Sequenzabschnitten4a'' ,4b'' komplementärer Rezeptor-Abschnitt6'' und bei Nichtübereinstimmung Inosin an den im vorherigen Schritt synthetisierten Rezeptor-Abschnitt6 angefügt wird. - Der Rezeptor mitsamt der Innosinbase(n) kann in einem Syntheselabor hergestellt werden (www.biomers.net).
- Der immobilisierte Rezeptor
8 wird derart mit einer zu untersuchenden, die erste DNA-Sequenz2a und/oder die zweite DNA-Sequenz2b als Ligand enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, dass der Ligand an den Rezeptor8 binden kann. In2 und3 ist erkennbar, dass sowohl die DNA-Sequenz2a als auch die zweite DNA-Sequenz2b beim Kontaktieren des Rezeptors8 jeweils spezifisch an diesen hybridisieren. Dabei bildet sich jeweils zwischen einander zugeordneten, komplementären DNA-Basen eine Bindungsbrücke zwischen der DNA-Sequenz2a ,2b und dem Rezeptor8 aus. An den Stellen, an denen die Inosin-Basen angeordnet sind, treten dagegen keine Bindungsbrücken auf. Der so gebildete Rezeptor-Liganden-Komplex kann dann mit an sich bekannten Verfahren, z. B. mittels eines optischen Markers, nachgewiesen werden. - Bei dem in
4 und5 gezeigten Ausführungsbeispiel umfassen die ersten Sequenzabschnitte4a ,4a' ,4a'' , die zweiten Sequenzabschnitte4b ,4b' ,4b'' und die Rezeptor-Abschnitte6 ,6' ,6'' jeweils eine Folge von mindestens vier DNA-Basen. Deutlich ist erkennbar, dass in den Rezeptor8 an Mutationsstellen3 , an denen sich die DNA-Sequenzen2a ,2b jeweils durch mindestens eine Base voneinander unterscheiden jeweils eine Folge von vier oder fünf Inosin-Basen eingebaut wird. An den übrigen Stellen ist der Rezeptor8 jeweils komplementär zu den entsprechenden Stellen der DNA-Sequenzen2a ,2b . - In
3 und4 ist noch erkennbar, dass der Rezeptor8 zwischen zwei Platzhaltern7 jeweils ein Tupel, bestehend aus mindestens vier DNA-Basen aufweist. - Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
-
- - US 6197503 B1 [0002]
- Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - www.biomers.net [0024]
Claims (7)
- Verfahren zum Herstellen eines Biochips (
1 ), wobei zumindest eine erste DNA-Sequenz (2a ) eines ersten DNA-Moleküls und eine zweite, sich von der ersten DNA-Sequenz (2a ) durch mindestens eine Mutationsstelle (3 ) unterscheidende DNA-Sequenz (2b ) eines zweiten DNA-Moleküls bereit gestellt werden, wobei jede DNA-Sequenz (2a ,2b ) in Sequenzabschnitte (4a ,4a' ,4a'' ,4a ,4a' ,4a'' ) unterteilt wird, die jeweils mindestens eine Base aufweisen, wobei jeder Sequenzabschnitt (4a ,4a' ,4a'' ) der ersten DNA-Sequenz (2a ) jeweils mit einem ihm zugeordneten Sequenzabschnitt (4b ,4b' ,4b'' ) der zweiten DNA-Sequenz (2b ) verglichen wird, wobei auf einem Träger (5 ) mindestens ein Rezeptor (8 ) immobilisiert wird, welcher Rezeptor (8 ) an jeder Stelle, an der ein Sequenzabschnitt (4a ,4a' ,4a'' ) der ersten DNA-Sequenz (2a ) mit dem entsprechenden Sequenzabschnitt (4b ,4b' ,4b'' ) der zweiten DNA-Sequenz (2b ) übereinstimmt, einen zu diesem Sequenzabschnitt (4b ,4b' ,4b'' ) komplementären Rezeptor-Abschnitt (6 ,6' ) aufweist, und welcher Rezeptor (8 ) an jeder Stelle, an der ein Sequenzabschnitt (4a ,4a' ,4a'' ) der ersten DNA-Sequenz (2a ) nicht mit dem entsprechenden Sequenzabschnitt (4b ,4b' ,4b'' ) der zweiten DNA-Sequenz (2b ) übereinstimmt, einen Platzhalter (7 ) aufweist, der für keine der DNA-Basen Guanin, Cytosin, Adenin und Thymin bindungsspezifisch ist, und wobei der Platzhalter (7 ) derart gewählt wird, dass der Abstand der an den Platzhalter (7 ) beidseits angrenzenden Basen des Rezeptors (8 ) etwa dem Abstand der Basen entspricht, die an die dem Platzhalter (7 ) zugeordneten, nicht übereinstimmenden Sequenzabschnitte (4a ,4a' ,4a'' ,4b ,4b' ,4b'' ) der ersten DNA-Sequenz (2a ) und der zweiten DNA-Sequenz (2b ) jeweils beidseits angrenzen. - Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Platzhalter (
7 ) mindestens eine Neutralbase aufweist, insbesondere Inosin. - Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei weist mindestens ein Sequenzabschnitte (
4a ,4a' ,4a'' ,4b ,4b' ,4b'' ) eine Anzahl von jeweils mindestens zwei und vorzugsweise jeweils vier DNA-Basen aufweist, und wobei der Platzhalter (7 ) eine dieser Anzahl entsprechende Anzahl von Neutralbasen hat. - Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNA-Sequenzen (
2a ,2b ) derart gewählt werden, dass sie sich durch mindestens zwei Mutationsstellen (3 ) voneinander unterscheiden und dass zwischen diesen Mutationsstellen (3 ) eine Folge von mindestens drei und vorzugsweise mindestens vier aufeinander folgenden DNA-Basen vorhanden ist, die bei der ersten DNA-Sequenz (2a ) und der zweiten DNA-Sequenz (2b ) übereinstimmen. - Biochip (
1 ), mit einem Träger (5 ) auf dem mindestens ein Rezeptor (8 ) immobilisiert ist, der eine Basen-Sequenz aufweist, die mehrere, jeweils mindestens eine Base enthalte Rezeptor-Abschnitte (6 ,6' ) und mindestens einen Platzhalter (7 ) aufweist, der für keine der DNA-Basen Guanin, Cytosin, Adenin und Thymin bindungsspezifisch ist und derart gewählt ist, dass der Abstand von beidseits an den Platzhalter (7 ) angrenzenden Basen des Rezeptors (8 ) etwa dem Abstand entspricht, den zwei durch eine DNA-Base oder durch einen aus mindestens zwei DNA-Basen bestehenden Sequenzabschnitt einer DNA-Sequenz voneinander beabstandete DNA-Basen haben. - Biochip (
1 ) nach Anspruch 5, wobei der Platzhalter (7 ) mindestens eine Neutralbase aufweist, insbesondere Inosin. - Biochip (
1 ) nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Platzhalter (7 ) aus mehreren Neutralbasen besteht, insbesondere aus einer Sequenz von vier Neutralbasen.
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Also Published As
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